이 작품은 NIH NS059622, NS073636, 국방부 CDMRP W81XWH-12-1-0562, 장점을 검토 상 I01 미국 재향 군인 담당 부서, 크레이그 H Neilsen 재단 296749, 인디애나 척수 및 뇌 손상 연구 재단 (BX002356에 의해 부분적으로 지원 ISCBIRF) 인디애나 주 보건 (019919), 및 Mari Hulman 조지 기부금 펀드의.

모든 수술 및 동물 취급 절차 관리 및 실험 동물 사용 (국가 연구 위원회)의 인디애나 대학 학교의 약 기관 동물 관리 및 사용 지침에 대 한 가이드 아래 승인으로 수행한 위원회입니다.
1. 수술 준비
<ol>
	<li>척추 안정제를 포함 하 여 모든 수술 도구를 소독. 수술 테이블 및 70% 에탄올과 모든 주변 지역 청소. 비 생존 수술의 준비, 37 ° C가 열 패드 상단 깨끗 한 수술 패드 장소.</li>
	<li>6 주 오래 된 Sprague Dawley (SD) 쥐를 사용 하 여이 연구에 대 한. 무게와 케 타 민 (87.7 mg/kg) 및 xylazine (12.3 mg/kg) 혼합물의 복 주사와 쥐를 anesthetize. 동물 발가락 꼬집어 자극에 응답을 중단 하는 경우 마 취의 적절 한 단계를 확인 합니다. 피하 주사 0.01-0.05 mg/kg Buprenorphine 및 5 mg/kg Carprofen 수술 전에.</li>
	<li>2 지역에 쥐 면: 뒷면 및 목 지역을 가슴 쪽에 자 궁 경관 등뼈 지역. 70% 알코올 잎사귀 betadine 외과 스크럽과 피부 영역 면봉. 수술 중 안구 건조를 방지 하기 위해 눈 연 고를 적용 합니다. 깨끗 한 수술 패드에서 부정사 위치에 동물을 놓습니다.</li>
</ol>
2. 외부 경 정 맥 도관 법
<ol>
	<li>외부 경 정 맥, 쇄 골 근처 펄스 포인트를 찾는 하 여 찾아서 3 해 부 포인트 크로스 포인트는 자리에 수직 절 개를 만들기 위해 작은 봄이 위 컷: 오른쪽 mandible의 큰 결 절의 꼬리 ramus 상 완 골 및 위 (그림 1A). 봄이 위 및 미세 집게를 사용 하 여 선박을 격리 합니다. 1 메 마른 외과 봉합 사 선 (그림 1C)20선단부를 묶어.</li>
	<li>1 1 mL 주사기 가득 염 분 및 21-게이지 바늘 (그림 1B)에서 만든 특수 카 테 터와 연결을 준비 합니다. 그릇에 마이크로 위를 사용 하 여 작은 절 개를 하 고 선박에는 카 테 터를 슬라이드.<ol>
		<li>두 인접 하 고 원심 끝 (그림 1C)을 매 서 바늘을 보안 합니다. 특수 카 테 터는 21-게이지 바늘에서 이루어집니다. 갈기 플랫 팁 및 용접 팁의 2 밀리미터 조각으로 또 다른 21-게이지 바늘에서 잘라. 이 밖에 미 끄 러에서 테를 방지할 수 있습니다. 
		참고: 바늘에 흐르는 혈액의 작은 양의 바늘 혈관을 성공적으로 입력 했습니다 나타냅니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 척추 안정화 및 C5-C7 Laminectomy
<ol>
	<li>경향이 위치에 동물을 놓습니다. 원하는 척추 레벨에서 15 번 메스 블레이드와 중간 선 따라 피부를 잘라. 근육 레이어 5회 에서 7번째 경관 척추 (C5-C7) 양측 측면 측면 (그림 2A)21폭로 해 부. 
	참고: 고 견 사이 스파이크를 찾는 하 여 두 번째 흉부 척추를 (T2)을 찾습니다. C7 척추21,22,,2324찾을 T2 척추에서 위쪽으로 계산 합니다.</li>
	<li>수정 된 안정화 장치를 사용 하 여 쥐의 척추를 안정화 합니다. 측면 척추 뼈의 양쪽에 슬릿을 만듭니다. 스테인리스 스틸 팔 노출된 가로 프로세스 측면 아래 슬라이드와 안정성 (그림 2B)를 확보 하 고 나사를 조입니다.</li>
	<li>조심 스럽게 제거 C5-C7 하기 (laminectomy, 그림 2C).</li>
	<li>계속 moisturized (그림 2D) 노출된 dura mater 위에 식 염 수에 젖은 gelfoam의 작은 조각을 넣으십시오.</li>
</ol>
4. 2 광자 (2 P) 이미징 창 설치
<ol>
	<li>물건 작은 조각의 gelfoam 근육과 척추 뼈 사이의 간격으로 또한 척수와 척추 뼈 사이 gelfoam의 얇은 라인을 물건 다음 조직 접착제 접착제를 사용 하 여 근육-뼈 주변을 밀봉 하기 위하여. 완전 한 건조 (그림 2E)에 대 일 분 기다립니다. 
	참고: 이 단계는 효과적으로 창 시키는 침수 솔루션으로 미래의 출혈을 방지 합니다.</li>
	<li>DdH2O 전자 레인지에 4 %agar 준비 합니다. 고 한 천이 녹는 완전히 후 만질 수 있는 온도에 반환 될 때까지 기다립니다. 한 솔루션으로 1 mL의 멸 균 주사기를 (그림 2E) 벽을 만들려고 윈도우의 가장자리에 파이프. 솔루션 신속 하 게 굳은 렌즈 또는 목표 자유롭게 이동할 수 있도록 유연 하 고.</li>
	<li>이미징에 대 한 준비를 하는 경우 2 P (그림 2F) 이미징에 대 한 창 gelfoam 및 장소 침수 액체를 제거 합니다. 2 광자 현미경 어두운 챔버 내부 안정화 동물 전송 및 2 P 이미징 창 렌즈 아래에 직접 배치. 이미지 창으로 렌즈를 신중 하 게 낮은.</li>
</ol>
5. 첫 번째 형광 염료 및 초기 이미징의 주입
<ol>
	<li>0.5 mL Rhodamine B isothiocyanate-Dextran의 준비 (4 mg/mL 평균 분자량 ~ 70kDa) 염 분에. 솔루션 1 mL의 멸 균 주사기를 이전에 설치한 카 테 터에 주사기를 연결. 
	참고: 형광 염료 솔루션을 준비 하 고 전에 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>주사기를 매우 느리게 우울 하 여 첫 번째 염료를 주사 (그림 3B). 먼저, 관심의 영역을 식별 하는 접 안 렌즈를 사용 합니다. 충전 결합된 장치 (CCD) 카메라를 사용 하 여 랜드마크 이미지와 낮은 확대율에서 표면 혈관 패턴의 밝은 필드 이미지를 얻으려고. 전환 하 레이저 스캐닝 모드와 다음 두 이미지를 수집 하기 위한 소프트웨어 이미징 2p를 열고 고 라인 스캔 데이터.</li>
	<li>Fluorophores 군데 조직에 있는 사용에 맞게 적절 한 2 P 레이저 여기 파장, 전력 및 형광 채널 (첫 번째 염료 빨강 채널)을 선택 하 고 vivo에서 화상 진 찰 (그림 3E)를 수행. 전체 과정에서 열 패드에 동물 유지.</li>
</ol>
6. C7 Contusive 부상 리사 장치를 사용 하 여
<ol>
	<li>C7 중간 타 박상 부상 이전 설립된 프로토콜25,26에 따르면 루이빌 부상 시스템 장치 (리사) 장치를 사용 하 여 수행 합니다.<ol>
		<li>간단히, 다음 보정 리사 무대에 동물을 배치 합니다.</li></ol></li></ol>0 포인트 설정을 선택 하 고 조직 조정 후 변위 (이 경우 0.800 m m), 소프트웨어 충돌 릴리스를 실행 하 고 부상을 만들의 "실험 실행" 버튼을 클릭 합니다.
		<li>부상, 후 식 염 수에 젖은 gelfoam moisturized 유지 하 노출된 dura mater 위에 다른 작은 조각을 놓습니다.</li>
	
	
	<li>4.3 단계를 반복 하 고 다시 수행 vivo에서 화상 진 찰 이전 주입된 붉은 염료와 표시 같은 지역에 (그림 3C &#38; F).</li>
	<li>동물 다시 수술 테이블에 전송 하 고 동물 IACUC IUSM 프로토콜에 따라 적절 한 마 취와 진정을 유지.</li>

7. 두 번째 형광 염료 주입 후 부상 영상
<ol>
	<li>염 분에 Fluorescein isothiocyanate-dextran (4 mg/mL, 평균 분자량 ~ 70 kDa) 0.5 mL를 준비 5.1에서 동일한. 1 mL의 멸 균 주사기에서 솔루션을 작성 하 고 이전에 설치 된 카 테 터와 연결.</li>
	<li>2 P 현미경 어두운 챔버 내부 안정화 동물 다시 전송 하 고 다시 첫 번째 염료에 대 한 빨강 채널와 두 번째 염료에 대 한 녹색 채널 같은 지역 이미지 (3D 인물 &#38; G).</li>
	<li>영상의 마지막에 척추 안정화 장치에서 쥐 놓고 천 벽 청소.</li>
</ol>
8. 동물 희생
<ol>
	<li>이미징, 후 transcardial 관류 프로토콜27다음 쥐를 희생. 척수 샘플을 수집 하 고 4%에 그들을 수정 PFA.</li>
</ol>
9. 오프 라인 데이터 분석: 혈관 직경의 정량화
<ol>
	<li>오프 라인 분석에 대 한 워크스테이션에 이미지 파일을 전송.</li>
	<li>ImageJ 고 "파일"을 선택 하 고 이전 저장 된 원시 데이터 선택 열고 연관 된 단일 이미지 파일 (그림 4B).</li>
	<li>"분석" "비율 설정" (그림 4C) 다음을 선택 하 여 이미지를 보정. "픽셀에서 거리"에 배치 하는 값은 그림 4A에 표시 하는 수식을 사용 하 여 계산 됩니다. 2 광자 광 렌즈의 교정 방정식에 기본 값을 결정합니다. "OpticalZoom"의 값은 Excel 확장 태그 Languagefile (XML 파일) 단일 이미지 파일 (그림 4B)와 관련 된에서 발견 된다.</li>
	<li>혈관의 긴 축에 수직인 선 그리기 (그림 4D1 &#38; E1)와 "분석" 뒤에 "측정"을 선택 하십시오. 혈관 직경의 측정 결과 창에 표시 됩니다 (그림 4D2 &#38; E2). 평균 값을 얻으려고 선박에서 3 회를 반복 한다.</li>
</ol>
10. 오프 라인 데이터 분석: 빨간 혈액의 정량화 셀 (RBC) 속도
<ol>
	<li>분석을 위한 워크스테이션을 라인 스캔 파일을 전송.</li>
	<li>ImageJ 소프트웨어 시작 고 "파일"을 선택 하 고 이전 저장 된 원시 데이터 선택한 확장 이름 ".ome"와 모든 연결 된 라인-스캔 파일을 열.</li>
	<li>"이미지"를 열고 "스택" 뒤에 "스택 이미지"를 선택 합니다. 단일 이미지 스택 TIFF 파일로 모든 오메 파일을 변환 합니다.</li>
	<li>Matlab 소프트웨어를 시작 하 고 "열기"를 클릭 합니다, 그리고 "LSPIV_parallel.m" 코드 파일을 선택 합니다. 참고: LS-PIV를 위한 Matlab 코드 https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18 에서 다운로드 될 수 있다</li>
	<li>다음 주문을 선택: "실행" &#62; "폴더 변경" &#62; "동맥". 10.3에서 생성 된 이미지 스택 TIFF 파일을 선택 합니다.</li>
	<li>"Y"를 입력 하 고 Enter 키를 누릅니다.</li>
	<li>커서를 왼쪽 및 오른쪽 이미지의 각각, 그리고 프로그램 데이터 처리 하기 시작.</li>
	<li>프로그램의 끝에, 최종 읽기 계산을 2 값을 입력: "pixel_meter 변환 값", 그리고 "스캔 시간 변환 값". 둘 다 라인 스캔 데이터와 관련 된 XML 파일에서 찾을 수 있습니다. 최종 값으로 평균 및 표준 편차 (mm/s) 당 밀리미터의 단위로 속도의 표시 됩니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>National Spinal Cord Injury Statistical Center. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+Cord+Injury+Facts+and+Figures+at+a+Glance.">Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance.</a> SCI Data Sheet 2016. , (2016).</li><li>Dumont, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+spinal+cord+injury,+part+I:+pathophysiologic+mechanisms.">Acute spinal cord injury, part I: pathophysiologic mechanisms.</a> Clin Neuropharmacol. 24 (5), 254-264 (2001).</li><li>Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. 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Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling.">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).</li></ol>

저자는 공개 없다.

과학 다음 혈관 연구에 대 한 하나의 도전 전통적인 기법 혈관 구조 변화 사후 샘플에 크게 제한 하기 때문에 기술적 제한입니다. 이 소설 에서 vivo imaging 위에서 설명한 방법을 혈액 흐름과 관련된 매개 변수 (속도 및 선박 직경) 살아있는 쥐에서 2 P-LSM을 사용 하 여 동적 측정을 수 있습니다. 그것은 또한 contusive 영향은 다음 다른 시간 지점에서 혈관의 동일한 세트에 반복된 검사 수 있습니다. 이전 2 광자 현미경 이미징 기술을 단일 추적 프로그램의 누설 때문 후 외상 혈관 구조를 포착 하지 못했습니다. 우리의 듀오 컬러 디자인 충격적인 모델에 대 한 동적 혈관 이미징이 있습니다. 또한,이 방법의 유연성 급성 혈관 변화 영향은 다음의 임시 공간 프로 파일을 생성 하는 기회를 제공 한다
우리의 에 비보 듀오 컬러 이미징 방법에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 시간 경과 영상, 특히 호흡 모션 아티팩트를 줄일 전에 척수의 물리적 안정성을 보장 하기 위해 기본적 이다. 우리 설계 안정화 동안 척추 척추의 높이 약간 인상 척추 클램프의 모양. 따라서 호흡 동물을 연관 척수의 운동 수 크게 감소 (그림 1D-F, 2B). 이미징 각 세션의 시작 전에 척수의 안정성을 확인 하는 것이 좋습니다. 척수 안정성을 달성 하지 못하면 조정 정렬 및 척수 클램프의 견고 하 여야 한다. 둘째, 주변 조직 (뼈, 근육 층 및 피부) 이미징 창으로 출혈 보기의 오염 위험 수 있습니다. 부드러운 이미지 세션에 대 한 효과적인 예방에 대 한 주변 조직에 gelfoam 조직 접착제 접착제를 적용 합니다. 셋째, 우리가 선택 하는 형광 염료로 알 부 민 (66 kDa), 주요 높은 분자량의 혈장 단백질은 비슷한 크기를 있다. 조건 하에서 항상성, 염료 민28유사한 선박 내부 크게 유지 했다. 부상 후 염료 방해 내 피 구조를 통해 전달 하 고 맥 관 구조 (그림 3 층-G)의 주변 지역에서 형광 강도 중요 한 증가 일으키는 실질에 유출. 또한, 우리가 외부 경 정 맥 도관 법을 선택 하는 이유는 두 가지 이유가 있다. 첫째, 그것은 언제 든 지 실험의 배달의 일관 되 게 액세스할 수 있는 경로 제공할 수 있습니다. 둘째, 그것은 미래의 치료 주사에 대 한 경로로 사용할 수 있습니다.
비록 우리의 vivo에서 듀오 컬러 방법 외상 성 혈관 이미징 연구에 대 한 새로운 장소를 제공할 수 있게,이 기술에 대해 약간의 경고를 해결 합니다. 현재,이 기술은 2 시간 포인트 (기준선 및 1 시간 후 포인트)에서 혈관 변화를 평가 하기 위해 설계 되었습니다 하지만 추가 형광 염료와 채널 사용할 수 있는 경우 여러 시간 포인트 전환 가능. 비록 만성 intravital 이미징 이식된 유리 창을 사용 하 여 여러 연구, 외상 성 부상19,,2930, 후 동일한 선박에 초기 계획 정보 제공할 수 있습니다 그들 중 누구도 31,32. 이러한 연구와 달리 우리의 창 없는 유리 창이입니다. 이것은 사전 및 사후 부상 이미징, 편리 하지만 장기 관찰에 대 한 창 재건에 대 한 도전 수 있습니다. 우리의 미래 연구는 만성 이미징 기술 향상에 노력 하고있다. 혈관 시스템은 여러 선박 종류 (동맥, 정 맥 및 모 세관)로 구성 되며 각 형태와 기능의 측면에서 다른. 영상 중 선박 종류 중에서 차별화는 애타게 혈관 변화의 명확한 패턴을 도울 수 있었다. 위의 프로토콜 형태 및 속도;에 따라 선박을 식별 하는 관찰자에 따라 달라 집니다. 그러나, 동맥 특정 염료 선박 종류33사이 더 명확한 분류 줄을 쉽게 추가할 수 있습니다.
이 기술은 contusive에 평가 제한 및 다른 충격 모델, 호감의 부상과 방사선 상해 뿐만 아니라 하지만에 BSCB의 초점을 맞추고, 뿐만 아니라 혈관 침투성 변경. 스키, 외 루 경화 증 (ALS), 다 발성 경화 증 (MS) 등 다른 신경 퇴행 성 질환에 따라 혈관 변화를 공부 하 사용 될 수 있습니다. 또한, 동적 neurovascular 상호 작용을 공부 하는 유전자 변형 동물 모델에 양도 될 수 있습니다. 강력한 검사 도구로 서 미래 연구는 척수 부상에 대 한 치료의 효능을 평가 하기 위해 여기에 설명 된 이미징 기술을 활용 수 있습니다.
결론적으로, vivo에서 듀오 컬러 방법은 신뢰할 수 있는, 실시간 vivo에서 접근 도구는 시간적 공간적 혈관 프로필의 동적 혈관 변화를 평가 하 고 치료에 대 한 심사 영향은 다음과 같은 2 차 피해를 줄이기 위해

외상 성 척수 상해 (SCI) 모터, 감각, 및 자치 기능의 손상으로 이어지는 일반적인 상해가 이다. 에 따르면는 국립 척수 부상 통계 센터 (NSCISC) 2016 년에, 약 282000 명 동안 그들의 69% 교통 사고 때문에 주로 영향을 받은 또는1폭포. 이러한 환자는 종종 인텐시브 케어; 필요 그러나, 효과적인 치료는 현재 사용할 수 있습니다. 따라서, 과학으로 새로운 효과적인 전략 시급히 필요 합니다.
과학은 주로 두 개의 단계로 분할 된다: 기본 부상과 2 차 부상. 영향2, 염증, 세포 apoptosis, 점차적으로 이어질 나머지 축 삭의 demyelination 등 보조 부상 사건의 연속에 의해 다음의 사이트에서 출혈 성 괴 사를 일으키는 물리적 모욕을 구성 하는 주요 부상 에 형태학 상과 기능적인 적자3,4,,56의 확장. 출혈 부상, SCI7,8의 급성 단계에서 즉각적인 혈관 장애를 나타내는의 첫번째 보이는 표시 이다. 초기 혈관 손상을 줄이기 위한 신경 보호 전략 환자의 회복을 향상 시킬 수 있습니다 하지만이 사건의 초기 포스트 상해는 혈관 병 태 생리 메커니즘의 더 나은 이해.
이전 연구는 척수 맥 관 구조 공부를 다양 한 방법을 사용 하 여에 불구 하 고 중요 한 한계는 남아 있다. 예를 들어 수소 클리어런스9, autoradiography10, microangiogram8, 관 부식 캐스트11및 immunohistochemistry12, 사후 샘플만을 공부 하는 가장 공유 단점 ,13. 레이저 도플러 Flowmetry 척수 혈액 흐름14의 비 침범 성 실시간 모니터링을 제공, 하지만 그것은 혈관 시스템을 구별 하 여 혈관 형태학 상 변화를 감지 수 없습니다. 동적 대비 강화 된 MRI (DCE-MRI) 또한 비 침범 성, 하지만 그것은 저해상도 이미지를 생성 하 고 비싼 인프라15요구.
Vivo에서 2 광자를 사용 하 여 이미징 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (2 P-LSM) 피 질16,,1718에 vasodynamics 공부에 대 한 개발 되었습니다, 그리고 연구의 제한 된 수 있다 두 가지 이유로 더 도전 contusive 부상 후 시연된 혈관 변화 영향은 탕 외. 다음 hemisection 모델19, 그러나 영상에서 병 변 사이트의 가장자리에 혈액의 흐름에 변화를 보여왔다. 첫째, 전통적인 유리 광학 창 부상 사이트 것 하지 기계적 영향을 유지 하 고 이미징 기능 유지. 둘째, 누설으로 인해 실질에 추적의 출혈 후 부상 영상과 어려움을 만듭니다.
여기 우리가 영상 사전 및 사후 부상 시간 지점에서 동일한 개별 선박 수 소설 듀오 컬러 이미징 방법 제시. 또한, 그것은 contusive 문화에 따라 혈관 동적 변화의 시간적 공간 프로 파일 제공 또한 여러 후 시간 점에서 이미징에 대 한 가능성이 있다. 이 프로토콜은 혈관의 상호 작용을 공부 하는 유전자 변형 동물에 직접 적용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1049">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Purdue Products Betadine Surgical Scrub</td>
			<td style="width:351px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-027132</td>
			<td style="width:288px;">Skin sterilization</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:292px;">Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg)</td>
			<td style="width:351px;">Patterson Veterinary&#160;</td>
			<td style="width:119px;">07-881-9413, 07-890-5745</td>
			<td>Anesthetic agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buprenorphine(0.03 mg/mL)&#160;</td>
			<td>Patterson Veterinary&#160;</td>
			<td style="width:119px;">07-891-9756</td>
			<td>Pain relief agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carprofen</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:119px;">07-844-7425</td>
			<td>Non-steroidal anti-inflammatory drug</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dukal Gauze Sponges&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-415-490</td>
			<td>Skin sterilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Decon Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">04-355-450</td>
			<td>Skin sterilization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Artificial Tears Eye Ointment</td>
			<td>Webster Veterinary</td>
			<td style="width:119px;">07-870-5261&#160;</td>
			<td>Prevent drying eyes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>1006015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Rhodamine B isothiocyanate&#8211;Dextran</td>
			<td style="width:351px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R9379</td>
			<td>Average mol wt 70kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Fluorescein isothiocyanate&#8211;dextran</td>
			<td style="width:351px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">46945</td>
			<td>Average mol wt 70kDa</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Instrument Sterilizer</td>
			<td style="width:351px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">18000-50</td>
			<td style="width:288px;">for sterilizing surgery tool</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:292px;">Spine stabilizer set</td>
			<td style="width:351px;">Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:288px;">Contact Y. Ping Zhang for details. 
			(yipingzhang50@gmail.com)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Vetbond</td>
			<td style="width:351px;">3M Animal Care Products</td>
			<td style="width:119px;">1469SB</td>
			<td>Tissue adhesive Glue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Gelfoam</td>
			<td style="width:351px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">9083300</td>
			<td>Stop bleeding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Noyes Spring Scissors</td>
			<td style="width:351px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">15013-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Fine Forceps- Dumont #5</td>
			<td style="width:351px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Rongeur</td>
			<td style="width:351px;">Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td>laminectomy</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Surgical Retractor</td>
			<td style="width:351px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">17005-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Scalpel</td>
			<td style="width:351px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">10003-12&#160;</td>
			<td>skin cut</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Scalpel Blade #15</td>
			<td style="width:351px;">Royal-Tek</td>
			<td style="width:119px;">BS2982</td>
			<td>skin cut</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">micro angled scissors</td>
			<td style="width:351px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">500260</td>
			<td>Can be from any vendor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">3-0 vicryl sutures</td>
			<td style="width:351px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">J393H</td>
			<td>Can be from any vendor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">1ml syringe</td>
			<td style="width:351px;">Henke Sass Wolf</td>
			<td style="width:119px;">4010.200.V0</td>
			<td>Can be from any vendor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">21 gauge needle</td>
			<td style="width:351px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305165</td>
			<td>Can be from any vendor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Agar</td>
			<td style="width:351px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1296</td>
			<td>Can be from any vendor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Two-photon Laser Scanning Microscope</td>
			<td style="width:351px;">Bruker Fluorescence Microscopy</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:292px;">LISA device</td>
			<td style="width:351px;">Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:288px;">Contact Y. Ping Zhang for details. 
			(yipingzhang50@gmail.com)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:351px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">HCImage Live</td>
			<td style="width:351px;">Hamamatsu Corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">PrairieView</td>
			<td style="width:351px;">Prairie Technologies/Bruker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Two-photon imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">ImageJ</td>
			<td style="width:351px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:292px;">Matlab statistics toolbox</td>
			<td style="width:351px;">The MathWorks, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle</td>
			<td style="width:288px;">Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo duo-color method for imaging vascular dynamics following contusive spinal cord injury

척수 상해 (SCI) 상해의 사이트에 중요 한 혈관 장애를 발생합니다. 혈관 병 리 과학 후 즉시 발생 하 고 급성 부상 단계에 걸쳐 계속 됩니다. 사실, 내 피 세포 contusive 문화 후에 먼저 표시 혈액 척수 장벽 (BSCB)의 증가 된 침투성을 포함 한 초기 혈관 이벤트 vasogenic 부 종 유발 하 고 복잡 한 부상 메커니즘에 의해 발생 하는 해로운 2 차 부상 이벤트에 기여. 혈관 장애를 대상으로 따라서, 수 과학 후 조직학 및 기능 장애에 기여 하는 보조 부상 계곡을 줄이기 위해 핵심 전략 이전 연구와 사후 샘플에 수행 주로 했다 혈관 네트워크의 동적 변화를 포착 하지 못했습니다. 이 연구는 vivo에서 듀오 컬러 2 광자 이미징 메서드를 contusive 문화에 따라 급성 혈관 동적 변경 내용을 모니터링 개발 했습니다. 이 방법은 혈액 흐름, 혈관 직경, 및 사전 및 사후 부상 같은 쥐의 다양 한 사이트에서 다른 혈관 병 리 수 있습니다. 전반적으로,이 방법은 혈관 역학 조사에 대 한 훌륭한 장소를 제공 합니다.

방법은 변화를 모니터링 vivo에서 동적 척추 혈관 개별 선박 수 사전 및 포스트 외상 성 문화 첫째, 카 테 터는 후속 형광 염료 주사 (그림 1A-C, 그림 3)에 대 한 액세스 권한을 제공 하려면 외부 경 정 맥을 통해 설치 됩니다. 두 번째 단계에서 전문된 기구는 노출된 C5-C7 (그림 1D-F, 그림 2A-B)를 안정화 하는 데 사용 됩니다. 이 안정화 단계 호흡 아티팩트를 제거 하 고 꾸준한 이미지를 제공할 수 있습니다. (그림 2C) laminectomy, 다음 다음 단계 2 P C5-C7 (그림 2D-F)을 통해 창 이미징의 설치입니다. 주변 조직 척추 영상 창의 주위 출혈을 최소화 하는 것이 성공적인 혈관 이미징에 대 한 중요 합니다. 다음 단계 (그림 3A-B, E) 기준으로 rhodamine dextran 형광 염료 (빨간색) 랜드마크 지도 혈관 네트워크를 언급 한 카 테 터를 통해 주입 하는. C7 중간 중간 심각도 contusive 부상, 후 원하는 후 시간 포인트에서 도입 FITC-dextran (녹색) (그림 3A &#38; D). 듀오-색 방법의 아름다움은 한 여전히 첫 번째 염료는 이미 부상 (그림 3G)으로 인해 실질으로 밖으로 유출 하는 경우 두 번째 염료를 사용 하 여 혈관 구조를 검색할 수 있습니다.
이미징 세션 동안 그것은 마 취 유도 후 몸 핵심 온도 유지 하는 생리대에 동물을 유지 하는 것이 좋습니다.
우리의 듀오 컬러 메서드를 사용 하 여 개별 혈관의 직경 및 적혈구 속도 (RBC 속도) 측정 되 고 계산. 직경, 하나 ImageJ 교정 (그림 4) 후 3 반복에 그것의 최대 직경에 선박을 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 속도, 라인 스캔 이미지 RBC 속도 (그림 5)18계산 Matlab 프로그램 (MATLAB R2013a)를 사용 하 여 측정 됩니다. 형태학, 혈액 흐름 속도, 및 혈관 직경에 따라, 혈관으로 분류할 수 있습니다 2 카테고리: 동맥과 정 맥 (표 1 참조).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig1.jpg"> 
그림 1 . 경 정 맥 도관 법 및 척추 안정화 (A) 외부 경 정 맥을 찾기 위한 그리기 회로도. (B) 21-게이지 바늘에서 만든 특수 카 테 터. 팁 지상 평평 하 고 다른 21-게이지 바늘에서 잘라 2 밀리미터 팁의 조각으로 용접 했다. (C)는 회로도 도관 법의. 선단부는 근 위 카 테 터 안정화, 혈관 (혈관 결 찰, 파란색 화살표) 함께 바늘을 고정으로 끝나는 다음 먼저, 출혈입니다. (D) 수정된 척추 안정제의 이미지. C5-C7 창 laminectomy (E) 이전 및 laminectomy contusive 문화 (F) 후 표시 됩니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56565/56565fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig2.jpg"> 
그림 2 . 광 창 설치 단계별 회로도입니다. ( A) 1 단계: 절단 피부와 중간 선 따라 근육에 의해 척추를 노출. (B) 2 단계: 척추 안정화. (C) 3 단계: laminectomy. (D) 4 단계: 식 염 수에 젖은 gelfoam의 조각을 배치 하 여 척수의 수 분을 유지. 5 단계 (E) : 살 균 gelfoam와 vetbond 간격 물개. 건조 후, 한 천 벽의 레이어 창의 가장자리에 만들어집니다. (F) 6 단계: 이미지에 대 한 준비, 이미징 창 2 P 내부 gelfoam 및 장소 침수 액체 제거. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56565/56565fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig3.jpg"> 
그림 3 . vivo에서 듀오 컬러 방법 절차 단계별. 5 단계 (A)모든 절차에 의하여 이루어져 있다. 다음 1 단계와 2 단계, 대략 70의 크기와 한 쌍 dextran 추적기의 KDa는 (전에 척수 맥 관 구조를 시퀀스에 주입 하는B 와 C) contusive 문화 (D)후. (E)-(G) 대표 2 P 이미지-단계 5 단계 3에서 척수 맥 관 구조를 표시. 흰색 화살표 영역 (F 및 G)를 새 첫 번째 파 붉은 염료를 가리킨, 청록색 화살촉 표시 두 번째-파도 녹색 염료 누설 (G). 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56565/56565fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig4.jpg"> 
그림 4 . 수집 및 척추 혈관 직경의 정량화 준비, 다음 단일 이미지 파일 보정된 값 (B)의 XML 파일과 함께 2 P 현미경 아래 획득 됩니다. (A) 방정식 표시 "픽셀의 미크론 당" 광학 확대/축소 값에 따라 계산이 됩니다. ImageJ (C)에서 교정, 후 선박 직경 전에 경도 축을 3 지점에서 측정 된다 (D1) 후 (E1) 부상. (D2) 및 (E2) 측정된 값을 표시. (F) 기준선과 30 분 후 상해에서 혈관 직경의 정량화. 눈금 막대 = 50 µ m. 데이터 표시 됩니다 ± SD, 의미 * * * p &#60; 0.0001, 양측 쌍체 t 검정.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56565/56565fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig5.jpg"> 
그림 5 . 수집 및 척추 배 속도의 정량화 라인 스캔 이미지 파일은 단일 선박 속도 계산 하기 위해 2 P 현미경 아래 획득 됩니다. (A)는 선택한 용기와 혈관 RBC 속도 평가 하는 방법의 예입니다. (B) 라인 스캔 이미지와 속도의 계산에 대 한 해당 플롯 파일의 동맥 예 뿐 아니라 정 맥 (C)의 예. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56565/56565fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>동맥</td>
			<td>정 맥</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>형태학</td>
			<td>직선, 부드러운, 두꺼운 혈관 벽</td>
			<td>분기, 거친 가장자리</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>혈액 흐름 속도</td>
			<td>빠른</td>
			<td>천천히 하지만이 다릅니다.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>직경</td>
			<td>30-80 µ m</td>
			<td>100-250 µ m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 기준 선박 유형 식별

Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury at JoVE.com

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

에 비보 듀오 컬러 이미징 혈관 역학 Contusive 척수 상해를 따르는 방법

우리는 vivo에서 이미징 방법 성인 Sprague-Dawley 쥐에 contusive 척수 상해 다음 동적 척추 혈관 변화 추적 하기 위한 두 개의 서로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 소개 합니다.

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

9.4K 조회수.  Indiana University School of Medicine. 우리는 vivo에서 이미징 방법 성인 Sprague-Dawley 쥐에 contusive 척수 상해 다음 동적 척추 혈관 변화 추적 하기 위한 두 개의 서로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 소개 합니다.

비디오: An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

연구

신경과학

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

측면 유체 타악기 : 마우스의 외상성 뇌 손상 모델

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 척수의 영상

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

쥐 자궁 경부 척수에 확산 이미징

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

척수와 디딜 방 아에 활동 기반 교육 부상 Wistar 쥐

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, such as cell transplantation methods, are being researched to overcome the debilitating disabilities arising from SCI. Most pre-clinical animal trials are conducted in rodent models of SCI. While rat models of SCI have been widely used, mouse models have received less attention, even though mouse models can have significant advantages over rat models. The small size of mice equates to lower animal maintenance costs than for rats, and the availability of numerous transgenic mouse models is advantageous for many types of studies. Inducing repeatable and precise injury in the animals is the primary challenge for SCI research, which in small rodents requires high-precision surgery. The transection-type injury model has been a commonly used injury model over the last decade for transplantation-based therapeutic research, however a standardized method for inducing a complete transection-type injury in mice does not exist. We have developed a surgical protocol for inducing a complete transection type injury in C57BL/6 mice at thoracic vertebral level 10 (T10). The procedure uses a small tip drill instead of rongeurs to precisely remove the lamina, after which a thin blade with rounded cutting edge is used to induce the spinal cord transection. This method leads to reproducible transection-type injury in small rodents with minimal collateral muscle and bone damage and therefore minimizes confounding factors, specifically where behavioral functional outcomes are analyzed.

This protocol describes how to create a precise laminectomy for induction of stable transection-type spinal cord injury in the mouse model, with minimal collateral damage for spinal cord injury research.

마우스에서 완전한 Transection 형 척수 손상의 유도

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...