우리 산드라 북 아 일 Manosalvas-Kjono, 푸 림 Ladpli 감사, 장치 설계 및 돌연변이 동물의 세대에서 파라 Memon, Divya Gopisetty, 및 베로니카 산체스에 대 한 지원. 이 연구는 지원 했다 NIH 교부 금 R01EB006745 (BLP)에, (에 MBG) R01NS092099, K99NS089942 (MK)를, (ALN)에 F31NS100318 및 받은 자금 유럽 연합의 지평선 2020 연구 및 혁신 유럽 연구 회의 (ERC)에서 프로그램 ( 부여 계약 번호 715243 MK).

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저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서는 미세 칩에 갇혀 거 위 피부에 정확한 기계적 자극을 제공 하는 방법을 보여 줍니다. 그것은 생물학 질문에 응답 하기 위한 물리적 자극의 통합을 촉진 하기 위한 것입니다 그리고 생물학 실험실에서 mechanobiology 연구를 합리화 하는 것을 목표로. 이 메서드는 C. 선 충에 mechanosensory 신경의 기능을 평가 하기 위해 이전 분석을 확장 합니다. 이전 양적 및 반 정량적 기법 힘1,34 및 동작35, 측정 하지만 신경 활동의 고해상도 이미지와 통합 하기 어려웠다. 우리는 따라서이 칩의 사용은 현재 응용 프로그램을 확장 하 고 부드러운 터치에 필요한 신경의 자극에 대 한 성능을 최적화 믿습니다. 우리는 거의 최대한 신경 응답에 도달 하는 충분히 강한 자극에 도달 5 µ m, 액추에이터의 편향 최적화. 약간의 변화, 우리는이 디자인 몸 표면36자극 PVD nociceptors 같은 거친 터치 수용 체를 자극 하는 데 사용 될 수 믿습니다.
수정 및 문제 해결 없는 클린 룸 수 8 석판에 사용할 수 있는 경우에, 벤치탑 깨끗 한 상자 또는 SU-8 소프트 리소 그래피 역과 UV 램프, 프로그래밍 가능한 핫 플레이트, 스핀 coaters 사용할 수 있습니다. 미세 클린 룸 시설 사용을 방지 하는 장치 수의 생산에 대 한 저비용 대안 뒤26.
디자인에서 우리는 기존 트래핑 기법, 미세 채널에서 하나의 동물을 움직이게 구현. 함정 디자인은 웜36에서 후 각 감각을 공부 하는 데 사용 되는 장치에서 적응 하지만 웜 운동을 억제 가능한 유일한 선택은 아닙니다. 다른 전략 미세 장치에서 벌레를 잡아 보고 되었습니다: CO2전기 이동, 및 압축 immobilization11,,3738 사용 되 고 통합 될 수을 수정 디자인입니다.
우리는 상용, 압 전 압력 펌프를 사용 하 여 제어할 수 있는 외부 압력 소스에서 최대 800 kPa를 제공 작동 채널에 압력을 전달. 우리는 ~ 450 kPa를 제공 수 있는 연구 건물, 압축 공기에 펌프를 연결. 압축 공기의 아무 소스를 사용할 수 있는 경우 (예를 들어, N2) 압축된, 불활성 가스의 탱크를 사용 수 있습니다. 이 더 높은 압력을 제공 하 고 큰 개 악, 생성의 추가 혜택을 가질 것 이다 하지만 또한 칩에 압력 컨트롤러에 연결 하는 고압 피팅 필요. 부드럽게 PDMS에서 칩을 날조 증가 압력 유도 개 대체 방법입니다.
이 실험에서 압력 펌프의 출구 1 mm 받는 구멍 (예를 들어, 펀치 구멍)을 통해 언론 맞는 20 G 금속-튜브 PE에 삽입 구성 된 접착제와 양면 interconnectors와 연결 PDMS 칩에 연결 되어 튜빙. 이 700 kPa39까지 압력 저항을 보였다. 그러나 주의 해야 합니다 반복된 삽입 하는 동안, 구멍 주위 PDMS 눈물 따라서 성능이 제한 또는 칩을 사용할 수 없게 만드는 경향이 있다. 이러한 이유로, 금속 튜브 한 번 삽입 하 고 왼쪽 제거 하 고 반복적으로 그것을 삽입 하지 않고는 칩에 연결 했다.
중요 한 단계 자극은 피부를 들여쓰기 가압된 작동 채널에 의해 전달 됩니다. 결과 변형 및 mechanoreceptor 신경 활성화는 광학 형광 현미경 confocal 설정에 높은 해상도와 몇 군데 있습니다. 여러 가지 요인 GCaMP 응답의 탐지를 방해 수 있습니다. 첫째, 선 충 C. TRNs21,23, 파란색 조명 후 세포 활성화를 포함 하 여 많은 뉴런에 블루 빛 수용 체30 표현 (488 nm) 빛. 따라서, 이미징 C. 선 충 유전자 인코딩된 칼슘 센서 GCaMP6s를 사용 하 여 활성화할 것 이다 조명, 칼슘 과도23기계적 자극 의해 활성화를 왜곡 시 그것의 신경. 라이트-1 돌연변이 배경에서 작업 하거나 레드 이동 칼슘 활동 센서를 사용 하 여이 confound를 방지 합니다. 자극 프로필에는 몸의의 감도 일치 하지 않으면 두 번째, 기계적으로 유도 된 칼슘 과도 감지 되지 않을 수도 있습니다. 우리를 높은 진폭 단계 및 경사로, 활성화를 검색 하지 못했습니다 하지만 중간 역학 자극 (예를 들어, 200-kPa 버즈)으로 자극 후 매우 높은 신호를 불러 일으켰다. 마지막으로, 반복 된 자극에 TRNs habituate 짧은 배달 (< 60 s) interstimulus 간격. 따라서, 디자인 자극 시퀀스 요법이 니 공부 하 고 있는 경우에서를 제외 하 고 habituation 최소화 하는 것이 중요 하다.
파편과 먼지는 버퍼에서 쉽게 작은 트래핑 채널을 방해할 수 있습니다으로 모든 솔루션, 필터링 것이 좋습니다. 또한, 동물 나이 동기화 해야 하 고 칩의 디자인; 크기 일치 동물 젊은 성인 보다 작은 것 이다 장치를 통해 슬라이드 또는 구속 될 실패 및 큰 동물 트래핑 채널을 입력할 수 없습니다 붕괴 칩 막힘의 위험에. 막힘의 경우 웜 또는 중력 흐름 입구에 과도 한 압력의 적용 채널, 청소 수 있습니다 하지만 또한 피팅의 실패 이어질 수 있습니다.
결과 섹션에서 설명 했 듯이, 여러 가지 요인 분석 프로그램에 오류가 발생할 수 있습니다. 문제는 컴파일 코드에서 발생 하는 경우 확인 하는 가장 최근의 피지 소프트웨어가 실행 되 고 그 피지 최신 Java 컴파일러를 사용 하는 것이 좋습니다. 프로그램을 실행 하지만 예상 되는 경우 결과 확인 하십시오 실제 기계적 자극 기준선과 배경 형광의 적절 한 평가 보장 하기 위해 수행 하기 전에 기록된 영화는 50 프레임 버퍼. 또한, 보기의 필드 활동-종속 (GCaMP6s) 녹색과 빨간색의, 활동-독립 (tagRFP) 채널 각각 카메라 칩의 위와 더 낮은 반에 예상 간주 됩니다. 광 빔 스플리터 이미지 센서의 왼쪽 및 오른쪽 반 투영, 얻기 위해 녹음 하는 동안 원하는 방향 또는 사전 처리 단계에서 이미지 스택 회전 90 ° 카메라를 켜십시오. 또한, 프로그램의 형광에 의해 신경을 식별 하 고 신호 대 잡음 비율 또는 대비 너무 낮은 경우 실패 합니다. 이 경우에, 자극 강도 및 노출 시간 변경 문제를 해결할 수 있습니다. 신경에 경우 신경 위치 해야 시야의 센터에 새로운 수집을 시작 하기 전에 기록 하는 동안 보기 필드의 경우에 프로그램 중지 됩니다.
기술의 한계 현재의 디자인 PVD nociceptors TRNs, 그러나 벌레의 머리 지역, FLP, 화산재 등을 자극 몸의 하지 같은 몸 벽 mechanoreceptor 뉴런의 자극 수 있습니다. 그것은 압력 제한 < 700 kPa. 큰 압력에 대 한 다른 튜브 피팅 채택 될 필요가 있다. 압력 공급 여기 500 kPa을 초과 하지 않았다, 이후 최대 압력을 적용 하는 450 kPa에 국한 되었다. 칼슘 과도 여기 관찰 예상된 신호의 위쪽 경계를 표시 합니다. 우리의 액츄에이터의 설계를 위한 또 다른 한계는 그들의 가로 세로 비율. 원칙적으로, 얇은 격 막 것 큰 개 악, 있지만 높은 종횡비와 구조는 안정적으로 조작 하기가 어렵습니다. 큰 개는 필수, 경우 넓은 액추에이터 또는 양쪽 모두에서 병렬 변형 유용할 수 있습니다, 조 외 에 의해 발표로 29
우리 다이어 프 램 변형 모니터링할 수 있습니다, 비록 작동 채널의 공 압 자극 동안 적용 하는 힘을 측정 하기 어렵습니다. 원리 한계가 이다 액추에이터의 접촉 영역 잘 정의 되지 않습니다. 액추에이터 자체 이며 탄성 deforming 발동, 편향도 증가 함께 연락처 반지름을 변경 하는 동안 때문입니다. 마음에 이러한 경고와 더불어 우리는 5 µ m 들여쓰기 (빈 칩에 약 300 kPa 작동 압력) Petzold 외 의 웜 뻣 뻣 함 견적에 따르면 벌레에 약 3.8 µN을 적용할 전망 이다 예측할 수 있습니다. 그러나 신경 전류의 힘 의존 이후 34 다릅니다 다른 stiffnesses1,34, 벌레에서, 힘 대신 자극 강도의 측정 권장 들여쓰기를 모니터링.
우리는이 프로토콜의 배포 사용자 C. 선 충 을 사용 하 여 모델 시스템으로 하는 mechanobiology 연구에 대 한 마이크로의 활용 분야에서이 중요 한 주제에 따라서 과학의 발전을 가속 도움이 될 것입니다 바랍니다.

터치의 감각 동물을 그들의 환경에 대 한 중요 한 정보를 제공합니다. 적용 된 힘에 따라 터치 인식으로 무해 한, 즐거운, 또는 고통 스러운. 터치 하는 동안 조직 변형 전문된 mechanoreceptor 세포는 피부에 포함 된 가장 일반적으로 이온 채널, 수용 체 단백질을 표현 하 여 감지 됩니다. 터치와 고통 중에 이온 채널 활성화를 연결 하는 힘 인식 단계는 완전히 이해 되지 않는다. 심지어 어떻게 피부 조직을 기계적 변형 및 몸의 긴장에 있는 변화를 탐지 여부 필터 또는1,2,3스트레스에 대 한 알려져 있다. 이해에이 간격, 부분적으로, 세포 수준에서 응답을 관찰 하는 동안 정확한 기계적 stimulations 살아있는 동물의 피부 표면에 적용할 적당 한 도구의 부족에서 발생 합니다. 원자 힘 현미경 검사 법 사용 되었습니다 광범위 하 게 적용 하 고 격리 된 셀4,5 에 힘을 측정 하 고 또한 생활에 있는 Piezo1 수용 체를 활성화 하는 반면 세포6을 비슷한 실험 특히 살아있는 동물을 사용 하 여 C. 선 충, 악명 때문에 피사체의 본질적인 이동성 도전 되었습니다. 이 문제는 전통적으로 무력화 한 천 패드1,7,,89에 개별 동물을 동물 또는 외과-급 cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여 피할. 이 접근은 생산성, 되었지만 접착 및 기계적 규격에 소프트 한 표면에 의해 동원 정지에 필요한 기술에 관련 된 제한 사항에는. 마이크로 전략 gluing에 연결 하는 합병증 중 일부를 피할 수 있는 무료 대안 이다.
선 충 류 선 충 C. 완전히 매핑된 신 경계를, 동물의 크기 때문에 적합 한 마이크로 기술 유전자 모델 생물 이다. 마이크로-기반 장치 그렇지 않으면 매우 모바일 동물 고해상도 이미징 및 관련 modulatory 신경 자극의 전달을 수행 하는 동안 제 지 될 수 있는 이점 제공 합니다. 미세의 도움으로 기술, 동물 생활 해10,11, 전체 수명12,13 이상 행동 활동의 모니터링 및 고해상도 없이 움직일 수 있습니다. 신경 활동14,15,,1617의 이미지입니다. 또한, 통증의 감각 그들의 생리1,8, 기계4,,1819, 특징 수에 필요한 많은 mechanoreceptor 신경 세포 및 분자 레벨20,,2122.
C. 선 충 6 TRNs, 동물의 앞쪽 (ALML/R 및 AVM) 중 3 개는 자극과 중 3 개는 동물의 후부 (PLML/R와 PVM) 자극을 사용 하 여 그것의 몸 벽에 부드러운 기계적 자극을 감지 합니다. 생 화 확 적인 신호에는 적용 된 힘을 시험에 필요한 이온 채널 분자는 그것의 TRNs8에 광범위 하 게 연구 되었습니다. 이 문서에서는 고정된 C. 선 충 의 피부에 정확한 기계적인 힘을 적용 하는 연구원을 가능 하 게 한 미세 플랫폼23 제공 광학 이미징에 의해 그것의 내부 조직 변형 밖으로 읽는 동안 거 위. 잘 정의 된 기계적 자극을 제시 하는 것 외에도 칼슘 과도 subcellular 해상도 mechanoreceptor 뉴런에 기록 된 고 형태학 및 해 부 기능 연관 될 수 있습니다. 하나의 동물을 보유 하 고 (그림 1 및 그림 2) 6 공 압 작동 채널 옆의 피부를 선물 하는 중앙 트래핑 채널 장치에 의하여 이루어져 있다. 6 채널 각 벌레의 6 TRNs의 기계적 자극을 제공 하는 트래핑 채널에 따라 배치 됩니다. 이러한 채널 트래핑 상공에서 외부 공기 압력 소스 (그림 1)에 의해 구동 될 수 있다 얇은 PDMS 격 막에 의해 구분 됩니다. 우리는 압력에 대해 편향 보정 하 고이 문서에 측정을 제공. 각 액추에이터 개별적으로 해결 하 고 선택의 mechanoreceptor 자극 하는 데 사용 될 수 있습니다. 압 전 구동 압력 펌프를 사용 하 여 압력을 전달 하지만 어떤 다른 장치를 사용할 수 있습니다. 우리 TRNs에서 vivo에서 활성화 하 고 운영 기기 성인 C. 선 충에 기계적 자극을 제공, 장치에 성인 동물을 로드, 칼슘 이미징 수행 입증 하 압력 프로토콜을 사용할 수 있음을 보여합니다 실험, 그리고 결과 분석입니다. 장치 제조 두 가지 주요 단계로 구성 됩니다: 1) 수-8;에서 금형을 만들기 위해 사진 평판 그리고 2) PDMS 장치를 만들기 위해 성형. 간결성, 명확성을 위해 독자 이전 게시 된 기사와 프로토콜24,25 금형 및 장치를 생산 하는 방법에 대 한 지침은 이라고 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chrome mask</td>
			<td>Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;&#39;, designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chrome mask</td>
			<td>Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;&#39;, designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chrome mask</td>
			<td>Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;&#39;, designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;&#39; Silicon wafer (B-test)</td>
			<td>Stanford Nanofabrication Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2002</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-coater</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exposure timer</td>
			<td>Optical Associates, Inc</td>
			<td>OAI 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination controller</td>
			<td>Optical Associates, Inc</td>
			<td>2105C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A426F-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloromethylsilane (TCMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92361-500ML</td>
			<td>Caution: TCMS is toxic and water-reactive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>PDMS prepolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch, 1 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Plasma Asher</td>
			<td>Branson/IPC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW</td>
			<td>New England Small Tube Corporation</td>
			<td>NE-1300-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene syringe filter, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>725-2520</td>
			<td>to filter all solution, small particles would clog the chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID</td>
			<td>Solomon Scientific</td>
			<td>BPE-T50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 ml</td>
			<td>BD Scientific</td>
			<td>309628</td>
			<td>for worm trapping and release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 20 ml</td>
			<td>BD Scientific</td>
			<td>309661</td>
			<td>for gravity-based flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>to suck solutions and worms out of the chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic flow controller, equipped with 0&#8211;800 kPa pressure channel</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3</td>
			<td>pressure delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5195 T52</td>
			<td>connection from house air to pressure pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5195 T51</td>
			<td>connect pressure pump to small tubng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push-to-Connect Tube Fitting for Air</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5111K468</td>
			<td>metric - imperial converter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Connector for 6 mm &#215; 1/4&#8243; Tube OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5779 K258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMI 4000 B microscopy system</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63&#215;/1.32 NA HCX PL APO oil objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lumencor Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td></td>
			<td>With cyan and green/yellow light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation beam splitter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>59022bs</td>
			<td>in the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission beam splitter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T570lpxr</td>
			<td>in the image splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filters GCamp6s</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET525/50m</td>
			<td>in the image splitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filters mCherry</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET632/60m</td>
			<td>in the image splitter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of c. elegans

Mechanobiology의 한 중앙 목표 단백질 및 세포에 기계적 스트레스의 상호 효과 이해 하는 것입니다. 그 중요성에도 불구 하 고 세포질 기능에 기계적 스트레스의 영향이 아직도 제대로 이해 된다. 몇 가지 도구를 사용 하면 조직과 세포의 동시 변형, 생체, 세포 활동의 이미지와 달리 매우 모바일 모형 유기 체, 선 충 류 등 운동 성의 효율적 제한 때문에이 기술 격차 존재 하는 부분에서 꼬마 선 충. C. 선 충 의 작은 크기에 게 그들 훌륭한 일치 하는 마이크로-기반 연구 장치, 그리고 동원 정지에 대 한 솔루션 제시 된 미세 장치를 사용 하 여. 이 장치 고해상도 이미징에 대 한 허용, 동물 완전히입니다 (PDMS) 및 기계적 힘 또는 electrophysiological 녹음의 배달에 대 한 물리적 액세스를 제한 하는 유리에 쌌 다. 최근, 우리 고해상도 형광 현미경과 호환 되는 트래핑 디자인 공 압 액츄에이터를 통합 하는 장치를 만들었습니다. 작동 채널 벌레 트랩 채널에서 얇은 PDMS 격 막에 의해 구분 됩니다. 이 다이어 프이 램은 외부 소스에서 압력을 적용 하 여 벌레의 측으로 편향. 장치는 개별 mechanosensitive 신경을 대상 수 있습니다. 이러한 뉴런의 활성화에 몇 군데 유전자 인코딩 칼슘 지표와 고해상도. 이 문서는 그들의 터치 수용 체 신경 (TRNs)에 있는 칼슘-민감한 작동 표시등 (GCaMP6s)를 표현 하는 C. 선 충 종자를 사용 하 여 일반적인 메서드를 제공 합니다. 메서드를 조사로 TRNs도 칼슘 센서에 국한 되지 않습니다 하지만 다른 기계적으로 민감한 세포 또는 센서에 확장 될 수 있다.

수-8 리소 그래피와 칩 본딩 리소 그래피 프로토콜 및 PDMS 성형 표준 절차를 따릅니다. 자세한 내용은 다른23,,2425,26찾을 수 있습니다. PDMS는 경화 후 문제 없이 웨이퍼를 벗기다 한다. 수-8 기능 PDMS 필 링 하는 동안 벗어 버리고, 경우 SU-8 접착 레이어 또는 silanization는 충분 하지 않았다. 경우 유리 coverslips 및 PDMS 칩의 플라즈마-활성화 약한 결합 트래핑 채널 또는 성능이 저하 되 고 자극의 부재에서 발생 하는 공 압 액추에이터 누설 될 수 있습니다 충분 하지 않습니다. 유체 누설은 분명, 칩 사용 되지 않습니다.
액츄에이터 성능 PDMS 액츄에이터 및 공기 저수지에 칩을 연결 하는 튜브의 모든 제대로 격 막의 적절 한 공 압 작동 되도록 봉인 해야 합니다. 반복된 삽입 및 제거 PE 튜브 (배관)의 PDMS 구멍 손상 되며 압력에 있는 감소에 지도. 이러한 압력 손실 액추에이터 편향과 고정된 동물의 피부에 적용 되는 힘을 제한 합니다. 횡 경 막의 편향 된 빈 칩 (동물 존재)를 사용 하 여 원하는 압력으로 여러 작동 사이클을 수행 하 고 이론적인 예측 양적 값을 비교 하 여 측정할 수 있습니다. 멤브레인 및 웜 경계 시각화 하기 어렵기 때문에 횡 경 막의 편향 되지 트랩 채널에서 동물의 존재에 측정 했다. 이것은 덫을 놓은 동물 정밀 교정 불가능 합니다. 표 1 압력의 기능으로 예상된 편향을 나열합니다. 이러한 값은 탄성 판 이론을 사용 하 여 계산 된 및 Nekimken 외 에 세부 정보를 찾을 수 있습니다. 23 이 관계 칩 주조 및 칩 및 유리 및 물개 압력 소스에 칩을 연결 사이 결합의 무결성 등 다른 요인 중에 생성 된 격 막 두께에 차이 따라 달라질 전망 이다. 여기, 값 1 µ m에서 450 kPa의 압력을 초과 하지 않는 약간의 변형으로 재현 했다. 우리는 모든 3 개의 다른 자극 프로필에 대 한 격 막의 성능 특징 고 Nekimken 외에 관심이 있는 독자를 참조 하십시오. 23 요약, 거기에은 값은 표 1에서 이탈 하는 경우 고려해 야 할 몇 가지 요소: 1) 튜브 또는 튜브 커넥터에 누출, 2)는 PDMS는 베이스 폴리머 경화제의 다른 비율에서 발생할 수 있습니다, 다른 탄성 또는 3)는 PDMS는 세 고 crosslink 시간이 지남에. 따라서, 응용 프로그램의 한 달 안에 준비 된 칩의 사용을 권장 합니다.
트랩핑 성능 칩의 입구에는 벌레를 삽입 한 후 주사기와 부드러운 압력 트래핑 채널 안에 하나의 단일 동물을 배치 하 고 6 액츄에이터 (그림 1)와 함께 그것의 피부를 선물 해야 합니다. 중요 한 것은, 동물의 코 않습니다 반드시 필요가 없습니다 버퍼 저수지로 내 다. 대신, 그런은 neurite은 가까운 액추에이터와 그것의 세포 체는 현미경의 시야 내에서 동물의 위치를 더 중요 하다. 최적의 신경 활성화를 달성 하기는 액추에이터의 셀 몸 앞쪽 거짓말 액추에이터 몸과 셀 사이의 거리를 조정 한다. 우리의 경험에서는, 신경 세포 체를 후부, 아무 활성화도 걸릴 것 이다 장소 및 칼슘 자극된 과도 됩니다 결 석. 적절 한 동원 정지 젊은 성인 또는 1 일 오래 된 광고에 나온 것 (두 나가에 대 한 최적화 된 장치 같은 마스크에 사용할 수 있습니다) 달성 될 수 있다. 작은 동물 컬렉션 저수지에 또는 트래핑 채널 내 옆으로 이동. 너무 큰 동물 TRNs mechanoreceptor 과도 검색 후속 실패의 조기 활성화 될 수 있습니다 채널에 압착 될 것입니다. 또한, 큰 벌레의 제거는 도전, 동물의 죽음에 지도 및/또는 장치의 막힘. 이 디자인으로, PLM 신경 일반적으로 수 없습니다 될 움직일 수 완전히, 그래서 그것은 수평 및 수직으로 이동 하 게 자유롭게. 비록 우리가 성공적으로 PLM 신경 활성화, 꼬리의 수직 운동으로 인해 어렵습니다 이러한 신경 세포에서 칼슘 과도 기록. 또 다른 트랩 디자인은 PLM33에서 사용 되었습니다.
칼슘 과도 및 분석의 이미징 한 번에, 동물 6 액추에이터 중 하나를 사용 하 여 자극 될 수 있습니다. 6 액츄에이터는 각각 6 TRNs의 기계적 자극을 제공 하는 위치가 결정 됩니다. 미세 유량 450 kPa 사내 압력 소스에 연결 자극 프로토콜 2-s 275 kPa 단계, 2-s 0-275 kPa 램프 및 2-s 버즈 (75 kPa, 275 kPa 단계와 겹쳐 10 Hz 사인)의 구성 된 동물을 제공 하는 데 사용 되었다 각 10-s 대기 기간으로 구분. 칼슘 과도 동시에 기록 된 이미지 시퀀스는 피지, 우리의 GitHub 계정 (위 참조 및 https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer)에 사용할 수 있는 사용자 작성 소프트웨어를 사용 하 여 분석 되었다. 우리는 압력 경사로 압력 단계 활성화 TRNs 자극 400 kPa 이상 압력을 달성 하는 경우에 발견. 대조적으로, 모든 TRNs 압력 < 275 kPa에서 정현파, 10 Hz 버즈를 사용 하 여 자극된의 강력한 활성화 (그림 4) 관찰 되었다. 일반적으로, TRNs 간단한 정현파 자극에 더 나은 응답 (전화 '버즈'), 다른 방법론1,9를 사용 하 여 이전 보고서와 일치 하 여. 버즈와 함께 자극은 고효율, 선도 ~ 시련과 모든 뉴런에는 활성화의 90% 테스트 (그림 4). 놀랍게도, 강한 상관 관계가 여부 자극은 등 또는 복 부 측에 적용 된 고 셀 바디와는 neurite에 자극 위치 사이의 거리의 독립에 관찰 했다. 미래 연구는 최대 응답의 지연/자극 거리와 관련이 있는지 여부를 조사 해야 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56530/56530fig1.jpg"> 그림 1: 칩 설계의 개요. (A)는 포토 마스크 및 모든 커넥터가 표시 결과 칩의 회로도 레이아웃. 6 개폐 손가락, 3 중앙 트래핑 채널의 각 측면에 있다. 눈금 막대 = 3 m m. (B) 미세 소자의 PDMS와는 coverslip에 접착 사진과 웜 입구와 웜 콘센트에서 배관에 연결. 반면 다른 다섯은 하지 작동 손가락의 단 하나 압력 소스에 연결 됩니다. 그림의 부분 참조23 크리에이 티브 공통 라이센스에서 재현 되어 있다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56530/56530fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56530/56530fig2.jpg"> 그림 2: 근접 중앙 트래핑 채널 및 트래핑 절차의. 트래핑 채널의 그림 (A) 회로도 벌레 입구 쪽에서 기둥 동양 벌레와 동물의 로드를 용이 하 게 도움이. 개폐 손가락 가압 수 고 갇혀 견본에는 얇은 막 들여쓰기. 눈금 막대 = 200 µ m. (B) 대표 비디오 프레임의 수평 채널에 갇혀 되는 벌레. 채널은 벌레 6 공 압 액추에이터 걸쳐 누워 온다 되도록 설계 되었습니다. 꼬리는 왼쪽으로, 오른쪽 머리입니다. 개별 터치 수용 체 신경 (TRNs)의 위치는 화살표로 표시 하 고 그림에 표시 된. 눈금 막대 (모든 패널)에서 100 µ m =. 그림의 부분 참조23 크리에이 티브 공통 라이센스에서 재현 되어 있다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56530/56530fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56530/56530fig3.jpg"> 그림 3: 칼슘 성분이 프로토콜 인수 분석 제공된 피지 플러그인의 개요. 소프트웨어는 그래픽 사용자 인터페이스를 시작합니다. 사용자 인터페이스의 첫 번째 탭 ("열려 있는 비디오") 단추 비디오를, 경로 열린된 비디오의 첫 번째 프레임을 표시 합니다. 두 번째 탭 ("정의 ROIs") 버튼 정의 터치 수용 체 신경, "정의 액추에이터" 버튼과 "정의 액추에이터" 버튼을 활성화 하기 위한 확인란을 포함 합니다. 하단 부분에는 비디오의 첫 번째 프레임이 표시 됩니다. 세 번째 탭 (이 하 "분석")의 상단 부분에서 이미지 분석을 위한 조정 가능한 매개 변수가 표시 됩니다. 중간 부분 "분석 시작" 버튼을 보여 줍니다. 아래 부분에 진행률 표시줄 현재 분석의 진행 상황을 보여 줍니다. 4 탭, "결과", 결과 시간이 지남에 상대적 형광 강도의 그래프로 표시 됩니다. 아래 부분에서는 결과 테이블을 저장 하는 버튼입니다. "도움말", 다섯 번째 탭에서 도움말 텍스트 분석 소프트웨어와 교육에 대 한 요구 사항을 사용 하는 방법에 보여주는 표시 됩니다. 그림 참조23 크리에이 티브 공통 라이센스 아래에서 적응. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56530/56530fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56530/56530fig4.jpg"> 그림 4: 기계적 자극에 응답 하는 개별 뉴런. 버즈와 함께 기계적 자극 전후 AVM 터치 수용 체 신경 이라고 표시 된 GCamP6s의 (A) 대표 형광 현미경 사진. 눈금 막대 = 10 µ m. 색 눈금 1500-3500 회색 값을 =. (B) 자극 프로토콜 2 s 격 막 여기 275 kPa 단계, 275 kPa 램프 및 275 kPa 단계 (버즈) 겹쳐 사인 (75 kPa, 10 Hz) 대표를 포함 하 여. (C) 정규화 GCamP6s 강도 추적 AVM 자극된에서 야생 유형 동물의 B에 표시 된 프로필 기록 (음영된 지역으로 ± sem의 의미) (녹색, n = 14) 및 동물 돌연변이 mechanoreceptor 채널 소 단위 멕-4 (블루, n = 10), 즉 기계적 스트레스에 대 한 응답을 촉진 하기 위하여 알려진입니다. 이 과도 적용된 기계적 자극에 의해 유도 되는 나타냅니다. 그림의 부분 참조23 크리에이 티브 공통 라이센스에서 재현 되어 있다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56530/56530fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>압력 (kPa)</td>
			<td>편향 (µ m)를 의미</td>
			<td>SD</td>
			<td>예상된 편향 (µ m)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>-0.01</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td>0.77</td>
			<td>0.26</td>
			<td>0.607143</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1.57</td>
			<td>0.58</td>
			<td>1.21429</td>
		</tr>
<tr>
<td>150</td>
			<td>2.32</td>
			<td>0.65</td>
			<td>1.82143</td>
		</tr>
<tr>
<td>200</td>
			<td>3.13</td>
			<td>0.74</td>
			<td>2.42857</td>
		</tr>
<tr>
<td>250</td>
			<td>3.86</td>
			<td>0.79</td>
			<td>3.03571</td>
		</tr>
<tr>
<td>300</td>
			<td>4.61</td>
			<td>0.79</td>
			<td>3.64286</td>
		</tr>
<tr>
<td>350</td>
			<td>5.3</td>
			<td>0.82</td>
			<td>4.25</td>
		</tr>
<tr>
<td>400</td>
			<td>5.92</td>
			<td>0.82</td>
			<td>4.85714</td>
		</tr>
<tr>
<td>450</td>
			<td>6.43</td>
			<td>0.75</td>
			<td>5.46429</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 0-450에서 배열 하는 적용 된 압력에 대 한 실험적인 편향 값 예상 kPa와 그들의 이론적인 예측. 데이터 단계 자극에 대 한 파생. 의미 ± sd. 이러한 데이터는 빈 트래핑 채널 인수 했다.

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Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

Mechanobiology 연구에 대 한 새로운 도구 어떻게 기계적 스트레스를 이해 하는 데 필요한 생화학 경로 활성화 하 고 elicits 생물학 응답. 여기, 우리 세포 응답의 고해상도 이미지를 수 있도록 미세 트랩으로 움직이지 동물의 선택적 기계적 자극에 대 한 새로운 방법을 전시.

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

9.7K 조회수.  Stanford University. Mechanobiology 연구에 대 한 새로운 도구 어떻게 기계적 스트레스를 이해 하는 데 필요한 생화학 경로 활성화 하 고 elicits 생물학 응답. 여기, 우리 세포 응답의 고해상도 이미지를 수 있도록 미세 트랩으로 움직이지 동물의 선택적 기계적 자극에 대 한 새로운 방법을 전시.

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Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

유전자 변형을 사용하여 시금 β - 아밀로이드 독성 C. 엘레간스 모델

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

연구

신경과학

Combining Transcranial Magnetic Stimulation and fMRI to Examine the Default Mode Network

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful rest."1,2,3 It is thought the default mode network corresponds to self-referential or "internal mentation".2,3
It has been hypothesized that, in humans, activity within the default mode network is correlated with certain pathologies (for instance, hyper-activation has been linked to schizophrenia 4,5,6 and autism spectrum disorders 7 whilst hypo-activation of the network has been linked to Alzheimer's and other neurodegenerative diseases 8). As such, noninvasive modulation of this network may represent a potential therapeutic intervention for a number of neurological and psychiatric pathologies linked to abnormal network activation. One possible tool to effect this modulation is Transcranial Magnetic Stimulation: a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.9
In order to explore the default mode network's propensity towards and tolerance of modulation, we will be combining TMS (to the left inferior parietal lobe) with functional magnetic resonance imaging (fMRI). Through this article, we will examine the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools.

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the combination of TMS and fMRI to examine the effects of brain stimulation on the default network.

기본 모드 네트워크를 검사하기 위해 Transcranial 자석 자극과 fMRI를 결합

The default mode network is a group of brain regions that are active when an individual is not focused on the outside world and the brain is at "wakeful ...

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS : 연약한 X 증후군 및 자폐증과 개인의 소성의 Mechasnism를 탐험하는 세타 - 버스트 프로토콜을 사용하여

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

TMS의 국가 종속성 효과 : 동기 Phosphene 동작 좀보세요

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

NeuroStar TMS 장치 : FDA를 실시는 우울증 치료 프로토콜을 승인

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments in vision research require displays with more than 12 bits of luminance resolution. Several solutions are available. Bit++ 1 and DataPixx 2 use the Digital Visual Interface (DVI) output from graphics cards and high resolution (14 or 16-bit) digital-to-analog converters to drive analog display devices. The VideoSwitcher 3 described here combines analog video signals from the red and blue channels of graphics cards with different weights using a passive resister network 4 and an active circuit to deliver identical video signals to the three channels of color monitors. The method provides an inexpensive way to enable high-resolution monochromatic displays using conventional graphics cards and analog monitors. It can also provide trigger signals that can be used to mark stimulus onsets, making it easy to synchronize visual displays with physiological recordings or response time measurements.
Although computer keyboards and mice are frequently used in measuring response times (RT), the accuracy of these measurements is quite low. The RTbox is a specialized hardware and software solution for accurate RT measurements. Connected to the host computer through a USB connection, the driver of the RTbox is compatible with all conventional operating systems. It uses a microprocessor and high-resolution clock to record the identities and timing of button events, which are buffered until the host computer retrieves them. The recorded button events are not affected by potential timing uncertainties or biases associated with data transmission and processing in the host computer. The asynchronous storage greatly simplifies the design of user programs. Several methods are available to synchronize the clocks of the RTbox and the host computer. The RTbox can also receive external triggers and be used to measure RT with respect to external events. 
Both VideoSwitcher and RTbox are available for users to purchase. The relevant information and many demonstration programs can be found at <a href="http://lobes.usc.edu/">http://lobes.usc.edu/</a>.

Conventional computer hardware can not generate visual stimuli with sufficiently high grayscale resolution and measure response times with sufficient accuracy. We describe how to use the VideoSwitcher to produce high-resolution monochromatic displays, and the RTbox to measure response times with high accuracy on conventional computer hardware.

사용 높음 - 해상도 디스플레이와 종래의 컴퓨터에 정확한 응답 시간 측정 그레이 스케일

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

인간 Midbrain위한 고해상도 기능성 자기 공명 영상 방법

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...