현재 프로젝트 개념 펀드의 캔자스의 대학 증거에 의해 투자 되었다. 우리는 cochleae 문화 지원에 대 한 인간의 탯, 그리고 데이비드 조 젠 슨은 취득에 우리 위한 KUMC (캔사스 시, KS)에서 간호 직원을 감사 하 고 싶습니다.

동물 안락사를 포함 하 여 모든 절차는 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 프로토콜 (ACUP #2014-2234) 캔자스의 대학 의료 센터 (KUMC)에 따라 실시 했다.
참고: HWJCs 동의 제공 하는 환자에 의해 기증 된 인간 탯 으로부터 격리 되었고 표본 캔자스의 대학 인간 주제 위원회 (구 IRB #15402)에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 사용 했다.
1. 측 뼈 수확과 달팽이 관 절연
<ol>
	<li>수술가 위, 날카로운 쌍 두개골과 첫 번째 자 궁 경부 척추 사이 절단 하 여 적절 하 게 안락사, 15 주 된 마우스를 목을 벨 다음 스프레이로 소독 (그림 1A) 70% 에탄올과 머리.</li>
	<li>(그림 1B-C, 파선) 수술가 위 같은 날카로운 쌍을 사용 하 여 중간에 화살 평면에서 두개골 이등분</li>
	<li>(그림 1D, 화살촉) 집게의 쌍을 사용 하 여 두개골에서 뇌 조직을 제거 합니다.</li>
	<li>청각의 존재 및 두개골 및 외관 (1 층 그림, 화살표)에서 외가도의 내부에 vestibular 신경 뿌리 (그림 1E-F, 화살촉) 통해 측 뼈를 식별 합니다. 측 뼈 두개골 (그림 1G)의 나머지에서 분리 두개골을 통해 조심 스럽게 잘라. 참고: 어떤 경우에, 그것 가능 할지도 모른다 섬세 하 게 절단 하지 않고도 측 뼈에서 두개골의 주변 뼈를.</li>
	<li>그래서 팁 달팽이 puncturing 위험 하지 않습니다 약 5 m m (그림 1 H), 외가도의 개통으로 미세 집게를 삽입 합니다. 부드럽게 깨 물집 (그림 1 H, 상단 빨간색 음영 처리 된 영역)의 뼈 그래서 그것 골절 (1I 그림, 빨간 점선 라인). 참고: 필요한 경우, 해 부 현미경 수 있습니다 원조이 과정에서 정확 하 게 배치 하 고 악기의 조작.</li>
	<li>미세 집게를 사용 하 여, 놀 리 려 멀리 측 뼈, 뼈 미로 달팽이 관 (그림 1J, 빨간 괄호)의 노출에서 물집의 나머지.</li>
	<li>페 트리 접시 측 뼈를 충분히 큰 장소 (예를 들어, 30 m m 이상)는 해 부 아래 시야 범위와 함께 충분 한 인산 염 버퍼링 염 분 (PBS) 측 뼈 (예를 들어, 0.5 ~ 1 mL)를 작성.</li>
	<li>향하도록 하는 달팽이 관의 타원형과 둥근 창문이 PBS에 제거 물집과 측 뼈를 잠수함. 참고: 달팽이 관에서 vestibular 시스템의 제거 필요는 없습니다,로 vestibular 시스템 역할 잘 조작 하 고 방향을 (1I 그림 및 그림 2B) 달팽이 관의 기능에 대 한 핸들.</li>
	<li>집게의 초 미세 쌍을 사용 하는 등골을 통과 stapedial 동맥을 제거 합니다.</li>
	<li>어디 동맥을 통과 하는 등골의 아치를 통해 초 미세 집게의 한 끝을 삽입 하 고 섬세 하 게 위쪽으로 등골을 리프트. Disarticulated 등골 타원형 창에서 리프트 해야 합니다.</li>
	<li>초 미세 집게의 한 팁을 사용 하 여 타원형 펑크 및 windows를 둥근.</li>
	<li>튜빙 28.5 게이지 주사기 가득 1 x PBS를 사용 하 여 (내부 직경 0.28 m m, 외경 0.61 m m) 타원형 창 튜브를 놓고, (그림 2A -B). 참고: 튜브의 오프닝 조작할 수 있습니다 정확 하 게 배치 되도록 돕는 초 미세 집게를 사용 하 여.<ol>
		<li>신선한 주사기와 튜브를 사용 하 여 각 달팽이 관에 대 한.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10% 항생제 antimycotic (방지) 및 10% 페니실린-스 (펜-strep) PBS에 5 분 이상 달팽이 관을 통해 제거 하는 perilymph의 2 개 mL perfuse 너무 빨리 너무 많은 압력으로 perfusing는 달팽이 관 내의 미세 구조 손상 것입니다. 참고: 수동으로 perfuse 달팽이 관을 통해 액체를 손으로 주사기 운전은 효과적 이다, 관류 펌프 대신으로 사용 될 수 있지만.<ol>
		<li>수동으로 perfusing, 자동 폐쇄 달팽이 관 (그림 2A) 안정 집게 관류 동안 측 뼈의 vestibular 부분을 파악,의 쌍을 사용 합니다. 참고: 필요 하지 않지만 이것은 두 손을 자유롭게 처리 계기; 다른 튜브를 배치할 수 있습니다 하는 동안 한 손으로 주사기 (그림 2A)를 구동할 수 있다 적절 하 게 (그림 2B).</li>
		<li>이 단계에서 앞으로, 공기에 불필요 하 게 달팽이 관을 노출 하지 않도록 주의. 유체 순환 차단 유체 공간으로 기포를 도입 하 고 달팽이 관 내의 미세 구조 손상 더 밖으로 건조.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>제거 하 고 미세 집게를 사용 하 여 하 모든 나머지 근육 조직과 뼈 파편을 삭제.</li>
	<li>필요한 경우, 최대 7 일간 항생제 솔루션 모든 48 h의 일정 변경에 대 한 10% 방지와 PBS에서 10% 펜 strep 솔루션에 4 ° C에서 고립 된 cochleae를 저장 합니다.</li>
</ol>
2. 인공 처리
<ol>
	<li>Decellularization
	<ol>
		<li>각 달팽이 관에 대 한 채우기 20 mL 유리 섬광 유리병으로 1% 나트륨 라우릴 황산 드 이온된 (DI) 수, 달팽이 관을 decellularize 하는 데 사용 되는에 (SDS) 솔루션.</li>
		<li>개통은 달팽이 관 통과를 위해 충분히 큰 되도록 면도날을 사용 하 여 플라스틱 7 mL 전송 피 펫의 끝을 잘라.</li>
		<li>전송 피 펫을 사용 하 여, 부드럽게 그릴 달팽이 관 피펫으로에 그래서 그것은 단지 몇 밀리미터에 의해 잘라 가장자리를 전달.</li>
		<li>1 %SDS 솔루션 가득 섬광 유리병에 달팽이 관을 추방.</li>
		<li>전송 피 펫을 사용 하 여 섬광 유리병에 달팽이 관을 통해 드 이온된 (DI) 수에서 1 %SDS 2 개 mL를 순환.</li>
		<li>회전으로 섬광 유리병을 놓고 실내 온도에서 72 h에 대 한 10 rpm 회전 섬광 유리병을 허용 합니다.<ol>
			<li>1 %SDS 솔루션 마다 24 h 72 h 동안 변경 합니다. 결코 공기에 달팽이 관을 노출 하는 SDS를 변경할 때 주의 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>디 물으로 30 분 각각에 대 한 세 번 달팽이 관을 세척.</li></ol></li></ol>SDS 요금; 사용 같은 섬광 유리병에는 세척을 수행 이 단계에서 달팽이 관은 decellularized입니다.
	
	
	<li>Decalcification
	<ol>
		<li>충분히 빠져들 달팽이 관을 계속 떠나 섬광 유리병에서 나머지 디 물을 제거 합니다.</li>
		<li>Decalcification를 하려면, 달팽이 관을 포함 하는 섬광 유리병에 디 물에 10 %ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (0.02 M)의 5 mL을 추가 합니다.</li>
		<li>전송 피 펫을 사용 하 여 섬광 유리병에 달팽이 관을 통해 디 물에 10 %EDTA 2 개 mL를 순환.</li>
		<li>회전에 다시 섬광 유리병을 놓고 실 온에서 72 h에 대 한 10 rpm 회전 섬광 유리병을 허용 합니다. 10 %EDTA 솔루션 마다 24 h 72 h 동안 변경 합니다. 달팽이 관은 공기에 노출 되지 않습니다 있도록 솔루션을 변경할 때 주의 합니다.</li>
		<li>2 h 각 1 x PBS;에 대 한 3 번 달팽이 린스 이 단계에서 달팽이 관은 석.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>스토리지
	<ol>
		<li>10% 방지, 10% 펜 strep 솔루션에 PBS에서 4 ° c.에 최대 72 h에 대 한 cochleae를 저장 참고: 긴 저장 기간 항생제 솔루션;의 일정 변경 가능 있을 수 있습니다. 그러나, 처리 된 cochleae의 확장된 저장이이 프로토콜에서 검증 되지 않았습니다.</li>
	</ol>
	</li>

3. 조달 및 hWJCs의 확장
<ol>
	<li>이전에 게시 프로토콜22에 따라 hWJCs를 격리 합니다. 간단히, 3 cm 섹션으로 탯 세그먼트.</li>
	<li>조심 스럽게 만들 메스로 절 개를 얕은 세로 각 탯 선분을 풀 튼의 젤리 탯의 노출에. 집게를 사용 하 여 혈관을 제거.</li>
	<li>조직 잠수함 탯 세그먼트 (예를 들어, 60 mm 페 트리 접시에에서 40 mL) 충분 한 PBS로 두 번 씻는 다. 가늘게 조직 세그먼트 메스를 말하다. 다이제스트 100 mm 페 트리 접시 소화 매체의 50 mL와 조직 (0.2 %2 형 콜라, 1% 페니실린-스, 낮은 혈당에서 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)).</li>
	<li>소화는 5% CO2, 37 ° C 배양 기에서 1 박 50 rpm에서 궤도 통에 중간에 티슈를 놓습니다. 다음 날, 소화 매체 2% 항생제-PBS에서 antimycotic에 1시 16분의 비율로 희석 하 고 실 온에서 500 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 (~ 27 ° C) 10 분 삭제 상쾌한에 대 한.</li>
	<li>Resuspend 펠 릿 중간 엽 줄기 세포 성장 매체 (MSCGM)에서 하 고 세포를 재결합. 조직 문화에 7 x 103 셀/c m2 의 조밀도에 접시 셀 T-75 플라스 크 취급. MSCGM에서 HWJCs 문화 한 통로 5 실험을 확장 합니다. 참고: HWJCs 수 수 하위 양식 큰 T-플라스 크로 (예를 들어, T-150, T-300) 실험에 대 한 hWJCs의 수확량 증가를 뿌리고 때.</li>
</ol>
4입니다. Decellularized Cochleae에 hWJCs의 주입
<ol>
	<li>Decellularized cochleae을 준비
	<ol>
		<li>무 균 기술을 사용 하 여, 3 시간 30 분 대 한 1 x PBS에 저장된 cochleae 세척.</li>
		<li>Cochleae 24-잘 접시의 별도 우물으로 전송 하 고 37 ° C의 1 mL를 추가 MSCGM를 미리 예 열.</li>
		<li>Cochleae는 5% CO2, 세포의 주입 하기 전에 1 h의 최소 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에서에서 품 어.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>해리 hWJCs 및 resuspend
	<ol>
		<li>37 ° c 워시 hWJCs 전 두 번 1 x PBS를 따뜻하게합니다.</li>
		<li>37 ° c 충분 한 사전 예 열 셀 선박 표면에 0.5 %EDTA 트립 신.</li>
		<li>HWJCs는 5% CO2, 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에서에서 최대 5 분을 품 어.<ol>
			<li>세포의 90%는 거꾸로 현미경 세포를 확인 하 여 세포 문화 표면에서 분리 된 확인 합니다. 참고: 때 문화 배 도청 부드럽게 이동 하는 셀 분리 했습니다. 셀 고정, 남아 있는 분리 하지 있다.</li>
			<li>부드럽게 연결 된 셀을 더 꺼내 려 플라스 크의 측면을 누릅니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>무 균 기술을 사용 하 여, 해당 볼륨 MSCGM의 Trypsin의 볼륨을 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 문화 선박에서 전송 hWJCs는 세포 분열을 사용.</li>
		<li>실 온에서 500 x g에서 centrifuging 여는 hWJCs 작은 (~ 27 ° C) 5 분.</li>
		<li>상쾌한, 발음 하 고 500, 000 셀/mL의 농도에서 MSCGM에 hWJCs를 resuspend.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cochleae perfuse
	<ol>
		<li>Cochleae 전송 피 펫을 사용 하 여 새로운 24-잘 접시에 전송 합니다.</li>
		<li>어떤 달팽이 관 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 각 달팽이 관에 MSCGM의 한 방울을 추가 합니다.</li>
		<li>섬세 하 게 타원형과 둥근 창문을 향하도록 하 초 미세 집게를 사용 하 여 달팽이 관을 방향을 정하십시오. 참고: 주의 극단적인 달팽이 관 손상 쉽게 각 달팽이 관을 직접 처리 하는 경우.</li>
		<li>살 균 28.5 게이지 인슐린 주사기를 사용 하 여 연결 된 튜빙, 0.2 mL resuspended hWJCs (100000 셀)를 그립니다.</li>
		<li>멸 균된 미세 집게를 사용 하 여 케이블의 튜빙을 타원형 창에 놓으십시오.</li>
		<li>섬세 하 게 그리고 천천히 perfuse 폴 리 에틸렌 튜브에 연결 28.5 게이지 인슐린 주사기를 사용 하 여 resuspended hWJCs의 0.2 mL와 달팽이 관 (외경: 0.61 m m, 내경: 0.28 m m) 약 5 분 이상.</li>
		<li>관류, 후 37 ° C의 0.8 mL를 추가할 필요는 잘 포함 하는 잘에서 1 mL 전체 볼륨을가지고 달팽이 관에 MSCGM를 미리 따뜻하게.</li>
		<li>각 달팽이 관, 신선한 주사기를 사용 하 고 각 시간을 튜브에 대 한 4.3.3-4.3.7 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>5% CO2, 37 ° C 세포 문화 인큐베이터, 끼얹는다 cochleae를 놓고 미디어 주 당 3 시간을 변경 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 달팽이 수확 및 보존
참고: Cochleae 그리고 경작 수 있습니다 최대 30 일 후 관류 시간 언제 든 지 수확.
<ol>
	<li>Cochleae를 유지 하려면 1 x PBS 락 플랫폼에 4 ° C에서 하룻밤에 4 %paraformaldehyde 수정 했다.</li>
	<li>고정, 후 5 분에 대 한 세 번 1 x PBS 가진 cochleae 세척.</li>
	<li>점차적으로 에탄올과 달팽이 관을 탈수 하 고 파라핀에 포함 하기 전에 지방 족 탄화수소 용 매로 취소 합니다.</li>
	<li>에 톰 및 마운트를 사용 하 여 10 µ m의 두께로 섹션 샘플 현미경 슬라이드 유리. 참고: 샘플 준비가 이제 조직학 immunohistochemical 처리 표준 프로토콜을 사용 하 여 또는.</li>
</ol>

<ol>
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J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bioactivity+of+cartilage+extracellular+matrix+in+articular+cartilage+regeneration.">The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration.</a> Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

우리는 성공적으로 복잡 한 3 차원 조직 발판으로 달팽이 관의 사용을 허용 하는 decellularization 과정을 통해 달팽이 관에서 네이티브 인공 세포를 제거할 수 있습니다 시연 했다. 산 티 외. 15 decellularizing cochleae에 대 한 초기 방법을 개발 하 고 정확 하 게 빛 시트 현미경23의 도움으로 많은 인공 구조를 통해 볼륨 견적 했다. 이러한 초기 작업 조직 엔지니어링과 세포 문화 기술을 여기에 대 한 강력한 기반으로 재직 했습니다. Decellularized 달팽이 관 수 성공적으로 융합 세포, 그리고 그 시간의 연장된 기간에 대 한 교양. 다양 한 동물에서에서 cochleae 수 이론적으로 세포 유형의 다양 한 유사 하 게와 함께 활용할 수 있습니다. 이러한 조합을 허용 여기에 제시 된 수많은 가능한 실험적인 디자인, 감각 상피 개발14검사, 약물의 새로운 제약 에이전트 테스트 하는 응용 프로그램 엔지니어링 조직에 활용 하는 기법 24, 와우 복구의 개발 모델25. 그러나, 이러한 기술의 광범위 한 적용에도 불구 하 고 그들은 되지 않습니다 제한 없이.
현재 기술의 한계 중 하나는 관류 개인에 따라 변수입니다. 달팽이 관에 대 한 홀더를 개발 하 고 주사기 펌프를 사용 하 여 perfusions를 수행 과정의 성공과 정확성 증가할 수 있습니다. 또한, 결정적으로 증명 하는 성공적인 decellularization 잠재적으로 여러 가지 방법을 통해 수행할 수 있는. 우리 DAPI 얼룩이 남아 있는 세포 핵을 계량 하는 데 사용 된 고용 하 고 우리가 관찰 아니 잔여 핵 게시물-decellularization. 또한, 표준 DNA 정량화 분석 실험 시 약, 녹색 염료 picogram 양의 DNA 핵 산 나머지, 시각적으로 핵의 작은 파편의 존재를 식별 DAPI 보다 더 민감한 수 있는 식별을 검색 활용 decellularized 조직26에 있는 산. 어떤 기법은 성공적인 decellularization의 유효성을 검사 하는 데 사용 됩니다에 발판으로 활용 하 여 이전 개별 달팽이 관의 완전 한 decellularization를 하지 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 우리는 성공적이 고 강력한 decellularization 과정을 발견 했다.
현재 프로토콜에서 두 개의 가장 중요 한 단계는 고립 그리고 cochleae의 처리는 cochleae의 관류. 달팽이 관은 섬세 하 고 취 성 달팽이 관 처음 격리 된 때 신중을 기울여야 합니다. 집게와 달팽이 관을 처리 하는 동안 너무 많은 힘을 적용 하는 경우는 달팽이 관 수 조각화 됩니다. 따라서, decellularization 및 decalcification 전에 각 달팽이 관을 부드럽게 처리 하는 것이 필수적 이다. Vestibular 시스템 그대로, 겸 자와 함께 복잡 한 내 귀를 잡아와 달팽이 관을 향하는 큰 핸들로 사용 됩니다. 마찬가지로, perfusing 세포와 달팽이 관, 뒤에 관류 압력 너무 중대 해서는 안, 그렇지 않으면 세포는 관류 살아날 수 있습니다. 현재 프로토콜에서 설명 했 듯이, 1 mL 인슐린 주사기의 끝에 튜브를 부착 한 손으로, 및 perfusing 다른 손으로 달팽이 관을 통해 셀에 정밀도와 달팽이 관의 쉽게 처리 할 수 있습니다.
다음 단계로 그것 자연 인공 ECM은 줄기 세포의 분화를 유도 하 고 있다와 그래서, 달팽이 관에서 특정 ECM 구성 요소를 셀에 변경 내용을 유도 확인을 발달 및 기능 표시를 평가 하는 것입니다. 다른 종류의 세포 (예를들면, 줄기 세포, neuroprogenitors, 섬유 아 세포, 등) 모니터 세포 분화 및 행동에 달팽이 관을 통해 perfusing 다른 매혹적인 후속 조사 될 것 이다. 또한, 세포 유전자 변형 또는 성장 인자 차별화 프로토콜에 노출 되는 인공 ECM neurosensory 개발을 지원 하는 방법에 대 한 새로운 통찰력을 제공 하 고 청문회에서 함수 어쩌면 수 있습니다. 따라서, 현재 프로토콜 인공 ECM를 사용 하 여 내가 neurosensory 개발 및 유지 보수, 5 월 1 일 새로운 치료법의 개발로 이어질 청력 손실 복원 연구에 중요 한 첫 단계입니다.

달팽이 관은 측 뼈에서 발견 하는 복잡 한 나선형 구조. 그것은 외부 뼈 미로 동심, 내부 membranous 미로1로 구성. Membranous 미로 3 유체 공간 구성: 스칼라 vestibuli, 스칼라 언론과 Scala tympani1. 스칼라 미디어 하우스 수많은 종류의 세포로 구성 되어, 감각 상피, 하지만 감각 머리 세포 (HC), 신경 충 동2음파 기계적 에너지 transduce는 특정 관심의. 음향 외상3,,45, 약6, 질병7,8, 및 노화9 노출 모두 HC 죽음 통해 장애인된 청각 기능 발생할 수 있습니다. 포유류에서 머리 세포 손실 부상10후 재생성 수 조류 HCs 달리 영구적 이다.
다양 한 현대 연구 노력 하고자 했다 손실된 HCs 복원 특정 실험적인 접근 다르지만. 감각 상피에 유전자 발현의 조작 및 몸 밖에 서 분화 하는 줄기 세포의 주입은 필드에서 지배적인 접근 인공 organoids로 줄기 세포를 분화 하는 유도 방법 있다 지만 시도11,,1213. 이 방법의 각각은 줄기 세포 나 줄기 세포; 사용 발달 큐에 직접 의존 그러나, 두 번째 공유 하 고 잠재적으로 중요 한 요소는 달팽이 관 자체의 ECM14,15.
ECM 뿐만 아니라 세포와 조직, 세포 접착, 확산, 생존, 및 마이그레이션에 대 한 서피스를 포함 하지만 또한 HCs와 나선형 ganglion15,16의 개발에 중요 한 역할에 대 한 물리적 지원 제공 ,17. 자연스럽 게 발생 ECM는 세포 표현 형 결정 및 세포 접착, 확산, 그리고 생존18가이드 수 유도 신호를 제공 합니다. 따라서, 교양된 hWJCs와 함께에서 decellularized 달팽이 관의 사용 ECM HC 재생의 역할을 탐구 하는 독특한 기회를 제공 합니다. HWJCs는 중간 엽 줄기 세포19처럼 인간의 탯에서 고립 된 쉽게 사용할 수, 비 논란이 셀 유형입니다. HWJCs는 neurosensory 세포 계보20,21아래로 차별 하는 능력을 보여주었다. 따라서, 현재 프로토콜 절연, decellularization, 및 cochleae 내가 조직 공학에 대 한 hWJCs와 C57BL 마우스 시체에서의 관류 자세히 설명합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Allegra X-14R Centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>B08861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intramedic Semi-Rigid Tubing</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1190-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18155-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB087579B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-100 Insulin Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-341-73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-170-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-170-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear-Rite 3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-046341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal Stem Cell Growth Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP T-75 Culture Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP T-150 Culture Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP T-300 Culture Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MFA51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-425-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% SDS Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for decellularizing mouse cochleae for inner ear tissue engineering

포유류에서 청각 부족을 재생성 하는 기능을 촉진 하는 mechanosensory 세포는 청력 손실에 대 한 치료를 제한 했다. 현재 재생 의학 전략 이식 줄기 세포 또는 주변 청각 상실을 해결 하기 위해 손상 된 줄기 세포의 교체를 장려 하는 내가 지원 세포의 유전자 조작에 집중 했다. 그러나, 기질 (ECM) 유도 하 고 세포의 기능 유지에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다 그리고 잘 조사 하지. 인공 와우를 사용 하 여 성체 줄기 세포를 성장 하는 발판으로 ECM 어떻게 구성 및 extracellular 환경 아키텍처 셀에 에이즈 청력 기능을 유지 하는 독특한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기 우리는 분리 하 고 건설 기계 성인 줄기 세포 끼얹는다 수락으로 사용 하는 마우스에서 cochleae를 decellularizing 하는 방법을 제시. 현재 프로토콜에서 cochleae 안락사 쥐, decellularized, 그리고 석 으로부터 격리 됩니다. 그 후, 탯 줄에서 고립 된 인간의 튼 젤리 셀 (hWJCs) 각 달팽이 관에 끼얹는다 신중 하 게 했다. cochleae 생물 반응 기, 사용 하 고 셀 분석에 대 한 처리를 진행 하기 전에 30 일 동안 배양 되었다. Decellularized cochleae 식별 extracellular 구조를 유지 하지만 DNA의 현저한 조각 또는 셀의 존재를 공개 하지 않았다. 셀 달팽이 관에 끼얹는다 인테리어와 달팽이 관의 외관의 대부분을 침공 하 고 30 일의 기간 동안 사고 없이 성장 했다. 따라서, 현재 방법 어떻게 인공 ECM에 영향을 미치는 세포 발달 및 행동 연구를 사용할 수 있습니다.

여기에 제시 하는 방법을 사용 하 여, cochleae의 성공적인 decellularization 4'를 통해 DNA의 유무를 검사 하 여 평가 했다 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 얼룩. Cochleae는 DNA 이었다 decellularized 달팽이 관 내에서 확인 되지 않는 경우 완전히 decellularized로 간주 됐다. Decellularization 또는 decalcification을 받을 하지 않았다 이전 실험에서 네이티브 달팽이 관 구조와 전통적으로 C57BL 마우스 달팽이 관에 있는 세포를 설명 하기 위해 긍정적인 제어로 사용 되었다. 어떤 hWJCs를 주입 하지 않은, decellularized-석된 달팽이 관, 부정적인 컨트롤으로 사용 되었다. 아니 정량 DAPI 스테인드 세포 핵 조직 단면도 (그림 3)의 어떤 지역에서 관찰 되었다. 두 개의 cochleae decellularized 고 석, 되었고 현재 프로젝트에 대 한 hWJCs 주입. HWJCs와 함께 끼얹는다 했다 decellularized-석된 cochleae 수많은 DAPI를 달팽이와 달팽이 관 (표 1) 외부 뼈 껍질에 성장 핵 스테인드 관찰 되었다. 총 예상 셀 셀 밀도 생긴 첫 번째 달팽이 관 후 30 일 문화 (그림 4 및 그림 5)와 두 번째 달팽이 관에 대 한 문화의 30 일 후 118,732 세포/달팽이 관 113,759 세포/달팽이 관을 했다 (그림 6 과 그림 7)입니다. 이러한 셀 밀도 추정 Scala tympani, 스칼라, 그리고 스칼라 현관, 언론과 구조 3 유체 공간 내에서 볼륨을 포함 하지만 이러한 견적 제외 나머지 골 질 미로. 또한, 각 달팽이 관에서 샘플 Hematoxylin와 오신 스테인드 했다 (H &#38; E) 세포와 각 달팽이 관 (그림 8) 내에서 해 부 특징의 존재를 보여. 와우 마이크로 구조의 심한 해부학 모든 스테인드 섹션;에 걸쳐 주로 불변에 남아 있었다 그러나, 셀 (그림 8B) decellularized-석된 섹션에서 식별 했다. 세포 핵의 식별 네이티브 달팽이 관 (그림 8A)과 셀 (그림 8C-D) 주입 decellularized 석된 cochleae 사이 극적으로 달랐다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig1.jpg"> 
그림 1: 측 뼈 절연 마우스. 일단 마우스 적절 하 게 안락사 되었습니다, 두개골의 기지와 첫 번째 자 궁 경부 척추 사이 절단 하 여 동물을 목을 벨 고 에탄올 소독 (A) 머리를 스프레이. 수술가 위, 뇌 조직 및 뼈를 통해 절단 날카로운 쌍을 사용 하 여 섹션B-(C)의 화살 평면에서 두개골 이등분 Bisected 마우스 머리 (D, 없는 실험적인 작품에 대 한 제거 하는 낮은 mandible) 뇌 조직 측 뼈를 제거 해야 합니다 다음. 청각과 vestibular 신경 통과 (E, 빨간 화살촉)는 유용한 두 foramina 측 뼈를 성공적으로 식별에 대 한 단서. 두개골 (F)에서 육체를 제거 합니다. 외부 귀 운하 (F, 화살표, 맨 위 패널) 뿐만 아니라 유용한 외부 큐를 제공합니다. 신중 하 게 멀리 측 고립 된 뼈 (G)에 그냥 떠나 초과 뼈 손질. 물집 (H, 상위 패널, 붉은 강조 표시 된 영역) 제거 해야 합니다 다음 수 섬세 하 게 잘 집게 (H, 낮은 패널)을 사용 하 여. 물집 얇은 뼈 이며, 수 있다 쉽게 부서진 떨어져 (나) 뼈 미로 달팽이 관의 계시 (J, 빨간 괄호) 될 때까지. 모든 이미지에 스케일 바는 1 m m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig2.jpg"> 
그림 2: 인공 관류. 측 뼈 고립 되어가 물집 제거 되었습니다 일단 달팽이 관 다음 설정할 수 있습니다 현미경에 관류에 대 한. 튜빙 수동으로 구동된 주사기를 사용 하 여 perfusing (A, 라인을 점선) 때 자체 닫는 집게의 쌍을 사용 하 여 달팽이 관을 안정화 하는 데 도움이 수 있습니다. 부드럽게 측 뼈 (B)의 vestibular 부분에는 집게를 연결 하 고 페 트리 접시 (A)의 입술에 대 한 겸 휴식. 이것은 두 손을 자유롭게 관류 동안 악기를 조작 하. 한 손으로 다음, 액체의 유량을 제어 하는 동안 다른 손 집게 (B)의 두 번째 쌍을 사용 하 여 타원형 창을 통해 튜브를 배치할 수 있습니다 주사기를 조작할 수 있습니다. 튜브의 무료 끝 각도 절단 허용 쉽게 위치, 튜브의 시야를 차단 하지 않고 올바로 배치를 허용 합니다. 눈금 막대는 1 m m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig3.jpg"> 
그림 3: decellularized 마우스 달팽이 관의 조직 단면도. 똑바로 피 형광 현미경 (10 X 접 안 렌즈 및 20 X 목표) 200 X의 확대에서 샘플 이미지를 사용 했습니다. 이미지는 약 4 × 5 몽타주를 만들려고 함께 바느질 했다. 셀의 표시 부재 얼룩 핵 DAPI 패널 A DAPI 공통 필터 집합 (350 nm 여기, 470 nm 방출), 그리고 설쳐를 사용 하 여 fluorescein isothiocyanate (FITC) 일반적인 필터를 사용 하 여 autofluorescence의 회색 음영 이미지에에서 표시 됩니다. 세트 (490 nm 여기, 525 nm 방출), 해부학 적 랜드마크를 제공 하는 패널 B에 표시 됩니다. 자동된 셀 수 A 와 B두 패널에 delineated 관심의 3 개 지역에서 수행 했다. 총 세포 수는 전체 조직 단면도 (1, 흰색 실선)과 달팽이 관 (2, 파선)에 대 한 계산 했다. 이 두 숫자 달팽이 관 이상으로 하지만 조직 섹션 (3, 점선 및 파선 사이의 공간)의 외부, 뼈 가장자리에서 뼈 구조에 있는 셀의 수를 계산 하는 데 사용 되었습니다. 모든 이미지에 규모 바 500 µ m입니다.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig4.jpg"> 
그림 4: decellularized 마우스 달팽이 관 1의 가까이 modiolar 섹션 들어갈 hWJCs. DAPI 핵 얼룩 A 해부학 적 랜드마크를 제공 하는 녹색 채널에서 설쳐, 회색조 autofluorescence에 중첩 패널에 표시 됩니다. 자동 셀 카운트 패널 A에 delineated 관심의 3 개 지역에서 수행 되었다. 총 세포 수는 전체 조직 단면도 (1, 흰색 실선)과 달팽이 관 (2, 파선)에 대 한 계산 했다. 이 두 숫자 달팽이 관 이상으로 하지만 조직 섹션 (3, 점선 및 파선 사이의 공간)의 외부, 뼈 가장자리에서 뼈 구조에 있는 셀의 수를 계산 하는 데 사용 되었습니다. B, 패널에 표시 됩니다 절연 DAPI 얼룩이 지 고 자동화 된 정량화 사용 DAPI 얼룩의 임계값 C패널에 표시 됩니다. 모든 이미지에 스케일 바는 500 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig5.jpg"> 
그림 5: decellularized 마우스 달팽이 관 1의 가까이 modiolar 섹션의 높은 확대 보기 들어갈 hWJCs. DAPI 핵 얼룩 A 해부학 적 랜드마크를 제공 하는 녹색 채널에서 autofluorescence의 설쳐, 회색 음영 이미지에 중첩 패널에 표시 됩니다. B, 패널에 표시 됩니다 절연 DAPI 얼룩이 지 고 자동된 셀 카운팅 하는 동안 사용 되는 임계값 이미지 C패널에 표시 됩니다. 유체 공간 및 달팽이 관 내에 위치 해 미세한 마이크로 구조는 decellularization 동안 잘 보존 실험의 문화 단계 세포. 스칼라 Vestibuli (SV), Scala Tympani (SM), Basilar 막 (BM), Tectorial Membrane (TM), 나선 Limbus (L), 로젠 탈의 운하 (RC), Modiolus (M), 나선형 인 대 (SL), 그리고 흔 Vascularis (*). Reissner의 막 조직 섹션에 명확 하 게 정의 되지 않았다 그리고 결과적으로 스칼라 미디어 명확 하 게 정의 되지 않았습니다. 스케일 바의 모든 이미지에는 250 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig6.jpg"> 
그림 6: modiolar에 가까운 부분의 hWJCs 주입 했다 decellularized 마우스 달팽이 2. DAPI 핵 얼룩 패널 A, 해부학 적 랜드마크를 제공 하는 녹색 채널에서 회색조 autofluorescence에 중첩에 표시 됩니다. 자동 셀 카운트 패널 A에 delineated 관심의 3 개 지역에서 수행 되었다. 총 세포 수는 전체 조직 단면도 (1, 흰색 실선)과 달팽이 관 (2, 파선)에 대 한 계산 했다. 이 두 숫자 달팽이 관 이상으로 하지만 조직 섹션 (3, 점선 및 파선 사이의 공간)의 외부, 뼈 가장자리에서 뼈 구조에 있는 셀의 수를 계산 하는 데 사용 되었습니다. B, 패널에 표시 됩니다 절연 DAPI 얼룩이 지 고 자동화 된 정량화 사용 DAPI 얼룩의 임계값 C패널에 표시 됩니다. 모든 이미지에 스케일 바는 500 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig7.jpg"> 
그림 7: hWJCs 주입 했다 decellularized 마우스 달팽이 2의 가까이 modiolar 섹션의 높은 확대 보기. DAPI 핵 얼룩 패널 A, 해부학 적 랜드마크를 제공 하는 녹색 채널에서 회색조 autofluorescence에 중첩에 표시 됩니다. B, 패널에 표시 됩니다 절연 DAPI 얼룩이 지 고 자동된 셀 카운팅 하는 동안 사용 되는 임계값 이미지 C패널에 표시 됩니다. 유체 공간 및 미세한 마이크로 구조는 달팽이 관 내에 위치 해 실험의 decellularization 및 셀 문화 단계 동안 유지 됩니다. 스칼라 Vestibuli (SV), Scala Tympani (SM), Basilar 막 (BM), Tectorial Membrane (TM), 나선 Limbus (L), 로젠 탈의 운하 (RC), Modiolus (M), 나선형 인 대 (SL), 그리고 흔 Vascularis (*). Reissner의 막 조직 섹션에 명확 하 게 정의 되지 않았다 그리고 결과적으로 스칼라 미디어 명확 하 게 정의 되지 않았습니다. 스케일 바의 모든 이미지에는 250 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig8.jpg"> 
그림 8: Hematoxylin와 오신 얼룩 제어 및 치료 cochleae. 되며 및 네이티브 셀 현재 일반적인 달팽이 관을 표시 하는 섹션을 스테인드 오신 패널 A에 표시 됩니다. 패널 B 패널 A,으로 동일한 구조를 포함 하지만 세포 외 매트릭스 뒤에 완전히 decellularized 달팽이 관에서. 2 개의 이전 표시 cochleae hWJCs 주입 패널 C 와 D에서 볼 수 있습니다. 비록 특정 세포 인구와 위치는 극적으로 변경 된 총 인공 해부학 주로 decellularization 및 세포 배양 프로세스를 통해 그대로 남아 있습니다. 스칼라 Vestibuli (SV), Scala Tympani (SM), Basilar 막 (BM), Tectorial Membrane (TM), 나선 Limbus (L), 로젠 탈의 운하 (RC), Modiolus (M), 나선형 인 대 (SL), 그리고 흔 Vascularis (*). 스케일 바의 모든 이미지에는 250 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>A 1 달팽이 관 + 셀</td>
			<td>A2 달팽이 관 + 셀</td>
			<td>B2 부정적</td></tr></tbody></table>제어 달팽이 관
		
		<tr>
			<td>외부 골 질 미로</td>
			<td>3,758</td>
			<td>549</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>뼈가 외부 달팽이 관 공간</td>
			<td>248</td>
			<td>586</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>달팽이 관 내</td>
			<td>518</td>
			<td>701</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>총 셀</td>
			<td>4,524</td>
			<td>1,836</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>섹션 볼륨 (μ)</td>
			<td>0.0077</td>
			<td>0.0100</td>
			<td>0.0147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>달팽이 관의 볼륨의 %</td>
			<td>0.46%</td>
			<td>0.59%</td>
			<td>0.87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>달팽이 관 내의 셀 밀도 추정</td>
			<td>113,759</td>
			<td>118,732</td>
			<td>0</td>
		</tr>
	

표 1: 셀 수. DAPI 스테인드 인공 섹션 thresholded 되었고 관심 (밖에 서 뼈 미 궁, 측 뼈 인공 액체 공간 및 달팽이 관 내) 3 겹치지 않는 영역에 ImageJ의 자동 계산 도구를 사용 하 여 정량. ImageJ, 달팽이 관 단면적 측정 또한 되었다 그리고이 값 섹션 두께 (10 µ m)와 조합에서 섹션 볼륨을 계산 하는 데 사용 되었다. 산 티 외 에 의해 총 인공 볼륨의 견적을 사용 하 여 23, 주어진된 섹션의 상대 인공 볼륨 계산 했다. 전체 달팽이 관의 셀 밀도 짝된 셀 수 조합에 지정 된 섹션의 상대 인공 볼륨을 사용 하 여 추정 되었다.

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A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

내가 조직 공학에 대 한 마우스 Cochleae Decellularizing에 대 한 프로토콜

이 프로토콜의 목표 decellularize 알려줍니다 마우스 cochleae 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 공중 발판으로 이용 하는 효과적인 방법 설명 하는 것입니다.

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.7K 조회수.  University of Kansas Medical Center. 이 프로토콜의 목표 decellularize 알려줍니다 마우스 cochleae 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 공중 발판으로 이용 하는 효과적인 방법 설명 하는 것입니다.

비디오: A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

심근 조직 공학을위한 생물학 유래 주사용 재료의 제조

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

연구

생체공학

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

룽 공학을위한 절차

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

탄성 PGS는 아티 조직 공학 공사장 공중 발판

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying cellular responses under various culture conditions in vitro. The three dimensional environment more closely mimics what the cells observe in vivo due to the application of mechanical and chemical stimuli in all dimensions 1. Three-dimensional hydrogels can either be made from synthetic polymers such as PEG-DA 2 and PLGA 3 or a number of naturally occurring proteins such as collagen 4, hyaluronic acid 5 or fibrin 6,7. Hydrogels created from fibrin, a naturally occurring blood clotting protein, can polymerize to form a mesh that is part of the body's natural wound healing processes 8. Fibrin is cell-degradable and potentially autologous 9, making it an ideal temporary scaffold for tissue engineering.
Here we describe in detail the isolation of neonatal cardiomyocytes from three day old rat pups and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. Neonatal myocytes are a common cell source used for in vitro studies in cardiac tissue formation and engineering 4. Fibrin gel is created by mixing fibrinogen with the enzyme thrombin. Thrombin cleaves fibrinopeptides FpA and FpB from fibrinogen, revealing binding sites that interact with other monomers 10. These interactions cause the monomers to self-assemble into fibers that form the hydrogel mesh. Because the timing of this enzymatic reaction can be adjusted by altering the ratio of thrombin to fibrinogen, or the ratio of calcium to thrombin, one can injection mold constructs with a number of different geometries 11,12. Further we can generate alignment of the resulting tissue by how we constrain the gel during culture 13.
After culturing the engineered cardiac tissue constructs for two weeks under static conditions, the cardiac cells have begun to remodel the construct and can generate a contraction force under electrical pacing conditions 6. As part of this protocol, we also describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including functional analysis of the active force generated by the cardiac muscle construct upon electrical stimulation, as well as methods for determining final cell viability (Live-Dead assay) and immunohistological staining to examine the expression and morphology of typical proteins important for contraction (Myosin Heavy Chain or MHC) and cellular coupling (Connexin 43 or Cx43) between myocytes.

We describe the isolation of neonatal cardiomyocytes and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. We describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including active force generated upon electrical stimulation and cell viability and immunohistological staining.

심장 조직 공학을위한 섬유소 히드로겔에 Cardiomyocytes의 캡슐

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

조직 공학을위한 Electrospun의 Fibres의 Postproduction 처리

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

트라이 전단지 폴리머 밸브의 상대 유체 역학 평가를위한 프로토콜

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

조직 공학을위한 이축 기계 로딩 생물 반응기의 설계

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...