Das aktuelle Projekt wurde von der University of Kansas Beweis des Konzept-Fonds finanziert. Wir möchte das Pflegepersonal an KUMC (Kansas City, KS) unterstützen uns bei der Beschaffung von menschlichen Nabelschnur und David Jorgensen mit Cochleae Kulturen zu unterstützen.

Alle Verfahren, einschließlich tierischen Euthanasie wurden entsprechend dem genehmigten institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) Protokoll (ACUP #2014-2234) an der University of Kansas Medical Center (KUMC) durchgeführt.
Hinweis: HWJCs wurden isoliert von menschlichen Nabelschnur, die von den Patienten gespendet wurden, die Einwilligung zur Verfügung gestellt und Proben dienten im Einklang mit den Protokollen von der University of Kansas menschlichen Themen Ausschuss (KU-IRB #15402) genehmigt.
1. Felsenbein Ernte und Cochlea-Isolation
<ol>
	<li>Enthaupten Sie eine entsprechend euthanasierten, 15 Wochen alten Maus durch Schneiden zwischen dem Schädel und dem ersten Halswirbel mit einem scharfen chirurgische Schere zu, dann sprühen Sie den Kopf mit 70 % Ethanol (Abbildung 1A) zu desinfizieren.</li>
	<li>Halbieren Sie den Schädel in einer Mitte-sagittale Ebene mit den gleichen scharfen chirurgische Schere (Abbildung 1 b-C, gestrichelte Linien).</li>
	<li>Entfernen Sie das Hirngewebe aus dem Schädel mit einer Zange (Abb. 1, Pfeil).</li>
	<li>Identifizieren des Schläfenbeins durch die Anwesenheit des auditorischen und Vestibular Nervenwurzeln (Abb. 1E-F, Pfeilspitzen) auf der Innenseite des Schädels und der Gehörgang von außen (Abb. 1F, Pfeil). Schneiden Sie vorsichtig durch den Schädel des Schläfenbeins vom Rest des Schädels (Abbildung 1) zu isolieren. Hinweis: In einigen Fällen kann es zart hebeln die umliegenden Knochen des Schädels vom Temporal Knochen ohne Schneiden möglich.</li>
	<li>Einfügen der feinen Zange in die Öffnung des Gehörgangs ca. 5 mm (Abbildung 1 H), so dass die Spitzen nicht riskieren Durchbohrung der Cochlea. Sanft aufbrechen die Knochen von Pufels (Abbildung 1 H, Top rot schraffierte Fläche) so dass es Frakturen (Abbildung 1I, rote gepunktete Linie). Hinweis: Bei Bedarf kann eine Dissektion Mikroskop dabei Hilfe für präzise Positionierung und Handhabung der Instrumente zu gewährleisten.</li>
	<li>Mit feinen Pinzette, Hebeln Sie entfernt den Rest der Bulla aus dem Felsenbein, Freilegung der knöchernen Labyrinths der Cochlea (Abbildung 1J, roten Klammern).</li>
	<li>Legen Sie eine Petrischale groß genug für das Felsenbein (z.B., 30 mm oder größer) unter dem sezieren Umfang Sichtfeld und füllen es mit genügend Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zur Deckung des Schläfenbeins (z.B. 0,5 bis 1 mL).</li>
	<li>Tauchen Sie das Felsenbein mit der Bulla in PBS mit ovalen und runden Fenster der Cochlea nach oben entfernt. Hinweis: Entfernen des vestibulären Systems aus der Cochlea ist nicht notwendig, da das vestibuläre System auch als Griff dient für Manipulation und Funktionen der Cochlea (Abbildung 1I und Abbildung 2 b) orientieren.</li>
	<li>Mit einer ultra-feine Pinzette, entfernen Sie die stapedial Arterie, die durch den Steigbügel führt.</li>
	<li>Legen Sie eine Spitze der ultrafeinen Zange durch den Bogen von den Steigbügel, wo die Arterie durchlaufen, und zart heben Sie die Steigbügel nach oben. Die Sauropoden Steigbügel sollten deaktivieren des ovalen Fensters aufheben.</li>
	<li>Mit einer Spitze der ultra-feine Zange, Punktion des Ovals und Runde Fenster.</li>
	<li>Gefüllt mit einer 1 X PBS 28,5-Gauge-Spritze mit Schlauch (Innendurchmesser 0,28 mm, Außendurchmesser 0,61 mm) befestigt, positionieren Sie den Schlauch über das ovale Fenster (Abbildung 2A -B). Hinweis: Die Öffnung des Röhrchens manipuliert werden kann mit ultra-feinen Pinzette helfen, die um genaue Platzierung zu gewährleisten.<ol>
		<li>Verwenden Sie frische Spritze und Schläuche für jede Cochlea.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfundieren Sie 2 mL 10 % Antibiotikum Antimykotikums (Anti-Anti) und 10 % Penicillin-Streptomycin (Stift-Strep) mit PBS-Puffer durch die Cochlea über 5 min die Perilymphe zu entfernen. Zu schnell mit zu viel Druck Vorrichtung beschädigen die feinen Strukturen in der Cochlea. Hinweis: Manuell fahren die Spritze von hand um die Flüssigkeit durch die Cochlea durchspülen ist wirksam, obwohl eine Perfusion Pumpe als Alternative verwendet werden könnte.<ol>
		<li>Verwenden Sie manuelle Vorrichtung, ein paar feine, selbstschließende Pinzette zur Stabilisierung der Cochlea (Abbildung 2A) während der Perfusion durch das Greifen des vestibulären Teils des Schläfenbeins. Hinweis: Obwohl nicht erforderlich, dies lässt beide Hände frei, Instrumente zu behandeln; Einerseits kann die Spritze (Abbildung 2A) fahren, während die andere den Schlauch positionieren kann entsprechend (Abb. 2 b).</li>
		<li>Von diesem Schritt vorwärts, kümmern uns um die Cochlea unnötig an der Luft auszusetzen zu vermeiden. Einführung von Luftblasen in die fließende Räume Flüssigkeitszirkulation blockiert, und weitere Austrocknen die feinen Strukturen in der Cochlea beschädigt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie alle restlichen Muskel und Knochen Fragmente mit feinen Pinzette.</li>
	<li>Gegebenenfalls speichern Sie isolierten Cochleae bei 4 ° C in Anti-Anti 10 % und 10 % Stift-Strep Lösung mit PBS-Puffer für bis zu sieben Tage mit regelmäßigen Änderungen antibiotische Lösung alle 48 h.</li>
</ol>
(2) Cochlea-Verarbeitung
<ol>
	<li>Decellularization
	<ol>
		<li>Für jede Cochlea füllen ein 20-mL-Glas funkeln Fläschchen mit einer 1 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) Lösung in deionisiertes (DI) Wasser, das verwendet wird, um decellularize die Cochlea.</li>
		<li>Schneiden Sie die Spitze weg von einem Kunststoff 7 mL Transferpipette mit einer Rasierklinge, so dass die Öffnung groß genug für ein Cochlea ist passieren.</li>
		<li>Mit der Transferpipette, sanft Aufstellen der Cochlea in die Pipette also es nur die Cut-off Rand um wenige Millimeter geht.</li>
		<li>Die Cochlea in 1 % SDS-Lösung gefüllt funkeln Fläschchen zu vertreiben.</li>
		<li>Zirkulieren Sie 2 mL 1 % SDS deionisiertes (DI) Wasser durch die Cochlea im Funkeln Fläschchen mit einer Transferpipette.</li>
		<li>Legen Sie das Funkeln-Fläschchen in ein Rotator und ermöglichen Sie das Funkeln Fläschchen mit 10 u/min für 72 h bei Raumtemperatur rotieren.<ol>
			<li>1 % SDS-Lösung alle 24 h über einen Zeitraum von 72 Stunden zu ändern. Vorsicht beim SDS um der Cochlea an die Luft setzen Sie niemals ändern.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Die Cochlea dreimal für jeweils 30 min. mit VE-Wasser zu waschen.</li></ol></li></ol>Führen Sie Waschungen in dem gleichen funkeln Vial verwendet für die SDS-Gebühren; in diesem Stadium ist die Cochlea decellularized.
	
	
	<li>Entkalkung
	<ol>
		<li>Entfernen des Restwassers DI aus der Durchstechflasche funkeln, verlassen gerade genug, um die Cochlea eingetaucht.</li>
		<li>Fügen Sie Entkalkung zunächst 5 mL 10 % Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (0,02 M) in VE-Wasser, das Funkeln-Fläschchen mit der Cochlea.</li>
		<li>Zirkulieren Sie 2 mL 10 % EDTA DI Wasser durch die Cochlea im Funkeln Fläschchen mit einer Transferpipette.</li>
		<li>Das Funkeln Fläschchen zurück in den Rotator, und ermöglichen Sie das Funkeln Fläschchen mit 10 u/min für 72 h bei Raumtemperatur rotieren. Wechseln Sie die 10 % EDTA Lösung alle 24 h über einen Zeitraum von 72 h. Vorsicht beim Lösungen zu ändern, so dass die Schnecke nicht Luft ausgesetzt ist.</li>
		<li>Spülen Sie die Cochlea 3 Mal für jeweils 2 h mit 1 X PBS; in diesem Stadium ist die Cochlea entkalkt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lagerung
	<ol>
		<li>Speichern der Cochleae für bis zu 72 h in einer 10 % Anti-Anti, 10 % Feder-Strep Lösung mit PBS-Puffer bei 4 ° c Hinweis: Längere Lagerung können mit regelmäßigen Änderungen antibiotische Lösung möglich sein; längere Lagerung von verarbeiteten Cochleae wurde jedoch nicht in diesem Protokoll validiert.</li>
	</ol>
	</li>

3. Beschaffung und den Ausbau der hWJCs
<ol>
	<li>HWJCs nach zuvor veröffentlichten Protokolle22zu isolieren. Kurz, Segment Nabelschnüre in 3-cm-Abschnitte.</li>
	<li>Machen Sie sorgfältig einen flachen Schnitt mit einem Skalpell auf jedem Segment der Nabelschnur zu entrollen und setzen die Wharton Gelee von der Nabelschnur in Längsrichtung. Verwenden Sie Zange um die Blutgefäße zu entfernen.</li>
	<li>Waschen Sie Segmente der Nabelschnur zweimal mit genügend PBS (z.B. 40 mL in einem 60 mm Petrischale), um das Gewebe zu tauchen. Hacken Sie fein Gewebe Segmente mit einem Skalpell. Gewebe in einem 100 mm Petrischale mit 50 mL Verdauung Medium zu verdauen (0,2 % Typ 2 Kollagenase, 1 % Penicillin-Streptomycin, in niedrig-Glukose Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM)).</li>
	<li>Legen Sie Gewebe bei der Verdauung von Medium auf einem Orbitalschüttler bei 50 u/min über Nacht in einer 5 % CO2, 37 ° C Inkubator. Am nächsten Tag Verdauung Medium in einem Verhältnis von 01:16 in 2 % Antibiotikum Antimykotikums in PBS verdünnen und pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 500 X g bei Raumtemperatur (~ 27 ° C) für 10 min. verwerfen überstand.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Pellets in mesenchymale Stammzellen Wachstum Medium (MSCGM) und rekombinieren Sie Zellen. Platte Zellen bei einer Dichte von 7 x 103 Zellen/cm2 in Gewebekultur behandelt T-75 Flaschen. Kultur HWJCs in MSCGM, und erweitern Sie auf Abschnitt 5 für Experimente. Hinweis: HWJCs können Sub kultiviert werden in größeren T-Fläschchen (z.B.t-150, T-300) beim Passagierung zur Erhöhung der Ausbeute an hWJCs für Experimente.</li>
</ol>
(4) Infusion von hWJCs in Decellularized Cochleae
<ol>
	<li>Bereiten Sie decellularized cochleae
	<ol>
		<li>Mit aseptischen Technik gespeicherten Cochleae in 1 X PBS dreimal für jeweils 30 min. waschen.</li>
		<li>Cochleae in separaten Vertiefungen einer 24-Well-Platte übertragen, und fügen Sie 1 mL von 37 ° C vorgewärmt MSCGM.</li>
		<li>Inkubieren Sie Cochleae in einer 5 % CO2, 37 ° C Zelle Kultur Inkubator für ein Minimum von 1 h vor der Infusion von Zellen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HWJCs distanzieren und Aufschwemmen
	<ol>
		<li>Waschen hWJCs mit 37 ° C vorgewärmt es 1 X PBS zweimal.</li>
		<li>Fügen Sie genügend 37 ° C vorgewärmt Trypsin mit 0,5 % EDTA an die Zelloberfläche Schiff zu decken.</li>
		<li>Inkubieren Sie hWJCs für bis zu 5 min in einer 5 % CO2, 37 ° C Zelle Kultur Inkubator.<ol>
			<li>Vergewissern Sie sich, dass 90 % der Zellen von der Zelloberfläche Kultur getrennt haben, indem Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop ansehen. Hinweis: Zellen, die sich bewegen, wenn das Kulturgefäß sanft getippt wird, getrennt haben. Zellen, die stationär bleiben, nicht gelöst haben.</li>
			<li>Klopfen Sie leicht die Seiten des Kolbens, weiteren angeschlossene Zellen verdrängen.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aseptischen Technik verwendet, Transfer hWJCs aus dem Kulturgefäß für eine 50mL konische Röhrchen mit gleichwertigem Umfang des MSCGM auf das Volumen des Trypsin, die Zellen zu trennen.</li>
		<li>Pellet-die hWJCs durch Zentrifugieren bei 500 X g bei Raumtemperatur (~ 27 ° C) für 5 Minuten.</li>
		<li>Aspirieren Sie überstand und aufzuwirbeln Sie hWJCs in MSCGM in einer Konzentration von 500.000 Zellen/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfundieren cochleae
	<ol>
		<li>Übertragen Sie Cochleae auf einen neuen 24-Well-Platte mit einer Transferpipette.</li>
		<li>Einen Tropfen des MSCGM auf jede Schnecke, Cochlea Austrocknen verhindert wird.</li>
		<li>Zart orientieren Sie die Cochlea mit ultra-feine Pinzette, so dass die ovalen und runden Fenster sind nach oben. Hinweis: Extreme Vorsicht im Umgang mit direkt jede Schnecke da die Cochlea leicht beschädigt ist.</li>
		<li>Mit einer sterilen 28,5-Gauge-Insulin-Spritze mit angeschlossenen Schläuchen, erarbeiten von 0,2 mL Nukleinsäuretablette hWJCs (100.000 Zellen).</li>
		<li>Positionieren Sie mit sterilisierten feine Pinzette, Schlauch über das ovale Fenster.</li>
		<li>Zart und langsam durchspülen die Cochlea mit 0,2 mL resuspendierte hWJCs mit einer 28,5-Gauge Insulin Spritze verbunden mit Polyethylen-Rohre (Außendurchmesser: 0,61 mm, Innendurchmesser: 0,28 mm) über ca. 5 min.</li>
		<li>Fügen Sie nach der Perfusion, 0,8 mL von 37 ° C vorgewärmt MSCGM, die gut mit der Cochlea, das Gesamtvolumen in den Brunnen zu 1 mL zu bringen.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritte 4.3.3-4.3.7 für jede Schnecke, mit einer frischen Spritze und Schlauch jedes Mal.</li>
		<li>Perfundierten Cochleae in einer 5 % CO2, 37 ° C Zelle Kultur Inkubator und ändern Sie Medien dreimal pro Woche zu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
(5) Cochlea Ernte und Konservierung
Hinweis: Cochleae möglicherweise kultiviert und geerntet zu jedem Zeitpunkt bis zu 30 Tage nach dem Perfusion.
<ol>
	<li>Um Cochleae zu bewahren, in 4 % Paraformaldehyd in 1 X PBS über Nacht bei 4 ° C auf einem schaukelnden Plattform zu beheben.</li>
	<li>Waschen Sie nach der Fixierung Cochleae mit 1 X PBS drei Mal für 5 Minuten.</li>
	<li>Allmählich austrocknen Cochlea mit Ethanol und klar mit einem aliphatische Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel vor Einbettung in Paraffin.</li>
	<li>Abschnitt-Proben bis zu einer Dicke von 10 µm, die mit einem Mikrotom und Mount auf Glas-Objektträger. Hinweis: Die Proben sind nun bereit für histologische oder immunhistochemische Bearbeitung mit standard-Protokolle.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir haben erfolgreich gezeigt, dass native Cochlea-Zellen aus der Cochlea über einen Decellularization-Prozess entfernt werden können, ermöglicht die Verwendung der Cochlea als eine komplizierte, dreidimensionale Gewebe-Gerüst. Santi Et Al. 15 die erste Methode für einem Cochleae entwickelt und haben genau die Volumen der durch viele Cochlea-Strukturen mit Hilfe von leichten Merkblatt Mikroskopie23geschätzt. Diese frühen Arbeiten war eine starke Basis für die Gewebe-Engineering und Zelle Kultur hier vorgestellten Techniken. Decellularized Cochlea kann erfolgreich mit Zellen infundiert werden und dann für einen längeren Zeitraum hinweg kultiviert. Cochleae aus einer Vielzahl von Tieren könnte theoretisch in Kombination mit einer ebenso großen Auswahl von Zellen genutzt werden. Diese Kombinationen können die Techniken, die hier vorgestellt werden, um in zahlreichen möglich experimentellen Designs, wie Gewebe, technische Anwendungen, das sensorische Epithel Entwicklung14untersuchen, Drogen-Tests neuer pharmazeutischer Wirkstoffe genutzt werden 24, und Entwicklung von Cochlea-Reparatur Modelle25. Sie sind jedoch trotz der breiten Anwendbarkeit dieser Techniken nicht ohne Einschränkungen.
Eine Einschränkung der aktuellen Technik ist, dass die Perfusion Variable basierend auf einzelnen. Eine Halterung für die Cochlea, Entwicklung und dem Einsatz einer Spritzenpumpe Verbandwechsel durchzuführen können die Richtigkeit und den Erfolg des Prozesses erhöhen. Darüber hinaus könnte die endgültig beweisen erfolgreiche Decellularization potenziell durch verschiedene Methoden erreicht werden. Wir beschäftigt DAPI Färbung, die verwendet wurde, um die verbleibenden Zellkerne zu quantifizieren, und wir beobachteten keine verbleibenden Kerne Post-Decellularization. Darüber hinaus nutzen standard DNA Quantifizierung Assays Reagenz, grünen Farbstoff erkennen Picogram Mengen von DNA, Nukleinsäure-Überreste zu identifizieren, die optisch als DAPI möglicherweise empfindlicher für die Ermittlung der Anwesenheit von kleine Fragmente von Nukleinsäuren Säuren in decellularized Gewebe26. Unabhängig davon, welche Techniken verwendet werden, um erfolgreiche Decellularization zu validieren möglicherweise es nicht möglich, vollständige Decellularization eines einzelnen Cochlea vor nutzen es als Gerüst zu zeigen. Allerdings fanden wir den Decellularization-Prozess erfolgreich und robust.
Die beiden wichtigsten Schritte in das aktuelle Protokoll sind die Isolation und der Umgang mit den Cochleae und die Durchblutung der Cochleae. Große Vorsicht ist geboten, wenn die Cochlea zunächst isoliert ist, wie die Cochlea zart und spröde ist. Wenn zu viel Kraft beim Umgang mit der Cochlea mit Zange angewendet wird, könnte die Cochlea fragment. Daher ist es unerlässlich, jede Schnecke vor Decellularization und Entkalkung sanft behandeln. Das vestibuläre System dient bleibt intakt, als ein großer Griff für das Innenohr Komplex mit einer Pinzette greifen und Ausrichten der Cochlea. Ebenso wenn die Cochlea mit Zellen Vorrichtung, der Druck hinter der Perfusion darf nicht zu groß sein, sonst Zellen möglicherweise nicht überleben die Perfusion. Wie in dem aktuellen Protokoll erwähnt, ermöglicht das anbringen Schlauch bis zum Ende einer 1-mL Insulin-Spritze zur einfacheren Handhabung der Cochlea mit einer Hand und höhere Präzision bei der Vorrichtung Zellen durch die Cochlea mit der anderen Hand.
Als nächster Schritt wäre es natürlich zu beurteilen, Entwicklungs- und funktionellen Markierungen, um festzustellen, ob die Cochlea-ECM Differenzierung von Stammzellen Induktion ist, und wenn so, welche spezifische ECM-Komponenten in der Cochlea sind Veränderungen in Zellen induzieren. Perfusing verschiedene Arten von Zellen (z.B., Stammzellen, Neuroprogenitors, Fibroblasten, etc.) durch die Cochlea, Monitor-Zell-Differenzierung und Verhalten wäre eine weitere faszinierende Follow-up-Untersuchung. Darüber hinaus können Zellen, die gentechnisch verändert wurden oder ein Wachstumsfaktor Differenzierung Protokoll ausgesetzt sind erlauben neue Einblicke in wie die Cochlea-ECM neurosensorischen Entwicklung unterstützt und möglicherweise sogar Funktion in Verhandlung. Das aktuelle Protokoll ist somit ein wichtiger erster Schritt bei der Verwendung der Cochlea-ECM, um Innenohr neurosensorischen Entwicklung und Wartung, die vielleicht eines Tages zur Entwicklung neuer Therapien zum Verlust der Hörfähigkeit wiederherstellen führen zu studieren.

Die Cochlea ist eine komplizierte Spiralstruktur in das Felsenbein gefunden. Es besteht aus einem äußeren knöchernen Labyrinth und eine konzentrische, innere Membranous Labyrinth1. Die Membranous Labyrinth besteht aus drei fließende Räume: Scala Vestibuli, Scala Media und Scala Pauke1. Die Scala Media beherbergt das sensorische Epithel, die aus einer Vielzahl von Zelltypen besteht, aber die sensorischen Haarzellen (HC), die mechanischen Energie in Schallwellen in Nervenimpulse2transduzieren, von besonderem Interesse sind. Belastung durch Knalltrauma3,4,5, Medikamente6, Krankheit7,8und Altern9 kann alle Beeinträchtigung der auditiven Funktion über HC Tod führen. Haarzelle Verlust bei Säugetieren ist dauerhaft, im Gegensatz zu Vogelgrippe HCs, die nach Verletzungen10regenerieren können.
Eine Vielzahl von zeitgenössischen Forschungsbemühungen haben versucht, Wiederherstellen von verlorenen HCs, obwohl die spezifische experimentelle Ansätze variieren. Manipulation der gen-Expression in den sensorischen Epithel und Implantation von Stammzellen differenzierte außerhalb des Körpers sind dominante Ansätze im Bereich, obwohl Induktion Methoden, die darauf abzielen, Stammzellen in Cochlea Organellen zu unterscheiden gewesen 11,12,13versucht. Jeder dieser Ansätze ist entweder direkt auf Stammzellen oder die Entwicklungsstörungen Cues verwendet durch Stammzellen; jedoch eine zweite geteilt und potenziell kritische Element ist das ECM der Cochlea selbst14,15.
ECM bietet nicht nur physische Unterstützung für Zellen und Gewebe, die eine Oberfläche für die Zelladhäsion, Proliferation, überleben und Migration, aber auch spielt entscheidende Rolle bei der Entwicklung der HCs und die Spirale Ganglion15,16 ,17. Natürlich bietet vorkommende ECM induktive Signale, die Zelle Phänotyp Entschlossenheit und/oder Zelle Adhäsion, Vermehrung und überleben18führen können. Daher die Verwendung von decellularized Cochlea in Kombination mit kultivierten hWJCs bieten eine einmalige Gelegenheit, die Rolle der ECM und HC Regeneration zu erforschen. HWJCs sind eine schnell verfügbare, unumstrittenen Zelltyp abseits der menschlichen Nabelschnur, die Verhalten sich wie mesenchymalen Stammzellen19. HWJCs haben die Fähigkeit zu differenzieren, neurosensorische Zelle Linien20,21gezeigt. So beschreibt das aktuelle Protokoll der Isolation, Decellularization und Durchblutung des Cochleae von C57BL Maus Kadaver mit hWJCs für das Innenohr Tissue Engineering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Allegra X-14R Centrifuge</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>B08861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intramedic Semi-Rigid Tubing</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1190-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18155-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL Conical Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB087579B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-100 Insulin Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-341-73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-170-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-170-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear-Rite 3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-046341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-998-078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal Stem Cell Growth Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP T-75 Culture Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP T-150 Culture Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPP T-300 Culture Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MFA51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>NU-425-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% SDS Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>436143-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for decellularizing mouse cochleae for inner ear tissue engineering

Bei Säugetieren, Mechanosensory Haarzellen, die Anhörung fehlt die Fähigkeit zu regenerieren, zu erleichtern hat die Behandlungen für Hörverlust beschränkt. Aktuelle Strategien der regenerativen Medizin konzentrierten sich auf die Transplantation von Stammzellen oder genetische Manipulation der umliegenden Stützzellen im Innenohr zu ermutigen, Ersatz der beschädigten Zellen, Verlust der Hörfähigkeit zu korrigieren. Doch die extrazelluläre Matrix (ECM) kann spielen eine entscheidende Rolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung der Funktion der Haarzellen und nicht gut untersucht. Mit dem Cochlea-können ECM als Gerüst zu adulten Stammzellen wachsen einzigartige Einblicke in wie die Zusammensetzung und die Architektur der extrazellulären Umgebung aids Zellen bei der Aufrechterhaltung des Gehörs. Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung und einem Cochleae von Mäusen, als Gerüste akzeptieren perfundierten adulten Stammzellen zu verwenden. In dem aktuellen Protokoll sind Cochleae isoliert euthanasierten Mäuse, decellularized und entkalkt. Danach wurden menschliche Wharton Gelee Zellen (hWJCs), die aus der Nabelschnur isoliert wurden sorgfältig in jedem Cochlea durchblutet. Die Cochleae dienten als Bioreaktoren, und Zellen waren für 30 Tage vor einer Bearbeitung für die Analyse kultiviert. Decellularized Cochleae identifizierbare extrazelluläre Strukturen beibehalten, aber das Vorhandensein von Zellen oder spürbare Fragmente von DNA nicht offenbart. Zellen in die Cochlea durchblutet erobert die meisten von Interieur und Exterieur der Cochlea und wuchs ohne Zwischenfall über eine Dauer von 30 Tagen. So kann die aktuelle Methode verwendet werden, wie Cochlea-ECM Affekte Zellentwicklung und Verhalten zu studieren.

Mithilfe der hier vorgestellten Methoden, erfolgreiche Decellularization Cochleae wurden abgeschätzt, indem untersucht das Vorhandensein oder Fehlen von DNA durch 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Färbung. Cochleae galten als voll decellularized, wenn DNA in der decellularized Cochlea nicht erkannt wurde. Ein native Cochlea aus einer früheren Experiment, die nicht Decellularization oder Entkalkung unterzogen wurde als Positivkontrolle verwendet, um die Strukturen und Zellen, die traditionell in ein C57BL Maus Cochlea veranschaulichen. Die decellularized-entkalkt Cochlea, die keiner hWJCs durchdrungen hatten, diente als Negativkontrolle. Keine quantifizierbaren DAPI gefärbt Zellkerne wurden in jeder Region des Abschnitts Gewebe (Abbildung 3) beobachtet. Zwei Cochleae wurden decellularized und entkalkt und dann mit hWJCs für das aktuelle Projekt infundiert. Der decellularized-entkalkt Cochleae, die mit hWJCs durchströmt wurden beobachtet, haben zahlreiche DAPI gefärbt Kerne innerhalb der Cochlea und wachsen auf die knöcherne Hülle außerhalb der Cochlea (Tabelle 1). Geschätzte Zelldichten für die Zelle infundiert erste Cochlea wurden 113.759 Zellen/Cochlea nach 30 Tagen der Kultur (Abbildung 4 und Abbildung 5) und für die zweite Cochlea 118.732 Zellen/Cochlea nach 30 Tagen der Kultur wurden (Abbildung 6 und ( Abbildung 7). Diese Zelle Dichte Schätzungen gehören die Scala Pauke, Scala Media, Scala Vestibül und Volumen der Strukturen innerhalb der drei fließende Räume gefunden, aber diese Schätzungen eines der verbleibenden knöchernen Labyrinth ausgeschlossen. Darüber hinaus wurden Proben aus jedem Cochlea gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin (H &#38; E) zeigen die Anwesenheit von Zellen und anatomischen Gegebenheiten in jedem Cochlea (Abbildung 8). Die Anatomie der Cochlea-Mikrostrukturen unverändert überwiegend alle gefärbten Abschnitten; jedoch keine Zellen, die im Abschnitt decellularized-entkalkt (Abbildung 8 b) erkennbar waren. Die Identifizierung der Zellkerne war dramatisch anders zwischen der nativen Cochlea (Abb. 8A) und die decellularized-entkalkt Cochleae Zellen (Abbildung 8–D) durchdrungen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Maus Felsenbein Isolierung. Sobald die Maus entsprechend eingeschläfert worden, das Tier durch Schneiden zwischen der Basis des Schädels und des ersten Halswirbels zu enthaupten und Sprühkopf mit Ethanol (A) zu desinfizieren. Halbieren Sie den Schädel in einer Sagittalebene Abschnitt (B–C) mit einer scharfen chirurgische Schere, Schnitt durch das Gehirngewebe und Knochen. Die halbierten Maus-Kopf (D, unteren Unterkiefer entfernt für unabhängige experimentelle Arbeit) muss dann das Hirngewebe entfernt, um das Felsenbein offenbaren. Die zwei Foramina durch die auditive und Vestibular Nerven-Pass (E, roten Pfeilspitzen) sind nützlich Hinweise für erfolgreichen Identifizierung des Schläfenbeins. Entfernen Sie das Fleisch aus dem Schädel (F). Der äußeren Gehörgang (F, Pfeil, Oberboden) bietet einen nützlichen externe Hinweis sowie. Sorgfältig trim entfernt überschüssige Knochen, so dass nur die isolierte Felsenbein (G). Bulla (H, Abdeckung, rot markierter Bereich) muss dann mit feinen Pinzette (H, untere Leiste) vorsichtig entfernt werden. Die Bulla ist dünne Knochen und kann sein leicht angeschlagen entfernt (ich) bis das knöcherne Labyrinth der Cochlea offenbarten (J, rote Klammern) ist. Maßstabsleisten auf allen Bildern sind 1 mm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Cochlea-Perfusion. Sobald das Felsenbein isoliert wurde und die Bulla entfernt wurde, kann die Cochlea dann Durchblutung am Mikroskop eingerichtet werden. Wenn Vorrichtung mit einer manuell betriebenen Spritze mit Schlauch (A angeschlossen, gepunktete Linie) kann es zur Stabilisierung der Cochlea mit einem Paar von selbstschließende Pinzette hilfreich sein. Sanft legen Sie die Zange auf die vestibuläre Teil des Schläfenbeins (B) und ruhen Sie die Zange gegen die Lippe der Petrischale (A). Dadurch können beide Hände frei, Instrumente während der Perfusion zu manipulieren. Einerseits kann dann bearbeiten die Spritze, steuern den Durchfluss der Flüssigkeit, während die andere Hand den Schlauch über das ovale Fenster mit einer zweiten Zange (B) positionieren kann. Schneiden das freie Ende des Schlauches in einem Winkel ermöglicht einfacher Positionierung, so dass den Schlauch richtig platziert werden, ohne das Sichtfeld zu blockieren. Maßstabsleiste beträgt 1 mm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Gewebekapitel eine decellularized Maus Cochlea. Eine aufrechte Epi-Leuchtstoff-Mikroskop wurde verwendet, um Bild-Proben bei einer Vergrößerung von 200 X (10 X Okular und 20 X Objektiv). Bilder wurden aneinander genäht, um etwa eine 4 x 5-Montage zu erstellen. DAPI nuklearen Färbung zeigt Fehlen von Zellen wird im Panel A mit DAPI Filter einheitlicher (350 nm Anregung, 470 nm Emission) und ein überbelichtetes, Graustufenbild von der Autofluoreszenz mit einem Fluorescein erfolgt (FITC) gemeinsame Filter angezeigt. Set (490 nm Anregung, 525 nm Emission), der anatomische Landmarken vorsieht, wird im Bedienfeld " B" angezeigt. Automatisierte Zellzahlen wurden in drei Regionen von Interesse, durchgeführt, die auf beide Platten A und Babgegrenzt werden. Insgesamt Zellzahlen wurden für das gesamte Gewebe Abschnitt (1, durchgezogene weiße Linie) und der Cochlea (2, gestrichelte Linie) berechnet. Diese beiden Zahlen wurden zur Berechnung der Anzahl der Zellen in die knöchernen Strukturen außerhalb der Cochlea aber innerhalb der äußeren, knöchernen Ränder des Abschnitts Gewebe (3, Raum zwischen der gepunkteten Linie und gestrichelte Linie). Maßstabsleisten auf allen Bildern sind 500 µm.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig4.jpg"> 
Abbildung 4: ein in der Nähe von modiolar Abschnitt decellularized Maus Cochlea 1 infundiert mit hWJCs. DAPI nuklearen Färbung wird im Fenster angezeigt, die A auf eine überbelichtete, Graustufen Autofluoreszenz des grünen Kanals überlagert die anatomische Landmarken bietet. Automatisierte Zelle zählt wurden durchgeführt in drei Regionen von Interesse, die in zentrale Aabgegrenzt werden. Insgesamt Zellzahlen wurden für das gesamte Gewebe Abschnitt (1, durchgezogene weiße Linie) und der Cochlea (2, gestrichelte Linie) berechnet. Diese beiden Zahlen wurden zur Berechnung der Anzahl der Zellen in die knöchernen Strukturen außerhalb der Cochlea aber innerhalb der äußeren, knöchernen Ränder des Abschnitts Gewebe (3, Raum zwischen der gepunkteten Linie und gestrichelte Linie). Isolierte DAPI-Färbung wird im Bedienfeld " B" angezeigt, und die Schwelle der DAPI-Färbung verwendet, während automatisierte Quantifizierung wird im Bedienfeld " C" angezeigt. Maßstabsleisten auf allen Bildern sind 500 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig5.jpg"> 
Abbildung 5: hoher Vergrößerung Blick auf einen in der Nähe von modiolar Abschnitt decellularized Maus Cochlea 1 infundiert mit hWJCs. DAPI nuklearen Färbung wird im Fenster angezeigt, die A auf eine überbelichtete, Graustufenbild Autofluoreszenz des grünen Kanals überlagert die anatomische Landmarken bietet. Isolierte DAPI-Färbung wird im Bedienfeld " B" angezeigt, und verwendete, während automatisierte Zellzählung Schwelle Bild wird im Bedienfeld " C" angezeigt. Die fließende Räume und feiner Mikrostrukturen, untergebracht in der Cochlea sind gut erhalten, während die Decellularization und Zell-Kultur Phasen des Experiments. Scala Vestibuli (SV), Scala Pauke (SM), Basilarmembran (BM), Tectorial Membrane (TM), Spirale Limbus (L), Rosenthals Canal (RC), Modiolus (M), Spirale Ligament (SL) und Stria Vascularis (*). Reissner Membran wurde in Gewebeschnitten nicht klar definiert, und infolgedessen die Scala Media war nicht klar definiert. Maßstabsleisten auf allen Bildern sind 250 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig6.jpg"> 
Abbildung 6: eine in der Nähe von modiolar Abschnitt decellularized Maus Cochlea 2, die mit hWJCs infundiert wurde. DAPI nuklearen Färbung zeigt sich in Gruppe A, überlagert auf Graustufen Autofluoreszenz aus den Grün-Kanal, die anatomische Landmarken bietet. Automatisierte Zelle zählt wurden durchgeführt in drei Regionen von Interesse, die in zentrale Aabgegrenzt werden. Insgesamt Zellzahlen wurden für das gesamte Gewebe Abschnitt (1, durchgezogene weiße Linie) und der Cochlea (2, gestrichelte Linie) berechnet. Diese beiden Zahlen wurden zur Berechnung der Anzahl der Zellen in die knöchernen Strukturen außerhalb der Cochlea aber innerhalb der äußeren, knöchernen Ränder des Abschnitts Gewebe (3, Raum zwischen der gepunkteten Linie und gestrichelte Linien). Isolierte DAPI-Färbung wird im Bedienfeld " B" angezeigt, und die Schwelle der DAPI-Färbung verwendet, während automatisierte Quantifizierung wird im Bedienfeld " C" angezeigt. Maßstabsleisten auf allen Bildern sind 500 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig7.jpg"> 
Abbildung 7: hoher Vergrößerung Blick auf einen in der Nähe von modiolar Abschnitt decellularized Maus Cochlea 2, die mit hWJCs infundiert wurde. DAPI nuklearen Färbung zeigt sich in Gruppe A, überlagert auf Graustufen Autofluoreszenz aus den Grün-Kanal, die anatomische Landmarken bietet. Isolierte DAPI-Färbung wird im Bedienfeld " B" angezeigt, und verwendete, während automatisierte Zellzählung Schwelle Bild wird im Bedienfeld " C" angezeigt. Die fließende Räume und feiner Mikrostrukturen innerhalb der Cochlea untergebracht werden während der Decellularization und Zelle Kultur des Experiments beibehalten. Scala Vestibuli (SV), Scala Pauke (SM), Basilarmembran (BM), Tectorial Membrane (TM), Spirale Limbus (L), Rosenthals Canal (RC), Modiolus (M), Spirale Ligament (SL) und Stria Vascularis (*). Reissner Membran wurde in Gewebeschnitten nicht klar definiert, und infolgedessen die Scala Media war nicht klar definiert. Maßstabsleisten auf allen Bildern sind 250 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56523/56523fig8.jpg"> 
Abbildung 8: Hämatoxylin und Eosin Färbung des Steuerelements und behandelten Cochleae. Hämatoxylin und Eosin befleckt Abschnitte zeigt ein typisches Cochlea mit native Zellen vorhanden ist in zentrale Agezeigt. Abdeckung B enthält die gleichen Strukturen als zentrale A, jedoch ist von einer vollständig decellularized Cochlea, die die extrazelluläre Matrix hinterlässt. Die zwei bisher gezeigte Cochleae, angereichert mit hWJCs sind in C und D-Panels gesehen. Die grobe Cochlea-Anatomie unverändert überwiegend durch die Decellularization und Kultur Zellprozesse, obwohl die spezifische Zellpopulationen und Standorte dramatisch verändert. Scala Vestibuli (SV), Scala Pauke (SM), Basilarmembran (BM), Tectorial Membrane (TM), Spirale Limbus (L), Rosenthals Canal (RC), Modiolus (M), Spirale Ligament (SL) und Stria Vascularis (*). Maßstabsleisten auf allen Bildern sind 250 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56523/56523fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>A1 Cochlea + Zellen</td>
			<td>A2 Cochlea + Zellen</td>
			<td>B2 Neg.</td></tr></tbody></table>Kontrolle Cochlea
		
		<tr>
			<td>Äußeren knöchernen Labyrinth</td>
			<td>3.758</td>
			<td>549</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knochen Cochlea Aussenräume</td>
			<td>248</td>
			<td>586</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Cochlea</td>
			<td>518</td>
			<td>701</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insgesamt Zellen</td>
			<td>4.524</td>
			<td>1.836</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schnittkörper (μl)</td>
			<td>0.0077</td>
			<td>0.0100</td>
			<td>0.0147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prozent des Volumens der Cochlea</td>
			<td>0,46 %</td>
			<td>0,59 %</td>
			<td>0,87 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zelldichte in Cochlea geschätzt</td>
			<td>113.759</td>
			<td>118.732</td>
			<td>0</td>
		</tr>
	

Tabelle 1: Zelle zählt. DAPI gefärbt Cochlea-Abschnitte waren thresholded und quantifizierte automatische Zählung Werkzeugen in ImageJ in 3 nicht überlappende Regionen von Interesse (außerhalb der knöchernen Labyrinth, Felsenbein außerhalb der Cochlea-fließende Räume und in der Cochlea). Cochlea-Querschnittsfläche wurde auch in ImageJ gemessen, und dieser Wert wurde zur Berechnung der Schnittkörper in Kombination mit Schnittdicke (10 µm). Verwenden eine Schätzung der Cochlea-Gesamtvolumen von Santi Et Al. veröffentlicht 23, die relative Cochlea-Lautstärke eines bestimmten Abschnitts wurde berechnet. Die Zelldichte der gesamte Cochlea schätzte die relative Cochlea-Lautstärke eines bestimmten Abschnitts in Kombination mit der gekoppelten Zellzahl.

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering at JoVE.com

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Ein Protokoll für einem Maus Cochleae für das Innenohr Tissue Engineering

Das Ziel dieses Protokolls ist eine effektive Methode, um decellularize und Entkalken Maus Cochleae zur Nutzung als Gerüste für Tissue-engineering-Anwendungen zu demonstrieren.

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

a-protocol-for-decellularizing-mouse-cochleae-for-inner-ear-tissue

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.7K Aufrufe.  University of Kansas Medical Center. Das Ziel dieses Protokolls ist eine effektive Methode, um decellularize und Entkalken Maus Cochleae zur Nutzung als Gerüste für Tissue-engineering-Anwendungen zu demonstrieren.

Serie: A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

Herstellung von biologisch abgeleiteten Injizierbare Materialien für Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Forschung

Biotechnik

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

Vorgehensweise für Lung Technik

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

Elastomer-PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying cellular responses under various culture conditions in vitro. The three dimensional environment more closely mimics what the cells observe in vivo due to the application of mechanical and chemical stimuli in all dimensions 1. Three-dimensional hydrogels can either be made from synthetic polymers such as PEG-DA 2 and PLGA 3 or a number of naturally occurring proteins such as collagen 4, hyaluronic acid 5 or fibrin 6,7. Hydrogels created from fibrin, a naturally occurring blood clotting protein, can polymerize to form a mesh that is part of the body's natural wound healing processes 8. Fibrin is cell-degradable and potentially autologous 9, making it an ideal temporary scaffold for tissue engineering.
Here we describe in detail the isolation of neonatal cardiomyocytes from three day old rat pups and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. Neonatal myocytes are a common cell source used for in vitro studies in cardiac tissue formation and engineering 4. Fibrin gel is created by mixing fibrinogen with the enzyme thrombin. Thrombin cleaves fibrinopeptides FpA and FpB from fibrinogen, revealing binding sites that interact with other monomers 10. These interactions cause the monomers to self-assemble into fibers that form the hydrogel mesh. Because the timing of this enzymatic reaction can be adjusted by altering the ratio of thrombin to fibrinogen, or the ratio of calcium to thrombin, one can injection mold constructs with a number of different geometries 11,12. Further we can generate alignment of the resulting tissue by how we constrain the gel during culture 13.
After culturing the engineered cardiac tissue constructs for two weeks under static conditions, the cardiac cells have begun to remodel the construct and can generate a contraction force under electrical pacing conditions 6. As part of this protocol, we also describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including functional analysis of the active force generated by the cardiac muscle construct upon electrical stimulation, as well as methods for determining final cell viability (Live-Dead assay) and immunohistological staining to examine the expression and morphology of typical proteins important for contraction (Myosin Heavy Chain or MHC) and cellular coupling (Connexin 43 or Cx43) between myocytes.

We describe the isolation of neonatal cardiomyocytes and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. We describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including active force generated upon electrical stimulation and cell viability and immunohistological staining.

Verkapselung von Kardiomyozyten in einer Fibrin-Hydrogel für Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Postproduction Verarbeitung von Elektrogesponnene Fasern für Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Protokoll für Relative Hydrodynamische Beurteilung der Tri-Polymer Merkblatt Ventile

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

Entwurf eines Biaxiale Mechanische Belastung Bioreaktor für Tissue Engineering

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...