우리 장 Roch Mouret, 실 비 Dequin 로봇 기반 발효 시스템의 개념에 기여에 대 한 장-마리 Sabalyrolles 마틴 Pradal, 니콜라 부 비 그리고 Pascale Brial 그들의 기술 지원에 대 한 감사 합니다. 이 프로젝트에서 제공한 Ministère 드 l'Education 회, 드 라 검색 외에 대 한 자금 드 라 Technologie.

<ol>
	<li>Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifteen+years+of+large+scale+metabolic+modeling+of+yeast:+developments+and+impacts.">Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts.</a> Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).</li><li>Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+identification+and+flux+quantification+in+the+central+metabolism+of+Saccharomyces+cerevisiae+under+different+conditions+of+glucose+repression.">Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression.</a> J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).</li><li>Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C+metabolic+flux+analysis.">13C metabolic flux analysis.</a> Metab Eng. 3, 195-206 (2001).</li><li>Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+metabolic+flux+analysis+based+on+gas+chromatography-mass+spectrometry+derived+13C+constraints.">High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints.</a> Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).</li><li>Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analytic+and+systematic+framework+for+estimating+metabolic+flux+ratios+from+13C+tracer+experiments.">An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments.</a> BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).</li><li>Zamboni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C+metabolic+flux+analysis+in+complex+systems.">13C metabolic flux analysis in complex systems.</a> Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).</li><li>Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+plant+metabolic+networks+from+steady-state+metabolic+flux+analysis.">Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis.</a> Biochimie. 91, 697-702 (2009).</li><li>Quek, L. -. E., Dietmair, S., Kr&#246;mer, J. O., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+analysis+in+mammalian+cell+culture.">Metabolic flux analysis in mammalian cell culture.</a> Metab Eng. 12, 161-171 (2010).</li><li>Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+amino+acids+during+beer+production:+The+concept+of+a+critical+time+value.">Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value.</a> J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).</li><li>Magasanik, B., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+regulation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 290, 1-18 (2002).</li><li>Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+amino+acid,+nucleotide,+and+phosphate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190, 885-929 (2012).</li><li>Cooper, T. G., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 39-99 (1982).</li><li>Jones, E. W., Fink, G. R., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+amino+acid+and+nucleotide+biosynthesis+in+yeast.">Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast.</a> The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. , 182-299 (1982).</li><li>Hazelwood, L. A., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ehrlich+pathway+for+fusel+alcohol+production:+a+century+of+research+on+Saccharomyces+cerevisiae+metabolism.">The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism.</a> Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).</li><li>Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+detection+of+assimilable+nitrogen+deficiencies+during+alcoholic+fermentation+in+oenological+conditions.">Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions.</a> J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).</li><li>Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+reconstruction+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+metabolic+network.">Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network.</a> Genome Res. 13, 244-253 (2003).</li><li>Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IsoCor:+correcting+MS+data+in+isotope+labeling+experiments.">IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments.</a> Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).</li></ol>

저자는 공개 없다.

동위 원소 추적 실험을 사용 하 여 신진 대사 네트워크를 통해 화합물의 분할을 측정 하는 것은 미생물 물질 대사의 동작을 이해 하기 위한 유망한 접근 이다. 이 방법론, 하나 또는 두 개의 레이블된 기판, 성공적으로 적용 하는 동안 수 없습니다 현재 구현 여러 레이블이 원소 동위 원소 (즉, 두 개 이상의 기판)를 사용 하 여 다양 한 소스의 대사를 공부. 실제로, 사용할 수 있는 분석 기법 공동 두 요소와 라벨 때 단일 요소 및 동위 원소를 사용 하는 경우에 독점적으로 proteinogenic 아미노산의 분자 라벨 패턴의 정확한 결정을 사용 합니다. 따라서, 이러한 한계를 해결 하 고 미생물에 의해 여러 영양소 소스 관리를 평가, 우리 13C 또는 15 선택한 기판 라벨 동안 동일한 환경 조건 하에서 문화의 세트를 반복 하기로 N 동위 원소. 다음, 추가 각 13C 또는 15N 추적 실험에서 제공 하는 특정 정보의 조합을 여러 소스의 대사의 양적 확장된 보기를 제공 합니다.
보고 된 접근의 성과에서는 표준 조건 하에서 문화의 재현 시리즈의 구현에 모든 문화 (셀에 대 한 동일한 정의 된 생리 적 상태에 있는 세포의 인구에서 샘플의 컬렉션 성장, 기판 등의 소비). 독립적인 실험에서 얻은 데이터를 혼합 하 고 함께 분석 될 수 있도록 이러한 조건이 충족 되어야 합니다. 이러한 제약 조건을 정확 하 고 빈번한 실시 되었다 미생물 활동의 모니터링 요구 만족, 실험적인 작품에서 보고 여기, 효 모 발효 활동의 온라인 모니터링을 위한 로봇 기반 시스템을 사용 하 여. 그러나, 미생물 배양 및 모니터링, 광학 밀도 측정 하 여 세포 성장 결정 같은 더 전통적인 방법 샘플링 절차를 정상화 하 사용할 수 있습니다.
이 방법을 수행 하기 위한 또 다른 필수 조사를 네트워크에 관련 된 변화 통로의 명확한 비전을가지고 것입니다. 이 지식을 공부 하 고 문제를 처리 하기 위한 가장 적합 한 레이블된 기판의 세트를 선택 하기 위한 필수적입니다. 레이블이 지정 된 화합물으로 서 자연과 라벨 (13C, 15N, 또는 다른 사람)의 위치 분자 내에서 선택 해야 합니다 적절 한 순서로 나)에서 파생 되는 화합물에 기판에서 제공 하는 모든 라벨을 복구 그들의 놓을 고 추가 분석 절차 및 ii) 방법론의 정확성 및 결과의 타당성을 보여 주는 중복 데이터를 가져옵니다. 여기에 설명 된 절차는 또한 인간과 금융 자원에 비용과 시간이 많이 소요 될 수 있는 분석의 중요 한 수를 포함 한다. 또한, 일부 분석 제약이이 방법론의 사용을 제한할 수 있습니다. 첫째, 사용자는 모든 분석 방법 미생물 물질 대사 동안 생산 하는 화합물의 정량화에 대 한 필요 하 고 그들의 동위 원소 농축의 결정에 대 한 사용할 수 있습니다 확인 해야 합니다. 둘째,이 이렇게 화합물 충분 한 금액을 정확 하 게 측정할 수에서 생산 되는 모든 변환에 대 한 기판의 물질 대사를 평가에 적용 됩니다.
이 문서에서 우리는 와인 발효 하는 동안 효 모에 의해 여러 질소 소스의 관리를 탐험이 워크플로 적용. 이 보고서는 가장 소비 아미노산, 단백질, 그리고 선구자를 공급 추가 사용 되는 CCM의 주요 기여 금으로 그들의 낮은 직접 설립과 함께 상당한 놓을 포함 효 모 물질 대사에 대 한 새로운 통찰력을 제공 둘 다 proteinogenic 아미노산의 de novo 종합 및 휘발성 분자의 형성.
더 넓게, 여기 설명 된 방법은 어떤 미생물의 대사 네트워크를 통해 여러 기판의 분할 측정을 위해 사용할 수 있습니다. 그것은 연구원 그들은 셀 입력 후 모든 소비 화합물의 명료 하 고 선구자 및 제품의 신진 대사 원산지 식별 주소를 허용할 것 이다. 이 정보 다른 유전 배경에 있는 긴장의 신진 대사 활동을 비교 하는 데 유용할 수 있습니다 또는 다른 조건 하에서 그리고, 따라서, 발효 프로세스를 개선 하기 위해 합리적인 전략을 설계에 대 한 성장.

미생물 물질 대사 작동 하는 방법 이해는 발효 프로세스를 개선 하 고 발효 화합물의 생산을 조절 하는 효율적인 전략의 디자인에 대 한 중요 한 문제 이다. 유전체학 및 기능 유전체학이 마지막이 십년에서 크게 지식의 많은 미생물 대사 네트워크의 토폴로지를 확장에 기여. 이 정보에 액세스할 세포질 기능1의 포괄적인 개요를 목표로 하는 방식의 개발을 주도. 이러한 방법론은 자주 측정 매개 변수 모델 기반 해석에 의존합니다. 이 실험 데이터 포함, 한 손으로, 대사 산물 통풍 관 및 생산 속도 하 고, 다른 한편으로, 양적 세포내 얻은 정보를 동위 원소 추적 프로그램에서 실험. 이러한 데이터는 정의 된 대사 네트워크2,,34다른 통로의 vivo에서 활동의 공제에 대 한 필수 정보를 제공합니다. 현재, 사용할 수 있는 분석 기법만 단일 요소 동위 원소를 사용 하 여 분자의 패턴을 라벨의 정확한 검색을 사용 가능 하 게 하 고 공동 두 동위 요소와 라벨 때. 또한, 대부분의 성장 조건에서 탄소 소스만 구성 되어 하나 또는 두 화합물의 있습니다. 따라서, 탄소 기판에서 13C 동위 원소 예 광 탄에 따라 접근 넓게 그리고 성공적으로 적용 된 탄소 대사 네트워크 작업5,6,7의 완전 한 이해를 개발 하 ,8.
대조적으로, 많은 자연 및 산업 환경에서 미생물 성장을 지 원하는 사용할 수 있는 질소 리소스는 다양 한 분자의 구성 자주 됩니다. 예를 들어 와인 또는 맥주 발효 하는 동안 질소 18 아미노산 및 가변 농도9암모늄의 혼합물으로 제공 됩니다. Anabolism 액세스할 수 있는 N 화합물의이 만드는이 복잡 한 미디어 조건 크게 다른 생리 적 연구에 대 한 일반적으로 사용 되는 후자 질소, 일반적으로 암모늄의 독특한 소스를 사용 하 여 달성 하는.
전반적으로, 질소 화합물 직접 단백질에 통합 되거나 catabolized 내 면. 효 모 Saccharomyces cerevisiae를 포함 하 여 많은 미생물 물질 대사 질소의 네트워크 구조는 매우 복잡 한 기판의 다양성에 따라. 개요로,이 시스템은 글루타민, 조미료, α ketoglutarate10,11, transaminases와 deaminases의 interconversion를 catalyzes 질소 물질 대사의 중앙 코어의 조합을 기반으로 합니다. 이 네트워크를 통해 암모늄 또는 다른 아미노산에서 아민 그룹 수집 하 고 α-keto 산 발표 했다. 이 중간체는 또한 중앙 탄소 대사 (CCM)12,13synthetized. 이 많은 수의 분기 반응 및 중간체, 외 인 질소 소스의 놓을 proteinogenic 아미노산의 anabolism에 관련 된 세포의 근육 요구 충족. 이러한 다른 상호 경로 통해 활동 대사 산물의 배설에도 발생합니다. 특히, α-keto 산 제품의 감각 프로필에 필수적인 참여자는 더 높은 알콜 및 그들의 아세테이트 에스테 르 유도체14, Ehrlich 통로 통해 리디렉션할 수 있습니다. 그 후, 질소 대사 작동 하는 방법 바이오 매스 생산 및 휘발성 분자를 (향기)의 형성에 중요 한 역할을 재생 합니다.
반응, 효소, 및 질소 대사에 관여 하는 유전자는 문학에서 광대 하 게 기술 된다. 그러나, 대사 네트워크를 통해 여러 질소 소스의 배포의 문제는 아니라 아직 해결 되었습니다. 정보의이 부족을 설명 하는 두 가지 주요 이유가 있습니다. 첫째, 질소 대사 네트워크의 중요 한 복잡성의 관점에서 정량적 데이터의 큰 금액은 사용할 수 작업의 완전 한 이해에 필요한 지금까지. 두 번째, 많은 실험의 제약 조건 및 분석 방법의 한계 방지 이전 CCM 함수 설명에 사용 된 방법의 구현.
이러한 문제를 극복 하기 위해 우리는 일련의 동위 원소 추적 실험에서 데이터의 화해를 기반으로 하는 시스템 수준 접근 방법을 개발 하기로 결정 했다. 워크플로가 포함 되어 있습니다. -다른 선택한 영양 소스 (기판) 때마다 표시 하는 동안 발효 된 동일한 환경 조건 하에서 실시. -레이블된 기판 및 농도의 잔류 농도 및에서 파생 된 화합물의 동위 원소 농축 발효의 여러 단계에서 정확한 결정을 위한 분석 절차 (HPLC, GC-MS)의 조합 파생 된 바이오 매스를 포함 하 여 레이블이 지정 된 분자의 놓을. -각 질량과 동위 균형의 계산 소비 레이블이 분자 및 유동 비율의 결정을 통해 미생물에 의해 여러 영양소 소스 관리에 대 한 글로벌 개요를 얻기 위해 데이터 집합의 추가 통합된 분석 .
이 방법론을 적용 하기 위해 주의 문화 사이의 긴장/미생물의 재현 동작에 지불 되어야 합니다. 또한, 다른 문화에서 샘플 같은 잘 정의 된 발효 진행 중 촬영 해야 합니다. 이 원고에 보고 하는 실험적인 작품에서 로봇 기반 시스템 이러한 제약 조건에 대 한 계정에 발효의 온라인 모니터링에 대 한 사용 됩니다.
또한, 연구의 과학적 문제를 해결 하기 위해 적절 한 레이블이 기판 (화합물, 자연, 그리고 라벨의 위치)의 집합을 선택 하는 것이 필수적입니다. 여기, 15N 표시 된 암모늄, 글루타민, 아르기닌 포도 주스에서 발견 세 가지 주요 질소 근원으로 선정 됐다. 이 proteinogenic 아미노산에 소비 화합물에서 질소 재배포의 패턴을 평가 허용. 우리는 또한 소비 아미노산 및 휘발성 분자의 생산에 그들의 공헌의 탄소 등뼈의 운명을 조사 목적. 충족 시키기 위해이 목표, 균일 하 게 13C 라는 신, 이소류신, 트레오닌, valine 포함 되었다 연구에 Ehrlich 통로의 주요 중간체에서 파생 된 아미노산으로.
전반적으로, 우리 양적 효 모 또한으로 탄소 선구자의 초과 제거 하는 동안 발효를 통해 근육의 요구 사항을 충족 하는 외 인 질소 소스를 재배포 하 여 복잡 한 질소 리소스를 관리 하는 방법을 탐구 휘발성 분자입니다. 이 논문에 보고 된 실험 절차 다른 미생물에 의해 사용 된 다른 여러 영양소 소스 조사에 적용할 수 있습니다. 그것은 미생물의 대사 행동에 유전 배경이 나 환경 조건 영향의 분석에 대 한 적절 한 접근을 것 처럼 보인다.

<table><tbody><tr><td>D-Glucose</td><td>PanReac</td><td>141341.0416</td><td></td></tr><tr><td>D-Fructose</td><td>PanReac</td><td>142728.0416</td><td></td></tr><tr><td>DL-Malic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0875</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7129</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Potassium sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0772</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4514</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Manganese sulfate monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td></td></tr><tr><td>Zinc sulfate heptahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7631</td><td></td></tr><tr><td>Potassium iodine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4286</td><td></td></tr><tr><td>Cobalt (II) chloride hexahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3169</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium heptamolybdate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21210</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine, hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5669</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Ergost&amp;eacute;rol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6510</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>VWR Chemicals</td><td>101074F</td><td></td></tr><tr><td>Iron (III) chloride hexahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-Phenylalanine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptophane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-Valine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C5-L-Valine</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2249-H-0.25</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C6-L-Leucine</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2262-H-0.25</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N-Ammonium chloride</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-467-1</td><td></td></tr><tr><td>ALPHA-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N-L-Glutamine</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-1016-1</td><td></td></tr><tr><td>U-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N4-L-Arginine</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-396-PK</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270989</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl propanoate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>112305</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 2-methylpropanoate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>246085</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl butanoate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E15701</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 2-methylbutanoate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>306886</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-methylbutanoate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8.08541.0250</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl hexanoate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>148962</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl octanoate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244910</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl decanoate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W243205</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl dodecanoate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244112</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl lactate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244015</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl succinate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W237701</td><td></td></tr><tr><td>2-methylpropyl acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W217514</td><td></td></tr><tr><td>2-methylbutyl acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W364401</td><td></td></tr><tr><td>3-methyl butyl acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>287725</td><td></td></tr><tr><td>2-phenylethyl acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>290580</td><td></td></tr><tr><td>2-methylpropanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>294829</td><td></td></tr><tr><td>2-methylbutanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>133051</td><td></td></tr><tr><td>3-methylbutanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309435</td><td></td></tr><tr><td>Hexanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>128570</td><td></td></tr><tr><td>2-phenylethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77861</td><td></td></tr><tr><td>Propanoic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94425</td><td></td></tr><tr><td>Butanoic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>19215</td><td></td></tr><tr><td>2-methylpropanoic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58360</td><td></td></tr><tr><td>2-methylbutanoic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>193070</td><td></td></tr><tr><td>3-methylbutanoic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W310212</td><td></td></tr><tr><td>Hexanoic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>153745</td><td></td></tr><tr><td>Octanoic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W279900</td><td></td></tr><tr><td>Decanoic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W236403</td><td></td></tr><tr><td>Dodecanoic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L556</td><td></td></tr><tr><td>Fermentor 1L</td><td>Legallais</td><td>AT1357</td><td>Fermenter handmade for fermentation</td></tr><tr><td>Disposable vacuum filtration system</td><td>Dominique Deutscher</td><td>029311</td><td></td></tr><tr><td>Fermenters (250 ml)</td><td>Legallais</td><td>AT1352</td><td>Fermenter handmade for fermentation</td></tr><tr><td>Sterile tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Fermentation locks</td><td>Legallais</td><td>AT1356</td><td>Fermetation locks handmade for fermentation</td></tr><tr><td>BactoYeast Extract</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Incubator shaker</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Particle Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605697</td><td>Multisizer 3 Coulter Counter</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Jouan</td><td></td><td>GR412</td></tr><tr><td>Plate Butler Robotic system</td><td>Lab Services BV</td><td>PF0X-MA</td><td>Automatic instrument</td></tr><tr><td>Plate Butler Software</td><td>Lab Services BV</td><td></td><td>Robot monitor software</td></tr><tr><td>RobView</td><td></td><td></td><td>In-house developed calculation software</td></tr><tr><td>My SQL</td><td></td><td></td><td>International source database</td></tr><tr><td>Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50088009</td><td>String Drive 60</td></tr><tr><td>BenchBlotter platform rocker</td><td>Dutscher</td><td>60903</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia enzymatic kit</td><td>R-Biopharm AG</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer cuvettes</td><td>VWR</td><td>634-0678</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer UviLine 9400</td><td>Secomam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amino acids standards physiological - acidics and neutrals</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6407</td><td></td></tr><tr><td>Amino acids standards physiological - basics</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6282</td><td></td></tr><tr><td>Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6000-06</td><td></td></tr><tr><td>Sulfosalycilic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2130</td><td></td></tr><tr><td>Norleucine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N1398</td><td></td></tr><tr><td>Biochrom 30 AAA</td><td>Biochrom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZChrom Elite</td><td>Biochrom</td><td></td><td>Instrument control and Data analysis software</td></tr><tr><td>Ultropac 8 resin Lithium</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6002-47</td><td>Lithium High Resolution Physiological Column</td></tr><tr><td>Filter Millex GV</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVX13NL</td><td>Millex GV 13mm (pore size 0.22 &amp;micro;m)</td></tr><tr><td>Membrane filter PALL</td><td>VWR</td><td>514-4157</td><td>Supor-450 47mm 0.45&amp;micro;m</td></tr><tr><td>Vacuum pump Millivac Mini</td><td>Millipore</td><td>XF5423050</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium smooth weigh dish 70mm</td><td>VWR</td><td>611-1380</td><td></td></tr><tr><td>Precision balance</td><td>Mettler</td><td></td><td>Specifications AE163</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxid dried</td><td>Merck</td><td>1029310161</td><td>(max. 0.025% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O) SeccoSolv</td></tr><tr><td>Combustion oven</td><td>Legallais</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA protein assay kit</td><td>Interchim</td><td>UP40840A</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Fluka</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td>Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Lithium acetate buffer</td><td>Biochrom</td><td>80-2038-10</td><td></td></tr><tr><td>Commercial solution of hydrolyzed amino acids</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AAS18</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine sulfone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0876</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteic acid monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30170</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex glass culture tubes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z653586</td><td></td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>Acros Organics</td><td>131780500</td><td>99% Extrapure</td></tr><tr><td>Ethyl chloroformate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23131</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32222</td><td></td></tr><tr><td>Vials</td><td>Sigma Aldrich</td><td>854165</td><td></td></tr><tr><td>Microinserts for 1.5ml vials</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SU860066</td><td></td></tr><tr><td>GC/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>5890 GC/5973 MS</td><td></td></tr><tr><td>Chemstation</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Instrument control and data analysis software</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Chromasolv, for HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>ChromasolvPlus, for HPLC</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>394963</td><td></td></tr><tr><td>BSTFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>33024</td><td></td></tr><tr><td>DB-17MS column</td><td>Agilent Technologies</td><td>122-4731</td><td>30m*0.25mm*0.15&amp;micro;m</td></tr><tr><td>Sodium sulfate, anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238597</td><td></td></tr><tr><td>Technical nitrogen</td><td>Air products</td><td>14629</td><td></td></tr><tr><td>Zebron ZB-WAX column</td><td>Phenomenex</td><td>7HG-G007-11</td><td>30m*0.25mm*0.25&amp;micro;m</td></tr><tr><td>Helium BIP</td><td>Air products</td><td>26699</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipettes</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td></td></tr></tbody></table>

workflow based on the combination of isotopic tracer experiments to investigate microbial metabolism of multiple nutrient sources

미생물학의 분야에 있는 연구는 다양 한 방법론의 구현에 의존합니다. 특히, 적절 한 방법의 개발은 실질적으로 독특한 질소와 탄소 소스를 포함 하는 화학적으로 정의 된 미디어에서 성장 하는 미생물의 물질 대사의 광범위 한 지식을 제공에 기여 한다. 반면, 여러 소스의 영양소, 자연 또는 산업 환경에 광범위 한 그들의 존재에도 불구 하 고 신진 대사를 통해 관리 거의 미개척 남아 있습니다. 이 상황은 조사 방해 적합 한 방법론의 부족 때문에 주로 이다.
우리는 양적 및 포괄적 대사 영양소는 다른 분자, 즉, 복잡 한 리소스의 혼합물으로 제공 하는 때 작동 하는 방법을 탐구 하는 실험적인 전략을 보고 합니다. 여기, 우리는 효 모 대사 네트워크를 통해 여러 질소 소스의 분할을 평가 하기 위한 응용 프로그램을 설명 합니다. 워크플로 안정 동위 원소 추적 실험 선택한 13C-또는 15N 표시 기판 사용 하는 동안 얻은 정보를 결합 합니다. 그것은 먼저 이루어져 있다 N 포함 된 분자;의 혼합물을 포함 하는 동일한 매체에 병렬 및 재현성 발효 그러나, 선택 된 질소 소스 때마다 표시 됩니다. 대상된 화합물의 라벨 패턴을 평가 하 고 소비 및 다른 대사 산물에 기판의 복구를 계량 분석 절차 (HPLC, GC-MS)의 조합을 구현 됩니다. 완전 한 데이터 집합의 통합된 분석 셀 내에서 사용 된 기판의 운명에 대 한 개요를 제공합니다. 이 방법은 발효의 온라인 모니터링을 위한 로봇 기반 시스템에 의해 샘플-촉진의 컬렉션에 대 한 정확한 프로토콜을 필요-그리고 수많은 시간이 걸리는 분석의 공적. 이러한 제약에도 불구 하 고 그것은 이해 하 고, 처음으로, 효 모 대사 네트워크를 통해 여러 질소 소스의 분할 허용. 우리는 다른 N 화합물 쪽으로 더 풍부한 소스에서 질소의 재분배를 해명 하 고 휘발성 분자와 proteinogenic 아미노산의 대사 기원 결정.

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Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

이 프로토콜 양적이 고 포괄적으로 여러 영양소 소스의 신진 대사를 조사 하는 실험 절차를 설명 합니다. 이 워크플로, 동위 원소 추적 실험 및 분석 절차의 조합에 따라 결정 될 미생물 소비 영양분의 운명과 분자 synthetized의 대사 기원 수 있습니다.

여러 영양소 소스의 미생물 대사를 조사 하기 위해 동위 원소 추적 실험의 조합에 따라 워크플로

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

workflow-based-on-combination-isotopic-tracer-experiments-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.2K 조회수.  Université de Montpellier. 이 프로토콜 양적이 고 포괄적으로 여러 영양소 소스의 신진 대사를 조사 하는 실험 절차를 설명 합니다. 이 워크플로, 동위 원소 추적 실험 및 분석 절차의 조합에 따라 결정 될 미생물 소비 영양분의 운명과 분자 synthetized의 대사 기원 수 있습니다.

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Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

방사성 트레이서와 식물에 미네랄 영양 성분 및 독성 물질의 플럭스를 측정

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

연구

환경과학

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of "mock sorted" cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.

This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.

안정 동위 원소 추적을 사용하여 복잡한 세포 공동체의 정렬 된 부분 집단에서 대사를 측정하는 방법

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

생화학

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the abundances of key metabolites to which regulatory factors respond, adjusting cellular metabolism. In recent years, a number of proteins and RNA have emerged as important regulators of virulence gene expression. For example, the CodY protein responds to levels of branched-chain amino acids and GTP and is widely conserved in low G+C Gram-positive bacteria. As a global regulator in Staphylococcus aureus, CodY controls the expression of dozens of virulence and metabolic genes. We hypothesize that S. aureus uses CodY, in part, to alter its metabolic state in an effort to adapt to nutrient-limiting conditions potentially encountered in the host environment. This manuscript describes a method for extracting and analyzing metabolites from S. aureus using liquid chromatography coupled with mass spectrometry, a protocol that was developed to test this hypothesis. The method also highlights best practices that will ensure rigor and reproducibility, such as maintaining biological steady state and constant aeration without the use of continuous chemostat cultures. Relative to the USA200 methicillin-susceptible S. aureus isolate UAMS-1 parental strain, the isogenic codY mutant exhibited significant increases in amino acids derived from aspartate (e.g., threonine and isoleucine) and decreases in their precursors (e.g., aspartate and O-acetylhomoserine). These findings correlate well with transcriptional data obtained with RNA-seq analysis: genes in these pathways were up-regulated between 10- and 800-fold in the codY null mutant. Coupling global analyses of the transcriptome and the metabolome can reveal how bacteria alter their metabolism when faced with environmental or nutritional stress, providing potential insight into the physiological changes associated with nutrient depletion experienced during infection. Such discoveries may pave the way for the development of novel anti-infectives and therapeutics.

Here we describe a protocol for the extraction of metabolites from Staphylococcus aureus and their subsequent analysis via liquid chromatography and mass spectrometry.

의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근<em&gt; 포도상 구균</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer tissue with minor or no modification, allowing the dietary routing between different trophic levels. However, the FA trophic marker approach is still hampered by the limited knowledge in lipid metabolism of the soil fauna. This study used entirely labelled palmitic acid (13C16:0, 99 atom%) as a tracer in fatty acid metabolism pathways of two widespread soil Collembola, Protaphorura fimata and Heteromurus nitidus. In order to investigate the fate and metabolic modifications of this precursor, a method of isotopologue profiling is presented, performed by mass spectrometry using single ion monitoring. Moreover, the upstream laboratory feeding experiment is described, as well as the extraction and methylation of dominant lipid fractions (neutral lipids, phospholipids) and the related formula and calculations. Isotopologue profiling does not only yield the overall 13C enrichment in fatty acids derived from the 13C labeled precursor but also produces the pattern of isotopologues exceeding the mass of the parent ion (i.e., the FA molecular ion M+) of each labeled FA by one or more mass units (M+1, M+2, M+3, etc.). This knowledge allows conclusions on the ratio of dietary routing of an entirely consumed FA in comparison to de novo biosynthesis. The isotopologue profiling is suggested as a useful tool for evaluation of fatty acid metabolism in soil animals to disentangle trophic interactions.

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

The fatty acid trophic marker approach, i.e., the assimilation of fatty acids as entire molecule and transfer into consumer tissue with no or minor modification, is hampered by knowledge gaps in fatty acid metabolism of small soil invertebrates. Isotopologue profiling is provided as a valuable tool to disentangle trophic interactions.

영양 탄소 전송 및 무척 추 동물 소비자의 지질 대사에 대 한 통찰력을 제공 합니다 지방산 13C Isotopologue 프로 파일링

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

수생 생태계에서 유기 탄소 흐름의 새로운 경로를 밝히기 위해 추적자로 형광으로 분류 된 박테리아

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in cellular and mammalian models. Here, we describe detailed methods to perform stable isotopic profiling of intermediary metabolism and metabolic flux in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are described for profiling whole worm free amino acids, labeled carbon dioxide, labeled organic acids, and labeled amino acids in animals exposed to stable isotopes either from early development on nematode growth media agar plates or beginning as young adults while exposed to various pharmacologic treatments in liquid culture. Free amino acids are quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) in whole worm aliquots extracted in 4% perchloric acid. Universally labeled 13C-glucose or 1,6-13C2-glucose is utilized as the stable isotopic precursor whose labeled carbon is traced by mass spectrometry in carbon dioxide (both atmospheric and dissolved) as well as in metabolites indicative of flux through glycolysis, pyruvate metabolism, and the tricarboxylic acid cycle. Representative results are included to demonstrate effects of isotope exposure time, various bacterial clearing protocols, and alternative worm disruption methods in wild-type nematodes, as well as the relative extent of isotopic incorporation in mitochondrial complex III mutant worms (isp-1(qm150)) relative to wild-type worms. Application of stable isotopic profiling in living nematodes provides a novel capacity to investigate at the whole animal level real-time metabolic alterations that are caused by individual genetic disorders and/or pharmacologic therapies.

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stable isotopic profiling by gas chromatography mass spectrometric analysis of intermediary metabolic flux is described in the nematode, Caenorhabditis elegans. Methods are detailed for assessing isotopic enrichment in carbon dioxide, organic acids, and amino acids following isotope exposure either during development on agar plates or during adulthood in liquid culture.

개발하고 성인 단계에서 중개 신진 대사 플럭스 안정 원소 프로파일 Caenorhabditis 엘레간스</em

Stable isotopic profiling has long permitted sensitive investigations of the metabolic consequences of genetic mutations and/or pharmacologic therapies in ...

생물학

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine cell central metabolism and discover new enzymes is 13C-assisted metabolism analysis 1. This technique is based on isotopic labeling, whereby microbes are fed with a 13C labeled substrates. By tracing the atom transition paths between metabolites in the biochemical network, we can determine functional pathways and discover new enzymes. 
As a complementary method to transcriptomics and proteomics, approaches for isotopomer-assisted analysis of metabolic pathways contain three major steps 2. First, we grow cells with 13C labeled substrates. In this step, the composition of the medium and the selection of labeled substrates are two key factors. To avoid measurement noises from non-labeled carbon in nutrient supplements, a minimal medium with a sole carbon source is required. Further, the choice of a labeled substrate is based on how effectively it will elucidate the pathway being analyzed. Because novel enzymes often involve different reaction stereochemistry or intermediate products, in general, singly labeled carbon substrates are more informative for detection of novel pathways than uniformly labeled ones for detection of novel pathways3, 4. Second, we analyze amino acid labeling patterns using GC-MS. Amino acids are abundant in protein and thus can be obtained from biomass hydrolysis. Amino acids can be derivatized by N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) before GC separation. TBDMS derivatized amino acids can be fragmented by MS and result in different arrays of fragments. Based on the mass to charge (m/z) ratio of fragmented and unfragmented amino acids, we can deduce the possible labeled patterns of the central metabolites that are precursors of the amino acids. Third, we trace 13C carbon transitions in the proposed pathways and, based on the isotopomer data, confirm whether these pathways are active 2. Measurement of amino acids provides isotopic labeling information about eight crucial precursor metabolites in the central metabolism. These metabolic key nodes can reflect the functions of associated central pathways.
13C-assisted metabolism analysis via proteinogenic amino acids can be widely used for functional characterization of poorly-characterized microbial metabolism1. In this protocol, we will use Cyanothece 51142 as the model strain to demonstrate the use of labeled carbon substrates for discovering new enzymatic functions.

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13C-isotope labeling is a useful technique for determining the cell central metabolism for various types of microorganisms. After cells have been cultured with a specific labeled substrate, GC-MS measurement can reveal functional metabolic pathways based on unique labeling patterns in proteinogenic amino acids.

을 통해 대사 경로 확인 및 검색 13</supProteinogenic 아미노산> C - 라벨링

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

Guts of most insects are inhabited by complex communities of symbiotic nonpathogenic bacteria. Within such microbial communities it is possible to identify commensal or mutualistic bacteria species. The latter ones, have been observed to serve multiple functions to the insect, i.e. helping in insect reproduction1, boosting the immune response2, pheromone production3, as well as nutrition, including the synthesis of essential amino acids4, among others. &#160; &#160;
Due to the importance of these associations, many efforts have been made to characterize the communities down to the individual members. However, most of these efforts were either based on cultivation methods or relied on the generation of 16S rRNA gene fragments which were sequenced for final identification. Unfortunately, these approaches only identified the bacterial species present in the gut and provided no information on the metabolic activity of the microorganisms.
To characterize the metabolically active bacterial species in the gut of an insect, we used stable isotope probing (SIP) in vivo employing 13C-glucose as a universal substrate. This is a promising culture-free technique that allows the linkage of microbial phylogenies to their particular metabolic activity. This is possible by tracking stable, isotope labeled atoms from substrates into microbial biomarkers, such as DNA and RNA5. The incorporation of 13C isotopes into DNA increases the density of the labeled DNA compared to the unlabeled (12C) one. In the end, the 13C-labeled DNA or RNA is separated by density-gradient ultracentrifugation from the 12C-unlabeled similar one6. Subsequent molecular analysis of the separated nucleic acid isotopomers provides the connection between metabolic activity and identity of the species.
Here, we present the protocol used to characterize the metabolically active bacteria in the gut of a generalist insect (our model system), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). The phylogenetic analysis of the DNA was done using pyrosequencing, which allowed high resolution and precision in the identification of insect gut bacterial community. As main substrate, 13C-labeled glucose was used in the experiments. The substrate was fed to the insects using an artificial diet.

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

The active bacterial community associated with the gut of Spodoptera littoralis, was determined by stable-isotope-probing (SIP) coupled to pyrosequencing. Using this methodology, identification of the metabolically active bacteria species within the community was done with high resolution and precision.

제너럴의 장내 대사 활성 박테리아의 식별<em&gt; 스포 도프 테라 리토 랄</em&gt; DNA 안정 동위 원소를 통해 사용 프로빙<sup&gt; 13</sup&gt; C-포도당

Guts of most insects are inhabited by complex communities of symbiotic nonpathogenic bacteria. Within such microbial communities it is possible to ...

<meta charset="utf8"></head><body>OPTIR-FISH를 사용한 세포 식별 및 대사 분석을 위한 포괄적인 프로토콜

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we present a comprehensive protocol for simultaneous cell identification and metabolic analysis with the OPTIR-FISH platform by combining rRNA-tagged FISH probes and isotope-labeled substrates. Fluorescence imaging provides cell identification by the specific binding of rRNA-tagged FISH probes, while OPTIR imaging provides metabolic activities within single cells by isotope-induced red shift on OPTIR spectra. Using bacteria cultured with 13C-glucose as a test bed, the protocol outlines microbial culture with isotopic labeling, fluorescence in situ hybridization (FISH), sample preparation, optimization of the OPTIR-FISH imaging setup, and data acquisition. We also demonstrate how to perform image analysis and interpret spectral data at the single-cell level with high throughput. This protocol&#39;s standardized and detailed nature will greatly facilitate its adoption by researchers from diverse backgrounds and disciplines within the broad single-cell metabolism research community.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 복잡한 환경에서 단일 세포 대사 및 정체성 분석을 위한 통합 OPTIR-FISH

Here, we present a protocol using optical photothermal infrared-fluorescence in situ hybridization (OPTIR-FISH), also known as mid-infrared photothermal-FISH (MIP-FISH), to identify individual cells and understand their metabolism. This methodology can be applied broadly for diverse applications, including mapping cellular metabolism with single-cell resolution.

광학 광열 적외선-형광 현장 혼성화(OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

여러 영양소 소스의 미생물 대사를 조사 하기 위해 동위 원소 추적 실험의 조합에 따라 워크플로

요약

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방사성 트레이서와 식물에 미네랄 영양 성분 및 독성 물질의 플럭스를 측정

안정 동위 원소 추적을 사용하여 복잡한 세포 공동체의 정렬 된 부분 집단에서 대사를 측정하는 방법

의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근

영양 탄소 전송 및 무척 추 동물 소비자의 지질 대사에 대 한 통찰력을 제공 합니다 지방산 ¹³C Isotopologue 프로 파일링

수생 생태계에서 유기 탄소 흐름의 새로운 경로를 밝히기 위해 추적자로 형광으로 분류 된 박테리아

개발하고 성인 단계에서 중개 신진 대사 플럭스 안정 원소 프로파일 Caenorhabditis 엘레간스

을 통해 대사 경로 확인 및 검색^{13 C - 라벨링}

제너럴의 장내 대사 활성 박테리아의 식별

광학 광열 적외선-형광 현장 혼성화(OPTIR-FISH)

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