우리는이 프로토콜을 개발 하는 데 도움에 그들의 초기 작업에 대 한 Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP 듀얼 기자 mESC 라인으로 제니퍼 타이슨, Asif Maroof 및 팀 페트 로스를 개발 하기 위한 청나라 Xu에 감사. 우리는 또한 빨리 흐름 cytometry 핵심을 기술 지원에 대 한 감사합니다. 이 작품은 NIH R01 MH066912 (SA)와 F30 MH105045-02 (DT)에 의해 지원 되었다.

참고:이 프로토콜에서 설명 하는 듀얼 기자 mESC 라인은 요청 (sande@mail.med.upenn.edu).
1. 미디어 준비
참고: 모든 미디어 세포 배양에 사용 하기 전에 37 ° C를 따뜻하게.
<ol><li>
마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEF) 미디어 (500 mL를 준비)
	<ol>
<li>Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM), 및 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터 449 ml 50 mL 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 추가 합니다.</li>
		<li>여과 후 1 mL 항균 에이전트 (50 mg/mL)를 추가 합니다. 최대 1 달 또는 약 수 ≤에 저장소에 대 한 4 ° C에서 미디어를 저장-20 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
N2 미디어 (500 mL를 준비)
	<ol>
<li>5 mL L-알라닌-L-글루타민 추가 (100 x) 및 500 µ L 2-Mercaptoethanol (55mm) 489.5 ml DMEM: 영양소 혼합 F-12 (DMEM/F-12), 그리고 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터.</li>
		<li>여과 후 1 mL 항균 에이전트 (50 mg/mL)와 5 mL n 2 보충-B를 추가 합니다. 최대 1 달 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 미디어를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
혈 청 무료 성장 매체 (KSR) (500 mL를 준비)
	<ol>
<li>추가 75 mL 혈 청 무료 중간 보충, 5 mL L-글루타민 (100 배), 5 mL MEM 비 필수 아미노산 (MEM-NEAA) (100 x), 그리고 500 µ L 2-Mercaptoethanol (55mm) 413.5 mL 비-글루타민을 포함 된 DMEM, 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터링.</li>
		<li>여과 후 1 mL 항균 에이전트 (50 mg/mL)를 추가 합니다. 최대 1 개월 4 ° C에서 미디어를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마우스 배아 줄기 세포 미디어 (500 mL를 준비)
	<ol>
<li>75 mL 줄기 세포 학년 FBS, 5 mL MEM NEAA 추가 (100 배) 5 mL L-글루타민 (100 x), 그리고 500 µ L 2-Mercaptoethanol (55mm) 413.5 mL 비-글루타민을 포함 된 DMEM, 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터링.</li>
		<li>여과 후 1 mL 항균 에이전트 (50 mg/mL)를 추가 합니다. 최대 1 달 또는 약 수 ≤에 저장소에 대 한 어둠 속에서 4 ° C에서 미디어를 저장-20 ° c.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 경작 mESCs
<ol><li>플레이트 mitotically 비활성 MEF 피더 세포 조직 문화에 MEF 미디어에 3-4 x 104 셀/cm2접시를 취급. 적어도 12 h는 mESCs를 도금 하기 전에 ≥ 95% 상대 습도 및 5% CO2 와 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에 정착 하도록 허용 합니다. 즉시 사용 하지, MEF 미디어 3 일 마다 교체 합니다. 도금의 7 일 이내 사용 하지 않을 경우 MEFs의 처분.</li>
	<li>마우스 백혈병 금지 요인 (mLIF) (1000 U/mL)를 포함 하는 mESC 미디어에서 MEF 번호판 mESCs (밀도 범위 1-4 x 104 셀/cm2)를 추가 합니다. ≥ 95% 상대 습도 및 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	<li>트립 신-EDTA (0.05 %trypsin)를 사용 하 여 mESCs 통로 (1:5-1:10)는 요리 되 ~ 70-80% 합칠 또는 식민지 터치 하기 시작 하는 경우. 이 일반적으로 2 일 마다 발생 하지만 초기 도금 밀도 따라 4 ~ 5 일이 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>Pluripotency를 유지 mESC 매체에서 MEF 급지대 레이어에 mESCs을 유지 관리 합니다.</li>
	<li>
차별화를 시작 하기 전에 적어도 한 번 MEFs MEFs 밖으로 희석 없이 젤라틴 코팅 접시에 셀 통로.
	<ol>
<li>캘리포니아2 +/Mg2 + 취급 하는 조직 문화 접시에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 젤라틴 0.1% 추가 하 여 젤라틴 코팅 접시를 준비 하 고 적어도 1 헤 x 106 세포/10 c m 플레이트 플레이트 1.5-2에 대 한 37 ° C에서 떠나 (2.7-3.6 10 x4 셀/cm2) 차별화를 시작 하기 전에 2 일에 대 한 확장을 세포 허용.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 차별화 MGE 같은 Telencephalic 창시자 향해 mESCs
<ol><li>
차별화 일 (DD) 0 = "셀 플 로트"
	<ol>
<li>mESCs 성장 후 젤라틴 코팅 판 2 일에 대 한 미디어를 발음 하 고 한번 없이 캘리포니아2 +/Mg2 +PBS 가진 세포를 씻어. 충분 한 트립 신-EDTA (0.05 %trypsin) 4 분 ≥95% 상대 습도 및 5% CO2 와 37 ° C에서 배양 기에 다시 셀을 (일반적으로 4 mL 트립 신-EDTA 한 10cm 조직 문화 접시), 판의 표면을 커버를 추가 합니다.</li>
		<li>4 분 후 트립 신-EDTA mESC 미디어 2 배 볼륨을 사용 하 여 끄다. 적절 한 크기의 원심 분리기 튜브에 세포를 전송 하 고 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심. 5 분 후 튜브를 제거 하 고 미디어는 펠 렛을 방해 하지 않고 발음. 1 ml KSR:N2 미디어 (1:1) 펠 릿 포함 된 BMP 억제제 LDN-193189 resuspend (250 nM) 및 Wnt 억제제 XAV-939 (10 µ M).</li>
		<li>Hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀 농도 측정 합니다. LDN-193189를 포함 하는 KSR:N2 미디어 (1:1)에 75, 000 셀/mL을 추가 하 여 셀 embryoid 몸 (EBs)으로 성장 하는 시작 (250 nM) 및 XAV-939 (10 µ M) 비 점착 조직 문화 요리에서. ≥ 95% 상대 습도 및 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DD1에 셀에 대 한 "방문" 폴 리-L-리 신 (10 µ g/mL PBS에 캘리포니아2 +/Mg2 +) 코팅 처리 하는 조직 문화 요리에 의해 하룻밤 (O/N) ≥ 95% 상대 습도와 37 ° C에 또는 적어도 1 시간에 대 한 준비.</li>
	<li>DD2, 폴 리-L-리 신을 발음 하 고 laminin (10 µ g/mL PBS에 캘리포니아2 +/Mg2 +)와 플레이트 코트 O/N ≥ 95% 상대 습도와 37 ° C에서. 참고: O/N은 최적의 조금은 2 h 수 있습니다 충분. 다음 날 접시 사용 되지 않는, laminin를 발음 하 고 없이 Ca2 +/Mg2 +, PBS 바꿉니다 4 ° C에서 최대 2 주 동안 저장.</li>
	<li>
DD3 ("토지는 세포")
	<ol>
<li>EB 분리를 시작 하기 전에 laminin 발음 하 고 하 판 조직 문화 후드에 완전히 건조. 나타나는 반짝 또는 가시 젖은 접시를 사용 하지 마십시오. 15 mL 튜브 15 g x 또는 EBs는 수송과 때까지 3-4 분 동안 원심 분리기로 미디어와 EBs를 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미디어를 발음 하 고 DNase를 포함 하는 세포 분리 솔루션의 3 개 mL를 추가 (2 U/mL) ≥ 95% 상대 습도와 37 ° C에서 품 어와 15 분의 5% CO2 는 부드럽게 EB 분리에 도움 관 모든 3 분 영화.</li>
	<li>EBs는 더 이상 표시 하거나 15 분 경과, 추가 6 mL KSR:N2 (1:1) 포함 하는 DNase (1 U/mL) 및 200 x g에 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>KSR:N2 (1:1) LDN-193189를 포함 하는 셀을 접시 (250 nM), XAV-939 (10 µ M), 그리고 바위 억제제 Y-27632 (10 µ M) 4.5-5 x 104 셀/c m2에.</li>
</ol>4. SST 풍요롭게 프로토콜: "DD12 GFP 높은 소닉 고슴도치 (쉬)" (단계 3.7에서에서 계속)
<ol><li>DD5, 변경 FGF-2를 포함 하는 KSR:N2 (1:1)와 미디어 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), ssh (50 ng/mL).</li>
	<li>다시 하루 8 (단계 4.4)에 도금을 위한 조직 배양 배지 준비 단계 3.2 3.3에에서 설명 된 지침을 사용 하 여.</li>
	<li>DD7, 변경 FGF-2를 포함 하는 KSR:N2 (1:1)와 미디어 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), 그리고 쉬이 잇 (50 ng/mL).</li>
	<li>
DD8에 다시 셀 접시. 참고:이 단계는 필수, 다시 도금 셀 줄일 수 있습니다, 원치 않는 초기 분화 세포 유형. 다시 도금 다운스트림 immunohistochemical 분석을 어렵게 하는 셀의 공을 휴식 그리고 나중 시간 포인트에서 FACS의 효율을 증가.<ol>
<li>다시 셀을 접시, ≥95% 상대 습도 및 5% CO2와 37 ° C에서 5 분에 대 한 트립 신-EDTA (0.05 %trypsin)와 플레이트에서 세포를 분리. 트립 신-EDTA와 KSR:N2, 2 배 볼륨을 사용 하 여 담금질 및 5 분에 대 한 200 x g에서 원심 분리기 필터 어떤 덩어리를 제거 하려면 40 µ m 필터 튜브를 통해 셀. FGF-2 포함 된 N2/로켓 (1:1)에서 250, 000 셀/c m2 에서 셀을 다시 접시 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), 및 Y-27632 (10 µ M) 쉬와 (50 ng/mL). 참고: 다시 DD8 셀 접시 않기로 결정 했다 대신, 쉬를 포함 하는 KSR:N2와 미디어 변경 (50 ng/mL) DD7에서 DD12 2 일 마다 계속 IGF-1을 추가 하 고 (20 ng/mL)와 FGF-2 (10 ng/mL) DD9까지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DD10에 쉬를 포함 하는 KSR:N2와 미디어 변경 (50 ng/mL).</li>
	<li>
에 DD12, SST 하위 유형에 대 한 풍성 하 게 하는 셀을 얻기 위해을 사용 하 여 FACS Lhx6::GFP-만 셀을 표현.
	<ol>
<li>세포를 분리, 트립 신-EDTA 보다는 비 트립 신 포함 휴대-분리 시 약을 사용 합니다. 한 번 없이 Ca2 +/Mg2 +PBS 가진 세포를 씻어. 미리 데워 진된 비 트립 신 포함 하 셀 분리 시 약 DNase를 포함 추가 (2 U/mL)는 세포에. 10-30 분 또는 세포가 분리 될 때까지 ≥95% 상대 습도 및 5% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 배치 합니다. 부드럽게 분리를 돕기 위해 접시 마다 5 분을 누릅니다. 참고: DD11-12 문화에 대 한 10-15 분만 필요할 수 있습니다. DD15-16 문화에 대 일 분 이상 완전 한 분리에 대 한 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>일단 세포는 접시에서 완전히 해제 됩니다, FACS 절연 표준 프로토콜을 사용 하 여 진행 하거나 다른 다운스트림 분석 셀을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. PV 풍요롭게 프로토콜: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (단계 3.7에서에서 계속)
<ol><li>DD5, KSR:N2 (1:1) FGF-2를 포함 하는 미디어 변경 (10 ng/mL) 및 IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>DD8에 다시 도금 조직 문화 접시 준비 3.2 3.3 단계 (단계 4.4)에 설명 된 지침을 사용 하 여.</li>
	<li>DD7, 변경 포함 된 FGF-2 KSR:N2 (1:1)와 미디어 (10 ng/mL) 및 IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>DD8에 다시 접시 셀 다음 예외 4.4 단계에서 설명한 대로: 다시 셀 도금, 쉬 흐려져 주 작동 근으로 대체 (SAG; 30 nM) 비정형 PKC 억제제 (aPKCi; 2 µ M)를 추가 하 고. 합쳐, 다시 도금 미디어는 지금 N2/로켓 (1:1) 포함 된 FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µ M), 처 짐 (30 nM), 및 aPKCi (2 µ M).</li>
	<li>DD10에 KSR:N2 aPKCi (2 µ M)를 포함 하는 미디어 변경.</li>
	<li>
DD11 참고:이 시점에서, Nkx2.1::mCherry+ 세포는 풍부 하 게 될 태양광 발전 CIns.<ol>
<li>FACS 단계 4.6에서에서 설명 하는 동일한 프로토콜을 사용 하 여에 대 한 접시에서 세포를 분리 합니다. 나중 차별화 하루에 Nkx2.1::mCherry+ 세포를 수집 결정 경우이 단계를 무시 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>에 DD12, KSR:N2 aPKCi (2 µ M)를 포함 하는 미디어 변경. 에 DD14, KSR:N2 aPKCi (2 µ M)를 포함 하는 미디어 변경. 에 DD16, KSR:N2 aPKCi (2 µ M)를 포함 하는 미디어 변경. DD17에서 Nkx2.1::mCherry+ 셀 단계 4.6에서에서 설명 하는 동일한 프로토콜을 사용 하 여 수집 합니다.</li>
</ol>6. 태양광 발전 풍부 프로토콜: "DD17 mCherry 낮은 쉬" (단계 3.7에서에서 계속)
<ol><li>DD5, KSR:N2 (1:1) FGF-2를 포함 하는 미디어 변경 (10 ng/mL) 및 IGF-1 (20 ng/mL). DD7, 변경 포함 된 FGF-2 KSR:N2 (1:1)와 미디어 (10 ng/mL) 및 IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>
DD9, KSR:N2 (1:1)와 함께 미디어 변경 합니다. 이 시점에서 앞으로, 아니 추가 성장 요인이 필요 하다.
	<ol>
<li>계속 미디어 DD17에 셀 수확까지 2 일 마다 변경.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 메서드는 J1 파생 된 mESCs (SCRC-1010) 패턴에 매우 효과적인, 우리 다른 mESC 라인과 클론 분리 변수 성공을 경험 했다. 예를 들어, Foxg1::venus mESCs (EB3 파생; Danjo 외. 이 프로토콜을 Foxg1 DD12에 의해 유도 제대로 13) 응답은 일반적으로 1-2%의 순서. 이유로 우리가 완전히 이해 하지 않는 또 다른 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼 기자 클론 (나 JQ59) (JQ27 불리)이이 프로토콜에서 설명 하는 라인으로 동시에 고립 되었던 생산 1% 미만 Nkx2.1 표현 세포 성장 하는 때 동일한 조건. 상위 라인 (J1; 그러나 ATCC SCRC-1010),,이 프로토콜에 잘 응답 하 고 그림 1B에서 표시 된 것과 유사한 DD12에 Nkx2.1 표현 세포의 백분율을 생성. 필요한 경우 XAV 939와 쉬/SAG의 농도 줄 단위로 분화 조건을 최적화 하기 위해 조정할 수 있습니다. 그러나, 우리의 경험 MGE 같은 창시자에 다른 mESC 라인을 차별화 하는이 프로토콜을 사용 하 여 제한 됩니다.
우리의 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼 기자 mESC 라인에 관한 모든 Nkx2.1 + 셀 mCherry 익스프레스. Nkx2.1 단백질을 표현 하는 거의 모든 mCherry + 셀, 비록 기자 식 Nkx2.1 단백질 표정, 특히 차별화 (DD7-9)의 초기 단계 동안에 뒤에 lags. Nkx2.1 + mCherry을 꾸준히 표현 하는 셀의 일부는 분화의 과정 전반에 걸쳐 증가 합니다. 피크 레벨 (~ DD12-14) mCherry 창시자17을 표현 하는 모든 Nkx2.1의 약 30%에 표시 됩니다. 또한, 드라이브 mCherry 표현 하는 데 사용 같은 세균성 인공적인 염색체 유전자 변형 쥐24의 Nkx2.1 식 도메인 Cre recombinase 운전 사용 되었습니다. 이 마우스에 Cre 식 등 대부분 지역의 MGE의 Nkx2.1 표현 하는 세포 내에서 약한 되었고 운명-매핑이이 마우스와 함께이 지역25에서 크게 생성 될 것으로 알려진 아래의 레이블 SST 표현 CIns에 등장 26,,2728. 그러나, 이러한 불일치에도 불구 하 고 GFP 또는 mCherry 표현 세포의 수백만 수 있습니다 격리 FACS의 몇 시간 밖에.
이 기술의 두 가지 주요 이점이 있다. 첫째, 우리의 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼-기자 mESC 라인와 결합 하면, 그것은 PV 또는 SST 운명 대뇌 피 질의 interneuron 하위 될 농축 interneuron 선구자의 많은 수를 얻을 수 있습니다. 두 번째 주요 장점은 interneuron 운명 세포를 얻을 수 있습니다의 많은 수는 상대적으로 완화입니다. 몇 가지 다른 수정된 EB 기법 MGE 창시자와 뉴런을 차별화 하는 존재, 이러한 프로토콜은 일반적으로 Dkk113,,1429같은 Wnt 억제 분자의 사용에 의존 합니다. 우리 Foxg1과 Nkx2.1 식15에 의해 입증으로 Wnt 억제제 XAV 939 pallidal telencephalic 창시자의 생성을 크게 향상 시킵니다 발견 했다.
앞에서 설명 했 듯이, 다른 여러 가지 방법을 MGE 같은 창시자를 생성 하는 mESCs에서 존재 합니다. 와타나베 외. 14 먼저 뒤에 다시 부착 표면에 도금 하 여 혈 청 무료 정지 문화 방법을 개발 하 여 mESCs에서 telencephalic 차별화의 분야를 개척 했습니다. 그들은 그는 Wnt 및 Nodal 길 항 제, Dkk1 및 LeftyA, 각각, 효율적으로 몰고 mESCs 초기 neuroectodermal 계보13에 발견. 적용 하 여 쉬가이 문화에, 그들은 그 사이 있는 모든 셀의 5-15% 공동 표현된 Nkx2.1/Foxg1 문화 관찰 하 고 MGE 같은 창시자13로 간주 될 수 있다. 그러나, 많은 연구 서를 위한 토대를 하는 동안이 연구 하지 않았습니다 MGE 창시자를 격리 하거나 특정 CIn 하위에 대 한 풍부 하는 방법.
몇 년 후, Danjo 외. 13 mESC 파생 된 복 부 telencephalic 조직의 subregional 규격을 달성 하기 위해 다양 한 성장 인자, 특정 쉬에서의 시간된 관리와 함께에서 같은 혈 청 무료 정지 문화 방법을 사용. Foxg1::venus 기자 라인을 사용 하 여, 그들은 그 쉬 관리에서에서 발견 DD3-12 후 Foxg1::venus 기자13를 표현 하는 문화에서 모든 셀의 45-68% 사이 Dkk1 치료 결과. Foxg1::venus + 인구, 내 세포의 약 32% Nkx2.113표현. SAG 대 쉬를 대체 하 고 Fgf8를 추가, 그들은 더 약 4113Foxg1::venus + 인구 내의 Nkx2.1 창시자의 분수를 강화. 운명에 대 한 분석 때 약 17 %SST, PV는 21%, 18 %NPY, 및 8 %calretinin 하위13이 세포 생산. 그러나,이 연구 MGE 파생 CIn 운명을 대 CGE를 지정 하는 방법을 설명 하는 동안 선택적으로 태양광 또는 SST 하위에 대 한 풍부 하 게 하는 방법을 설명 하지 않았다.
다음 해, Cambray 외. 11 사용 혈 청 무료 단층 메서드 DD5에 다시 도금 마우스 및 인간의 ESCs에서 파생 된 telencephalic 신경 선구자의 정체성 분화에 activin의 효과 공부 하 고. 비록이 연구 그들의 프로토콜에서 생성 된 Nkx2.1 셀의 비율을 보고 하지 않았다, 그들은 문화에 있는 세포의 약 54% 공동 Nestin/Foxg1 DD2 (5 일 혈 청 자유로운 미디어 다음 추가 2 일 문화의 성장에 표현 보고 다시 도금) 후11. 그들은 또한 그 activin의 추가 함께 셀 ~ 55% 공동 표현 nestin 및 이러한 셀 꼬리 절 예 하 모양의 세포, calretinin을 표현 하는 대뇌 피 질의 수의 대부분을 생산 수 있습니다 나타내는 나타내는 CouptfII 보고 11. 실제로, 문화 (13 일 전반적인)에서 8 일에 의해 셀의 39% 공동 표현 하는 calretinin/BIII-tubulin, 동안 셀의 59% 공동 GABA/BIII-tubulin11익스프레스를 발견을 발견 했다. 이 연구는 태양광 또는 SST의 생산을 검사 하지 않았다.
다시 메서드를 사용 하 수정 EB, 첸 외. 12 그 MGE 관련 증강 요소를 따라 줄기 세포 파생 MGE 같은 셀12정화 사용 수를 설명 했다. 이 연구에서 그들은 Lhx6::GFP 기자 선;를 사용 하 여 MGE 같은 창시자에 mESCs의 감독된 차별점 중 다른 문화 조건의 효과 비교 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼-기자 선이이 원고에 설명 된에 대 한 상위 라인으로 봉사는 같은 라인. 그들은 그 문화에 Dkk1를 추가 하 여 DD0-3, 조건 따라 SAG의 추가 의해의 upwards 나타났다 ~ 문화에 있는 모든 셀의 10% 표현 Lhx6::GFP12. 그들은 또한 동일한 프로토콜, Danjo 그 외 여러분 에 의해 설명 된 Foxg1::venus 줄에 적용 발견 12, 귀착되 었 다 Foxg1::venus 기자를 표현 하는 모든 셀의 약 37%입니다. Lhx6::GFP 세포 이식 비보에있을 때, CIn 하위 마커의 다음과 같은 평균 비율 관찰 되었다: PV는 22%, 58 %SST, 및 16% NPY12.
더 최근에, 다른 그룹 직접 지정 CIns을 혈통 정의 녹음 방송 요인의 강제 식 사용. 아마도 이것의 첫 번째 데모가 했다 페트 로스 외. 10 Ainv15 mESCs Lhx6::GFP 세균 인공 염색체를 포함 하도록 수정 된에서 Nkx2.1 식 운전 doxycycline 유도할 수 있는 발기인을 사용. 이 연구는 문화 조건이 비슷한 XAV 93910의 추가 하지 않고 현재 원고에 설명 된 사용. 그러나, 제대로 이해 이유로, Lhx6::GFP + 셀의 낮은 비율 J1 Lhx6::GFP 부모 선이 원고10에 설명 된 사용 하는 경우에 비해 동일한 차별화 조건 하에서 관찰 되었다. Foxg1의 달성에 불구 하 고 식 (총 % 알 수 없는), Nkx2.1의 총 수에 적당 한 감소 했다 없이 세포 Lhx6::GFP 기자10을 표현 하는 모든 셀의 2% 보다 큰. 이 연구는 ESC 라인 원래 프로토콜을 개발 하는 데 사용 된 다른 분화 프로토콜을 적용 하려고 할 때 그 연구자 얼굴 도전과 다양 한 ESC 라인 사이 존재 하는 고유의 차이 강조 표시 합니다.
사용 하 여 우아한 접근, Au 외. 9 특정 하위 와타나베 연구진이 개발한 같은 복 부 telencephalic 차별화 패러다임을 사용 하 여 대뇌 피 질의 수의 생성 하 녹음 방송 요인의 순차 강제 식 사용 14 그들은 Foxg1 +, Nkx2.1 + 및 Olig2 + 선구자에서 문화 생산의 정확한 백분율을 보고 하지 않으면, 하는 동안 그들은 국가 문화에 있는 모든 셀의 약 50 %GABAergic 신경9로 분화. 11 일 후 차별화에서 EBs는 해리 되었고9E13.5 MGE 호스트 배아 이식. 작은 비율의 (1% 미만) 피 질, 그들은 그들의 Dlx5/6-eGFP 기자에 의해 발견 되었다 고 운명9에 대 한 분석으로 MGE에서 마이그레이션. 저자는 PV, SST, CGE와 같은 운명을 따라 그들의 선택한 강제 유도 전략9의 비율의 다양 한 관찰. 흥미롭게도, 녹음 방송 요인 Lmo3의 표현, 그들은 관찰 평균 약 57% 태양광, 21 %SST, CGE 파생 하위 15% (SST-/ reelin + 또는 VIP-유일한 +)9. 관찰 SST의 큰 비율 약 32 %SST, 생산과 35% 태양광 25 %CGE 파생 하위9는 Nkx2.1/Dlx2 프 라인을 사용 하 여 얻은 했다.
2015 년, Colasante 외. 30 GAD67 GFP 기자 쥐에서 섬유 아 세포 내에서 5 개의 녹음 방송 요인 (Foxg1, Sox2, Ascl1, Dlx5, 및 Lhx6)의 강제 식 GABAergic 같은 CIns로 모든 셀의 15%를 개조 했다. 놀랍게도, 이러한 세포의 약 90%에 갔다 SST30을 표현 하는 드문 셀만 PV, 표현. 이 메서드는 mESCs에 적용 되지, 있지만 사용 되었다 인간의 Ipsc 함께 어디 GABAergic 정체성30채택 하는 모든 셀의 약 30% 견적 되었다.
그림 2에서 같이 태양광 또는 SST CIns의 풍부한 인구를 생성 하는 여러 방법이 있다. DD17 프로토콜을 통해 PV 프로토콜 활용 aPKCi의 주요 이점은 셀 하나 큰 수 분리, 세포 생존, 및 문화의 기간. 우리는 그림 1에 DD17 유도 수준에 대 한 데이터를 표시 하지 않습니다, 비록 대략 두번 많은 mCherry + 셀에 있다 DD11 DD17에 있다 (데이터 표시 되지 않음). 이식에 대 한 셀 때, 우리는 더 많은 수의를 찾을 시작 셀 (아래 참조)은 도움이, 때문에 대략 세포의 30 ~ 50% 주입을 위해 그들을 집중 하는 과정에서 손실. 또한, 세포의 큰 번호는 셀 얼음에 있는 시간의 양을 제한 하 고 전체 비용을 낮추고 FACS 시간 단축으로 얻을 수 있습니다. 아마 체리 + 셀의 더 높은 백분율 때문에 창시자, 문화 (예, DD11)의 초기 단계에서 세포 신생아 피 질으로 이식 후 DD17 세포에 비해 더 큰 생존을 전시 한다. 많은 수의 가능한 셀이 필요한 경우 예 치료 간 질, 세포 이식의 경우 더 큰 시작 인구와 더 큰 생존 하는 데 장점은 주요.
프로토콜, 따라 그림 2에서 묘사 된 대로 Lhx6::GFP + 셀의 약 25-39% 분석 30 일 후 이식 일상적인 immunohistochemistry PV 또는 SST 단백질의 감지 레벨을 표현 하지 않습니다. 일반적으로, 이러한 태양광 발전-SST-세포 표현 GABA로 Sox6, MGE 파생 대뇌 피 질의 수 (타이슨 외. 참조 마커 / 15, Tischfield 외. 17).의 태양광 발전-1% 미만 / SST-Lhx6::GFP + 셀 다른 interneuron 하위 그룹, calretinin, 등, reelin neuropeptide Y의 명시적인 마커 (데이터 표시 되지 않음). Vivo에서 운명 매핑 연구는 사이 그 표시가 비슷합니다 ~ MGE 파생 수의 15-25 %PV 또는 SST23,,2531을 표현 하지 않습니다. Nkx2.1::mCherry+ 또는 Lhx6::GFP + 세포 격리 하 쥐 대뇌 피 질의 지류에 생체 외에서에 도금, 우리는 발견 하는 ~ Lhx6::GFP + 셀 문화에 28 일 후 태양광 발전-분석의 40-70% / 긍정적인 얼룩 할 그의 대다수와 SST-, SST를 표현합니다. 태양광 발전-이 증가 / SST 세포 특히 성숙한 태양광 발전 식 또는 피더 세포에서 차선 electrophysiological 입력 경우 있을 수 있습니다 존재 vivo에서, 외부 maturational 신호의 부재로 인해 수 있습니다. 이유 일지도 모른다 무엇 이건, 우리 운명 분석 보다는 체 외에서 차별 화를 위한 신생아 피 질으로 세포를 이식 하는 선호 한다.
대부분 이식 실험에 대 한 권장 최소 두 10 cm 비 점착 조직 문화 요리 DD0에 떠 있는 N2/로켓의 10 ml에서 105 mESCs x 포함 하 각 7.5 (4 셀/10ml x 7.5; 20 mL 전체 볼륨). 함께, 두 접시 일반적으로 5.4 x 10의6 셀 사용할 수 두 치료 6 잘 조직 문화 접시 (50, 000 셀/cm2; 약 110 cm2 총)을 시드하 DD3에 EB 분리 후 8-12 x 106 셀을 얻을 것입니다. DD8, 여 각 6 잘 플레이트 수익률 약 5-7 107 셀, 250, 000 셀/cm2 (총 3 개의 6-잘 경우 107 셀 x 4.05 요구의 조밀도에 5 6 잘 플레이트를 추가 3 씨앗을 사용할 수 있는 접시 또는 5 6 잘 플레이트의 경우 107 셀 x 6.75). DD14, 여 각 6 잘 플레이트 일반적으로 1-2.5 x 106 mCherry 또는 GFP 표현 셀을 얻을 것입니다. 실험의 요구에 따라 우리 큰 이식 프로젝트에 대 한 6 x 106 mESCs 이상에 소규모 immunohistochemistry 분석 105 mESCs x 7.5의 최소를 떠내려 있다.
프로토콜의 가장 중요 한 단계는 시작 차별화 이전 만능 주 및 DD3에 방문/분리 단계에서 mESCs을 유지 하 고 있다. 셀을 제대로 유지 하 고 방문/분리 DD3에 신중 하 게 이루어집니다, 차별화 성공 일반적으로 있을 것입니다. 만 줄기 세포 건강 한 나타나고는 차별화에 대 한 사용 해야 합니다. EBs DD0-3 사이 형성 또는 여러 형성에 실패, 작은, 비대칭 바디, 차별화가 높습니다 성공 하. 또한, DD3에 EB 분리, 중 EB의 모니터링 해야 합니다 수 신중 하 게 더 이상 표시 될 때까지 비 트립 신 포함 휴대-분리 리 젠 트에 장기간된 노출을 피하기 위해 눈으로.
이 문서에 소개 된 결과 품질 제어 시 약을 사용 하 여 최적화 된 조건 하에서 얻은 했다. 참고 이후 우리는 때때로 강력한 Nkx2.1 유도, 달성 하는 어려움 및 확장, mCherry 및 GFP 기자 식으로 중요 하다. 우리의 경험을 바탕으로, 우리는 이러한 변화에 대 한 가장 가능성이 계정 FBS의 로트 다양성을 믿습니다. 따라서, 테스트는 mESCs를 유지 하기 위한 최고의 작품을 결정 하는 FBS의 다른 많은 현명 하다. 우리는 2i/LIF 시스템 (혈 청 무료 매체는 MEK 억제제 PD03259010와 GSK-3α/β 억제 물 CHIR99021를 포함)를 사용 하지 않은, 비록 혈 청 무료 mESC 조건 보다 일관 된 결과 얻을 수이 가능 하다. 그러나 우리는,, 테스트를 하지 않은이 가설 하 고 혈 청 무료 mESC 미디어 사용 MGE 같은 창시자에 mESCs의 차별화에 영향을 미치는 여부에 관해서는 데이터가 없는. 또한, 가능 하면 신선한 성장 인자를 사용 하 여 aliquoting에 의해 반드시 단일 사용에 대 한 그들. 사용자에 따라 셀 밀도 DD3에 착륙 단계 동안 특히 충분 한 세포 생존을 달성 하기 위하여 증가 해야 합니다.
수, 마이그레이션, 생존과 호스트 회로 후 이식에 통합 놀라운 능력을가지고. 간 질환 마우스 모델 및 신경 정신병 병의 다른 모델에 interneuron 선구자를 이식 하이 프로토콜을 사용 하는 등, (참조 Southwell 외. 32 와33 interneuron 셀의 리뷰를 타이슨과 앤더슨 기반 요법). 예를 들어 최근 연구 Donegan 외. 34 의 정신 분열 증 마우스 모델에 이식 PV와 SST CIns의 인구를 풍성 하 게. 그들은 PV와 SST 태양광 농축 인구 그들은 공부 했다 정신 분열 증 endophenotypes 정상화와 마우스 동작에 다른 효과 생산 하는 이식 농축 발견.
최근 몇 년 동안, PiggyBac transposon 시스템은 다양 한 시스템에에서 안정적인 표현의 transgenes 달성 하기 위해 사용 되었습니다. 우리는 신속 하 고 쉽게 만들 안정적 interneuron 개발 하는 동안 특정 유전자의 역할을 연구 하기 doxycycline 유도할 수 있는 미르 구문 표현에이 시스템을 이용 했다. 우리는 또한이 기술을 사용 하 여 만들 듀얼 기자 optogenetically에 channelrhodopsin-2 (ChR2)을 나타내는 mESC 라인 드라이브 mESC 파생 수 또는 DREADD 수용 체 기술을 설정 또는 해제 이식 세포가 한꺼번에.

두 생쥐와 인간에 대략 절반 모든 대뇌 피 질의 억제 수 (CIns)의 발생 과도 subcortical 구조 중간 절 예 하 (MGE) 어디 라고 내 CIns 및 다른 신경 그리고 glial의 neuroepithelial 창시자 하위 그룹 표현 녹음 방송 요인 Nkx2.11,2. CIn 하위 그룹 또는 하위 형태학, neurochemical electrophysiological, 교차 및 연결 특성3,4로 정의 됩니다. MGE 파생 된 CIns로 그룹화 할 수 있습니다 대부분 비중첩 하위 PV 또는 SST, 특정 electrophysiological 및 연결 추세5와 어떤 관계가 식의 그들의 식에 따라. 부전 수, PV 비율에서 특히 그들의 여러 정신병 무질서 및 질병6,7에 연루 되었습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 줄기 세포 유래 mitotic 창시자 및 대뇌 피 질의 interneuron 생물학 연구 및 세포 기반 요법에 사용 하기 위해 태양광 또는 SST CIn 운명에 대 한 농축 철새 선구자입니다.
Interneuron 창시자 표현 하는 Nkx2.1 및 mESCs에서 그들의 자손의 파생에 대 한 확장 가능한, 매우 능률적인 방법을 개발 했습니다. Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP을 사용 하 여 듀얼 기자 mESC 선8, Nkx2.1 창시자 또는 그들의 Lhx6 표현 포스트 mitotic 자손은 FACS를 통해 격리 되 고 이후 다운스트림 응용 프로그램의 수에 사용 될 수 있습니다. 다양 한 신호 경로, 문화, 그리고 성체의 모드를 조작 하 여 우리 붙일 레이블된 interneuron 선구자 다운스트림 응용 프로그램의 호스트에 대 한 적합의 수백만 얻을 수 있습니다.
MESCs9,10,11,12,13,14, 의존 하는 Wnt 우리의 방법에서에서 MGE 같은 창시자를 생성 하기 위한 여러 가지 다른 방법 존재 길 항 근 XAV-939, Foxg1/Nkx2.1 공동 telencephalic 창시자 표현 생성에 특히 효율적입니다. 또한, interneuron 창시자 또는 우리의 듀얼 기자 시스템을 통해 그들의 포스트 mitotic Lhx6 표현 자손에 대 한 선택 수는 크게 고유 창시자 그리고 그들의 자손을 생성 하는 능력을 향상 시킵니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Corning 352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M)</td>
			<td>MTI-Globalstem</td>
			<td>GSC-6101G</td>
			<td>1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>Ant-pm-2</td>
			<td>Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement-B</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7156</td>
			<td>Do not filter with base media -- add after filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-NEAA (100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10829018</td>
			<td>Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone FBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82013-578</td>
			<td>Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture treated dish (10cm)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-adherent sterile petri dish (10cm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia inhibitory factor (mLIF)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>Do not freeze, store at 4&#39;C. References: 9,11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Gelatin Solution</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC PCS-999-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 RNase-Free DNase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M610A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN-193189</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0074</td>
			<td>Resuspend in DMSO and store at -80&#39;C in single use aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV939</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0046</td>
			<td>Resuspend in DMSO and store at -80&#39;C in single use aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhFGF-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB</td>
			<td>Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80&#39;C in single use aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIGF-2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>291-G1</td>
			<td>Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80&#39;C in single use aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Resuspend in DMSO and store at -80&#39;C in single use aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened agonist (SAG)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>566660-1MG</td>
			<td>Resuspend in H20 and store at -80&#39;C in single use aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rm Sonic Hedgehog/SHH</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>464-SH-025</td>
			<td>Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80&#39;C in single use aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKC&#950; Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>539624</td>
			<td>Resuspend in H20 and store at -80&#39;C in single use aliquots</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of mouse embryonic stem cells into cortical interneuron precursors

GABAergic 대뇌 피 질의 수는 흥분 성의 피라미드 뉴런의 출력 조절 피라미드 뉴런 앙상블의 출력을 동기화에 중요 한 역할을 하는 셀의 이종 인구. 정신병 무질서, 정신 분열 증, 자폐증, 간 질 등의 다양 한에서 적자 interneuron 함수에 연루 되었습니다. 배아 줄기 세포 로부터 대뇌 피 질의 수의 뿐만 아니라 그들의 개발 및 기능 연구에 대 한 허용 하지만 대뇌 피 질의 interneuron 관련 장애의 병 인을 기본 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 수는 또한, 마이그레이션, 생존과 호스트 대뇌 피 질의 회로 후 이식, 그들 세포 기반 요법에 사용 하기 위해 이상적인 후보자를 만들기에 통합 놀라운 능력을가지고. 여기, 우리 Nkx2.1 표현 interneuron 창시자와 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에서 그들의 자손의 파생에 대 한 확장성, 높은 효율, 수정 embryoid 몸 단층 방법 제시. Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼 기자 mESC 라인을 사용 하 여, Nkx2.1 창시자 또는 그들의 Lhx6 표현 포스트 mitotic 자손 수 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 통해 격리 되며 이후 다운스트림 응용 프로그램의 숫자에 사용. 우리는 또한 방법을 풍부 하 게 parvalbumin (태양광 발전) 또는 somatostatin (SST) interneuron 하위 그룹을 도움이 될 수 있습니다 운명 결정의 측면을 공부 하거나 사용 하기 위해 하위 그룹 농축 interneuron에서 도움이 될 것 이라고 하는 치료 응용 프로그램에 제공 이식입니다.

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Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

이 프로토콜 수정된 embryoid 몸 단층 메서드를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 대뇌 피 질의 interneuron 창시자와 포스트 mitotic interneuron 선구자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 창시자/선구자 사용 생체 외에서 또는 붙일 정렬 및 운명 결정, 공부에 대 한 신생아 피 질에 이식 하거나 수 치료 응용 프로그램에 사용.

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-into-cortical-interneuron

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.3K 조회수.  University of Pennsylvania. 이 프로토콜 수정된 embryoid 몸 단층 메서드를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 대뇌 피 질의 interneuron 창시자와 포스트 mitotic interneuron 선구자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 창시자/선구자 사용 생체 외에서 또는 붙일 정렬 및 운명 결정, 공부에 대 한 신생아 피 질에 이식 하거나 수 치료 응용 프로그램에 사용.

비디오: Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

마우스 Forebrain에 초음파 유도 Microinjection Utero에서 E9.5에서

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

연구

신경과학

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These animals also resist ischemic injury to the brain in vivo 2,3 and oxygen-glucose deprivation in vitro 4,5. These unique qualities provided the impetus to isolate AGS neurons to examine inherent neuronal characteristics that could account for the capacity of AGS neurons to resist injury and cell death caused by ischemia and extremely cold temperatures. Identifying proteins or gene targets that allow for the distinctive properties of these cells could aid in the discovery of effective therapies for a number of ischemic indications and for the study of cold tolerance. Adult AGS hippocampus contains neural stem cells that continue to proliferate, allowing for easy expansion of these stem cells in culture. We describe here methods by which researchers can utilize these stem cells and differentiated neurons for any number of purposes. By closely following these steps the AGS neural stem cells can be expanded through two passages or more and then differentiated to a culture high in TUJ1-positive neurons (~50%) without utilizing toxic chemicals to minimize the number of dividing cells. Ischemia induces neurogenesis 6 and neurogenesis which proceeds via MEK/ERK and PI3K/Akt survival signaling pathways contributes to ischemia resistance in vivo7 and in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., in preparation). Further characterization of these unique neural cells can advance on many fronts, using some or all of these methods.

Neural stem cells were prepared from the hippocampus of adult non-hibernating yearling Arctic ground squirrels (AGS). These neural stem cells can be expanded through numerous passages, differentiated and maintained as a nearly 50:50 neuron to glial culture.

성인 Hippocampal 북극 그라운드 다람쥐 신경 줄기 세포의 성장과 분화

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the demyelinating disease Multiple Sclerosis (MS). We have shown that transplantation of NSCs into the spinal cords of sick mice results in a significant improvement in both remyelination and in clinical outcome. Cell replacement therapies for the treatment of chronic neurologic diseases are now a reality and in vivo models are vital in understanding the interactions between the engrafted cells and host tissue microenvironment. This presentation provides an adapted method for transplanting cells into the spinal cord of JHMV-infected mice. In brief, we provide a procedure for i) preparation of NSCs prior to transplant, ii) pre-operative care of mice, iii) exposure of the spinal cord via laminectomy, iv) stereotactic injection of NSCs, and iv) post-operative care.

The transplantation of mouse neural stem cells (NSCs) into the spinal cords of mice with established demyelination is detailed. The preparation of NSCs, the laminectomy of thoracic vertebra 9 (T9), and transplantation of NSCs is outlined along with the pre- and post-operative care of the mice.

Neurotropic 마우스 간염 바이러스에 감염된 마우스의 척수 코드에 마우스 신경 줄기 세포의 이식 외과

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

이른 출생 후 마우스 두뇌로 Interneuron 선구자의 Homochronic 이식

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.