이 작품은 베이징 자연 과학 재단 (7152038), 중앙 남쪽 대학 (2016zzts162)의 중앙 대학 및 과학 연구 재단의 Aier 눈 병원 그룹 (부여 번호에 대 한 근본적인 연구 자금에 의해 지원 되었다 AF156D11)입니다. 마지막으로, 년 동안 귀중 한 지원 판 연 Yiping 쑤 감사합니다.

관련 된 동물 주제 기관 동물에 의해 승인 절차 관심과 사용 위원회 (IACUC) 수도 의과대학의. 모든 수술 기구 및 솔루션 미생물 감염을 제한 하는 수술 전에 소독 했다.
 참고: 수술 프로토콜 포함 5 개 부품, 즉 마 취, 수술 방법, 시 신경 평가, 마지막으로, 및 복구. 시 신경의 부분 양적 transection 지원, 새로운, 저렴 한 비용 수술 악기 설계 되었다. 모든 절차는 윤리적인 규칙 및 수술 방법에 따라 실시 했다.
 1. 수술 기법 <ol><li>무 균 기술을 사용 하 여 실험을 실시, 동물 사용에 대 한 프로토콜 특정 기관 이어야 합니다.</li>
	<li>Sterilize 악기 및 자료 (솔루션, 시험 물질, 추적기, 바늘, 등) 감염 및 동물 복지에 불리 한 영향 뿐만 아니라 연구에 잠재적인 부정적인 영향을 방지 하기 위해 생활 조직에 접촉으로 오는 .</li>
</ol> 2. 마 취 <ol><li>수의학 isoflurane 기화 기 시스템을 사용 하 여 Anesthetize SD 쥐. 1 L/min의 속도로 의학 급료 산소를 사용 하 여 증발 isoflurane 가스. 연결 된 마 취 상자에 동물 하 고 느린 호흡과 동물 진정까지 4.5%의 농도에서 isoflurane 실행.</li>
	<li>가스 마스크 첨부 파일에 가스 흐름을 전환 하 고 작업 테이블에는 동물을 놓습니다. 2%와 모니터 마 취 isoflurane 농도를 낮춥니다. 큰 동물 (&#62; 300 g) isoflurane의 높은 농도 필요할 수 있습니다. 적절 하 게 조정 isoflurane 복용량과, 수술 중 마 취를 모니터링 합니다. 끊임없이 깊이 호흡의 속도 평가 하 고 깊은 고통의 부재를 보장 하기 위해 발가락 핀치 평가 5 분 마다 수행.</li>
	<li>수술 완료는 isoflurane 끄고 작업 테이블에서 제거 하기 전에 몇 분 동안 호흡 산소는 동물 허용. 수술 담요로 동물을 취재 하거나 수술 하는 동안 규제 난방 담요를 사용 하 여 체온을 유지.</li>
</ol> 3. 수술 보조 악기 (SSAI)를 자체 설계 <ol><li>는 SSAI 만든 스테인리스 스틸 및 주로 사용은 휴대용 극 (100 m m, 길이, 직경, 9 m m)와 홈된 헤드 ( 그림 1). 홈 붙이 머리의 홈이 있는 표면을 각각 수직 깊이, 폭, 및 200 µ m, 500 µ m 및 1000 µ m의 길이와 반원형 이다. 두 부분 사이 50 m m의 길이와 공동 섹션이입니다. 홈 붙이 머리 &#39; s 가장자리는 넓은 300 µ m. 
	참고: 홈된 표면 transection 복 부 시 신경을 안정화 수 있습니다. 지 시 신경 시 신경의 복 부 측; 내 낳는 때 홈의 외부에 노출 되 한편, 홈된 가장자리에 노출 등 시 신경 수직 절단을 수행 하면 transected 될 수 있습니다. 홈 붙이 표면에서 누워 복 부 시 신경 홈이 있는 머리에 의해 보호 됩니다 &#39; s 지.</li>
	<li>RGCs 해당 양적 transected 시 신경 축 삭 (등 쪽), 하 주 상해를 구현 하는 보조 하면서 부상 RGCs 해당 직접 손상 없이 untransected 시 신경 축 삭 (복 부 측) 하에서 수행 것.</li>
</ol> 4. 외과 접근 <ol><li>장소 머리는 외과 의사를 직면 하 고 있는 수술 테이블에 위쪽으로 쥐의 오른쪽. 수술 시야의 중심에 바로 궤도 조정 합니다. 다음, 여러 번 측면 법 75% 에탄올에 0.5% 액체 적용 오른쪽 궤도 피부의 외부 음향 구멍을 따라 절 개 지역 청소. 아이리스가 위를 사용 하 여 외부 음향 구멍을 측면 법 사이 모피 제거.</li>
	<li>는 0.5 1 cm의 길이 가진 외부 음향 구멍을 측면 법 따라 아이리스가 위를 사용 하 여 피부 절 개를 확인 합니다. 다음, 근 막과 위쪽 삼각형 쐐기를 만들려고 이빨된 집게를 0.12 m m 풀을 꼬집어. 절 개 영역으로 욕실이 봄이 위 낮은 블레이드를 삽입 하 고 같은 전단 방향으로 근 막 오픈 컷.</li>
	<li>욕실이 함께 근 막 컷이 위 봄 하 고 궤도 정 맥 노출. 사용 날카로운 톱니 집게 클램프 궤도 정 맥의 측면 및 둔 절 개의 양쪽 열. 후속 작업을 촉진 하기 위하여 배치 되는 궤도 근육 표면의 수술 방향 궤도 정 맥 놓고 수술을 피하기 위해 궤도 정 맥 출혈 관련.</li>
	<li>아이리스가 위로 잘라 오른쪽 측면 법 동안 궤도 근육의 무딘 해 부에 대 한 시야를 완전히 노출 하 절 개 라인 따라 떨어져 따라 습을 사용 하 여</li>
	<li>클램프 subfascial 궤도 근육의 폴더와 무딘 계속 피부와 근 막 절 개의 방향에 수직으로 구분 합니다. 점차 궤도 지방이 많은 직물의 외관까지 궤도 깊이 도달 하는 측면에 따라 별도.</li>
	<li>궤도 지방 조직에의 노출, 외과 의사의 오른쪽 측면에 세로로 직면에서 쥐 머리 방향 변경. 한편, 지역 지속적으로 촉촉한를 사용 하 여 수술 또는 면봉 포함 하는 메 마른 PBS 유지. 이 이렇게 촉 촉 하 고 부드러운 조직을 유지 하면서 수술 분야의 명확한 비전을 보장.</li>
</ol> 5. 시 신경에 액세스 <ol><li>궤도 adipose 조직 궤도 구멍에서 시 신경 주위 궤도 근육 콘 취재를 잘라. 이렇게 하면 적절 한 수술 방법의 더 나은 노출. 피하기 위해 제한 된 지방 조직의 유지 절제는 출혈 지속.</li>
	<li>지방 조직, 측면 곧바로 노출 컷. 바깥쪽, 측면 곧바로 클램프 그리고 욕실이 봄이 위로 잘라. 지방 조직 측면 곧바로 아래 경우, 0.12 m m를 사용 하 여 시 신경 overlying 지방 올려 이빨 집게와 욕실이 봄이 위로 잘라. 
	참고:이 시간에, 광학 신경 주위 조직 칼 집 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>계속 분리 시 신경의 총 노출까지 궤도 깊이에 시 신경의 방향 따라 조직 칼 집. 깨끗 한 조직 제거에서 발생 하는 깨끗 한 적은 양의 혈액을 수술 면봉을 사용 하 여 영역을 유지. 
	참고: 이제, 시 신경 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>액세스, 안과 동맥 손상 없이 신경을 둘러싸는 meningeal 칼 집을 제거 합니다. 부드럽게 운영 현미경 고배율에서 경질의 혈관 패턴 검사를 칼 집 회전.
	<ol><li>혈관, 없는 영역을 식별 하 고 경질에 경도 컷 수행. 13 찢 어 칼 집 26 G 바늘 팁 또는 사파이어 외과 프로브 knifepoint 시 신경의 방향에 평행한 신중 하 게, 측면 인하와 함께 맥 관 구조에 손상을 피하. 
		참고: 신경을 다루는 유일한 남은 거미 집 모양의 membra 해야 합니다.네브라스카, 매우 얇고 투명.</li>
	</ol></li> <li>5.2 단계, 시 신경의 방향에 평행한 부드럽게 26 G 바늘 팁 또는 사파이어 외과 프로브의 knifepoint와 거미 집 모양의 막 버리고 비슷합니다. 13</li> <li>결과 홈된 머리 가장자리 보다 약간 높은 되 고 지 시 신경에 부드럽게 하 고 신중 하 게,에 악기 홈 안에 시 신경을 하다. 이 시점에서 26 G 바늘 팁 홈된 머리 플랫폼의 가장자리 또는 knifepoint 사파이어 외과 프로브 부분 시 신경 transection 완료를 위에 지 시 신경 transect.</li>
</ol> 6. 닫는 및 복구 후자를 시 신경의 <ol><li>이동 악기는 수직으로 좀 더 깊이 방향. 그런 다음, 부드럽게 악기의 홈이 있는 머리를 제거 합니다. 눈 근육 이나 다른 조직 추가 손상을 방지 하려면 스크래치 하지 마세요. 부분 시 신경 transection의 그 루터 기를 관찰할 수 있다.</li>
	<li>측면 곧바로, 근 막 및 그들의 원래 위치로 눈의 다른 주변 조직 교체합니다. 그런 다음 순서로 근육 및 궤도의 피부 층 봉합. 출혈이 지속 되 면, 부드럽게 의료 면봉으로 상처를 닫기 전에 시간 동안 이것을 유지. 감염을 방지 하기 위해 상처에 항생제 연 고를 적용.</li>
	<li>차례 isoflurane 소스 끄고 몇 분 동안 호흡 산소를 동물 허용. 쥐 소생 과정 온수 매트와 열 절연 제를 준비 하거나 건조 패딩 케이지 표면을 커버 합니다. 복구 프로세스 동안 쥐 기도 patency 되도록 담요와 동물 커버.</li>
	<li>수술 후 개별적으로 집 동물입니다. 제도 동물 보호 기관에 의해 제공 된 지침에 따라 수술 후 진통제를 관리 합니다. 수술 후 동물을 주의 깊게 모니터링.</li>
</ol>

<ol>
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모든 저자 들은 관심의 모든 갈등을 선언 합니다.

운영 절차
모델 건설 과정 고 시의 가치 있는 몇 가지 포인트가 있다. 4.2 단계에서 수술 운동 subfascial 근육 위에 맥 관 구조를 손상 되지 않도록 신중 하 게 수행 되어야 한다. 특히 때 피하 근 막 외부 측면 법에서 절단, 날카로운 톱니 집게 사용 해야 합니다을 위쪽으로 피하 근 막 근 막 표면에 수직으로; 근 막 욕실이 함께 모델 실패 과도 한 출혈이 발생할 수 있습니다 외부 법에서 궤도 혈관 손상을 방지 하려면 봄이 위 잘라 되어야 합니다. 4.3 단계는 잠재적으로 직접 혈관에서 제거 출혈 방지의 이점이 있다. 분리 단계 4.5, 따기 날카로운 톱니 모양의 겸 하지만 욕실이 없는 이유에서 궤도 근육에서 봄이 위 지속적인 출혈과 출혈을 방지 하는. 근육 피부 근 막 절 개;을 수직 방향으로 양쪽에 퉁 명 스럽게 분리 한편, 바깥쪽과 주변 궤도의 깊은 근육이 뻗어 있다. 이 절차는 큰 수술 창을 제공 하 고 오버레이 시 신경 조직에 대 한 한 시 빨리 벗어나게 액세스 허용 궤도 구멍의 깊은 부분을 발표할 예정 이다. 위의 절차에서 출혈이 발생 하는 경우 압력 적용 해야 살 균을 사용 하 여 수술 또는 면봉. 작은 출혈이 절차에 의해 몇 초 후 중지 됩니다. 4.6 단계의 목적은 쉽게 궤도 깊이에 시 신경의 방향 따라 시 신경이 노출 궤도 근육 콘에 뚱 뚱 하 고 별도 일부 근육을 제거 하는 후속 작업을 촉진 하기 위하여.
현재 프로토콜의 가장 중요 한 부품은 단계 5.1-5.6입니다. 그것은 시 신경 머리 주위 맥 관 구조를 손상 하지 해야 합니다. 시 신경이 부분적으로 눈의 1 mm 이내 신경 관통 하 고 내부 망막에 혈액을 공급 하는 안과 동맥에 손상을 피하기 위해 눈의 뒷면에서 최소 1.5-2.0 mm로 transected 한다. 측면 곧바로 절단의 목적 측면 곧바로 넓은 고 시 신경의 보기를 분명히 차단 시 신경의 더 나은 노출을 달성 하는 것입니다. 한편, 안과 동맥 meningeal 칼 집 (그림 5)와 관련 된 제거를 피하기 위해, 그것은 분리 하 고 시 신경 주위 dura 해리 meningeal 칼 집의 혈관 패턴을 검사 하는 데 필요한 집게를 사용 하 여 부드럽게 회전 하는 칼 집. 또한, 혈관이 없는 영역 식별 되어야 합니다, meningeal 칼 집에 경도 컷을 수 있도록. 그것은 또한 안과 동맥에 밀접 하 게 연관 된 경질의 부분을 피하기 위해 눈의 뒷면에서 작은 작업 거리를 유지 하는 데 필요한. 망막은 일반적으로 투명 하 고 혈관을 명확 하 게 구분 될 수 있습니다. 손상 된 망막 혈액 공급의 경우 망막 퇴 화, 유백색 백색의 부드러운 모습을 선도. 시간이 지남에 따라 눈과 렌즈의 유리 챔버를 뿐만 아니라, 줄된 눈 크기와 흐린 일반적으로 될 수 있습니다. 본이 연구에서는 수술 전 및 수술 후 이미지는 저 위의 단계를 적용 한 후 모델에 저 혈액 공급 손상 확인.
또한,이 모델의 몇 가지 단계에서 특별 한 주의가 필요 합니다. 노출 시 신경 날카로운 곡선-톱니 모양의 포 셉 또는 다른 수술 도구를 사용 하 여 때 외과 의사 피해 야 한다 과도 한 힘으로 시 신경, 안구 또는 안과 동맥 손상 될 수 있습니다 기본 상해 및 망막 국 소 빈 혈 결과. 또한, 눈 주변 혈관 해야 하지 손상 될, 지속적인 출혈을 방지 하는 모델링의 실패에 발생할 수 있습니다. 이 실험에 사용 된 SSAI 섬세 한 사용을 필요 합니다. 시 신경 악기 그루브 내 놓으면 시 신경 및 홈이 있는 표면을 단단히 좋은 일관성 및 각 동물 모델의 반복성을 보장 하기 위해 장착 해야 합니다. 초기 항목 인하 후 연습, 전체 수술 눈, 당 15-20 분 이내 완료 수 있습니다.
왕 외. 19 시 신경 양적 절단기를 사용 하 여 부분 시 신경 transection의 유사한 동물 모델을 발표 했다. 수술 절차 포함: 1) 절단 떨어져 외부 법, 중단 하 고 고정 종을 우수한; 2) 시 신경 탐험과 절단기;를 사용 하 여 시 신경의 우량한 부분을 transecting 그리고 3) 결 막과 피부를 봉합. 수술은 비교적 간단, 작업 중 다음과 같은 문제가 발생 했다. 비록 측면 법 절 개는 작업에 대 한 특정 공간 노출 수, 끊임없이 retrobulbar 시 신경 칼 집, 특히 때 외과 의사 이상 retrobulbar 노출 노출 하려면 안구 스트레칭 하는 피할 필요가 있었다 시 신경 칼 집 칼 집 격리; 더 촉진 하기 위하여 안구 스트레칭 위한 힘이 이었다, 안구 및 시 신경의 직접 견인 부상을 일으킬 것입니다. 시 신경 칼 집와 함께 잘라 수 있습니다 혈관에 특별 한 주의 지불 했다 그리고 혈관에 손상을 실패 모델 설립으로 이어질 가능성이 높습니다. 이 문서에서 설명 하는 보조 부상 모델의 주요 절차는: 새로운 요원 접근 안구의 측면 궤도 벽에서 직접 액세스 궤도 근육 콘으로 둘러싸인 retrobulbar 시 신경 주 상해를 피하는 안구, 시 신경, 아래쪽 또는 안구의 비 강 측면 사이드 쪽으로 당길 때 이 새로운 수술 방법을 모델링, 동안 외과 수술의 공간을 증가 하 고 밀접 하 게 관련 된 시 신경의 partial transection 전에 안과 동맥 meningeal 칼 집의 쉽게 격리 수 있습니다. 부분 시 신경 transection 자체 디자인된 한 외과 악기가 고, 비용 효과적이 고 재사용, 모델링의 전반적인 비용 감소와 함께 수행 되었다. 쥐의 궤도 구조는 법 및 아무 뼈 구조에 가장 가까운 궤도와 다른 포유동물의 다른 이지만 근육으로 덮여. 외과 접근은 궤도 뼈와과 파괴의 필요 없이 안구의 후부 부분을 도달할 수 있습니다. 통해 엄격한 수술 소독 하 고 수술 후 항생제 예방 치료, 감염, 염증 및 부 종 크게 감소 되었다.
자체 디자인된 외과 보조 기구
부분 시 신경 transection의 쥐 모델 자체 디자인된 외과 조수로 악기, 누구의 주요 특징은 다음과 같습니다를 사용 하 여 설립 되었다. 그것은 또한 다른 동물 사이에서 transection 일관성을 보장 하는 홈된 가장자리에 노출 시 신경의 부분 양적 transection에 지원할 수 있습니다. 우리는 테스트 하 고 SSAI 모델 설립의 반복성을 확인. 변이의 최대 계수는 1.85%, 평균 0.67% ±0. 44%. 20 이러한 결과 나타냅니다 만족 재현성 및 유엔 부분 시 신경 transection 모델을 설정 하는 SSAI를 사용할 수 있습니다.iformity입니다.
홈된 표면의 너비와 홈의 내부 표면의 세미 원의 디자인 수 시 신경에 영향을 더 고정 홈된 화면을 확인 하 고 시 신경 또한 감소 하는 실험적인 오류 및 불리 한 반응 더 긴밀 하 게 연결. 홈된 지 커터의 선명도에 홈에 시 신경 손상 하지 것입니다 작업 중 홈에 시 신경의 더 나은 보호를 허용 한다. 홈된 가장자리의 또 다른 장점은 시 신경 transection 동안 호감 부상 방지입니다.
그것은 깊고 좁은 공간에서 작동 하는 데 적합 합니다. 비록 새로운 요원 접근 확장 되었습니다 통로가 남아 깊은, 그리고 휴대용 극 및 공동 섹션 후속 작업을 수행 시 신경 칼 집에서 쉽게 홈된 머리를 사용할 수 있습니다. 작업에 대 한 악기를 사용 하는 경우 다양 한 커터 transection, 예: 26 G 바늘 팁에 대 한 사용할 수 있습니다. 사파이어 외과 프로브 칼도 타 박상을 방지 하 고가 위로 인 한 부상 호감을 선택할 수 있습니다. 그루브 표면 완료 시 신경 절단의 다양 한 각도에 다른 수직 깊이에 만들 수 있습니다.
왕의 절단기에 비해 외 는 SSAI 더 간단한 구조를 하고있다. 또한, 가공 단계 및 동물 모델의 반복성이 향상 된 일관성, SSAI를 사용 하 여 더 편리 하다. 마지막으로, 도구는 SSAI와 절단에 대 한 적용의 범위 넓은 이기도합니다. 끝으로, SSAI 신경의 양적 하 고 균일 한 절 개를 시키는 쥐 시 신경 transection를 평가 하기 위한 모델을 설정 하기 위한 효과적인 악기 역할을 수 있습니다.
쥐 부분 시 신경 Transection 모델의 특징
부분 시 신경 transection 모델 RGCs에 2 차 변성을 평가 하기 위해 유용 합니다. 이 모델의 잠재적인 장점 기본 2 차 변성에서 정확 하 게 분리 하는 기능은 제자리에, 모두는 시 신경 및 망막에서. 중앙과 복 부 시 신경 등 시 신경 (그림 6)의 partial transection (약 1/3 ~ 1/2) 후 보조 부상에 더 취약 했다. 망막에서 RGCs의 기본 및 보조 상해의 지역 위치에 해당 하는 망막 RGCs partial transection 후 시 신경의 지형에 근거 한다. 쥐의 전체 망막 등 (등)와 복 부 (열 등 한) 부분으로 나누어져 있습니다, 보조 및 기본 상해 있다면 두 부분에 존재. 그러나, RGCs 망막 및 시 신경 축 삭의 관계에 따라, 복 부 망막에 RGC 죽음 한다 주로 인할 보조 부상 (그림 3). 12 , 22 , 23 이 모델 포함의 장점: 간단 하 고 조작이 쉬운 악기 표준 절차; 눈에 영향을 주지 않습니다 좋은 재현성 및 안정성 이 기술은 짧은 방해 RNAs (siRNAs), 플라스 미드, 적용 하 여이 공간 절약형 요원 접근에서 RGCs transfect에 사용 될 수 및 부분 시 신경에 바이러스 성 벡터는 그 루터 기. 또한, 시 약 선택적 치료 또는 RGCs의 라벨에 대 한 부분 시 신경 등 걸에 배치 될 수 있습니다.
RGCs의 전체, 기본 및 보조 부상 후 망막 두 부상 종류 사이에서 명확한 경계와이 동물 모델에 부분 시 신경 transection 공존. 시 신경 축 삭 망막에 RGC 위치 협회 더 정확한 구별을 위해 추가 조사를 요구, 비록 공간 절약형 요원 이렇게 모델의 응용 프로그램 범위를 확장 하 고 탐구 하는 연구자 수는 새로운 방식으로 RGCs에 보조 부상의 메커니즘.

2 차 변성 외상 성 부상, 그리고 다음 급성과 만성 신경 퇴행 성 질환 후에 중앙 신경 조직 (CNS)에 일반적으로 발생합니다. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 주 병 적인 이벤트의 초기 결과 신경 그리고 glial 세포의 죽음은 불린다 기본 변성, 신경 및 또는 부분적 으로만 영향을 받지 않습니다 기본 glial 세포의 죽음에는 2 차 변성 손상입니다. RGCs의 2 차 변성 녹 내장에서 발생을 또한 믿어진다. 6 Yoles 외. 7 2 차 부상 RGCs의 시 신경 손상 모델에서 발생 하는 것을 확인 했다. 그들은 뉴런 누구의 axons 급성 피해는 결국 퇴행 성 환경으로 인해 타락 한 후 부상 되지 않았습니다 이러한 axons을 둘러싼 부상으로 생산 했다. 이 이차 변성 가해진 손상의 심각도 관련 된 진보적인 패션에 신경을 영향을 줍니다. 지금까지 녹 내장에서 RGC 손상 기본 메커니즘 불분명, 특히 부족 한 임상 치료에서 보조 부상에 관련 된 유지. 8 , 9 , 10 그러므로 필요는 녹 내장의 개발 하는 동안 RGCs의 보조 변성의 기본 메커니즘을 탐구입니다. 11 의 크기, 분포, 및 메커니즘 RGCs의 보조 변성의 양적 평가 수 보조 부상의 동물 모델 설립 과학자 공부 RGCs의 보조 부상 증가 주목을 끌고 있습니다.
이 문제를 명확 하 게 쥐 퐁 모델 Levkovitch-Verbin 그 외 여러분 에 의해 설립 되었다 12 axonal 상해 평가를 유도 변성 고 RGCs의 죽음. 이 모델 2 차 변성의 메커니즘을 탐구 하 고 잠재적인 신경 에이전트를 식별에 대 한 좋은 도구를 구성 하는 것 여겨진다. 보조 부상의이 모델을 생성 하는 데 사용 하는 악기는 완료 시 신경의 양적 transection 다이얼 노브를 통해 절단의 깊이 설정 하 여 양적 transect를 규모와 다이아몬드 칼입니다. 수술 경로 안구 위쪽 또는 일시적인 결 막에서 접근합니다. 수술 과정에서 망막 및 시 신경 수도 영향을 받을 차례로 주 부상을 일으킬 수 있습니다 집게의 힘에 의해. 더 중요 한 것은, 노출된 시 신경의 제한 된 공간 때문에 그것은 절 개 전에 meningeal 덮개 분리 어렵다. 따라서, 그것은 부분 시 신경 transection, 망막 허 혈 및 모델의 실패 귀착되는 동안 안과 혈관을 손상 수 있습니다. 또한, 다이아몬드 칼은 비용이 많이 드는, 그리고 각 사용 감소 팁 선명도. 이 영향을 미칠 수 깊이. 을 모델링의 효과
이 연구에서 설명 RGCs의 보조 변성의 모델 안구의 측면 궤도 벽에서 새로운 요원 접근 방식을 통해 얻은 것입니다. 소설 요원 이렇게 궤도 근육 콘, 아래쪽 또는 안구의 비 강 측면 사이드 쪽으로 당길 때 안구 및 시 신경 주 상해를 피하에 의해 둘러 쌓여 retrobulbar 시 신경에 직접 액세스 합니다. 이 또한 모델 설립, 동안 외과 수술의 공간을 증가 하 고 부분적으로 시 신경 transecting 전에 meningeal 칼 집 격리 수 있습니다. 그것은 실수로 참여와 안과 혈관의 부상 이어질 수 있는 모델의 실패를 통지 해야 합니다. 또한, 모델 transfected 세포, 마약과 transected 부분적으로 시 신경의 그 루터 기에 시 약의 후속 평가 수 있습니다. 자체 디자인된 수술 악기 저렴 하 고 사용된 여러 번 모델링의 비용을 줄일 수 있습니다. 이 방법에 의해 설립 RGCs의 보조 부상 모델 좋은 재현성 및 안정성을 보였다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="770">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Animal Aneathesia Ventilator System</td>
			<td style="width:268px;">MIDMARK</td>
			<td style="width:119px;">Matrx VMR</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:268px;">RWD Life Science Co.</td>
			<td style="width:119px;">R510-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:216px;">Surgical Microscope</td>
			<td style="width:268px;">Leica AG, Heerbrugg, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">M620 F20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tobramycin Eye ointment</td>
			<td style="width:268px;">Alcon</td>
			<td style="width:119px;">H20110312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluorogold</td>
			<td style="width:268px;">Biotium</td>
			<td style="width:119px;">80014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iris scissors</td>
			<td style="width:268px;">66vision Co.</td>
			<td style="width:119px;">54026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vannas spring scissor</td>
			<td style="width:268px;">66vision Co.</td>
			<td style="width:119px;">54137B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Sharp-serrated forceps/0.12mm toothed forceps&#160;</td>
			<td style="width:268px;">66vision Co.</td>
			<td style="width:119px;">53329A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sharp-curved forceps</td>
			<td style="width:268px;">66vision Co.</td>
			<td style="width:119px;">53324A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sapphire surgical probe</td>
			<td style="width:268px;">66vision Co.</td>
			<td style="width:119px;">50205TA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">26G needle tip</td>
			<td style="width:268px;">Shandong Weigao Group Medical Polymer Co.</td>
			<td style="width:119px;">3151474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 &#956;l Hamilton Syringe</td>
			<td style="width:268px;">Hamilton Co.</td>
			<td style="width:119px;">80030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-0 non-absorbable suture</td>
			<td style="width:268px;">Johnson &#38; Johnson International Co.</td>
			<td style="width:119px;">W580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chlorhexidine</td>
			<td style="width:268px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">282227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereotaxie apparatus</td>
			<td style="width:268px;">RWD Life Science Co.</td>
			<td style="width:119px;">68026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Retinal Imaging System</td>
			<td style="width:268px;">OptoProbe Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">OPTO-RIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">RetCamII wide field imaging system</td>
			<td style="width:268px;">Clarity Medical Systems,Inc.</td>
			<td style="width:119px;">RetCamII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:268px;">Leica Microsystems Inc.</td>
			<td style="width:119px;">DM6000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial optic nerve transection in rats: a model established with a new operative approach to assess secondary degeneration of retinal ganglion cells

이전 연구에 망막 신경 절 세포 (RGCs)의 2 차 변성 녹 내장에서 일반적으로 발생 하는 것으로 나타났습니다. 부분 시 신경 transection 유용 하 고 재현할 수 모델을 간주 됩니다. 2 차 변성, 예를 들면 완전 한 시 신경 transection와 시 신경 호감 모델 평가 대 한 일반적으로 사용 되 다른 시 신경 상해 모델에 비해, 부분 시 신경 transection 모델은 우수한 기본 구분 제자리에서 2 차 변성. 따라서, 그것은 2 차 변성을 평가 하기 위한 훌륭한 도구 역할을 합니다. 이 연구는 직접 안구의 궤도 측면 벽을 통해 retrobulbar 시 신경의 영역에 액세스 하 여 부분 시 신경 transection의 소설 작용 접근법을 설명 합니다. 또한, 선물이 transection 지원 하기 위해 새롭게 설계 된, 저렴 한 비용 수술 악기. 기본 및 보조 부상 분야의 경계를 구별에 대표적인 결과 같이, 새로운 접근 및 악기 하면 높은 효율과 안정성 모델의 외과 수술에 대 한 충분 한 공간을 제공 하 여. 이 차례로 쉽게 transection 전에 시 신경에서 meningeal 칼 집 및 안과 혈관을 분리 있습니다. 추가적인 혜택은 공간 절약형 요원 이렇게 뒤에 메커니즘의 탐사를 허용 하는 부분적으로 transected 시 신경의 그 루터 기에 약물, 운반대, 또는 선택적 RGC 추적기를 관리 하는 수 사관의 능력을 향상 새로운 방식에서, RGCs에 보조 부상.

SSAI (그림 2A)를사용 하 여 새로운 수술 방식으로 보조 부상 모델의 설립에 관한 성공 확인, RGCs 했다 retrogradely 모델 설립 후 즉시 표시 됩니다. 이 절차의 목적은 신경 추적 염료 (3 %fluorophore (예, Fluorogold) 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수에) 우량한 colliculus (그림 2B)에 주입 하 여 retrogradely 레이블 RGCs 것 이었다. 이 접근의 약간 변이 가진 가능한 RGCs 재현할 수 라벨 생성 합니다. 14 , 15 , 16 , 17 , 18 염료 RGCs 망막에 의해 retrogradely 촬영 될 것 이다 하 고와 오른쪽 눈에 안 transected 축 삭 라이브 RGCs에 대 한 마커를 창설 한다. 한편, RGCs는 오른쪽 눈에 축 삭 하지 추적 염료 (그림 2C)로 분류 될 수 transected 부분적으로 시 신경에 해당 하는. 제어 눈으로 작업, 망막의 시 신경을 따라 RGCs 없이 왼쪽된 눈은 모두 표시 형광 골드 염료와 우량한 colliculus (그림 2D)에서 역행으로.
7 일 부분 시 신경 transection RGCs, 역행 라벨링 한 후는 망막 수확, 고정, 평평 하 게 되었고 탑재. 레이블이 RGCs 망막의 정의 된 영역에서 형광 현미경 아래 몇 군데 있었다. 형광 표시 RGCs 부분 시 신경 transection 없이의 결과 그림 3에 표시 됩니다. 광학 신경의 untransected 부분에 해당 하는 오른쪽 망막 RGCs 형광 금, 표시 했다 레이블 및 레이블 RGCs의 명확한 경계 수만 (그림 3A, 그림 3B), 시각 시연 시 신경의 부분 트랜잭션. 제어 눈, 왼쪽된 눈 망막을 보여주었다 형광 (그림 3C, 그림 3D)의 모든 RGCs로.
평가 여부 시 신경 머리와는 entoretina에 혈액을 공급 하는 안과 동맥 맥 관 구조 손상 되었고 오른쪽 눈 안구 내부 작업 중에 영향을 했다 몇 군데 수술 전후. 이미지 고 전에 오른쪽 눈 (눈 수술) 수술 후 1 시간에 혈액 공급을 보여주었다. 동맥에 있는 혈액은 적절 한. 정 맥의 아무 방해 관찰 되었다. 이러한 연구 결과 표시 (그림 4A, 그림 4B)작업 중 혈액 공급 시스템에 아무 손상도 없었다. 따라서, 2 차 변성 모델 RGCs의 성공적으로 설립 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56272/56272fig1.jpg"> 
그림 1 : 자체 디자인된 외과 조수로 악기, SSAI의 사진. (A) 휴대용 극 및 홈이 있는 머리를 포함 하 여 2 개 주요 부품으로 외과 악기의 파노라마 전망. 그들 사이 50 m m의 길이와 공동 섹션이입니다. 휴대용 극의 길이 100 m m, 그리고 휴대용 극의 직경은 9 mm. SSAI 홈의 (B) A 기능. 홈 붙이 머리의 홈이 있는 표면을 transection 위해 안정 되 고, 누워 시 신경 수 세미 원형 이다. 홈이 있는 표면 200 µ m의 수직 깊이 500 µ m의 너비와 1000 µ m의 길이 이다. 홈 붙이 머리의 가장자리의 폭은 300 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56272/56272fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56272/56272fig2.jpg"> 
그림 2 : 자체 디자인된 외과 조수로 악기 (SSAI)와 함께 오른쪽 시 신경의 partial transection 후 망막에 라벨 및 retrogradely는 fluorophore와 우량한 colliculus 라벨 RGC의 회로도. (A) 부분 오른쪽 시 신경이 transection 자체 디자인된 수술 보조 장비 (SSAI) 쥐에서의 수술 보기. (B) 모델링, 후 RGCs 했다 표시 retrogradely 뇌의 우량한 colliculus 신경 추적 염료 (노란색, 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수에 3 %fluorophore) 주입 하 여. RGCs axons 우량한 colliculus에 거주, 이후 추적 염료 RGCs에 의해 retrogradely 촬영은 하 고 라이브 셀에 대 한 마커를 창설 한다. 그림에서 가로 섹션 시 신경의 단면을 나타냅니다. OD, 운영된 눈; 운영 체제, 작업 없이 제어 눈입니다. (C), 시 신경의 untransected 부분에 해당만 RGCs fluorophore와 분류 했다. 구분 되지 않은 복 부 시 신경 및 망막;에 해당 RGCs 블루 대표 레드는 부분적으로 transected 지 시 신경 및 망막에 해당 RGCs 반영합니다. (D)는 망막 수술 없이 왼쪽된 눈 (제어 눈)의 RGCs 했다 모든 분류 염료에 의해. 등 쪽과 복 부 시 신경 모두 뿐만 아니라 염료에 의해 표시 되었다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56272/56272fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56272/56272fig3.jpg"> 
그림 3 : 전체 망막 epifluorescence 현미경 fluorophore 표시 RGCs 부분 시 신경 transection 설정한 후 7 일의 모델 및 우량한 colliculus의 라벨 역행. 망막에 RGC 영역 스테인드 Fluorogold의 해당 도식은 또한 제공 됩니다. (A) (C) fluorophore와 각각 라벨링 후 RGCs 오른쪽 (요원)의 망막에 왼쪽 (제어) 눈의 도식 다이어그램을 나타냅니다. 노란색 형광 골드 염료와 함께 표시 하는 영역을 나타냅니다. 망막 등, 복 부 및 중앙 부분으로 나누어져 있습니다. (B) 와 (D) 형광 현미경; 얻은 전체 망막 epifluorescence 현미경 대표 노란은 RGCs fluorophore 표시 영역을 나타냅니다. B에 나와 수술 눈 (오른쪽 눈) 레이블이 없는 지역 RGCs에 해당 하는 망막의 등 쪽에 주로 transected 부분적으로 시 신경의 영역을 나타냅니다. 형광 골드 염료에 의해 표시 된 지역 RGCs transected 하지 이며 주로 망막의 중앙과 복 부 측면에 집중 되어 시 신경에 해당 지역입니다. boundary 레이블 및 레이블 RGCs 영역 사이 분명 하다. RGC 시체의 기본 변성 등 망막에 제한 됩니다 그리고 중앙과 복 부 망막에 RGC 시체의 모든 손실 보조 변성에 기 인할 수 있습니다. (D) 전체 망막 RGCs fluorophore와 라벨링 후 왼쪽된 눈의 photomicrograph. 수술 없이 왼쪽된 컨트롤 눈의 RGCs fluorophore에 의해 얼룩이 완전히 했다. 스케일 바 = 500 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56272/56272fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56272/56272fig4.jpg"> 
그림 4 : 수술 전 및 수술 후 이미지 오른쪽 눈의 저의 저 카메라에 의해 획득. (A) 쥐, 오른쪽 눈 수술 전에 저의 이미지는 저, 동맥 작성, 그리고 정 맥 반환 또는 방해의 좋은 혈액 공급을 보여주는 좋은 망막 혈액 공급 시스템을 나타냅니다. (B) 이미지의 오른쪽 눈 수술 후 1 시간의 저. 저의 수술 전 이미지와 비교 하면, 상당한 변경 망막 혈액 공급, 안구의 혈액 공급 시스템 모델링의 과정에서 영향을 받지 했다 나타내는에서 관찰 되었다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56272/56272fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56272/56272fig5.jpg"> 
그림 5 : 사진 retrobulbar 시 신경 그리고 안과 동맥의 외과 접근 방식을 통해 캡처한 meningeal 칼 집에 있는. 시 신경의 표적으로 길이 완전히 제거 후 안과 동맥 (화살촉) 시 신경의 meningeal 칼 집과 부수적인 되었고 노출, 시 신경에 병렬. 스케일 바 = 500 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56272/56272fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56272/56272fig6.jpg"> 
그림 6 : 시 신경에 기본 및 보조 변성 위치의 회로도. 시 신경의 부분 절 개 자체 디자인된 외과 조수로 악기 (화살표)를 사용 하 여 달성 되었다. 직접 손상 된 사이트 (회색에서 가로 섹션에서 시 신경의 지 느 러 미 절단 사이트)에서 축 삭 받아야 간접적으로 손상 된 사이트 (노란색에서 가로 섹션에서 시 신경의 중앙과 복 부 지역)에 그 기본 변성 2 차 변성을 받 다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56272/56272fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells at JoVE.

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

쥐에 있는 부분 시 신경 Transection: 망막 신경 절 세포의 2 차 변성을 평가 하기 위해 새로운 수술 방식으로 설립 모델

망막 신경 절 세포 (RGCs)의 2 차 변성 녹 내장에서 일반적으로 발생합니다. 이 연구 부분 시 신경 transection 위한 혁신적인 수술 접근 방법을 설명합니다. 이 공간 절약 요원 접근의 사용 모델의 응용 범위를 확장 하며 보조 부상 메커니즘의 탐사 RGCs에 새로운 방식으로

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection ...

partial-optic-nerve-transection-rats-model-established-with-new

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.1K 조회수.  Central South University, Changsha, China. 망막 신경 절 세포 (RGCs)의 2 차 변성 녹 내장에서 일반적으로 발생합니다. 이 연구 부분 시 신경 transection 위한 혁신적인 수술 접근 방법을 설명합니다. 이 공간 절약 요원 접근의 사용 모델의 응용 범위를 확장 하며 보조 부상 메커니즘의 탐사 RGCs에 새로운 방식으로

비디오: Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

시신경의 절개 : 중추 신경계에서 신경 세포의 Apoptosis 성인의 모델

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

연구

신경과학

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

포유류의 CNS에서 시신경의 절개 후 실험에 대한 노는 방법

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

망막 신경절 세포의 생존을 공부 시신경의 호감 상해 Murine 모델

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

형광 염료와 성인 Zebrafish의 망막 신경절 세포의 퇴행성 라벨링

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

실험 시신경의 탈수 초화의 쥐 모델에서 시각 유발 전위 기록

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

레이저 유도 된 망막 변성 및 재생 Zebrafish 모델 뮐러 명과 셀 활성화

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...