우리 지도 대 한 척 Kimmel, 존 다우드가 번 식 전략 개발에 대 한 도움, 골격 얼룩, 완성에 그녀의 작품에 대 한 Macie 워커 및 Charline 워커와 보 니 울만 도움이 zebrafish 조언을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품에 JTN K99/R00 DE024190에 의해 지원 되었다.

이 프로토콜에서 설명 하는 모든 실험 따라 그리고 콜로라도의 대학 및 대학 오 레 곤 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 완성 되었습니다.
 1. 선택 되지 않은 시작 재고 준비 <ol><li>식별 heterozygous 항공사의 지 느 러 미에 의해 돌연변이 체 대립 유전자의 클립 11 및 유전형 전체 형제 동물의 주식 선택의 방법으로와 같은 KASP 12 , , 13 14. 이 프로토콜 zebrafish mef2ca b1086 긴장 수행 되었다.</li>
	<li>KASP 유전형 
	참고: KASP 위한 대립 유전자 특정 뇌관 (재료의 표 참조) 시 약을 제공 하는 회사에 의해 설계 되었습니다. 특정 실시간 PCR 기계에 대 한 적절 한 6-carboxyl-X-rhodamine (ROX) 염료 농도 회사 웹사이트를 방문.
	세포의 용 해 버퍼 (10 mM tris (pH 8.3), 50 m KCl m, 1.5 m m MgCl 2, 0.3% 비 이온 계면 활성 제, 0.3 %Octylphenyl-폴 리 에틸렌 글리콜)의 <ol><li>장소 zebrafish 꼬리 조직 50에서 µ L. 2-5 h 20 분 94 ° C 비활성화 단계 뒤 55 ° C에서 열 cycler에 96-잘 PCR 플레이트 및 다이제스트의 당 성분을 K 10 mg/mL의 10 µ L를 추가 합니다. 소화. 세포 제품을 냉장 참고: 세포 제품 준비 후 몇 달 동안 성공적으로 사용 될 수 있습니다. 조직 50 m m NaOH를 사용 하 여 lysed 했다 때 KASP 반응 실패 했다. 이 발견은 건의 한다 genomic DNA 준비의 NaOH 메서드 KASP와 호환 되지 않습니다.</li>
		<li>게놈 DNA를 분 광 광도 계를 사용 하 여 계량. 각 반응 포함 약 20-30 ng 되도록 분자 생물학 학년 물을 사용 하 여 게놈 DNA 템플렛을 희석. 
		참고: 4 또는 5 샘플 계량, 그들, 수영장 다음 평균에 따라 모든 샘플에 대 한 희석을 준비 합니다. 이 프로토콜을 성인 꼬리 조직에 사용 하는 경우 1: 100 희석은 종종 충분 합니다. DNA 농도의 정확한 정량화는 필요 하지 않습니다.</li>
		<li>추가 0.14 µ L KASP 뇌관의 혼합 및 1.5 mL microcentrifuge 튜브와 튜브의 하단에 내용을 수집 centrifuging 짧게 전에 잘 믹스에 얼음에 샘플 당 혼합 KASP 마스터의 5 µ L. 
		참고: KASP 마스터 혼합 열 및 민감한 빛 얼음에 대 한 재고 유지 이며, 직접 빛을 하지 마십시오.</li>
		<li>피펫으로 5 µ L 뇌관/마스터의 믹스 솔루션 사용 되 고 실시간 PCR 기계에 대 한 적합 한 96-잘 광학 PCR 격판덮개의 우물으로.</li>
		<li>피펫으로 5 µ L의 희석 (약 5-7 ng / µ L) 각 DNA 템플릿 샘플 고를 섞어 피 펫과 발음.</li>
		<li>Nuclease 무료 물 3 웰 스 노-템플릿 컨트롤 (NTC)으로 희석된 확인된 homozygous 야생 타입, 긍정적인 컨트롤 heterozygous 및 homozygous 돌연변이 DNA 템플렛의 5 µ L을 추가 하는 추가 5 µ L.</li>
		<li>영화에 각 잘 완전히 밀봉 판 보장 광학 투명 필름 밀폐 장소.</li>
		<li>짧게 원심 600 x g 하단에 내용을 수집 하 고 믹스에서 거품을 제거 하 고 접시. 
		참고: 진행 준비까지 빛에서 얼음 및 방패에 접시를 유지.</li>
		<li>표 1에 표시 된 순환 프로그램을 사용 하 여 주요 KASP 반응을 수행 하.</li>
		<li>볼 결과 점도 분석 컴퓨터에 의해 제작. 성공적인 반응 플롯 ( 그림 3)에 포인트의 4 가지 그룹을 표시 됩니다: 3 샘플 유전자, 및 원점 근처 NTCs의 한 그룹에 해당 하는 그룹. 긍정적인 컨트롤 적절 한 샘플 그룹화와 분리 해야 합니다.</li>
		<li>컴퓨터 프로그램에 해당 특정 genotypes, 추가 세트 자전거 하로 그룹화 될 수 있습니다 음모를 인식 하지 못하는 경우 (표 2) 필요 합니다. 반복 하 여 추가 프로그램 유전자 형에 의해 꽉 그룹을 인식 하는 컴퓨터.</li>
		<li>유전형 결과 쉽게 사용 및 분석에 대 한 스프레드시트 파일에 내보냅니다.</li>
	</ol></li> <li>함께 주 물 시스템에 식별된 heterozygous 동물 집.</li></ol>
 2.는 첫 번째 라운드의 자손 득점 <ol><ol><li>동물 핀 클립에서 복구 후 쌍 형제 heterozygotes 크로스 <li>인덱스도 intercrosses을 설정. 디바이 더를 사용 하 여 되도록 배아 동기 16.</li>
		<li>배아를 수집 하 고 계속 감 금 소를 사육에서 고립 된 부모의 쌍.</li>
		<li>호전적인 물고기 분리 하거나 커버와 함께 제공 될 수 있도록 격리 된 성인 모니터링 (났습니다 물고기 멋지게 작업 그물). 물고기를 먹여야 한다 고 그들의 물 고정 물에 IACUC 지침 변경.</li>
	</ol></li> <li>태아 양육 <ol><li>무대 고 표준 조건 17에서 애벌레를 zebrafish 태아.</li>
		<li>Phenotypically 야생-타입 동물 수영 방광 클러치의 75%에 증가 될 때 5 또는 6에 유리 피 펫을 사용 하 여 수집 합니다. 어떤 부모 그들을 굴복 녹음 보육원에서 phenotypic 야생 종류 배치. 
		참고: 있는 치명적인, 사실 많은 골격 돌연변이 열성 돌연변이 체 대립 유전자와 homozygous 돌연변이 형태로 수영 방광 18 , 19 실패. 그러므로, phenotypic 야생 종류 수 있습니다 쉽게 분별 수 비정상적된 수영 방광에 따라 그들의 돌연변이 체 형제 자매에서.</li>
	</ol></li> <li>Alcian 블루/알리자린 레드 연골과 뼈 얼룩 <ol><li>0.17 g/L Tricaine를 사용 하 여 그들의 수영 방광 팽창 하지 않는 애벌레 Anesthetize-배아 미디어에 S. 넓은 구멍 유리 파스퇴르 피펫으로 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 동물을 수집 합니다. 튜브 당 이상의 100 애벌레 추가.</li>
		<li>각 관에서 배아 물을 제거 하 고 관 당 1 x PBS에 2 %paraformaldehyde 1 mL에 동물 수정. 
		주의: 수성 PFA 가연성 이며 심각한 피부와 눈 자극을 일으킬 것 이다. 장갑과 눈 보호와 같은 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 사용 후 손을 씻으십시오.</li>
		<li>1 h 바위; 더 긴 고정 손상 뼈 얼룩. 이 기간 동안 정기적으로 튜브를 확인 하 고 없는 애벌레를 보장 하기 위해 모든 이후 락 단계 측면에 붙어 되거나 튜브의 하단에 clumped.</li>
		<li>유리 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 정착 액 제거, 50% 에탄올과 락 10 분의 1 mL을 추가</li>
		<li>준비 20 µ L의 0.5%를 추가 하 여 솔루션 얼룩 신선한 공기로 Alcian의 1 mL 당 알리자린 레드 (0.04 %Alcian 블루/10 m m MgCl 2 / 80% 에탄올). 50% 에탄올을 제거, 각 관, 그리고 바위에 솔루션을 하룻밤 얼룩의 1 mL를 추가 합니다. 애벌레는 최대 5 일 동안 얼룩에 남아 있을 수 있습니다.</li>
		<li>튜브에서 얼룩이 솔루션을 제거 하 고 각 관을 80% 에탄올/10 m m MgCl 2 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 적어도 1 시간;에 대 한 튜브를 록 명확 하 게 Alcian 블루 얼룩을 생산할 수 있는 하룻밤을 rinsing.</li>
		<li>80% 에탄올/10 m m MgCl 2 솔루션 튜브에서 제거 및 추가 50% 에탄올의 1 mL; 5 분에 대 한 바위</li>
		<li>튜브에서 50% 에탄올 솔루션을 제거 하 고 25% 에탄올과 락 5 분의 1 mL을 추가</li>
		<li>튜브에서 50% 에탄올 솔루션을 제거 하 고 추가 1 mL 신선한 3% H 2 O 2 /0.5% 코 표백 솔루션입니다. 뚜껑 열기와 튜브 마이크로 튜브 랙 또는 희미 한 갈색 채색 솔루션의 위쪽 부분에서 볼 수 있습니다 때까지 약 10 분에 서 보자. 
		참고: 솔루션 위에 거품 형태의 레이어. 주의 타이밍은이 단계에서 필요 이상으로 표백 귀 착될 것 이다 가난한 더블 얼룩.</li>
		<li>표백 솔루션 제거 및 추가 25 %glycerol/0.1% 코의 1 mL; 1 h. 10 분 바위</li>
		<li>튜브에서 25 %glycerol/0.1% 코 솔루션을 제거, 각 관, 하룻밤에 10 분 동안 바위에 50 %glycerol/0.1% 코 솔루션의 1 mL을 추가.</li>
		<li>튜브에서 50 %glycerol/0.1% 코 솔루션을 제거 하 고 다시 각 튜브를 50 %glycerol/0.1% 코 솔루션을 추가 합니다. 락 하룻밤 도움이 됩니다 애벌레 내부 누적 될 수 있는 공기 방울을 제거. 사용 하지 않는 저장소 4 ° C에서 골격 준비 스테인드.</li>
	</ol></li> <li>형 점수 <ol><li>점수 스테인드 penetrance 선택한 표현 형의 대 한 돌연변이 자식. 니콜스 외에 1 돌연변이 소성 뼈의 모든 발생에 대 한 득점 했다. 
		참고: zebrafish 부모는 고정 물에 알리자린 레드 얼룩 시간 함께 사라질 수 있기 때문에, 그것은 중요 한 골격 준비 완료의 몇 일 이내에 해골 점수.</li>
		<li>Penetrance는 표현 형을 가진 유전자 형의 비율 이다. 다음 수식에 의해 계산 하는 백분율 penetrance: %penetrance (표현 형을 가진 돌연변이) = / (돌연변이의 총 수) × 100</li></ol></li></ol> 3. 가족 선택 <ol><li>선택 2 높은 penetrance, 다음 세대에 대 한 두 개의 낮은 penetrance 가족. Penetrance, 뿐만 아니라 통치와 활기; 전파 하는 가족을 선택할 때 고려 하는 것이 중요 하다 이 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.</li>
	<li>줄 각 부모의 쌍 하위 재고 식별자: 가족.01,.02, 등</li>
	<li>집 여러 혼합된 섹스와 메인 시스템에 부모의 쌍 &#39; 동반자 &#39; 물고기. 동반자 물고기 수 영구, 명백한 구별 기능, 변경 된 착 색 또는 탄 미 익 구조 등 어떤 제 브라 라인. 
	참고: 많은 연구원은 성공적으로 탱크에 쌍만 사육 유지할, 호의 베푸는 결과 볼 수 있습니다 여러 동반자 물고기와 쌍을 주택으로. 이 선택적 단계 더 큰 학교에 보관 하는 동물의 사육을 허용 하 고 그래서 그들은 수 있는 반복적으로 교차 필요에 따라 쉽게 검색. 부모의 쌍 대 전체 형제 가족; 생성 하 반복적으로 교차 수 있습니다. 같은 부모의 쌍 교차 반복 하기 전에 적어도 일주일 기다려.</li>
	<li>추려 단계 2.2.2에서에서 애벌레 가족. 그 다음 세대에 대 한 선택 하지 했다.</li>
	<li>탱크 그들의 돌연변이 체 형제에서 penetrance로 선택한 가족에서 야생-타입 형제 애벌레를 포함 하 고 정상적으로 성인 기에 발생.</li>
	<li>차세대 적어도 4 개의 풀-형제 가족, 위쪽 라인에 대 한 두과 아래쪽 라인에 대 한 2를 해야 합니다.</li>
	<li>애벌레 도달 성적인 성숙, 반복 새로운 세대와 함께 1 단계부터 시작 하는 프로토콜.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

선택적인 Breeding 유전자 기능의 예민을 발표
더 또는 덜 심각한 선택적인 breeding에 의해 돌연변이 고기 이동 유전자 기능에 새로운 통찰력을 얻을 하는 간단한 방법입니다. 선택 되지 않은 번 식의 표준 방법으로 비교, 여기에 제시 된 프로토콜 돌연변이 고기의 훨씬 더 완전 한 이해를 얻을 수 있습니다. 특히, 심한 긴장을 생성 하 여 돌연변이 고기의 전체 폭 수 계시 될, 선택 되지 않은 주식으로 관찰 되지 않은 것을 포함 하 여. 따라서, 유전자 연구에 대 한 새로운 발달 역할 검색 될 수 있습니다. 반대로, 가벼운 긴장을 생성 하는 것은 관심사의 유전자에 대 한 가장 중요 한 역할 밝힐 수 있다. 받아, 예를 들어 단일 표현 형 가벼운 돌연변이에 지속. 여기 가장 비판적으로 가벼운 긴장에서 방해 남아 발달 과정에서 유전자의 기능 필요 가능성이 높습니다. 따라서, 주어진된 돌연변이의 전체 phenotypic 시리즈 선택적인 breeding를 통해 더욱 완벽 하 게 이해할 수 있습니다.
근 친 결혼 불경기를 피하
관련된 개인의 자손 zebrafish20를 포함 한 많은 동물 및 식물 시스템에서 감소 된 생존과 통치를 보여 줍니다. 근 친 결혼 불경기로 알려진, 대부분 모델 멋 부리 다 하는 해로운 열성 대립 유전자 또는 heterozygotes 기초21이 현상 도움이 되는 대립 유전자 loci에서 homozygosity를 증가. 야생 zebrafish와 연구는 자연 인구22에 해로운 대립 유전자의 낮은 주파수를 공개. 또한, 실험실 긴장 AB 같은 열성 치 사 돌연변이23의 허가 추가 했다. 따라서, 해당 주의 농업 선택한 zebrafish 라인의 무기한 근 친 수 하는 것 같다. 실제로, 최근 보고서 밝혀 그 zebrafish 적어도 16 세대9전체 형제 근 친 결혼에 의해 유지 될 수 있다.
이 프로토콜은 타고 난된 제 브라 라인 개발 연구를 위해 유용한 충분 한 자손을 생산 하기 위해 계속 수 있도록 몇 가지 간단 하지만 중요 한 단계를 강조 합니다. 이 선택적인 breeding 전략의 가장 중요 한 점은 자체 선정 과정입니다. 첫째, 동물을 개발 해야 합니다 신중 하 게 모니터링 발달 결함 또는 이상이, 관심의 돌연변이에 링크 되지 않은 가족에 대 한 엄격 하 게 선정 될 수 있다 그래야. 두 번째, 클러치 크기 선택적인 breeding 대 가족 요구에 따라 고려 되어야 한다. 항복 하는 쌍을 선택 하는 것 외에도 큰 클러치, 대 가족 같은 부모의 쌍의 반복 십자가 통해 생성 될 수 있습니다. 쉽게 될 여전히 있도록 동안 큰 conspecific 그룹에 쌍 번 식의 장기 주택 수 유지 부모의 쌍 탱크에 다른 많은 동반자와 함께 물고기를 쉽게 번 식 쌍 착 색 등 지 느 러 미 돌연변이, 분별 식별 하 고 검색. 이 연습 부모의 쌍은 다른 zebrafish24쇼 얼 무료 건강 한 사회 환경을 촉진 합니다. 그러나 연구원 쉽게 검색할 수 부모의 쌍 그들은 반복, 교차 될 수 있도록 매우 큰 전체 형제 가족의 생성을 활성화.
선택 가능한 표현 형을 선택
이 프로토콜 형 득점의 큰 거래를 포함 한다. 따라서, 하나의 제한 선택 쉽게 시각화 하 고 빠르게 점수 표현 형에 적용 될 필요가입니다. 그것은 또한 어떤 단계 동물 고정 되며 득점을 위한 스테인드에 결정 하는 것이 중요입니다. 뼈 고기, 뼈 더25 를 개발 하 고 더 쉽게 득점 될 것 이기 때문에 6 dpf까지 기다려야 유리 하다. 돌연변이 고기를 패턴화 하는 연골에 대 한 4 dpf는 종종 표현 형26,27득점에 적합 합니다. 때 동물을 해결 하기 위해 결정, 그것은 관심사의 유전자는 다 면 발현 성 역할 보조 결함을 혼동 될 수 있습니다 다른 조직에서 발달 돌연변이 고기 선도 경우 고려 하는 것이 중요. 예를 들어 chondrogenesis에 있는 일반적인 지연 같은 보조 결함이 전에 4 dpf에서 해결 하는 것이 중요 하다 심장 부 종 표시 골격 돌연변이와26명단.
편의상, 우리는 시스템 penetrance 우리의 선택적 번 식에 초점을 맞추고 득점 하는 이진을 선택 했다. 그러나, 돌연변이 고기 또한 가변 표현력을 가질 수 있습니다. 미래 연구, 그것은 재미 있을 것입니다 테스트 penetrance, 같은 표현력은 선택적인 breeding에 민감한 경우. 즉, 특정 소성 뼈 모양의 주파수 선택적인 breeding를 통해 변경할 수 있습니다.?
이 프로토콜 자손 선택 및 zebrafish 발달 유전자 연구의 응용의 고전적인 선택적 번 식 전략을 설명합니다. 여기에 설명 된 간단한 농업 사례는 어떤 실험실, 소규모 시설에도 가능 합니다. 선택적인 breeding, zebrafish 시스템의 가장 큰 강점 중 하나를 통해 세공 유전학, 수십 년 동안 전파 된 돌연변이로 새로 개발된 된 돌연변이 유전자 기능에 대해 배울 수 있 수 있습니다.

Zebrafish는 골격 발달을 이해 하기 위한 강력한 모델 시스템입니다. 돌연변이 제 브라 긴장와 생물학 skeletogenesis 동안 유전자 기능을 해독할 수 있습니다. 그러나, zebrafish 골격 돌연변이 고기 가변 penetrance1,2,,34 개발 및 유전자 분석을 방해할 수 있는 제시할 수 있습니다. 이 방법의 목적은 3 겹 이다. 첫째, 지속적으로 심각한 고기 생산 zebrafish 돌연변이 라인 생성 시간 경과 기록5 와 이식6같은 다운스트림 발달 연구 수 있습니다. 연구의 이러한 종류 고기 일관성 명단만 공부 하 여 무력화 될 수 있습니다. 둘째, zebrafish 긴장 inbreeding 유전 배경 변화, 따라서 실험 일관성과 재현성을 홍보를 줄일 수 있습니다. 예를 들어 모든 현장에서 수행 교 잡 분석 한 선택적으로 타고 난된 긴장에 수 혼란 가변성을 감소 하며 결론을 강화. 셋째, 심각 하 고 가벼운 긴장을 생성 하는 것은 특정 돌연변이에서 발생할 수 있는 전체 phenotypic 시리즈를 발표할 예정 이다.
언뜻 보기에 치명적인 돌연변이의 선택적인 breeding 불가능 보인다. 선택에 대 한 득점은 동물 들이 죽은 때 어떻게 penetrance에 대 한 하나의 품종을 수 있습니까? 다행히, 가족 선택, 테스트, 특히 자손에 의해 선택적인 breeding 방법 많은 년7,8에 대 한 프로그램을 사육 하는 가축에 효과 증명 하고있다. 이 프로그램 주로 암소에 우유 생산 또는 할 꺼야에 계란 생산 한 섹스에만 되는 특성에 대 한 선택적인 breeding에 사용 됩니다. 이 종족의 남성을 직접 득점 수 없습니다 하지만 그들의 자손은 득점 하 고 값은 부모에 게 할당. 이 전략에서 대출, 여기에 제시 된 프로토콜 고정 및 스테인드 돌연변이 자손 zebrafish의 쌍에서 관심사의 돌연변이 유전자에 대 한 heterozygous는 득점을 포함 한다. 어떤 개인은 라인에 다음 세대를 생산할 예정 이다 결정할 때 homozygous 치명적인 돌연변이 자손의 표현 형의 penetrance 부모에 게 할당 됩니다. 우리는이 방법은 penetrance zebrafish 치명적인 골격 돌연변이1에 이동 하는 효과적인 수단을 찾으십시오.
다른 연구와 마찬가지로,이 선택적인 breeding 프로토콜 클러치 크기, 자손의 생존, 배아, 그리고 섹스 비율9의 정상적인 개발 고려 조건에서 걸립니다. 그러나, 이러한 요인은 돌연변이 penetrance 이동의 목적으로 돌연변이 배경의 맥락에서 모두 간주 됩니다. 따라서,이 프로토콜 배경 동질성을 증가 뿐만 아니라 발달 돌연변이 분석을 강화 하는 방법을 제공 하 여 이전 선택적인 breeding 패러다임을 확장 합니다.
이 프로토콜 사전에 안정적이 고 신속한 유전형 프로토콜을 개발 하는 것이 중요 하다 그래서 광범위 한 유전형을 요구 한다. 그러나 많은 유전형 프로토콜 사용할 수 있는10,11, 우리는 KASP 유전형12,,1314 찾을 빠릅니다, 더 비용 효율적인, 그리고 방법 보다 더 신뢰할 수 있는 증폭된 시퀀스10의 제한 효소 절단을 기반으로 합니다. 따라서, 우리는이 작품에서 KASP 프로토콜을 포함. 또한, 우리는이 프로토콜에 골격 돌연변이 고기에 집중 하 고 Alcian 블루/알리자린 레드 얼룩 이전 프로토콜15수정 절차를 포함.
여기 설명 하는 방법을 상향 또는 하향 치명적인 돌연변이 penetrance 변화는 간단한 전략입니다. 이 프로토콜은 골격 돌연변이 고기에 초점을 맞추고, 하는 동안 우리는 모든 돌연변이 제 브라 라인의 축산에 대 한 유용한 전략 될 것입니다 믿습니다. 사실,이 번 식 전략 가능성의 유틸리티 zebrafish 넘어 확장 됩니다. 우리가 예측 penetrance 생물의 광범위 한 범위에서 이동이 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 치명적인 penetrance 자손 테스트 하 여 이동 하는 것은 어떤 발달 유전학의 진도 앞으로 밀어 것을 도울 수 있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Paraformaldehyde, pelleted, solid</td>
			<td style="width:125px;">Ted Pella Co.</td>
			<td style="width:119px;">18501</td>
			<td style="width:167px;">Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride, solid</td>
			<td style="width:125px;">Acros Organics</td>
			<td>223210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x PBS, Aqueous</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">190 proof Ethanol</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alcian Blue, solid</td>
			<td style="width:125px;">Anatech Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">867</td>
			<td>Must be from Anatech</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alizarin Red, solid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5533-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP229 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrogen peroxide, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP263500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium hydroxide,&#160; solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P250 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">StepOnePlus Real-time PCR Machine</td>
			<td style="width:125px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL)</td>
			<td style="width:125px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4346906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microseal &#39;B&#39; seal</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KASP Master Mix, High ROX</td>
			<td style="width:125px;">LGC</td>
			<td>KBS-1016-022</td>
			<td>https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KASP By Design Primer Mix</td>
			<td style="width:125px;">LGC</td>
			<td style="width:119px;">KBS-2100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris HCl, solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP153 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">potassium chloride, solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP366 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween-20, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP337 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nonidet P40</td>
			<td style="width:125px;">ThermoFisher</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:125px;">Western Chemicals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1700 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T100 Thermal Cycler</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Controlled Drop Pasteur Pipets</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td>13-678-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:125px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>for DNA quantitation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shifting zebrafish lethal skeletal mutant penetrance by progeny testing

Zebrafish 돌연변이 고기는 수시로 불완전 하 게 침투 하 고, 일부 돌연변이 명시. 일관성 없이 나타나는 재미 있는 고기 공부 하 고, 어려울 수 있으며 결과 혼동으로 이어질 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 증가 하 고 감소에 치명적인 zebrafish 골격 돌연변이 penetrance 간단 번 식 패러다임 이다. 치명적인 돌연변이 수 없습니다 선택적으로 사육 될 직접, 때문에 자손 테스트의 고전적인 선택적 번 식 전략 채택 된다. 이 메서드는 또한 Kompetitive 대립 유전자 특정 PCR (KASP) 유전형 zebrafish 및 얼룩 애벌레 zebrafish 연골과 뼈에 대 한 프로토콜을 포함합니다. 여기에 설명 된 농업 전략 적용 다운스트림 응용 프로그램에 더 많은 결과 재현할 수 있도록 재미 있는 골격 표현 형의 penetrance를 증가할 수 있다. 또한,이 선택적 번 식 전략을 통해 돌연변이 penetrance 감소 가장 결정적인 돌연변이 유전자의 기능을 해야 하는 개발 프로세스를 밝힐 수 있다. 골격은 구체적으로 간주 하지만 여기, 우리는이 방법론은 모든 zebrafish 돌연변이 라인에 대 한 도움이 될 것입니다 제안 합니다.

이 프로토콜은 장기 축산 기술 이해 zebrafish 골격 돌연변이 (그림 1)에 대 한 유용. 선택적인 breeding 자손을 테스트 하 여 전반적인 penetrance 하향 및 상향 몇 세대 (그림 2)에 있는 변화를 항복 한다. 우리의 이전 작품에서는, 선택적인 breeding의 2 라운드 3117%에서 평균 penetrance 아래로 몰고. 마찬가지로, 우리의 위쪽 라인에서 우리 이동 평균 penetrance 위쪽으로 63%에서 93%로 3 세대. 선택적인 breeding의 4 라운드 후 아래쪽 또는 위쪽으로 penetrance 응답 하지 않으면, 득점 되는 표현 형 자손 테스트 하 여 선택적인 breeding에 과민 하지 않다 가능 하다.
성공적인 KASP 절차, 유전자 형에 해당 하는 샘플의 그룹화는 컴퓨터 프로그램에 의해 인식 되어야 한다 하 고는 NTCs 작의의 근원에 부근 해야 충분 한 사이클 후 꽉 수행 (그림 3). 경우 KASP 분산형 플롯 데이터를 밀접 하 게 그룹화 하지 또는 한 NTC에 오염 감지, 프로그램 genotypes을 확인할 수 없습니다. 경우 대부분 샘플 그룹화, 유전자 형에 의해 인식 됩니다 하지만 여전히 일부는 모호한, 불확 실한 샘플 데이터 집합에서 생략 유전형 클러스터 인식 프로그램을 허용할 수 있습니다. 알 수 없는 샘플 호출 및 모호한 유전자 그룹화 다음에서 발생할 수 있습니다: 없는 NTCs 원점, 원점 근처 찾을 이상 희석된 템플릿 DNA 샘플을 일으키는 근처 그룹화 하지 것입니다 오염 된 반응 혼합물에서 묽 게 된 템플릿 DNA 또는 반응 주기의 부족 수. 오염이 의심 되는 경우 신선한 NTCs를 준비 합니다.
성공적인 Alcian 블루/알리자린 레드 얼룩 것입니다 vibrantly 뼈 및 연골 요소 (그림 4A) 투명 하지 않은 얼룩이 있다 또는 희미 (그림 4B). 연골 요소의 경계 선명 하 고, 표시 하 고 개별 chondrocytes 뚜렷한 것. 알리자린 레드 뼈 얼룩은 일반적으로 두 개의 얼룩의 더 몹시 이다. 팬 모양 opercle (op) 뼈와 branchiostegal 광선 (br) 모양의 막대기는 성공적인 6 일 게시물 수정 (dpf) 뼈 얼룩 (그림 4A, op, br)의 좋은 지표. 표백 단계 색상의 다른 조직을 완전히 삭제 하는 동안 뼈와 연골에 얼룩 퇴색 한다. 눈은 이후에 성공적인 얼룩 지우기 갈색 색조를 있을 것 이다. 너무 집중 Alcian 블루 분석 불가능 (그림 4C) 다른 조직에서 지워지지 않습니다. 자료의 테이블에 설명 된 이외의 공급 업체에서 Alcian 블루 또한 가난한 연골 얼룩을 만들 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56200/56200fig1.jpg"> 
그림 1 . 골격 Penetrance 자손 테스트에 대 한 선택적인 Breeding의 도식 개요. (A) 유전자 돌연변이 라인에서 전체 형제 가족 heterozygous 사업자 식별을 (B) 행렬과 교차 확인된 heterozygous 형제 고 부모 자손 득점 수 있습니다 때까지 격리를 유지. (C) , 성인 기에 발생 비정상적된 수영 방광 연골 및 뼈 얼룩 없이 돌연변이 애벌레를 수정 하는 보육원에서 phenotypically 야생-타입 애벌레 비정상적된 수영 방광으로 배치 합니다. (D) 점수 Alcian 블루의 각 클러치/알리자린 레드 스테인드 penetrance 돌연변이 동물. 어느 가족 위쪽으로 그리고 아래쪽으로 사육 될 것 이다 및 인상 성인 각 가족에서 phenotypic 야생 형식을 선택 합니다. 그들은 큰 전체 형제 가족을 생성 하 반복적으로 교차 될 수 있도록 (E) 부모의 집 동료와 함께 쌍. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56200/56200fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56200/56200fig2.jpg"> 
그림 2 . 골격 돌연변이 Penetrance 자손 테스트 하 여 이동의 예. 선택적인 사육이이 원고에 설명 된 대로 제 브라 mef2cab1086 돌연변이를 적용 했습니다. 이 실험에서 우리는 opercle와 치명적인 homozygous 돌연변이에 branchiostegal 레이 소성 뼈의 높은 또는 낮은 penetrance 선택. 돌연변이 자손에 소성 뼈의 penetrance 같이 penetrance 여 색 누가 부모의 쌍에 할당 되었다. 이 그림1에서 수정 되었습니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56200/56200fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56200/56200fig3.jpg"> 
그림 3 . 스크린 샷 KASP 유전형 및 결과 분석에 사용 되는 소프트웨어에서. 이 성공적인 KASP 반응에서 꽉 샘플 그룹 형성 되었다. 블루 포인트는 homozygous 돌연변이, 녹색 포인트는 heterozygous, 빨간 포인트는 야생 형 homozygous 되며 검은 사각형 NTCs 그룹 컴퓨터 프로그램에 의해 지정 되었다. NTCs 상징 하는 더 작은 반응 혼합물 오염 하는 작의의 근원에 가까이 있습니다. 유전자 형을 아직 할당 되지 않은 불확 실한 샘플 x 표시 될 것 이다. 이 성공적으로 완료 된 실행에 있는 아무 불확 실한 샘플을 확인 하 고 있습니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56200/56200fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56200/56200fig4.jpg"> 
그림 4 . 좋은, 나쁜와 추악한 Alcian 블루/알리자린 레드 골격 준비. 
(A) 신선, 멋지게 스테인드 하 고 맑게 된 연골과 뼈 얼룩의 예가 표시 됩니다. 고유한 연골 요소와 쉽게 시각화 된 빨간 opercle (op)와 branchiostegal 레이 (br) 뼈 note. (B) 약한 연골 얼룩 어두운 알리자린 레드 얼룩 표시 됩니다. 이 샘플 4 ° C에서 opercle 및 branchiostegal 레이 서 어두운된 연골 뼈 구별 하기 어려운 결과로 여러 달 동안 토. (C) -스테인드 애벌레 너무 많은 Alcian 블루 사용 되었다. 눈금 막대는 200 μ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56200/56200fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

이 프로토콜의 목표 zebrafish에 치명적인 골격 돌연변이 고기 penetrance 선택적인 breeding에 의해 변경 하는 것입니다. 치명적인 돌연변이 성인 기에 성장 될 수 없는 자신을 사육, 따라서이 프로토콜 추적 하 고 여러 세대에 걸쳐 penetrance 테스트 자손에 의해 선택 하는 방법에 설명 합니다.

Zebrafish 치명적인 골격 돌연변이 Penetrance 자손 테스트 하 여 이동

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

shifting-zebrafish-lethal-skeletal-mutant-penetrance-progeny

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Developmental Biology

Unit 2

Mendelian Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

7.5K 조회수.  University of Colorado Anschutz Medical Campus. 이 프로토콜의 목표 zebrafish에 치명적인 골격 돌연변이 고기 penetrance 선택적인 breeding에 의해 변경 하는 것입니다. 치명적인 돌연변이 성인 기에 성장 될 수 없는 자신을 사육, 따라서이 프로토콜 추적 하 고 여러 세대에 걸쳐 penetrance 테스트 자손에 의해 선택 하는 방법에 설명 합니다.

비디오: Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

겐타 마이신 유도 부상으로 성인 Zebrafish의에서 신장 재생

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

연구

발생학

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Zebrafish의 태아에서 기계 선박 부상

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Blastulae 개발의 외과 융합에 의해 Parabiotic 제브라 피쉬 배아의 생성

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Cardiotoxin 주입에 의한 급성 골격 근육 재생 유도

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

마우스 골격근에서 I 형과 II 형 Pericytes 분리

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

면역 결핍 마우스에서 인간 골격 근 이종이식 수행

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...