이 작품에 대 한 자금이 미국 심장 협회 (16SDG29870005)와 노스 캐롤라이나 주립 대학 연구 및 혁신 씨앗 자금 통해 제공 되었다.

1. 1 일: 셀 및 시 약 준비 참고: 모든 셀 및 시 약 준비 생물 안전 캐비닛 샘플의 오염을 방지 하기 위해 수행 되어야 합니다.
<ol><li>따뜻한 필터링 Dulbecco &#39; s 수정이 글 &#39; s 매체 (DMEM), 소 태아 혈 청 (FBS), L-글루타민, 고 37 ° C 물 욕조에 페니실린/스.</li>
	<li>보완 하 여 준비 신생아 인간 피부 섬유 아 세포 (HDFn) 미디어와 10 %FBS, 1% 페니실린/스, 1 %DMEM 따뜻하게 L-글루타민.</li>
	<li>녹여 냉동 HDFns 및 x 200g에 8 분 분리기 cryopreservation 매체를 제거 하는 유리병. 준비 HDFn 미디어 T-75 문화 플라스 크에 1 x 10 6 셀/mL과 씨앗의 밀도에 셀 resuspend.</li>
	<li>장소 플라스 크 (37 ° C, 5% CO 2) 세포 증식을 허용 하는 인큐베이터에서.</li>
	<li>저장소 HDFn 미디어 4 ° c.</li>
	<li>필요에 따라 프로 및 안티 migratory 시 약 준비.</li>
</ol> 2. 주 3: 회전 타원 체 준비 <ol><li>다음 샘플의 오염을 방지 하기 위해 문화 후드에서 수행.</li>
	<li>셀 도달 80 %confluency 미디어를 발음 하 고 0.25%의 5 mL을 추가 트립 신-EDTA. 완전 세포를 플라스 크 표면에서 분리 하려면 5 분 동안 37 ° C 배양 기에서 저장소 술병.</li>
	<li>중화는 트립 신을 플라스 크를 따뜻하게 미디어의 5 mL을 추가.</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브 믹스 Trypan 파랑의 10 μ와 세포 현 탁 액의 10 μ.</li>
	<li>200 x g.에서 8 분에 대 한 원래의 세포 현 탁 액 분리기</li>
	<li>세포 현 탁 액은 centrifuged 되 고, 하는 동안는 hemocytometer를 Trypan 블루 셀 서 스 펜 션의 10 μ를 추가 하 고 셀 수 수행.</li>
	<li>원심 분리, 다음 셀 펠 릿을 dislodging 없는 미디어 발음. 1.25 x 10 5 셀/mL의 농도에서 세포 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>10 cm 배양 접시 회전 타원 체 성장 하는 동안 수산화 유지 하기의 밑에 버퍼링 하는 멸 균 인산 염 (PBS)의 5 mL을 추가.</li>
	<li>반전 페 트리 접시의 뚜껑. Petri 접시 뚜껑의 안쪽 표면에 세포 현 탁 액의 몇 20 μ 방울을 추가.</li>
	<li>빨리 뚜껑을 다시 반전 하 고 다시 제자리에 걸려 방울을 꺼내 려 하지 않도록 주의 되 고, 접시의 바닥. 그림 1에서는 성공적으로 형성 된 거 방울.</li>
	<li>신중 하 게 37 ° C 배양 기에서 접시를 놓고 고 교수형에 성장 spheroids 72 h.의 기간에 대 한 문화를 드롭</li>
</ol> 3. 제 6 일: 3D 매트릭스로 Spheroids 포함 <ol><li>다음 샘플의 오염을 방지 하기 위해 문화 후드에서 수행.</li>
	<li>응고 솔루션으로 많은 우물 잘 당 100 μ를 추가할 충분 한 양의 응고 솔루션을 생성 하는 첫번째 섬유 소 층의 형성에 대 한 (우물 당 1 회전 타원 체) 필요 합니다. 혈전 10 X HEPES 버퍼는 10%의 볼륨 (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50mm CaCl 2, pH 7.4), 2 mg/mL 인간의 fibrinogen, 및 0.1 U/mL 인간의 알파 트 롬 빈에 의해 구성 되어 있습니다. 응고 볼륨의 나머지는 초순 구성.
	<ol><li>추가 트 롬 빈 마지막 하 고 신속 하 게 솔루션을 추가 48-잘 접시에 원하는 우물 우물에 추가 되 고 이전 polymerizing에서 혈전을 방지 하기 위해.</li>
	</ol></li> <li>부드럽게 흔들어/탭 섬유 소 혈전 혼합물 전체를 잘, 코팅은 되도록 잘 플레이트 그리고 유해를 응고 레이어 수 있도록 1 h에 대 한 보육에 잘 접시 장소. 잘 플레이트 충분히 거품 형성;을 유발 하드 흔들 하지 마십시오 우물의 전체 코팅까지 간단 하 게 필요한 만큼 접시 바위. 더 큰 응고 볼륨 사용 하는 경우이 단계가 필요 하지 않을지도.</li>
	<li>섬유 소 레이어 spheroids 전송.
	<ol><li>제거 잘 플레이트와 교수형에 spheroids를 포함 하는 페 트리 접시는 인큐베이터에서 문화를 삭제 하 고 spheroids 현미경 검사. 다음 문화 후드에 접시를 놓고.</li>
		<li>신중 하 게 액세스할 수 있도록 페 트리 접시의 뚜껑을 거꾸로 매달려 놓기 문화.</li>
		<li>신중 하 게 우물의 바닥 코팅 섬유 소 생산 층을 찔린 하지 않도록 주의 복용 각 잘 중심으로 거꾸로 뚜껑에서 한 방울을 전송 1 mL 주사기에 부착 된 21 G 바늘을 사용 하 여. 효과적으로 드롭 전송, 바늘에 드롭 천천히 당겨. 다시 마자 전체 드롭 니 들; 내부 플런저를 당겨 중지 후퇴는 드롭 너무 멀리 공기 방울, 효과적인 회전 타원 체 전송 또는 후속 이미징 중단 될 수 있습니다 발생할 수 있습니다.</li>
		<li>Spheroids는 모든 원하는 우물으로 옮겼다 제대로 되도록 현미경 잘 판 검사.</li>
	</ol></li> <li>두 번째 섬유 소 층의 형성에 대 한 첫 번째 섬유 소 레이어 (3.2 단계)의 창조에 대 한 위의 같은 준비를 사용 하 여 다른 응고 솔루션을 만듭니다. 신중 하 게 각 포함 하는 회전 타원 체 드롭에 100 μ 플라스틱 및 spheroids는 그대로 하 고 우물의 가장자리에 밀어 안 되도록 다시 현미경 검사.</li>
	<li>인큐베이터에 잘 접시를 반환 하 고 두 번째 레이어 1 헤에 대 한 유해를 허용합니다</li>
</ol> 4. 주 6: 추가 프로 철새 억제 요인 <ol><li>따뜻한 HDFn 미디어 37 ° c.</li>
	<li>오염을 방지 하기 위해 후드에서 다음 단계를 수행 하십시오.</li>
	<li>미디어 프로/안티 migratory 에이전트를 평가의 적절 한 농도 포함 하 여 각 그룹에 대 한 준비.</li>
	<li>인큐베이터와 문화 후드에 장소에서 잘 플레이트 제거.</li>
	<li>제어 회전 타원 체 그룹의 각 음을 표준 미디어의 추가 500 μ, 마이그레이션 저해 회전 타원 체 그룹의 각 음을 억제 미디어의 500 μ 및 마이그레이션 향상 된 회전 타원 체 그룹의 각 음에 프로 철새 미디어의 500 μ.</li>
	<li>인큐베이터에 잘 접시를 반환.</li>
	<li>변경 미디어 모든 48 헤</li>
</ol> 5. 6-9 일: 평가 셀 이동과 확산 미디어 (0 h)와 24 h에 다음의 추가 직후 72 h. 옵션에 대 한 명시 야 현미경을 사용 하 여 <ol><li>이미지 spheroids: 각 시간 지점에서 경우 확인 하려면 z-스택 이미지 걸릴 마이그레이션 영역 외부에 1 차 초점의 비행기에서 발생 됩니다. 우리의 경험에의 하면이 발생 하지 않습니다; 그러나, 이것은 모든 실험의 경우 되도록 유용 하다.</li>
	<li>사용 ImageJ 셀 파생물에 각 잘 각 연속 시간 시점에서 각 회전 타원 체의 셀 테두리를 추적 하 고 사용 하 여 각 회전 타원 체에 대 한 영역에 백분율 증가 분석 하 여 결정 하는 &#34; 측정 &#34; 영역을 구하는 함수.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 프로토콜에는 상처 치유에 세포 이동의 시험 체 외에 3D 모델을 통해 소프트웨어 관련에 대 한 수 있습니다. 프로시저의 적절 한 실행에 중요 한 단계는 섬유 spheroids;의 적절 한 개발 준비 하는 동안 셀 농도 2500 셀/드롭의 초기 농도 주고 최적화 되었다 72 h의 인큐베이션 기간 동안 안정적으로 양식 spheroids을 허용. 셀의 수가 부족 사용 하는 경우 spheroids 효과적으로 집계 하지 있습니다 하 고 전송 하 고 섬유 소 층에 포함 되 고 시 떨어져 휴식 수 있습니다. 다른 세포 유형 사용 하는 경우 초기 세포 농도 및 회전 타원 체 시간 숙성 일관 되 고 안정 된 회전 타원 체 형성을 얻기 위하여 조정 될 수 있을 수 있습니다. 섬유 아 세포 보다는 더 느리게 증식 하는 세포 유형에 대 한 훨씬 높은 초기 세포 농도 72 시간 시간 범위 내에서 적절 한 회전 타원 체 형성을 보장 하기 위해 필요할 수 있습니다. 셀 교수형에 남아 있지 해야 문화 문화에 spheroids에 미디어를 변경 하는 무 능력 때문에 72 h 보다 더 드롭. 초기 회전 타원 체 크기에서 차이 때문에 고유의 생물 다양성; 예상 된다 우리가 해결이 변화 가능한 크기 차이 최소화 하기 위해 셀의 일관 된 수로 회전 타원 체 형성을 시작 하 여 정규화 데이터 비교에 대 한 허용 하는 시간이 지남에 따라 성장 하 여.
이 방법의 구현 하기 위한 주요 과제는 교수형에서 spheroids의 전송 응고 매트릭스에 문화를 드롭. 이 프로토콜을 사용 하 여 바늘과 주사기 거꾸로 Petri 접시 뚜껑에서 회전 타원 체 포함 된 물방울을 발음 하지만 핀셋 또는 손질된 팁에 부착 된 micropipettes의 사용과 같은 다른 방법 또한 효과적으로 전송에 적용 되는 교수형에서 spheroids를 드롭. Spheroids 주사기의 플런저를 당겨 안정적으로 옮겨질 수 있다 그는 물방울 그려집니다 바늘으로 천천히 가스 거품은 작은 물방울에 소개 하지 있도록 함으로써 다시는 물방울을 전송 하기 전에 약간. 주사기 플런저 해야만 뽑아 다시 바늘;에 전체 방울을가지고 충분히 다시 당기 어떤 추가 거품을 소개 되며 잘 접시의 우물에는 spheroids의 신뢰할 수 있는 전송 방해. 특수 거 문화 접시 회전 타원 체 문화를 단순화 하기 위해 사용할 수 있습니다 하지만 이렇게 단순히 표준 접시를 사용 하 여 보다 적은 비용 효율적인 수단을 드롭.
상처 치유 vivo에서, 동안 상처 영역을 침범 하는 섬유 아 세포 생산 섬유 소 매트릭스 저하 될 광범위 한 떠들고 프로 테아 제. 이 세포는 이후 새로운 세포 외 기질, 콜라겐, 손상 된 조직을 복구 하기 위해 주로 구성 된 음성 합성. 23 마이그레이션의이 기계 장치는 우리의 방법에 의해 캡처되지 않습니다 시스템의 한계를 나타내는 제어 침략에 대 한 수 있습니다. 또한 주목 해야 한다이 방법 활용 fibroblasts 시간이 지남에 저하 섬유 소 네트워크; 것 프로 테아 제 분 비 됩니다. 따라서, 경우 장기 (&gt; 72 시간) 마이그레이션 연구는 원하는, protease 억제제, aprotinin, 같은 세포 배양에 추가 되어야 한다.
이러한 제한에도 불구 하 고이 메서드를 간단 하 고 비용 효율적인, 재현 방법을 공부 하는 3D 마이그레이션에서 체 외에서세포를 제공 합니다. 동안 일반적으로 사용 되 2D 모델, 여기에 설명 된 3D 모델에서 성장 분석 보다 더 순수 관련 환경을 제공 2D 모델에서 제공 하는 정직 분석 유지 합니다. Spheroids는 단순 관찰법 또는 위상 현미경을 사용 하 여 시각화를 쉽게 하 고, 원하는 경우,이 방법은 쉽게 수정할 수 있습니다 형광 현미경 검사 법에 사용 하기 위해 세포 막과 매트릭스 단백질 붙일 라벨. 이 프로토콜을 만든 신생아 인간 피부 섬유 아 세포 조직 수리/개조에 섬유 아 세포 이동의 역할 때문에의 사용. 원하는 경우, 호 중구, 대 식 세포, keratinocytes 또는 다른 세포 유형 사용 될 수이 분석 결과에서 섬유 소 혈전 구조 변경 상처 치유에 관련 된 다른 세포 유형의 마이그레이션에 미치는 영향을 평가 하기 위해. 3D 자료도 수정할 수 있습니다 수 필요한 경우; 원하는 응용 프로그램에 따라 콜라겐 또는 다른 3D 매트릭스 자료 사용할 수 있습니다 섬유 소 매트릭스 대신 순수 관련 모델을 제공 하기 위하여. 상처 같은 환경에서 장기 세포 이동 공부에 대 한 유용한 모델 keratinocytes 콜라겐 보다는 섬유 아 세포와 섬유 소를 사용 하 여이 프로토콜으로 얻을 수 수 있습니다. 설명 하는 방법 또한 셀 마이그레이션에 더 큰 유연성과 비용 효율성을 허용 하 고 상처 치유 순수 관련 생체 외에서 모델의 구현을 통해 연구 필요 없이 즉시 vivo에서 작업 고전적인 2 차원 생체 외에서 연구를 다음과 같은.

상처 치유 하는 것은 부상 다음 조직의 무결성의 복원에 결과 복잡 한 과정 이다. 이 과정은 깨진 hemostasis, 염증, 확산 및 개장 하 고, 포함 하는 4 개의 겹치는 단계로 각 통제 되는 수용 성 신호, 세포-매트릭스 상호 작용 및 세포 세포 커뮤니케이션의 복잡 한 조합에 의해. 1 , 2 이러한 단서의 오케스트레이션 다양 한 상처 치유를 포함 하 여, 중요 한 것은, 셀 마이그레이션에 세포질 응답을 제어 합니다. 3 , 4 셀 이동 셀룰러 고기 그리고 기질 환경 생화학 및 생물 속성에 매우 역동적인 과정 이다. 5 셀 지속적으로 integrin 중재 경로;를 통해 그들의 기질 환경 조사 이 과정에는 다양 한 지형, 감 금, 강성, 등 행렬 속성을 셀 수 있습니다. 2 차원 (2D) 분석 세포 이동의 마이그레이션 lamellipodia 형성 걸 필 라 멘 트 번들의 세대를 통해 첨단에 의해 구동 됩니다 하는 방법을 보여 줍니다. 후행 가장자리에 수축과 수축 구동 actomyosin 함께에서 첨단에 초점 유착의 후속 대형 셀 앞으로 드라이브. 그러나 6 three-dimensional (3D) 셀룰러 이동은 현재 잘 이해 하지,, 최근 연구 결과 3D 마이그레이션이 보다 뚜렷이 보여는 afore 2d에서 메커니즘을 설명 하 고 가능성이 그렇지 메커니즘에 의해 구동 됩니다. 예를 들어, 피치 외최근 연구. 시연, ECM의 속성에 따라 셀 3D 행렬에 lamellipodium 및 lobopodium 마이그레이션 메커니즘을 구동 간에 전환할 수 있습니다. 7 셀 마이그레이션 응답을 치유 하는 상처의 중요 한 구성 요소 이므로 세포 이동의 3D 모델이 상처 치유 하는 동안 다양 한 자극에 생리 적인 응답을 이해 합니다. 상처 치유 과정, 잘 설립 스크래치 분석 결과 포함 하 여 동안 셀 이동의 최신 체 외에 모델 2D 활용 3D 매트릭스에서 마이그레이션에서 크게 다를 2D 표면에 셀 철새 동작 표시 되었습니다, 비록 단층 문화입니다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 더 최근 개발 분석 3 차원 매트릭스를 활용 하지만 여전히 따라서 진정으로 셀 환경 세를 정리 하는 능력을 제한 하는 매트릭스, 위에 단층 셀 문화 vivo에서. 15
여기에 설명 된 방법의 목적은 셀 마이그레이션 2D 표면이 아니라 순수 관련 3D 모델에 적용 된 자극과 관련 된 마이그레이션 응답의 더 강력한 이해를 얻기 위해 공부 하. 이 메서드는 셀 이동 활성화 하거나 연관 셀 마이그레이션 경로 억제 하는 요인의 3 차원 섬유 소 응고 매트릭스 내에서 평가 대 한 수 있습니다. 섬유 소 매트릭스 상처 치유;의 초기 단계에서 중요 한 역할 섬유 소 놀이 때문이 방법에 대 한 선정 다음 상해, 섬유 소 혈전 혈액 손실이 줄기 상처 환경에서 형성 되 고 조직 복구 및 리 모델링 하는 동안 초기 세포 침투에 대 한 비 계 역할. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 또한, 섬유 소 임상 수술 실 란 트로 사용 하 고는 밀봉의 구성 세포 마이그레이션 및 궁극적인 결과 치유에 연결 되었습니다. 콕스 외이전 연구. 다양 한 섬유 소 및 섬유 소 실 란 트를 최적화 하기 위해 트 롬 빈 농도의 구성 하는 섬유 소 혈전과 섬유 마이그레이션을 조사. 이러한 연구에서 플라스틱 접시에 섬유 소 혈전에서 셀의 정량 했다. 20 여기 선물이 셀 3D 섬유 소 환경 내에서 이동의 정량화를 허용 하는 방법. 특히이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 섬유 소를 사용 하는 동안이 모델은 원하는 대로, 교원 질 또는 다른 3D 매트릭스 같은 대안 매트릭스 재료를 사용 하 여 쉽게 수정할 수 있습니다. 또한, 선물이 구와 spheroids 사용 하 여가 분석이 결과에서 상처 침대로 구와 마이그레이션 기질 합성 및 조직 복구/리 모델링을 파라마운트 중요성 때문에. 그러나, 복구 하는 동안 프로세스 neutrophils 상처 침대, 대 식 세포에 의해 다음에 마이그레이션할 첫 번째 셀 유형입니다. 섬유 아 세포는 다음 상처 치유 과정의 증식 단계 시작 되는 시점에서 초기 부상 후 약 48 시간 상처 환경에 침투 하기 시작 합니다. 19 이 분석 결과 수 있을 쉽게 포함 하도록 수정 호 중구, 대 식 세포, 또는 다른 세포 유형 섬유 소 혈전 구조 변경 이러한 세포 유형의 마이그레이션에 미치는 영향을 평가 하기 위해. 21
이 분석 결과 구현 하려면 먼저, 섬유 회전 타원 체 형성 된다 줄기 세포 배양에 대 한 이전 설명의 수정을 사용 하 여. 22 섬유 회전 타원 체 이후 3D 섬유 소 매트릭스로 전송 되 고 파생물 수 다음 쉽게 모니터링 하 고 몇 일 동안 계량. 이 프로토콜은 계정에 생리 적 시스템의 3 차원 섬유 소 매트릭스 내에서 3D 셀 spheroids를 포함 하 여 따라서 세포 단층 모델 철새 행동을 함께 사용 하 여 2D 성장 표면에 의해 초래 하는 관련성에 한계를 피하, 동안 아직도 매우 제어 체 외에서 환경에서 셀 동작의 평가 대 한 허용.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Materials</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>VWRL0148-0500</td>
			<td style="width:217px;">DMEM already containing L-glutamine can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>10861-594</td>
			<td style="width:217px;">Dishes of any size can be used for hanging drop culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>12306C-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1680149</td>
			<td style="width:217px;">Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:267px;">Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Human Dermal Fibroblasts, neonatal</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher</td>
			<td>C0045C</td>
			<td style="width:217px;">Can be replaced with other cell type of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">21 G x 1 1/2&#39; needle</td>
			<td style="width:91px;">BD&#160;</td>
			<td>305167</td>
			<td>22 G x 1 1/2 needles will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>89174-491</td>
			<td>Syringes of any volume can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>82051-004&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td>FIB 3</td>
			<td style="width:217px;">Can be replaced with matrix protein of interest</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Human Alpha Thrombin</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td>HT 1002a</td>
			<td style="width:217px;">May not be necessary depending on matrix protein of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Equipment</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">BSL2 cell culture hood</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Inverted microscope with 10X objective</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Centrifuge compatibile with 15 mL tubes</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments

현재, 대부분 체 외에서 모델의 상처 치유, 잘 설립 스크래치 분석 실험 등, 공부 하는 2 차원 표면에 셀 마이그레이션 및 상처 폐쇄를 포함. 그러나,는 vivo에서 상처 치유 장소에에서 생리 적인 환경을 3 차원 보다는 2 차원 이다. 그것은 셀 동작에 크게 차이가 점점 더 분명 되 고 2 차원 3 차원 환경; 대 따라서, 더 순수 관련 생체 외에서 상처 폐쇄에 셀 마이그레이션 동작을 공부에 대 한 모델에 대 한 필요가 있다. 여기 설명 하는 방법을 더 나은 이전 설립된 2 차원 스크래치 분석 실험 보다 생리 상태를 반영 하는 3 차원 모델에서 셀 이동의 연구에 대 한 수 있습니다. 이 모델의 목적은 셀 프로 또는 안티 migratory 요인 존재 섬유 소 매트릭스 내에 포함 된 회전 타원 체 몸에서 셀 이동의 시험을 통해 결과 평가 하는 것입니다. 이 메서드를 사용 하 여 3 차원 매트릭스에서 회전 타원 체 몸에서 세포 파생물 관찰 될 수 있다 고 명시 야 현미경 검사 법 및 회전 타원 체 본문 영역의 분석을 통해 시간이 지남에 쉽게 정량은. 셀 마이그레이션에 프로 철새 및 억제 요인의 효과 또한이 시스템에 평가할 수 있습니다. 연구원 관련 3 차원 상처 행렬에서 체 외에서세포 마이그레이션 분석의 간단한 방법을 제공 합니다, 그리고 에 체 외 의 관련성 증가 셀 학문 vivo에서 동물의 사용 하기 전에 모델입니다.

회전 타원 체 문화 구와 마이그레이션 체 외에 프로 및 안티 철새 에이전트의 효과 평가에 이용 될 수 있다 3D 구와 spheroids 72 h (그림 1)의 기간에 걸려 드롭 문화를 통해 형성 될 수 있습니다. 문화 기간에 따라 spheroids 응고 매트릭스에 포함 하 고 명시 야 현미경 검사 법 (그림 2)를 사용 하 여 몇 군데. Spheroids (흰색 테두리에 묶여 지역으로는 그림에 표시 된)의 초기 영역 ImageJ를 사용 하 여 결정 되었고, 회전 타원 체 시체에서 후속 셀 파생물의 정도 결정 하는 기준점으로 사용. spheroids에 대 한 초기 평균 지역 측정 104 μ m2 ± 1.1 x 104 μ m2 에 대 한 제어 spheroids, 104 μ m2 ± 1.1 x 104 μ m2 프로 철새에 대 한 x 4.4 x 4.3 결정 했다 spheroids, 그리고 4.5 104 ± 7.7 x 103 μ m2 에 대 한 안티 철새 spheroids x. 미디어 프로 또는 안티 migratory 요소를 포함 하는 회전 타원 체를 포함 하는 혈전에 추가 되었습니다 하 고 초기 회전 타원 체 몸에서 세포 파생물은 최종 이미지 원본 미디어 (그림 3) 추가 된 후 72 h를 찍은 모든 24 h를 몇 군데.
완료 되 면 실험, 회전 타원 체 성장 시간이 지남에 ImageJ를 사용 하 여 계산 하는 각 샘플에 대 한 회전 타원 체 영역에서 변화를 분석 했다. 그림 3에서 보듯이 각 시간 지점에서 셀 클러스터의 바깥쪽 가장자리 세포 파생물의 시간-관련 결정을 사용 되었다. 우리가 기대 하는 그림 3 에 표시 된 밖으로의 초점 명소는 세포 파편, 고 우리 우리의 정량화에 이것을 포함 하지 않습니다. 전체 크기 이미지 보기 회전 타원 체 몸;에서 신흥 명확 하 고, 연속 셀 테두리 추적 결과 결정할 때이 테두리입니다. T에서 원래 회전 타원 체 본문 영역을 기준으로 셀 파생물 영역을 정상화 하 여 세포 파생물 계량은 = 0 h 및 다음 원래 회전 타원 체 영역의 백분율 성장을 표현. 72 h 동안 셀 파생물의 정량화 spheroids 프로 철새 에이전트에 노출에 노출 하는 spheroids에 비해 원래 회전 타원 체 몸에서 마이그레이션의 크게 증가 정도 전시할 계시는 마이그레이션 억제 에이전트와 제어 spheroids 표준 미디어에 노출 (p &#60; 0.0001, 그림 4). 반대로, 반대로 철새 에이전트에 노출 하는 spheroids 마이그레이션 원본 회전 타원 체 본문 spheroids 제어에 비해 거리의 크게 감소 정도 전시 (p &#60; 0.0001).
비교를 위해, 우리는 스크래치 분석 결과 (그림 5)의 예를 제공. 이 분석 결과 시드 fibroblasts 24 잘 접시 2 mg/mL fibrinogen 코팅에 500, 000 셀/c m2 에 의해 수행 되었다. 섬유 아 세포 성장 하룻밤 허용 되었다. 잘 표면 했다 다음 피 펫 팁, 긁 히 고 셀 마이그레이션 스크래치 영역으로 24 시간 이상 촬영 했다. 이 분석 결과;에 제한이 있다 그림 5A에 제시 하는 대표적인 이미지 에서처럼 흠집 재현성이 있으며 경우에 따라 경계는 명확 하 게 delineated 없습니다. 그러나, 프로 및 안티 migratory 요인 존재 전체 마이그레이션 동향은 그 전술 변화와 마이그레이션 모드의 차이도 불구 하 고 3D 회전 타원 체 분석 결과 동일 합니다. 마이그레이션 속도 빠른 3D 회전 타원 체 분석 결과에 비해 2D 스크래치 분석 결과에 주목 한다. 폐쇄 프로 철새 에이전트의 가장 빠른 이었고 교양 프로 철새 에이전트 존재 하는 모든 샘플 완전히 24 시간 이내에 폐쇄 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig1.jpg"> 
그림 1 : 교수형에 인간 피부 섬유 아 세포 문화 드롭. 셀은 교수형에 남아 72 h 회전 타원 체 형성을 유도 하는 것에 대 한 문화를 드롭. 상단 (A) 및 (B) 측면도 교수형의 문화를 드롭 되 게 됩니다. (C) 회로도 매달려 드롭에서 회전 타원 체의 모습을 묘사 검은 선 접시의 상단, 핑크 구 미디어를 나타냅니다 나타내고 보라색 구체 대표는 회전 타원 체 내의 셀. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56099/56099fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig2.jpg"> 
그림 2 : 섬유 소 매트릭스에서 초기 삽입 후 회전 타원 체 모양 (t = 0 h 미디어의 추가 후) 10 배 확대에서 명시 야 현미경을 사용 하 여 몇 군데. (A, D) 제어 회전 타원 체; (B, E) 회전 타원 체 미디어;에 반대로 철새 에이전트에 노출 (C, F) 회전 타원 체 미디어 프로 철새 에이전트에 노출. 이미지 (D-F)로 표시 되 고 (A-C) 없이 화이트 라인 파생물 영역을 결정 하는 데 사용 하는 테두리를 나타냅니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56099/56099fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig3.jpg"> 
그림 3 : 회전 타원 체 모양을 72 h 10 배 확대에서 명시 야 현미경을 사용 하 여 몇 군데 후. (A, D) 제어 회전 타원 체; (B, E) 회전 타원 체 미디어;에 반대로 철새 에이전트에 노출 (C, F) 회전 타원 체 미디어 프로 철새 에이전트에 노출. 이미지 (D-F)로 표시 되 고 (A-C) 없이 화이트 라인 파생물 영역을 결정 하는 데 사용 하는 테두리를 나타냅니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56099/56099fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig4.jpg"> 
그림 4 : 회전 타원 체 성장 이상 72 h. 프로-철새 및 안티 철새 에이전트 미디어에 크게 영향을 표시 됩니다.구와 마이그레이션 및 3D 환경에서 확산 N = 3/그룹; * 나타냅니다 p &#60; 0.0001. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56099/56099fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig5.jpg"> 
그림 5 : 표준 2D 스크래치 분석 결과 비교. (A) 표준 스크래치 분석 결과 24 시간 동안에 세포 이동의 대표 이미지. 섬유 아 세포 미디어 프로 또는 안티 migratory 요인, 조건에서 재배 하 고 스크래치 폐쇄에 차이가 시간이 지남에 계량 했다. (B) 섬유 아 세포 성장 제어, 프로-철새, 또는 반대로 철새 미디어에 대 한 시간이 지남에 % 폐쇄. 마이그레이션 3D 회전 타원 체 분석 결과 대이 2D 분석 결과의 모드에 차이가 있지만, 전반적인 마이그레이션 동향 일관성 유지. N = 3/그룹; * 나타냅니다 p &#60; 0.05. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56099/56099fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

이 프로토콜의 목표 3 차원 섬유 소 매트릭스 내에서 셀 마이그레이션에 프로 및 안티 migratory 요인의 효과 평가 하는 것입니다.

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

characterizing-cell-migration-within-three-dimensional-vitro-wound

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

7.6K 조회수.  North Carolina State University and The University of North Carolina - Chapel Hill. 이 프로토콜의 목표 3 차원 섬유 소 매트릭스 내에서 셀 마이그레이션에 프로 및 안티 migratory 요인의 효과 평가 하는 것입니다.

비디오: Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

연구

생체공학

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

2D 및 3D 환경에서 신경 전구 세포의 전기장 제어 감독 마이 그 레이션

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

미세 주입 상처 분석 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 표피의 현지화는 응답 기자의 상처<em&gt; 초파리</em&gt; 태아.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

준비 및 분석<em&gt; 체외</em&gt; 3 차원 유방 암 서로 게이트

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

3 차원 펩 티 드 건설 기계에 포유류 세포 배양

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

Keratinocyte 확산에 2-및 3 차원의 평가 유형 I 교원 질 기판

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...