저자는 다음 직원을 감사 하 고 연구 인력: 앙드레 Gauthier 피셔, 매튜 Librach, 타 냐 Barretto, Tharsan Velauthapillai, 그리고 사라 Laronde.

동물 관련 된 모든 연구 실시 하 고 도착 지침 29에 따르면 보고 했다. 모든 연구 기관 연구 윤리 위원회 승인 (REB 수 4276) 수행 했다. 모든 절차는 대학 건강 네트워크 (토론토, 캐나다), 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었다 동물과 모든 동물 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드, 8 번째 판 (준수 인도적인 치료 받은 2011 년 건강의 국가 학회).
 1. 대동맥 반지 분석 결과 설치 <ol><li>분리 쥐 대동맥.
	<ol><li>Euthanize 8-10 주 된 Sprague-Dawley 쥐 CO 2 질을 사용 하 여: 20% 설정 CO 2 챔버 가스 교체 (유량 챔버 볼륨/분 x 0.2 =). Palpating 가슴 여 핀치 반사와 심장 박동의 부재에 의해 확인.</li>
		<li>젖은 70% 에탄올으로 소독된 거 즈를 사용 하 여 가슴 지역에 모피. 소독된 집게와가 위를 사용 하 여 가슴 중간에 절 개 하 고 피부와 근육 레이어를 통해 잘라.</li>
		<li>흉 곽을 노출 되 면 각 측에 흉 곽을 잘라 고 각 측에 흉 골에서 위쪽으로 약 5 mm. 신선한 시신에 있는 동맥에서 예상은 일부 출혈.</li>
		<li>폐 조직과 심장 대동맥을 폭로 해 부 오른쪽으로 밀어. 대동맥은 백색 용기 있는 척추 열에 인접 한 색.</li>
		<li>(대동맥 아치) 후 대동맥을 공략 하 여 수술가 위 집게와 대동맥을 잡고 첫 번째 절 개를 사용 하 여 집게를 사용. 대동맥을 절단, 시 흉 혈액으로 신속 하 게 채울 것입니다, 따라서 그것은 혈액 응고 전에 대동맥을 신속 하 게 작업에 중요 한.</li>
		<li>대동맥 그리고 척추에서 부드럽게 껍질을 아래쪽으로, 대동맥 겸 자 사용. 풀 추가 절 개 없이 있는 동맥 끊을 것 이다. 대동맥은 복 부 구멍에서 두 가지로 나누고 시체에서 대동맥을 잘라 전에 약 10 cm의 조직 및/또는 얻을. 꼬리 방향에 낮은 대동맥의 섹션에 액세스 하는 데 필요한 경우 횡 경 막 밀어. 
		참고: 강렬한 힘 눈물을 일으킬 수 있기 때문에 대동맥을 부드럽게 껍질. 대동맥 눈물 몇 초 동안 혈액 응고를 허용 coagulated 혈액을 제거 하는 종이 타월을 사용 하는 경우 수 있도록 나머지 대동맥의 가시성.</li>
		<li>차가운 행 크의 10 mL 15 mL 튜브에 대동맥을 배치 &#39; s 균형 소금 솔루션 (HBSS) 보충 1% 페니실린/스 (P/S). 얼음에 튜브를 계속 
		참고: 대동맥 조직 얼음에 1-2 시간 지속 될 수 있습니다 하지만 최대한 신속 하 게 처리 하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol></li> <li>살 균 biosafety 내각 (BSC)에 대동맥 반지 분석 결과 문화 미디어 준비.
	<li>준비 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1 %gentamicin 및 성장 요인 (재료의 표 참조)으로 보충 내 피 기저 매체 (EBM)의 500 mL를 필터링 하 여과 장치를 사용 하 여 내 피 성장 매체 (EGM) <ol>. 37에 구슬 또는 물 목욕으로 필터링 된 미디어의 50 mL을 배치 ° c.</li>
		<li>다른 여과 장치를 사용 하 여 필터링 100 mL 2 %FBS 1% 보완 하는 EBM의 P/S는 EBM 준비 2 %FBS (EBM-FBS) 4에서 저장 ° c.</li>
	</ol></li> <li>12 음 조직 문화 접시 기저 막 추출 (공학은)를 가진 얼음에 작업 하는 동안 코트.
	<li>장소 (대형 아이스 팩 또는 트레이) 차가운 표면에 12-잘 접시 <ol>. 200 µ L/갓 해 동 공학은 사용 하 우물 피 펫 팁을 냉장 하 고 심지어 코팅 되도록 공학은 소용돌이 추가 합니다. 공학은의 불균일 중 합 방지를 신속 하 게 작업. 
		참고: 전형적인 대동맥 절단 20 대동맥 고리를 생성합니다. 대동맥 반지 분석 실험 사이 가변성에 대 한 계정, 치료 그룹 당 최소한 3 개의 대동맥 반지 분석 실험을 설정 하 고 컨트롤 포함. 소스, 허용 하는 경우 치료 그룹 당 6 링 좋습니다.</li>
		<li>습도 인큐베이터 (95% 상대 습도, 37 ° C, 5% CO 2;이 모든 습도 보육 단계에 적용이 조건)으로 코팅된 판 장소 30 분 장소 1000 µ L 피 펫 팁 다시 단계 1.5.3-20 ° C에. 
		참고: 기저 막 추출 물 재고 농도에서 사용 하는 동안 그것의 일관성 및 강성은 엄격 하 게 제어 중 합 시간. 모든 패 러 랠 및 독립적인 실험에 대 한 정확한 동일한 중 합 시간을 지키는 것을 확인.</li>
	</ol></li> <li>균일 한 반지로 대동맥을 섹션.
	<ol><li>15 mL 튜브에서 대동맥 하 고 신선한 HBSS 보충 1%의 10 mL와 10 cm 접시에 배치 P/s.</li>
		<li>집게의 두 세트를 사용 하 여 신중 하 게 초과 결합 조직, 지방 조직, 그리고 대동맥에 연결 되어 있는 동맥의 나머지 지점에 대 한 메스를 사용 하 여 분리. 이 잔여 조직의 다른 수준에 따라 링 장치 사이 가변성을 감소 시킨다. 어떤 잔여 대동맥 내부에서 혈액 응고 제거.</li>
		<li>는 눈금자 나 눈금을 정확 하 게 1-2 m m 메 마른 메스와 집게를 사용 하 여 대동맥의 넓은 섹션 10 cm 접시 아래 놓습니다. 섹션을 단위 사이 가변성을 줄이기 위해 가능한 정확한 컷.</li>
	</ol></li> <li>공학은에 대동맥 고리 포함. 
	참고: 대동맥 링의 단면 공학은 합 부 화 하기 전에 완료 되지 않으면, 습도 인큐베이터에서 코팅된 접시를 제거 하 고는 중 합 종료 각 잘 하 EBM의 100 µ L를 추가. 정확한 타이밍은 공학은의 오버 합 내 피 네트워크 개발 및 셀 마이그레이션 방해 수 있습니다 중요 합니다. 일단 대동맥 고리 준비가 우물에서는 EBM을 제거 하 고 단계 1.5.2에서에서 계속.
	<ol><li>습도 인큐베이터에서 공학은 코팅 웰 스를 제거 하 고 BSC 돌아갑니다.</li>
		<li>는 신중 하 게 집게와 개별 대동맥 고리를 선택 하 고 각 공학은 코팅 잘 가운데 하나. 나머지 대동맥 반지에 대 한 반복. 
		참고: 대동맥 반지 함께 전송 미디어 보관 해야 합 비리를 방지 하기 위해 최소한의.</li>
		<li>사용 냉각 (-20 ° C) 1000 µ L 피 펫 팁 각 대동맥 고리 위에 공학은의 300 µ L을 추가 하 고 균등 하 게 배포 우물 주위 공학은.</li>
		<li>30 분에 대 한 습도 인큐베이터에 포함 된 대동맥 반지 반환</li>
		<li>습도 인큐베이터에서 포함 된 대동맥 링 플레이트를 제거 하 고 천천히 피펫으로 두어서 EGM (준비 및에서 예 열 단계 1.2.1)의 1000 µ L 문화의 벽에 잘 팁 추가. 
		참고: 직접는 공학은에 미디어를 pipetting 수 polymerized 공학은 고 내 피 네트워크 지속적인 개발을 방해 됩니다. 적절 한 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 사용 가능한 경우.</li>
		<li>24 h, EGM의 1000 µ L을 제거 하 고 준비 단계 1.2.2에서 다시 천천히 잘 문화의 측에 대하여 pipetting EBM FBS의 1000 µ L를 바꿉니다.</li>
	</ol></li> <li>신선한 EBM-FBS (37 ° C)의 500 µ L 모든 48 h. EBM FBS의 500 µ L을 대체 하 여 대동맥 반지 분석 결과 유지 
	참고: 참조 초MSC를 시작 하는 2 기 문화 대동맥 반지 분석 결과 설립으로 같은 날에 확장. 내 피 네트워크 준비가 MSCs 공동 문화에 대 한 준비는 이렇게 하면.</li>
	<li>대동맥 반지 분석 결과 내 피 네트워크 개발에 따라 밝은 분야 현미경 검사 법 사용 (최적의 네트워크 개발에 대 한 참조로 그림 1 참조). 일단 내 피 네트워크 측면은 그림 2와 같이, 대동맥 반지 분석 결과-MSC 공동 문화 (제 3)를 설정으로 진행. 내 피 네트워크 이미징의 자세한 내용은 4.1 단계를 참조 하십시오.</li>
</ol> 2. 조직 문화 <ol><li>조직 문화 미디어의 준비 재고 솔루션.
	<ol><li>문화 FTM HUCPVCs (이전 설립, n &#8805; 각 3 독립 라인) 30과 알파-MEM 10 %FBS 1% 보충에 상용 BMSCs P/s.</li>
		<li>0.2 µ m 기 공 크기 필터 병을 사용 하 여 미디어를 소독.</li>
		<li>준비 미디어 솔루션 4 ° C에서 최대 3 주 동안 저장.</li>
	</ol></li> <li>습도 incubators에 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 결정 하는 70-80 %confluency 통행 유지 FTM HUCPVC 및 BMSC 문화. 사용 하 여 적절 한 양의 조직 문화 접시의 크기에 대 한 미디어 사용 (즉, 10 cm 접시에 10 mL). 이러한 문화 조건을 유지 하 고 뿌리고 MSCs를 사용 하 여.</li>
	<li>해리 뿌리고 위한 MSC monolayers 또는 대동맥 반지 분석 결과-MSC 분리 효소 솔루션 (요리 4 mL/10 cm)를 사용 하 여 공동 문화 및 3 분 밝은 분야 현미경 검사 법을 사용 하 여 셀의 확인 분리를 위한 습도 부 화기에서 품 어; 품 어 필요한 경우 추가 1-2 분.</li>
	<li>15 mL 튜브를 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 분리기로 해리 셀 전송</li>
	<li>는 상쾌한 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 발음 하 고 셀 카운터를 사용 하 여 계산에 대 한 적절 한 배양 (대동맥 반지 분석 결과/MSC 공동 문화에 대 한 셀 또는 EBM FBS를 뿌리고 대 한 완전 한 알파-MEM 미디어)의 1 mL에 셀 resuspend.</li>
</ol> 3. 대동맥 반지 분석 결과/MSC 공동 문화 준비 <ol><li>씨앗 10 4 MSCs 각 포함 대동맥 반지 (9000 셀/cm 2 / 12-잘 접시). 가능한, 함 형광 염료와 MSCs 얼룩 중 대동맥 반지 분석 실험의 수에 따라 달라 집니다. 컨트롤 그룹에 대 한 MSCs 없이 대동맥 고리의 적어도 3 개의 우물을 유지 합니다.
	<ol><li>10 5 MSCs/mL EBM FBS 미디어 얼룩, 가능한의 2.5 µ L을 추가, 양도 형광 염료/mL 미디어 (5 µ M) 15 mL 튜브와 30 분에 대 한 습도 인큐베이터에서 부드럽게 혼합 튜브는 인큐베이션을 통해 중간.</li>
		<li>다음에 30 분 부 화, 스테인드 셀에 신선한 EBM FBS의 1 볼륨을 추가 하 고 5 분에 대 한 400 x g에서 회전</li>
		<li>는 상쾌한을 제거 하 고 다시 EBM FBS 미디어의 1 mL에 셀 펠 릿을 중단. 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 MSCs의 성공적인 얼룩 확인.</li>
	</ol></li> <li>습도 인큐베이터에서 대동맥 반지-포함 된 번호판을 제거 하 고 각 우물에서 EBM-FBS의 500 µ L를 제거.</li>
	<li>신중 하 게 고르게 내 피 네트워크 주위 pipetting으로 각 임베디드 대동맥 고리에 EBM FBS의 500 µ L에 10 4 MSCs 씨. 부드럽게 문화 접시를 떨고 하 여 분배를 확인 합니다.
	<ol><li>대동맥 반지 분석 결과/MSC 공동 문화에 미디어의 총 볼륨 1000 µ L을 추가 EBM FBS 추가.</li>
	</ol></li> <li>형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 시각화 대동맥 반지 분석 결과에 놓여있는지 이라는 MSCs.</li></ol>
 4. 현미경 <ol><li>대동맥 반지 분석 결과/MSC 전에 쥐 내 피 네트워크 이미지를 사용 하 여 밝은 분야 현미경 검사 법은 공동 내 피 네트워크 속성 (예:, 네트워크의 기준선 (0 일) 측정을 위한 문화 길이, 네트워크 루프)입니다. 해당 사분면 내 내 피 네트워크의 더 부분을 대동맥 링에서 잘 당 4 사분면 이미지.
	다음 대동맥 반지 <ol><li>이미지는 대동맥 링 네트워크 분석 결과/MSC 공동 3, 5, 7 일에 문화. 이러한 이미지를 사용 하 여 내 피 네트워크 개발에 MSC 효과 계량.</li>
	</ol></li> <li>형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지 사전 이라는 MSCs 대동맥 반지 분석 결과에.
	<ol><li>다음 24 h 대동맥 반지 분석 결과/MSC의 공동 문화, MSC 추적, 신장 및 내 피 네트워크와 통합 시각화를 형광 현미경 검사 법을 사용 합니다. Colocalization 두 종류의 세포를 관찰 하는 내 피 세포의 밝은 필드 이미지와 MSCs의 형광 이미지를 오버랩.</li>
		<li>이미지 대동맥 링 조직에 인접 개발된 내 피 네트워크 내에서 지역화 된 MSCs 및 새로 개발 원심 대동맥 링 조직 ( 그림 2)에 네트워크 내에서 지역화 된 MSCs.</li>
	</ol></li></ol> 5. Flow Cytometry 및 정량 <ol><li>대동맥 링 내 피 네트워크를 해리 한 전날 녹여 냉동된 dispase에서 4 ° C O/명. 섹션 5.3 cytometry 및 정량에 대 한 동일.</li>
	<li>Dispase의 고 37 ° C 구슬 또는 물 목욕 트립 신 0.5%의 50 mL 50 mL 따뜻한.</li>
	<li>대동맥 반지 분석 결과/MSC 공동 문화에서 분석에 대 한 셀을 검색합니다.
	대동맥 반지 분석 결과/MSC 공동 문화의 <ol><li>후 1 주 문화 미디어를 제거 하 고 1 mL의 Phosphate-Buffered 염 분 (PBS) 천천히 하 각 3 분 잘 제거를 추가. 이 세척 두 번 더 반복.</li>
		<li>추가 800 µ L의 사전 각 우물에 dispase를 예 열 하 고 15 분에 대 한 습도 인큐베이터에서 품 어</li>
		<li>습도 인큐베이터에서 플레이트를 제거 하 고 공학은, 헤어 (5-10 x)를 pipetting으로 dispase를 일시 중단 하 고 별도 15 mL 튜브 각의 내용을 전송.</li>
		<li>반복 단계 5.3.3 다시 아니 잔여까지 신선한 미리 데워 진된 dispase 공학은 관찰 된다 문화에 잘. 1 볼륨 PBS 3%와 보충의 추가 dispase을 비활성화 하려면 dispase-세포 현 탁 액을 FBS. 피 펫 팁을 사용 하 여 세포 현 탁 액에 떠 있는 대동맥 고리 제거.</li>
		<li>5 분은 상쾌한 신중 하 게 제거, 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액 3 mL을 떠나는 대 한 400 x g에서 셀 정지 회전. 
		참고:은 분명 하 고, 단단한 펠 릿 보이지 않을 수 있습니다 하지만 셀 및 공학은.</li>
		<li>세포 현 탁 액 및 적극적으로 resuspend (5-10 x pipetting으로) 세포를 트립 신 0.5 %prewarmed의 3 mL를 추가합니다. 10 분에 대 한 습도 인큐베이터에서 trypsinized 셀 솔루션을 품 어</li>
		<li>습도 인큐베이터에서 trypsinized 셀 정지를 제거 하 고 추가 3 %FBS resuspend 보충 PBS의 6 mL 몇 팀es입니다. 5 분에 대 한 400 x g에서 셀 정지 스핀</li>
		<li>신중 하 게 튜브에 셀 펠 릿을 떠나 모든 상쾌한, 제거 하 고 1 ml PBS 3% 보충 셀 resuspend 각 관에서 FBS.</li>
		<li>필터링 세포 현 탁 액에서 집계 된 셀 및 잔여 공학은 제거를 70 µ m 셀 스 트레이너를 사용 하 여 1ml 세포 현 탁 액. 셀 카운터를 사용 하 여 셀 서 스 펜 션의 1 mL에 셀.</li>
	</ol></li> <li>Cytometry 셀 준비.
	<li>품 셀 <ol>정지 (3% 보충 200 µ L PBS에서 10 5 셀 FBS) fluorophore 활용 (FITC 또는 APC) 기본 항 체와 (TRA-1-85-CD146, CD31) 농도 = 1시 40분) 4 ° C에서 30 분, 빛 으로부터 보호. 
		참고: cytometry MSCs에 대 한 홍 외, 2013 28 최적화 했다. 최소 10000 셀은 정확한 판독에 필요한.</li>
		<li>2 ml PBS 3 %FBS 원심 분리기 (400 x g, 5 분) 보충의 셀 resuspend 30 분 부 화 다음.</li>
		<li>Cytometry (적어도 1 x 10 4 이벤트)에 의해 분석까지 1 시간 이내 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 계속 셀. 제어 전략에 대 한 보충 그림 1을 참조 하십시오. 인간의 MSCs 안티-TRA-1-85 (APC)를 사용 하 여 정렬 (농도: 1시 40분 및 0.5 %FBS에서 / PBS) 및 정량 분석을 위한 세포 세포의 용 해 버퍼의 350 µ L로 셀 정렬. 
		참고: Lysed 세포 수 저장 될-80 ° C에서 미래의 정량 분석에 대 한 최대 3 개월.</li>
	</ol></li> <li>정량 분석에 대 한 셀을 준비.
	<ol><li>열 기반 RNA 격리 키트를 사용 하 여 lysed 세포에서 RNA를 분리 하 고 RNA 농도 품질을 결정.</li>
		<li>100 당 RNA의 최대 5 µ g에서 준비 cDNA µ L 역전사 반응. RNA 수익률이 낮은 경우에 사전 증폭 단계를 수행 (&#60; 10 ng / µ L). 100의 사용 RNA의 ng false 네거티브의 높은 속도에서 발생 합니다. 
		참고: cDNA 템플릿을 저장할 수 있습니다 추가 분석을 위해-20 ° C에서 최대 4 개월.</li>
		<li>정량 유전자 발현에서 변화를 감지 하 신생 식 프로파일러 어레이 사용 하 여 수행 합니다. 반응 (40 주기, 어 닐 링/확장 온도 60 ° C) 당 cDNA의 사용 5 ng. 배 undifferentiated MSC 파생 된 cDNA 샘플에 비해 표현의 변화를 표현 한다. 적절 한 부정적인 컨트롤 (대동맥 반지 인간의 MSCs 없이) 실행.</li>
	</ol></li></ol> 6. 정량화 다음 대동맥 반지 분석 결과/MSC 공동 문화 네트워크 <ol><li>신생 분석기 플러그인 31 함께 ImageJ 같은 이미징 소프트웨어 다운로드.</li>
	<li>찍은 내 피 네트워크 이미지를 가져오고 소프트웨어를 사용 하 여 열기.</li>
	<li>변환 사용 하는 현미경의 사양에 따라 이미지 비늘.</li>
	<li>직선 도구를 사용 하 여 방사형 네트워크의 성장 측정.</li>
	<li>계산 셀 카운터 도구를 사용 하 여 내 피 네트워크 루프 (루프 4 면으로 계량 한다).</li>
	<li>네트워크 속성의 추가 정량화를 사용 하 여 신생 분석기 플러그인 또는 다른 유사한 플러그인 마스터 세그먼트 분석 대 한 총 세그먼트 길이, 총 네트워크 지역과 연결의 수. 흐리게 마스크 도구를 사용 하 여 대동맥 링 조직 및 거짓 긍정적인 계산을 피하기 위해 빈 공간을 흐림.</li>
	<li>대동맥 반지 분석 결과/MSC 공동 문화에 따라 통계 프로그램 및 그래프 내 피 네트워크 속성에 값을 전송.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis.">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146 (6), 873-887 (2011).</li><li>Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+and+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor and angiogenesis.</a> Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).</li><li>Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+progress+and+prospects:+therapeutic+angiogenesis+for+limb+and+myocardial+ischemia.">Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia.</a> Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).</li><li>Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+studies+of+angiogenic+gene+therapy.">Human studies of angiogenic gene therapy.</a> Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).</li><li>Chu, H., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+angiogenesis:+controlled+delivery+of+angiogenic+factors.">Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors.</a> Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).</li><li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+angiogenesis+for+ischemic+disorders:+what+is+missing+for+clinical+benefits?.">Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits?.</a> Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).</li><li>Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+growth+factor+delivery+for+therapeutic+angiogenesis.">Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis.</a> J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).</li><li>Bergers, G., Song, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pericytes+in+blood-vessel+formation+and+maintenance.">The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance.</a> Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).</li><li>Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+for+vascular+regeneration:+adult,+embryonic,+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells.</a> Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).</li><li>Sieveking, D. P., Ng, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapies+for+therapeutic+angiogenesis:+back+to+the+bench.">Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench.</a> Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).</li><li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays.">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).</li><li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+assays:+a+critical+overview.">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).</li><li>Tahergorabi, Z., Khazaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+angiogenesis+and+its+assays.">A review on angiogenesis and its assays.</a> Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).</li><li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+cell+tube+formation+assay+on+basement+membrane+turns+20:+state+of+the+science+and+the+art.">The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art.</a> Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).</li><li>Nicosia, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aortic+ring+model+of+angiogenesis:+a+quarter+century+of+search+and+discovery.">The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery.</a> J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).</li><li>Baker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+mouse+aortic+ring+assay+to+study+angiogenesis.">Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis.</a> Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+protein+(Canopy+2,+CNPY2)+enhances+angiogenesis+and+promotes+smooth+muscle+cell+migration+and+proliferation.">A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation.</a> Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).</li><li>Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geraniol+Suppresses+Angiogenesis+by+Downregulating+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+(VEGF)/VEGFR-2+Signaling.">Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling.</a> PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).</li><li>Masson, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Aortic+Ring+Assay:+A+New+Approach+of+the+Molecular+Genetics+of+Angiogenesis.">Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis.</a> Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).</li><li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mesenchymal+stem+cells+for+tissue+engineering+versus+regenerative+medicine.">Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine.</a> J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).</li><li>Caplan, A. I., Dennis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+as+trophic+mediators.">Mesenchymal stem cells as trophic mediators.</a> J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).</li><li>Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells:+new+directions.">Mesenchymal stromal cells: new directions.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).</li><li>Kilroy, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+profile+of+human+adipose-derived+stem+cells:+expression+of+angiogenic,+hematopoietic,+and+pro-inflammatory+factors.">Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors.</a> J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).</li><li>Tang, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+action+enhances+the+effects+of+autologous+mesenchymal+stem+cell+transplantation+on+vascular+regeneration+in+rat+model+of+myocardial+infarction.">Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction.</a> Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).</li><li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+MSCs+are+pericytes?.">All MSCs are pericytes?.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).</li><li>Hong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+human+umbilical+cord+perivascular+cells:+molecular+and+fate+potential+changes+during+gestation.">Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation.</a> Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+bioscience+research+reporting:+The+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research.">Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).</li><li>Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+propagation,+and+characterization+of+human+umbilical+cord+perivascular+cells+(HUCPVCs).">Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs).</a> Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+angiogenic+response+of+the+aorta+to+injury+and+inflammatory+cytokines+requires+macrophages.">The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages.</a> J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).</li></ol>

닥터 클 리 포드 L. Librach는 특허의 공동 소유자: 격리의 첫 번째 임신 탯 조직에서 파생 된 셀의 사용 방법. 캐나다와 호주에 부여.

성공적인 대동맥 반지 분석 결과 MSC 공동 문화 실험 설정에 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 분리 하 고 대동맥을 구분 하는 경우 가장 중요 한 단계는: 1) 대동맥;의 독점적으로 흉부 세그먼트를 취득 2) 신중 하 게 분기 혈관, 결합 및 지방 조직 제거 및; 각 분석 결과 사이 가변성을 제한 하는 대동맥 (~ 1 m m)의 3) 절단도 섹션입니다. 둘째, 공학은으로 대동맥의 성공적인 포함은이 분석 결과 대 한 중요 합니다. 경우는 공학은 완전히 생산 또는 균등 하 게 생산, 대동맥 고리는 공학은에 포함 내 피 돋 아를 시작할 수 없습니다 또는 그들은 불연속 내 피 네트워크를 개발할 수 있습니다. 공학은 합 충분 하지 않으면 분석 정량화에 대 한 신뢰할 수 없습니다. 셋째, 완전 한 요인 농축 내 피 미디어 돋 아 시작 하 대동맥 반지에 대 한 영양을 제공 하는 데 필요한입니다. 일단 대동맥 링 반지 선박 돋 아 시작, 다음 중요 한 곧 나오는 단계 테스트 셀 형식을 포함 한다. 이 위해 MSCs 성공적으로 미리 스테인드 하 고 돋 아 대동맥 고리를 관리 해야 합니다. 이 섹션에 대 한 두 가지 중요 한 절차가 있다. 1) 시드를 위한 적절 한 날 선택: 네트워크 개발 단계에 있어야 하 고 문화의 높은 적용 잘 도달 될. MSCs 하지 적시에는 관리 되는, 네트워크 개발에 있는 MSCs의 순 효과 계량 도전이 됩니다. 2) prestaining 추가 이전 MSCs: MSCs-스테인드 또는 펠 릿에는 광범위 한 시간 동안 유지, 응집 발생 합니다 손상 유도 및 내 피 네트워크 내에서 통합 하는. 마지막으로, 네트워크 측정 쉽게 얻을 수 있습니다 적절 한 컨트롤은 준비 하는 경우. MSCs 없이 대동맥 고리는 대동맥 자체 지원 돋 아, 하지만 MSCs는이 원고에 설명 된 대로 다른 네트워크 구조와 큰 네트워크 개발을 촉진 수 있기 때문에 내 피 네트워크를 개발할 것입니다. 내 피 네트워크의 정량화는 수행된 적어도 5 d 다음 설정 공동 문화 이어야 한다. 폐쇄 시스템으로 인해 신생 응답 일시적 이며 내 피 네트워크 시작 약 7 d에 따라 변질. 관측의 목적은 내 피 네트워크의 개발에 테스트 셀 종류 효과 평가 하는, 경우 공동 경작의 첫 주 내 이미지를 인수 한다.
현재 분석 결과의 가능한 수정 기본 인간 조직의 응용 프로그램 수 있습니다. 쥐 대동맥의 1 mm 섹션 공동 문화에 대 한 하나의 단위 하 게, 인간 aortas 높게 일관 된 측정의 섹션의 높은 숫자와 함께 제공할 수 있습니다. 가능한 인간 기본 조직의 매우 제한 된 가용성에도 불구 하 고 높은 출력 잠재적인 가능성을 제안합니다. 개발할 때 대규모 평가 대 한 분석 결과, 분석 결과 미리 형성 하 고 테스트에 대 한 셀을 사용할 수 있게 될 때까지 그 구성 요소를 저장 여겨질 수 있다. 공학은 코팅 조직 문화 접시에 준비 하 고 오랜 시간에 대 한 냉동, 탈수 형태로 저장 될 수 있습니다. 또한, 우리는 우리의 실험실에서 테스트, 쥐 대동맥 조직 냉동 고 나중에 응용 프로그램, 따라서 만드는 작업을 보다 편리 하 게 분석 결과의 가장 중요 한 요소에 대 한 저장.
대동맥 반지 분석 결과의 많은 장점에도 불구 하 고 나열 하는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, 분석 결과 문화의 설립 전하실 수 있습니다. 그것의 현재 모양에서 일상적인 응용 프로그램에는 충분 한 수동 기술을 필요로 한다. 운영자 오류 가변성을 발생할 수 있습니다. 그것은 네트워크의 성장에서 미러링할 수 있습니다 하 고 안정적으로 관리 되 세포의 효과 및 따라서 중요 한 신생 속성을 평가 하기 어려울 수 있습니다. 그러나, 이러한 과제는 유사 하지 다른 방법 사용할 수 있는, 그에 비해 작은 경우 그리고 필요한 교육 기간 짧고 vivo에서 실험 반대 경제 편리 하 게 될 수 있습니다. 둘째, ex vivo 대동맥 조직 및 세포 관리의 시간을 표시 하는 초기 네트워크 개발의 포함 사이의 지연 기간 사용자에 의해 설명 될 필요가 있다. 셋째, 내 피 네트워크 속성의 정량화 시간이 소요 될 수 있습니다 하지만 방사형 성장을 포함 하 여 각 매개 변수를 지정 하 여 해결할 수 있습니다, 그리고 튜브 길이 및 네트워크 메쉬 크기. 이 이미지 (이미지 J), 일관 되 고 안정적인 정량화에 필요한 시간을 크게 단축할 수 있는 원조 컴퓨터 분석을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 넷째, 각 분석 결과 사이 가변성 동물 조직 소스 및 운영자에 의해 처리에 약간의 불일치의 결과로 발생할 수 있습니다. 우리는이 문제를 효과적으로 극복할 수 있다는 정량화 된다 각 치료 그룹에 대해 triplicates를 설정 하 여 통계적으로 신뢰할 수 있는 발견. 마지막으로, 추출 하 고 인간의 세포와 쥐 원산지 사후 분석 결과 분석에 대 한 정렬 전하실 수 있습니다. 그러나, 특정 proteinases, dispase, 및 세포 복구 솔루션을 포함 하 여 immunophenotypic 또는 유전자 표정 분석에 대 한 셀을 복구에 적용할 수 있습니다.
이 분석 결과 사용 하 여 비보 전 대동맥 조직 공학은 조합의 제시 문화 단일 내 피 세포 유형을 또는 동물 시스템 라이브는 기존의 방법에 비해. 이 설치에는 세포 치료 후보자의 신생 속성 elucidating 질적 및 양적 데이터를 얻을 사용자 수 있습니다. 공학 및 멀티 셀룰러 비보 전 조직 결합 밀접 하 게 치료 셀 형식을 로컬 관리 후 발생할 수 있습니다 microenvironment을 흉내 낸 하는 속성을 제공 합니다. 패 러 랠 및 문화 상태에 가까운 제어의 높은 숫자의 가능성 때문에 연산자 제공 하는 있는 변수 및 불일치를 제거 하는 동안 신뢰할 수 있는 평가 위해 필요한 요소를 포함 하는 시스템 동물 모델입니다. 게다가, 평가 더 가능한 비용 및 반복된 동물 절차의 필요성을 줄일 수 있기 때문에입니다. 단일 세포 분석 실험 및 가장 동물 모델 부족 그렇지 않으면 세포 치료의 임상 응용 프로그램에서 발생 하는 면역 반응에 의해 도입 된 변수와 요인. 염증 반응을 신생 및 따라서 이식된 물질의 치료 효과 변경 또는 세포는 정확 하 게 측정할 수 없습니다. 대동맥 반지 분석 결과 분석 결과 측정을 방해 하는 많은 염증 구성 요소를 제외 합니다. 그러나, 그것은32의 microvasculature 개발 중요 한 선수는 상주 대 식 세포를 포함 되어 있습니다. Prestained 인간 세포와 내 피 네트워크의 쉬운 id와 MSC 분 비 염증 성 cytokines의 효과 면역 시스템의 세포도 요소 수 있습니다 쉽게 관찰이 분석 결과 사용 하 여.
시험 조건 및 실험적인 체제의 재현 특성 사용자에 의해 높은 제어 시스템에 추가 요소 도입에 대 한 수 있습니다. 첫째, 대동맥 반지 분석 결과 부상 모델로 사용할 수 있습니다. 대동맥 고리와 내 피 돋 아의 포함에 따라 분석 실험 허 혈 성 손상, 염증 성 요인 (TNF-α) 또는 세균성 lipopolysaccharide (LPS), MSC 뿐만 아니라 신생의 가능한 구조를 결정 하 여 다음에 소개 될 수 있다 응답은 다음과 같은 부상입니다. 둘째,의 가능한 메커니즘을 명료 하 게 하는 MSCs에 어떻게 공헌 하는지 신생 응답, neutralizing 항 체는 잠재적인 수용 체 세포 세포 상호 작용에 대 한 중요 한 침묵을 활용할 수 있습니다. 마지막으로, MSCs의 paracrine 속성 조사, 대동맥 반지 분석 결과 수 있습니다 설치 paracrine 속성에 신생 응답 하지만 초점의 세포-세포 상호 작용의 효과 제외 하려면 transwell 시스템에서.
요약, 대동맥 반지 분석 결과 능력을 평가할 수 있습니다 그리고 중재 처리, ECM에 세포 치료의 힘, 신생의 영역을 마이그레이션할 신체 접촉을 통해 선박 개발을. 신생 분석 결과 비보 전 대동맥 반지 재생 치료 후보 세포 라인에 대 한 가치, 양적 사전 심사 도구로 개발 될 수 있습니다.

신생의 복잡 한 프로세스 향상 하 고 기존 맥 관 구조1에서 새로운 선박 개발을 추진 하 여 조직 관류를 유지 합니다. 프로-신생 및 안티-신생 요인에 의해 단단히 규제, 공정한 과정 이다. 어떤 결핍이이 시스템에 부족 한 선박 유지 보수 또는 성장, 심근 질환, 뇌졸중, 신경 장애 등 심각한 허 혈 성 질환을 일으키는 발생할 수 있습니다. 그러나, 과장 된 혈관 개발 조건 암, 염증 성 질환2를 포함 하 여 특징입니다.
유리한 조직 재생을 달성 하기 위해 신생을 제어 하는 것을 목표로 하는 치료를 개발 하는 것은 중요입니다. 광범위 한 전 임상 및 임상 조사에도 불구 하 고 신생 프로 신생 요인과 microRNAs를 사용 하 여 자극 하려고 원하는 결과3,,45달성 못했다. 일시적 효과 대 한 가능한 이유: 신생 단백질 및 핵 산의 한정 된 수의 제한 된 장 수 대상 성장 요인6,7. 수용 성 신생 요소는 신생을 시작에 대 한 필수, 유지 보수 및 맥 관 구조의 기능 세포 유형 pericytes 및 평활 근 세포8을 포함 하 여 지원에 따라 다릅니다. 프로-신생 요법의 분야는 지금 잠재적인 줄기 세포 그리고 조상 세포 원 맥 관 구조, 자동 갱신 또는로 차별화 개발 물리적으로 새로 지 원하는 신생 요소를 로컬로 제공할 수 있습니다 탐험 내 피 같은 셀9,10. 찾는 최적의 신생 세포 유형 이러한 기능적 요구 사항을 충족 하는 기능으로 허 혈 성 조직 재생에 대 한 위대한 약속을 보유 하고있다.
임상으로 잠재적인 세포 기반 치료를 성공적으로 번역 하기 위해 전 임상 연구 하 그들의 효능을 입증 하 고 기본 신생 메커니즘을 강조 해야 합니다. 설립 된 신생 분석 실험의 높은 숫자에도 불구 하 고 필드 "금 표준" 생체 외에서 분석 결과 안정적으로 잠재적인 후보 셀 유형11,12, 의 효능을 평가할 수 있는 부족 13. 대부분 체 외에서 신생 분석 실험 (내 피 확산, 마이그레이션 및 관 형성 분석을 포함 하 여) 일반적으로 내 피 세포의 phenotypical 변화 나 감 별 법으로 셀 또는 화합물의 효과 평가 관 및 네트워크 구조14,15. 이러한 기능은 신생에 대 한 중요 한 동안, "번역" 분석 결과 또한 평가 해야 한다: 1) 확대 또는 pericytes 또는 평활 근 세포, ECM, 지하실 막의 2) 처리를 포함 하 여 지원 세포 유형의 교체 및 3) 기능 microvasculature의 형성을 촉진 하는 효율성. 각 막 분석 결과 및 Matrigel 플러그 분석 결과를 포함 하 여 신생 모델, vivo에서 독특한 vivo에서 microenvironment을 정리 하지만 추적 관리 셀의 어려움에 의해 도전 물리적 상호 작용을 관찰 하. 또한, vivo에서 모델 이종 면역 거부 잠재 수용자 세포 치료 후보16테스트 하는 동안 발생할 수 있습니다. 신생 모델 비보 전 특히 대동맥 반지 분석 결과 제공할 수 있습니다: 1) 쉽게 관찰과 3) ECM 호스트와 인공 공급에서의 염증 성 제외 4) 관 형 구조, 2) 액세서리 지원 셀의 정량화 구성 요소, 및 5) 신속 하 고 저렴 한 설치17,18. 일반적으로, 대동맥 반지 분석 결과 작은 분 비 단백질, 약리학 대리인, 및 유전자 변형 쥐 모델19,,2021의 신생 잠재력을 테스트할 수 있습니다.
MSCs는 주로 그들의 paracrine 중재 효과22,,2324통해 혈관 재생을 위한 유망한 후보자. 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), Hepatocyte 성장 인자 (HGF)를 포함 한 주요 신생 요인 분 비 MSCs 보였다 인슐린 같은 성장 인자-1 (IGF-1), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF), 및 angiopoeitin-1 (중앙-1)25 ,26. 그러나 MSCs도 검색할 수 있습니다 그리고 집에 허 혈 성 또는 염증 조직, 조사를 받고 아직도, 정확한 메커니즘은. 점점, 문학 가설 대부분 MSCs 혈관 주위 세포에서 발생 하는 공동 pericyte 마커, 표현 그리고 pericytes27처럼 행동 수를 지원 합니다. HUCPVCs는 인간의 탯 줄의 혈관 주위 지역에서 파생 하는 MSCs의 젊은 소스입니다. 그들은 pericyte 같은 속성으로 MSCs의 인구를 대표 하 고 용어와 FTM 탯에서 특징. FTM HUCPVCs CD146 및 높은 증식 및 multilineage 잠재력 NG2 면역 권한 속성을 비롯 한 pericyte 마커의 높은 식 설명 하 고 강력한 paracrine 프로필28을 표시 합니다. FTM HUCPVCs pericyte 같은 속성을 통해 새로운 맥 관 구조의 프로 모션을 통해 손상 된 조직의 재생을 촉진 하는 이상적인 후보자 셀 유형입니다.
신생 잠재력과 인간의 MSCs의 pericyte 같은 속성을 테스트 하려면 신생 분석 실험의 매우 제한 된 수 있으며 사용할 수 있는 긍정적인 angiotropic 마이그레이션 ("추적" 라 함), ECM 처리, 물리의 개발 셀 형식 간의 상호 작용 microvasculature 개발에 양적 데이터를 가져오는 동안, 조사 될 수 있다.
이로써 선물이 대동맥 반지 분석 결과의 새로운 응용 프로그램을 설명 하는 프로토콜. 인간의 MSCs 공동 개발 쥐 파생 대동맥 내 피 네트워크 형성, 성숙, 및 항상성 튜브에 그들의 기여를 평가 하기 위해 경작 했다. 이 버전의 대동맥 반지 분석 결과 평가 능력과 집 신생의 사이트를 수행 하 고 ECM 처리를 중재 pericyte 같은 물리를 수립을 통해 내 피 관 개발을 세포 치료의 힘 상호 작용입니다. 생체 외에서 내 피 네트워크 형성에 MSCs의 그물 효과 측정 하 고 세포 상호 작용을 관찰, 뿐만 아니라 우리는 또한 공동 문화에서 MSCs를 분리 하는 프로토콜 최적화. Cytometry 및 정량 Pcr을 수행 하 여 특성화 MSC 표현 형 및 유전자 식 공동 문화에 따라 변화 가능 하다. 모델 셀 유형으로 우리 ontogenetically 일찍 비교 (태아)와 인간의 MSCs의 늦은 (성인) 소스: FTM HUCPVCs와 인간의 골 수 파생 된 MSCs (BMSC), 대동맥 반지 분석 결과에서 각각. 우리는 신생 재생 응용 프로그램에 대 한 조사를 받고 때 어떤 물리적으로 지 원하는 셀 형식의 신생 잠재력 연구 대동맥 반지 분석 결과 사용할 수 있습니다 제안 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Alpha-MEM</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >12571071</td>
			<td >For FTM HUCPVC and BMSC culture media.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC-conjugated anti human TRA-1-85</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >FAB3195A</td>
			<td >Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Basal membrane extract (BME) (Matrigel)</td>
			<td >Corning</td>
			<td >354234</td>
			<td >For aorta embedding</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bullet-kit</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >CC-3162</td>
			<td >Includes: Gentamicin/Amphotericin-B 
			(GA)human Epidermal 
			Growth Factor (hEGF); Vascular 
			Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- 
			Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); 
			Ascorbic Acid; Hydrocortisone; 
			human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-&#946;); Heparin; Fetal Bovine Serum 
			(FBS). Required to prepare EGM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td >Thermo-fisher</td>
			<td >C2925</td>
			<td >For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CKX53 Culture Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td ></td>
			<td >For bright-field imaging of endothelial network development</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Countess automated cell counter</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >C10227</td>
			<td >Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dispase</td>
			<td >StemCell technologies</td>
			<td >7923</td>
			<td >For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable sterile scalpels</td>
			<td >VWR</td>
			<td >21909-654</td>
			<td >For sectioning aorta</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8537</td>
			<td >PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Endothelial basal media (EBM)</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >CC-3156</td>
			<td >Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 &#176;C before use). Required for EGM and EBM-FBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol, 70%, Biotechnology Grade</td>
			<td >VWR</td>
			<td >97064-768</td>
			<td >To sterilize surfaces</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EVOS</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td ></td>
			<td >In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone)</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >SH3039603</td>
			<td >Serum component of cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC-conjugated anti-CD31 antibody</td>
			<td >BD</td>
			<td >558068</td>
			<td >Human endothelial marker for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FITC-conjugated anti-CD146antibody</td>
			<td >BD</td>
			<td >560846</td>
			<td >Human pericyte marker for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td >Almedic</td>
			<td >7727-A10-704</td>
			<td >For handing rat tissue. Can use any similar forceps</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >14175-094</td>
			<td >1X Without calcium chloride and magnesium chloride</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HERAcell 150i CO2 Incubator</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >51026410</td>
			<td >For incubating cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >PAHS-024Z</td>
			<td >Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LSR II</td>
			<td >BD</td>
			<td ></td>
			<td >UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MoFlo Astrios</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td ></td>
			<td >UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/streptomycin</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td >Antibiotic component to buffers and cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNeasy Mini Kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >74104</td>
			<td >For RNA purification. Includes cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RT2Easy First Strand Kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >330421</td>
			<td >For preparation of cDNA for qPCR</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >330451</td>
			<td >Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical scissors</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >14059-11</td>
			<td >For cutting skin, muscle and aorta</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile gauze</td>
			<td >VWR</td>
			<td >3084</td>
			<td >To dampen and sterilize chest fur</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TrypleE</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605036</td>
			<td >MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2 &#956;m pore filtration unit</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >566-0020</td>
			<td >To sterilize tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25200056</td>
			<td >For cell dissociation, pre-warm at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 cm tissue culture dishes</td>
			<td >Corning</td>
			<td >25382-428</td>
			<td >For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12 well-cell culture plates</td>
			<td >Corning-Sigma Aldrich</td>
			<td >CLS3513</td>
			<td >For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 mL tube</td>
			<td >BD Falcon</td>
			<td >352096</td>
			<td >For general tissue culture procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#956;m cell strainer</td>
			<td >Fisherbrand</td>
			<td >22363548</td>
			<td >To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the aortic ring co-culture assay: a convenient tool to assess the angiogenic potential of mesenchymal stromal cells in vitro

신생은 복잡 하 고, 높은 규제 프로세스를 제공 하 고 적절 한 조직 관류를 유지에 대 한 책임. 지나치게 풍부한 혈관 개발은 암 및 염증 성 질환 관련 된 부족 한 맥 관 구조 유지 보수 및 병 적인 기형 심한 허 혈 성 질환에서 발생할 수 있습니다. 프로-신생 치료의 유망한 형태 신생 셀 소스, 새로 개발 하는 맥 관 구조에 대 한 규제 요인으로 물리적 지원을 제공할 수 있는의 사용 이다.
Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs)를 감지 하 여 허 혈 성 또는 염증 조직에 집 혈관 재생 paracrine 효과 및 그들의 능력에 대 한 광범위 하 게 조사 후보자 이다. 특히, 처음 3 달 동안 인간 탯 줄 혈관 주위 세포 (FTM HUCPVCs)는 그들의 pericyte 같은 속성, 높은 증식 및 multilineage 잠재력, 면역 권한 속성, 및 강력한 paracrine 매우 유망한 후보 프로 파일입니다. 효과적으로 평가 하 고 잠재적으로 신생 재생 세포, 그것은 그들에 신뢰할 수 있는 및 "번역" 전 임상 분석 실험 테스트는 필수 이다. 대동맥 반지 분석 결과 비보 전 신생 모델입니다 관 내 피 구조의 쉬운 정량화를 허용, 액세서리 지원 세포와 세포 외 기질 (ECM) 호스트에서 염증 구성 요소를 제외 하며는 빠르고 저렴 한 설정. 이것은 (예를 들어, 각 막 분석 결과, Matrigel 플러그 분석 결과); vivo에서 모델에 비해 유리 대동맥 반지 분석 결과 관리 셀을 추적 하 고 이종 면역 거부를 피하고 있는 동안 세포 상호 작용을 관찰할 수 있습니다.
선물이 개발 쥐 대동맥 내 피 네트워크 공동 문화에서 인간의 MSCs를 포함 하는 대동맥 반지 분석 결과의 새로운 응용 프로그램에 대 한 프로토콜. 이 분석 결과 관 형성 및 물리적 pericyte 같은 상호 작용을 통해 개발에 MSC 기여와 신생의 사이트를 적극적으로 마이그레이션하기 위한 그리고 그들의 능력을 수행 하 고 중재를 평가 하기 위한 그들의 힘의 분석에 대 한 허용 ECM 처리입니다. 이 프로토콜은 MSC 표현 형 유전자 표현 공동 문화에 따라 변화에 추가 정보를 제공 합니다.

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The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

여기, 선물이 대동맥 반지 분석 결과의 새로운 응용 프로그램 prelabelled 중간 엽 세포는 쥐 대동맥 파생 내 피 네트워크와 공동 경작. 이 새로운 메서드 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs) 유도 및 내 피 네트워크와 통합의 시각화, 네트워크 속성의 정량화 및 MSC immunophenotypes 고 진 식의 평가 수 있습니다.

대동맥 반지 공동 문화 분석 결과: Mesenchymal Stromal 세포에 생체 외에서 의 신생 잠재력을 평가 하는 편리한 도구

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

the-aortic-ring-co-culture-assay-convenient-tool-to-assess-angiogenic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

10.9K 조회수.  Create Fertility Centre. 여기, 선물이 대동맥 반지 분석 결과의 새로운 응용 프로그램 prelabelled 중간 엽 세포는 쥐 대동맥 파생 내 피 네트워크와 공동 경작. 이 새로운 메서드 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs) 유도 및 내 피 네트워크와 통합의 시각화, 네트워크 속성의 정량화 및 MSC immunophenotypes 고 진 식의 평가 수 있습니다.

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Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한<em&gt; 체외</em&gt; 수초 분석

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

연구

발생학

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

상처 스크래치 분석의 최적화 가용성 담배 연기 추출물에 의한 손상 후 쥐 중간 엽 기질 세포 이동의 변화를 감지 할

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

개발<em&gt; 체외</em&gt; 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic plasticity drives invasion, dissemination and metastasis. Indeed, while most of the studies of phenotypic plasticity have been in the context of epithelial-derived carcinomas, it turns out sarcomas, which are mesenchymal in origin, also exhibit phenotypic plasticity, with a subset of sarcomas undergoing a phenomenon that resembles a mesenchymal-epithelial transition (MET). Here, we developed a method comprising the miR-200 family and grainyhead-like 2 (GRHL2) to mimic this MET-like phenomenon observed in sarcoma patient samples.We sequentially express GRHL2 and the miR-200 family using cell transduction and transfection, respectively, to better understand the molecular underpinnings of these phenotypic transitions in sarcoma cells. Sarcoma cells expressing miR-200s and GRHL2 demonstrated enhanced epithelial characteristics in cell morphology and alteration of epithelial and mesenchymal biomarkers. Future studies using these methods can be used to better understand the phenotypic consequences of MET-like processes on sarcoma cells, such as migration, invasion, metastatic propensity, and therapy resistance.

We present here a cell culture method for inducing mesenchymal-epithelial transitions (MET) in sarcoma cells based on combined ectopic expression of microRNA-200 family members and grainyhead-like 2 (GRHL2). This method is suitable for better understanding the biological impact of phenotypic plasticity on cancer aggressiveness and treatments.

육종 세포의 중간 엽 상피 전환 유도

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

연골 세포 분열 분열의 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 5-mC Dot Blot Assay<em&gt; 체외에서</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in the elderly and end-stage renal disease (ESRD) patients, who commonly suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. At present, there are no medication therapies that can stop its progression. The mechanisms that underlie this pathological process remain unclear. The aortic valve leaflet is composed of a thin layer of valve endothelial cells (VECs) on the outer surfaces of the aortic cusps, with valve interstitial cells (VICs) sandwiched between the VECs. The use of a rat model enables the in vitro study of ectopic calcification based on the in vivo physiopathological serum phosphate (Pi) and calcium (Ca) levels of patients who suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. The described protocol details the isolation of a pure rat VIC population as shown by the expression of VIC markers: alpha-smooth muscle actin (&#945;-SMA) vimentin and tissue growth factor beta (TGF&#946;) 1 and 2, and the absence of cluster of differentiation (CD) 31, a VEC marker. By expanding these VICs, biochemical, genetic, and imaging studies can be performed to study and unravel the key mediators underpinning CAVD.

This protocol describes the isolation, culture, and calcification of rat-derived valve interstitial cells, a highly physiological in vitro model of calcific aortic valve disease (CAVD). Exploitation of this rat model facilitates CAVD research in exploring the cell and molecular mechanisms that underlie this complex pathological process.

절연 및 기본 쥐의 밸브 중간 세포: 관상동맥 밸브 석 회화를 공부 하는 새로운 모델

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide suffering from corneal vision loss1. To address the demand for viable human corneas, significant progress in three-dimensional (3D) tissue engineering has been made2,3,4. These cornea models range from simple monolayer systems to multilayered models, leading to 3D full-thickness corneal equivalents2.
However, the use of a 3D tissue-engineered cornea in the context of in vitro disease models studied to date lacks resemblance to the multilayered 3D corneal tissue structure, function, and the networking of different cell types (i.e., nerve, epithelium, stroma, and endothelium)2,3. In addition, the demand for in vitro cornea tissue models has increased in an attempt to reduce animal testing for pharmaceutical products. Thus, more sophisticated models are required to better match systems to human physiological requirements, and the development of a model that is more relevant to the patient population is absolutely necessary. Given that multiple cell types in the cornea are affected by diseases and dystrophies, such as Keratoconus, Diabetic Keratopathy, and Fuchs, this model includes a 3D co-culture model of primary human corneal fibroblasts (HCFs) from healthy donors and neurons from the SH-SY5Y cell line. This allows us for the first time to investigate the interactions between the two cell types within the human corneal tissue. We believe that this model could potentially dissect the underlying mechanisms associated with the stromal-nerve interactions of corneal diseases that exhibit nerve damages. This 3D model mirrors the basic anatomical and physiological nature of the corneal tissue in vivo and can be used in the future as a tool for investigating corneal defects as well as screening the efficacy of various agents before animal testing.

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

This protocol describes a novel three-dimensional in vitro model, where corneal stromal cells and differentiated neuronal cells are cultured together to assist in the examination and understanding of the interactions of the two cell types.

각 막 조직 공학:는 생체 외에서 의 모델 인간 각 막의 실질 신경 상호 작용

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

생체 외에서 Decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...