저자는 연구원의 EEA Grant NILS 과학 및 지속 가능성 조정 이동성 (참조 번호 : 017-ABEL-CM-2013)에 감사드립니다. CB 및 GP-M. 스페인 경제 및 경쟁력 부문 (AGL2015-70487-P)의 지원을 받았다. OCOU와 DBD는 노르웨이 생명 과학 대학 (NMBU)의 식품 과학 연구를위한 전략적 장학금 프로그램 (프로젝트 1205051025)에 의해 지원되었습니다. 우리는 동물 보호 및 샘플링에 대한 그녀의 도움으로 Inmaculada Noguera와 동물 시설에서 실험실 재료의 사용 가능성을 보장하는 데 도움을 준 Jesus Dehesa에게도 감사드립니다. 우리는 또한 통계에 관한 조언을 해주신 Lars-Gustav Snipen 교수님 께 감사드립니다.

관리 및 취급은 특수 동물 보호 장비에서 수행해야합니다. 여기에 설명 된 절차는 유럽 연합법 및 2010 / 63 / EU 및 스페인 정부의 동물 보호법 53/2013에 따라 의무화 된 실험실 동물 관리 원칙에 따라 발렌시아 대학 및 해당 지방 당국의 해당 윤리위원회의 승인을 받았습니다 동물 실험 (대체, 축소, 정제)에서 3R 원칙을 존중하기 위해 과학적 목적으로 사용됩니다. 1. 쥐를 접종하기 위해 사용되는 냉동 세균 배양액 <ol><li> 30 mL에서 뇌 - 심장 주입 (BHI) 배지 5 mL에 LAB의 개별 변종을 접종하고 20 - 24 시간 동안 성장시킨다. </li><li> BHI 200 ML에 야간 문화 2 ML을 전송하여 BHI에서 각 밤새 박테리아 문화를 100 배 희석. 30 - C에서 20 - 24 시간 동안 성장시킵니다. 참고 :이 연구에서 사용 된 균주는 표 1에 나와 있습니다. </li><li> 추수 감사절4 ℃에서 20 분 동안 5,000 xg에서 원심 분리하여 lls. </li><li> 뜨는을 제거하고 얼음 찬 인산 버퍼 식염수 (PBS) 100 ML에 각 세포 펠렛을 일시 중지하고 1.3 단계에서와 같은 세포를 수집하여 세포를 두 번 씻으십시오. </li><li> 두 번째 세척 후, PBS에서 얼음으로 차가운 15 % 글리세롤 20 ML에 각 세포 펠렛을 중단하십시오. </li><li> 튜브에서 1mL 부피로 세포 현탁액을 나누어 준 다음 사용할 때까지 -80 ° C에 보관하십시오. 참고 :이 시점 이후 1-2 개월 이내에 세포를 사용해야합니다. </li><li> 저장 전과 투여 전 세포 수를 결정하여 마우스에 주어진 생존 세포의 수를 알 수 있도록하십시오. <ol><li> 세포 계수를 위해 얼음처럼 차가운 0.9 % 염화나트륨 (NaCl) 용액에서 세포를 10 배 연속 희석하십시오. BHI 한천 플레이트에 각 희석액 100 μL를 퍼뜨립니다. 식민지 형성 단위 (cfu) / ML을 결정하는 후자의 세포 성장과 식민지 형성 30 ° C에서 하룻밤 (20-24 시간) 품어. </li></ol></li><li> 박테리아가 함유 된 음용수를 만들려면 100 mL의 멸균되고 걸러진 식수에 각각의 세균성 스톡 배양 배지의 세포를 희석하고 최종 평균 cfu는 10 9 / mL입니다. 박테리아 생존 평가를 위해 희석 직후와 박테리아 치료의 첫 2 주 동안 24 시간 후 일주일에 한 번씩 생균을 계산합니다. </li></ol> 2. 마우스 분석 및 실험 설계 참고 :이 실험에는 특정 병원체가없는 (SPF) BALB / c 암컷 쥐 (6 ~ 8 주)가 필요합니다. 여기에 총 100 마리의 동물을 구입했습니다. <ol><li> 실험을 통해 쥐에게 먹이와 물을 자유롭게 섭취하십시오. </li><li> 실험을 설계하고 힘을 계산하십시오. <ol><li> 각 치료가 자체적으로 통제 할 수있는 경우, 쌍으로 된 환자 - 대조 디자인 (t-test)을 적용하십시오. 예비 분석을 사용하여 결정할 가장 중요한 효과의 평균 및 표준 오차를 계산하십시오. </li&gt; <li> 분석의 능력과 다른 방법 자유롭게 사용 가능한 프로그램 (11)를 사용하여 그룹별로 필요한 동물의 수를 최적화 할 수 있습니다. </li><li> 박테리오신 생산자 대 비 생산 균주의 영향을 시험하기 위해서는 실험 조건 당 9 마리의 동물을 사용하십시오. 참고 :이 수치는 실험 표준 오차를 기준으로 결정되었으며 만족할만한 힘 (0.7 - 1.0)과 0.05 이하의 유의 수준을 나타냅니다. 참고 : 주어진 예제에서 11 그룹의 쥐가 케이지 당 하나씩 만들어졌습니다. 10 개의 케이지는 5 개의 바테 이오 신 생산 균주 및 상응하는 5 개의 동종 원성 생산 균주에 의한 처리에 상응 하였다; 11 번째 우리는 10 마리의 마우스를 가지며 치료되지 않은 대조군을 구성 하였다. </li></ol></li><li> 축산 시설에 쥐가 도착한 후에, 쥐를 가두리에 넣고 귀를 기울여 동물에게 개별 추적을 허용하십시오. p 이전에 일주일 동안 축산 시설 및 조건에 생쥐를 순응시킨다.우회. </li><li> 단계 1.8에서 설명한 바와 같이 박테리아 함유 식수를 준비하고 각 케이지의 마우스가 동일한 물병을 공유하도록 명확하게 식별되는 해당 독립 케이지에 음용수 병을 놓습니다. 참고 : 대조군은 시험 된 박테리아와 접촉하지 않고 별도의 케이지에 보관해야합니다. </li><li> 신선한 물 (100 mL)로 매일 새 병을 준비하고 해동 된 세균 현탁액을 새로 첨가하십시오. 이것을 15 일 연속으로하십시오. </li><li> 생쥐가 박테리아가없는 물 ( 그림 1 )을 마시는 시간 동안 2 주간 세균 치료를 따르십시오. </li></ol> 3. 샘플 채취 <ol><li> 대변 ​​샘플을 수집하십시오. <ol><li> 고압 멸균 케이지 (비어 있음)와 멸균 포 셉를 준비하고 각 마우스에 대해 멸균 1.5 ML 튜브를 라벨. </li><li> 일 동안 같은 시간에 샘플을 수집하여 미생물 생산의 변화를 피하십시오.하루의 과정. 최적의 결과를 얻으려면 신선한 샘플을 별도로 수집하십시오. 참고 : 마우스가 자발적으로 배설되는 경향이있는 아침 일찍 대변을 수집하는 것이 좋습니다. </li><li> 70 % 알코올로 빈장을 청소하고 안에 마우스를 넣으십시오. 그것을 똥을 허용하고, 1.5 ML 튜브에 배치 멸균 포 셉를 사용하여 2 - 4 배설물 알약을 수집합니다. 참고 : 때로는 마우스 꼬리를 위쪽으로 유지하는 것으로 충분합니다. 그러면 대변을 항문에서 튜브로 직접 수집 할 수 있습니다. </li><li> 4 주간의 실험 기간 동안 일주일에 한 번 각 마우스에서 대변 샘플을 수집하십시오 ( 그림 1 ). 박테리아에 마우스가 노출되기 바로 전에 첫 번째 샘플 (T0, 시간 0)을 수집하십시오. 7 일, 14 일, 21 일 및 28 일에 다음과 같은 찌끼 샘플을 수집하십시오. </li><li> 4 ℃에서 시료를 냉장 보관하여 실험실로 옮겨 -80 ° C에서 얼게하십시오. 사전 계획을 세우고 충분한 수납 상자를 제공하십시오.cal 샘플은 실험 중에 수집됩니다. </li></ol></li><li> 배설물 수집 일에 매주 모든 마우스를 체중 측정하십시오. </li><li> 15 일째에 모든 생쥐 안면 정맥, 박테리아 투여 최종일에서 혈액 샘플을 수집하고, 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, 고밀도 지질 단백질 (HDL), 저밀도 지단백질 (LDL)의 레벨을 결정할 혈청. 참고 : 숙련 된 인원은 동물의 스트레스를 줄이기 위해 혈액을 수집해야합니다. </li></ol> 4. LAB 계산 및 박테리오신 활동 <ol><li> 1.5 mL 튜브에 각 시료의 배설 펠렛 1 개를 넣고 10 % (w / v) 용액을 얻기 위해 충분한 양의 얼음처럼 차가운 0.9 % NaCl을 넣는다. 배설물 현탁액을 균질화하고 얼음처럼 차가운 0.9 % NaCl에서 10 배 시리얼 희석액을 준비 1.5 ML 튜브에 멸균 micropestles를 사용하십시오. </li><li> LAB 셀의 총 수를 센다. <ol><li> prewarmed 엄마 4 ML에 희석 세포 (100 μL)를 전송n Rogosa Sharpe (MRS) 연질 한천 (50 ° C, 0.8 % 한천). 고체 MRS 한천 플레이트 (1.5 % 한천)에 세포를 부어하기 전에 vortexing하여 섞는다. </li><li> 멸균 후드에서 뚜껑을 5 ~ 10 분 동안 꺼내어 30 ~ 24 시간 동안 세포를 배양 한 후 세포 성장과 콜로니 형성을 위해 플레이트를 건조시킵니다. </li></ol></li><li> 세균성 세포를 세어보세요. <ol><li> 박테리오신 생산자의 희석 세포 (100 μL)를 미리 데워진 MRS 연질 한천 (50 ° C, 0.8 % 한천) 4 mL에 옮기고 볼 텍싱하여 혼합 한 다음 MRS 한천 플레이트 (1.5 % 한천)에 세포를 부어 넣는다. 이 레이어를 첫 번째 레이어라고합니다. </li><li> 부드러운 한천에 모든 세포를 포함하는 첫 번째 레이어에 무 세포 MRS 부드러운 한천 (0.8 % 한천)의 다른 4 ML을 전송하십시오. 참고 :이 층은 세포가 한천 플레이트 표면에 식민지로 자라는 것을 방지하기위한 것입니다. 지표 세포가 표면에 쏟아 질 때 표면에서 성장하는 세포는 쉽게 옮겨집니다 (단계 4.3.4).따라서 결과의 해석이 복잡해집니다. 이 레이어를 두 번째 레이어라고합니다. </li><li> 멸균 후드에서 뚜껑을 5 ~ 10 분 동안 꺼내어 30 ~ 20 시간 동안 배양 한 다음 세포 성장과 콜로니 형성을 위해 배양하십시오. </li><li> 박테리오신 생성 콜로니를 확인하려면 표 1에 나와있는대로 적절한 지표 균주의 하룻밤 배양액 40 μL를 미리 데운 연질 한천 4 mL와 혼합합니다. 혼합물을 판에 붓는다. 이 레이어를 제 3 레이어라고합니다. </li><li> 멸균 후드에서 뚜껑을 5 ~ 10 분 동안 꺼내어 30 ~ 20 시간 동안 배양 한 다음 세포 성장과 콜로니 형성을 위해 배양하십시오. 참고 : Bacteriocin 생성 콜로니는 콜로니 주위에 명확한 (억제) 영역을 가지고 있습니다 ( 그림 2 ). </li></ol></li></ol> 5. DNA 추출, 16S rDNA 증폭 및 시퀀싱 참고 : f 단계또는 DNA 추출은 상업용 키트 ( 예 : Realpure &quot;SSS&quot;Kit)의 사용에 대해 설명합니다. <ol><li> 1 - 2 배설물 마우스 쥐똥 (~ 200 MG) 300 μL의 용해 솔루션에 일시 중지합니다. </li><li> 샘플을 유리 구슬 (직경 0.1mm) 0.5g을 넣은 2mL 마이크로 튜브에 옮긴다. </li><li> 10 U / μL에서 mutanolysin 1 μL와 40에서 60 분 동안 37 ° C에서 각 시료에 20 mg / mL의 리소자임 2 μL를 첨가한다. 대변 ​​샘플에서 DNA 추출을위한 표준 프로토콜 중 하나를 계속 수행하십시오 12 . </li><li> 두 사이클의 비드 - 비터 스텝을 1 분씩가하십시오. </li><li> proteinase K 2 μL를 첨가하고 완전히 혼합합니다. </li><li> 5 분마다 20 분 및 와동 동안 품어 낸다. </li><li> 샘플을 37 ° C로 식힌 다음 5 μg / mL RNase A 1 μL를 샘플에 첨가하십시오. 철저히 섞는다. </li><li> 37에서 품어 ° C 30-60 분. </li><li> 샘플을 실온으로 냉각시키고 180 μL단백질 침전 용액 20 ~ 30 초 동안 최대 속도로 활발하게 소용돌이 치게하십시오. </li><li> 5 분 동안 16,000 xg에서 원심 분리하십시오. 뜨는에 떠 다니는 입자가있는 경우, 얼음에서 5 분간 배양 한 다음 다시 원심 분리하십시오. </li><li> 이소프로판올 300 μL를 포함하는 새로운 1.5 ML microtube에 DNA를 포함하는 뜨는을 전송하십시오. </li><li> 20-30 번 튜브를 거꾸로하여 혼합하고 -20 ° C에서 1 시간 동안 품어 라. 또는 튜브를 더 오랜 기간 동안 배양하십시오 ( 예 : 밤새). </li><li> 2 분 동안 16,000 xg에서 원심 분리하십시오. </li><li> 뜨는을 제거하고 흡수 종이에 튜브를 말리십시오. DNA 펠렛을 씻어 70 % 에탄올 300 μL를 추가합니다. </li><li> 16,000 XG에서 1 분간 원심 분리하고 상층 액을 제거한 후 약 15 분 동안 펠렛을 건조 상태로 두십시오. </li><li> 펠렛이 건조되면 멸균 물 또는 트리스 (10 MM) / EDTA (1 MM) 버퍼 100 μL를 추가하고 펠렛을 resuspend. </li><li> 가능한 억제를 없애기 위해후속 단계에서 화합물을 제거하고 DNA를 세척하십시오. 추출 된 DNA를 2 배 용량 (200 μL)의 완충액 NTI와 섞어서 단계 5.15의 결합 조건을 조정합니다. </li><li> PCR 클린업 컬럼이 들어있는 실리카 멤브레인을 수집 튜브 (2 mL)에 넣고 샘플을 채 웁니다. </li><li> 11,000 x g에서 30 초 동안 원심 분리하십시오. 플로우 스루를 폐기하십시오. </li><li> 완충액 NT3 700 μL로 실리카 막을 씻고 5.16 단계를 반복하십시오. </li><li> 11,000 xg에서 1 분간 원심 분리하여 실리카 멤브레인을 건조시켜 잔류 에탄올 함유 세척 완충액 NT3를 제거합니다. </li><li> 컬럼을 새로운 1.5-mL microtube로 옮기고 70 ℃에서 2 - 5 분 ​​동안 배양하여 에탄올을 완전히 제거합니다. </li><li> PCR 등급의 물 30 μL를 추가하고 70 ° C에서 5 분 동안 품어 라. 11,000 x g에서 1 분간 원심 분리하여 용출시킨다. </li><li> UV / Vis 분광 광도계 또는 형광 측정법을 사용하여 DNA를 정량하십시오. </li><li> 같은 케이지를 공유하는 마우스의 DNA 샘플을 표준화하고 풀링하십시오.<html> ch 시점. </li><li> 시간 동안의 개별 변이를 관찰하기 위해 0 일, 14 일 및 28 일에 무작위로 선택된 3 마리의 생쥐의 DNA 샘플과 다른 2 마리의 무작위 케이지를 시퀀싱합니다. </li></ol> 6. 16S rRNA 유전자 증폭 및 시퀀싱 <ol><li> 증폭 된 16S rRNA 유전자의 라이브러리를 준비하십시오. 적절한 오버행 아답터가있는 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 박테리아 16S rRNA 유전자 5 의 V3-V4 영역을 증폭시킵니다. 5&#39;-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3 &#39; 5&#39;-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 &#39; </li><li> 1 % 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 증폭 된 밴드를 확인하십시오. </li><li> amplicon 정화를위한 자기 구슬을 사용하여 폴리 메라 이제 연쇄 반응 (PCR) 제품을 청소하십시오. </li><li> 사용 된 방대한 시퀀싱 플랫폼에 따라 제조업체가 지시 한대로 다음 단계를 진행합니다&gt; 6. </li></ol> 7. 데이터 분석 및 통계 <ol><li> 품질 필터링 (일반적으로 시퀀싱 시설에서 수행됨). <ol><li> 장비와 함께 제공된 소프트웨어를 사용하여 원시 읽기 데이터와 역 다중화를 필터링합니다. </li><li> USEARCH 14 (버전 7.0.1090)에서 구현 된 UPARSE 파이프 라인 13을 사용하여 쌍방향 읽기를 처리합니다. 쌍 끝을 병합하고 최대 예상 오류 (최대) 값 1.0을 사용하여 품질 필터링을 적용합니다. 150nt 미만의 서열을 폐기하십시오. 싱글 톤을 삭제하는 시퀀스를 삭제합니다. </li><li> 97 %의 서열 동일성을 갖는 작 동 분류 단위 (operational taxonomic units, OTU)로 서열을 분류하고, UCHIME 15 를 사용하여 키메라 서열을 여과한다. </li></ol></li><li> OTU 따기, 분류 학적 지정 및 계통 발생 재구성, 다양성 분석 및 시각화. <ol><li> 정량적 통찰력을 사용하여 OTU 처리 Into 미생물 생태학 (QIIME) 16 . </li><li> 최소 신원이 75 % (기본값) 인 PyNAST 18 을 사용하여 Greengenes 코어 세트 데이터베이스 17 에 대해 대표적인 OTU를 선택하고 정렬하십시오. </li><li> 0.8의 신뢰도로 Ribosomal Database Project (RDP) 분류 자 ​​프로그램 19 를 사용하여 정렬 된 서열에 택 소노 미를 할당하십시오. </li><li> OTU 테이블을 시퀀스 깊이가 가장 낮은 샘플의 시퀀스 카운트로 정규화하십시오. </li><li> 모든 변이가 매우 가변적 인 위치와 위치를 제거하기 위해 여과 단계 후에 Fast Tree 20 을 사용하여 정렬 된 서열로부터 계통수를 구축하십시오. 이 트리를 사용하여 알파 및 베타 다양성을 계산하고 희귀 곡선 및 샤논 인덱스를 계산합니다. </li><li> 비 중량 UniFrac 거리 측정법 21 을 생성하고 시각화하려면 주 좌표 분석 (PCoA)을 사용하십시오. 참고 : s통계 분석을 사용하면 R 22 나 QIIME 16 내에 구현 된 통계 도구와 같은 다른 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있습니다. </li><li> 서로 다른 치료법 사이의 다양성에 대한 Shannon 지수의 비교를 위해 R을 연속 종속 변수로 고려한 ANCOVA를 사용하십시오. </li><li> QIIME의 PCoA에서 치료 간의 거리를 양면 Student &#39;s t-test를 사용하여 비교하고 Bonferroni 보정을 사용하여 1,000 몬테카를로 순열로 비모수적인 p 값을 계산합니다. </li><li> 피어슨 상관 분석을 사용하여 특정 OTU의 상대적 존재 량과 콜레스테롤, HDL, LDL 등 의 혈청 수준과 같은 기타 측정 매개 변수 간의 상관 관계를 분석합니다. 이를 위해 CoNet 23 을 Cytoscape 3.1.1 24를 사용한 상관 관계 네트워크의 후속 시각화와 함께 사용하십시오. </li></ol></li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculture+with+specific+bacteria+enhances+survival+of+Lactobacillus+plantarum+NC8,+an+autoinducer-regulated+bacteriocin+producer,+in+olive+fermentations.">Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations.</a> Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).</li><li>Drider, D., Fimland, G., H&#233;chard, Y., McMullen, L. M., Pr&#233;vost, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Continuing+Story+of+Class+IIa+Bacteriocins.">The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins.</a> Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).</li><li>Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., Tan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bacteriocin+with+a+broad+inhibitory+spectrum+produced+by+Lactobacillus+sake+C2,+isolated+from+traditional+Chinese+fermented+cabbage.">A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage.</a> Food Control. 21 (1), 76-81 (2010).</li></ol>

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여기에 설명 된 절차는 미생물 군에서의 변화가 건강 또는 나이와 연관되어 있는지를 결정하는 데 사용되었습니다. 프로토콜의 다른 부분은 중요하지만, 그 중에서도 대변 샘플링, 시퀀싱 및 분석 할 DNA 단편의 선택, DNA 추출 및 생물 정보 분석의 수행이 가장 중요한 포인트 일 수 있습니다. 윤리적 이유로 마우스에 스트레스를주지 말아야하고 내장에서 박테리아의 비율을 변화시키는 것으로 알려져 있기 때문에 샘플링은 중요합니다. 가능한 한 빨리 샘플을 처리해야하며, 일부 박테리아는 탈수 및 / 또는 산소에 매우 민감하므로 사용하기 전에는 얼려 야합니다. 증폭 된 16S rRNA 유전자로부터 서열 화 될 DNA 단편의 선택은 중요한 포인트이다. 이 작품에서 변수 지역 V3 - V4 (25)을 선택했다. DNA 추출법의 중요성은 과소 평가되어서는 안된다. 왜냐하면 표본에 존재하는 박테리아 세포가 모두 동일하지 않기 때문이다여러 가지 용해 프로토콜에 민감 할 수 있으며 박테리아 집단 추정에 편향은 불완전한 용해로 인한 결과 일 수 있습니다. 따라서 비드 비터 단계가 필요합니다. 균주의 경우 형질 전환 염색체로 코드화 된 박테리오신에 내성이 문제가 될 수도 있지만, 유전성 균주는 유전 적 넉다운 또는 플라스미드 큐 레이션에 의해 구축 될 수있다. 이 절차는 혐기성 방법과 같은 다른 특정 배양 기술을 사용하여 적용 할 수 있습니다 26 . 이 절차는 연구 할 요인 변경의 유형에 따라 대부분의 단계에서 수정할 수 있습니다. 예방 접종 절차는 단축 될 수 있지만 혈청 매개 변수의 변화에는 개발에 약간의 시간이 필요할 수 있습니다. 이 방법의 가능한 한계는 수 시간 동안 생존하지 못하거나 응집 될 수있는 (또는 화합물에 대해 침전되는) 박테리아 균주 (영양물 또는 화합물)에 대한 연구 일 수 있습니다. 따라서 이것은 반드시해야하는 요소입니다.<html> 고려해야합니다. 지금까지 박테리오신 활성은 일반적으로 시험관 27 , 28 , 29 또는 혼합 배양 30 에서 결정 되었다 . 이 방법은 표준 실험용 쥐의 전체 내장균에서 5 종의 박테리오신의 활성을 생체 내에서 모니터링 할 수있게 해줍니다. 집단의 작은 변화뿐만 아니라 혈청 매개 변수와 같은 다른 세균 그룹 또는 생리적 요인에 대한 영향을 결정할 수 있습니다 12 . 박테리오신은 상대적으로 좁은 활성 스펙트럼을 가지며 분류 학적으로 관련된 박테리아의 성장을 억제한다. 그러나,이 분석에서 사용 된 것들 중 가장 효과적 인 것들은 사카신 A의 경우에서와 같이 Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes 31 및 심지어 Escherichia coli 의 일부 균주에 대해 활성 인 것들이 있습니다ass = &quot;xref&quot;&gt; 32. 생쥐에 접종했을 때, 박테리오신을 생산하는 LAB는 지구상의 미생물 군 구성에 현저한 변화를 일으키지 않았으며 박테리아 군의 감소 된 수를 나타냈다. 그럼에도 불구하고 전지구 적 상관 관계 네트워크 분석은 흥미로운 생태 학적 적합성과 다른 박테리아 사이의 적대감을 나타냈다. 이 방법은 건강 상태를 보존하기 위해 의도 된 결과가 의도적으로 제한 될 수 있지만 식품 성분, 약물 또는 기타 화합물의 영향을 분석하기 위해 적용될 수 있습니다.

박테리오신은 박테리아 (1, 2) 다양한 제조 항균 펩타이드이다. 이들 화합물과 생산자, 특히 LAB은, 탐구 및 식품 보존 및 의학 3에서의 응용 가능성에 대한 수십 년 동안 전 세계적으로 이용되고있다. Lactia, Enterococcus, Staphylococcus 및 Bacillus의 종을 포함하여 여러 가지 박테리오신이 중요한 병원균을 죽이는 것으로 알려져 있습니다. 일부 박테리오신은 면역 반응을 조절할 능력조차 가지고 있습니다 4 . 많은 박테리오신은 상대적으로 좁은 스펙트럼을 가지고 있는데, 이는 일부 응용 분야에서 크게 인정 받고 있습니다. 예를 들어, 일부 좁은 스펙트럼의 박테리오신은 동일한 틈새를 공유하는 공생 또는 유익한 식물상에 많은 방해없이 문제가되는 박테리아의 선택된 그룹에 대해 특정 활성을 지시하는 데 사용될 수 있습니다. 이것은 특히 내장 환경에서 필수적입니다.많은 유익한 미생물이 상호 작용하는 역동적 인 방식으로 5에서 성공 onment. 박테리오신은 또한 병원균, 병원균, 또는 장의 항상성을 불균형하게하는 기회 성 박테리아의 성장을 억제 할 수 있기 때문에 예방 또는 프로 바이오 틱 용도로 매우 유용합니다 6 , 7 . 그들의 성질과 물리 화학적 성질의 관점에서, 박테리오신은 구조, 표적 특이성, 작용 방식 등 이 매우 다양하기 때문에 매우 다양하다 . 대부분의 박테리오신은 시험 관내 환경에서 매우 상세하게 연구되었지만, 식품에서는 거의 시험되지 않았다 매트릭스 8 , 9 또는 생체 내에서, 예를 들어 동물 내장 6 , 10 . 시험 관내 특성은 생체 내 에서 복잡성 때문에 평가할 때 크게 다를 수 있습니다.장내 환경 및 유익한 박테리아에 대한 의도하지 않은 영향을 추정 할 수있다. 대부분의 probiotics는 LAB입니다. 그들은 호스트의 생리학에 영향을 미치는 것으로 알려진 단쇄 지방산을 비롯하여 특정 박테리아에 대한 항균성을 입증하기 위해 다양한 대사 산물을 생산합니다. 그러므로 박테리오신을 생성하는 프로 바이오 틱 균주의 경우 정상적인 미생물을 가진 건강한 동물과 같은 현실적인 분석법을 수립하는 것이 가장 좋습니다. 현재 연구에서, 우리는 건강한 마우스에 박테리오신이 다른 억제 스펙트럼을 갖는 다른 박테리오신 생산 균주의 효과를 평가할 수있는 전략을 제공한다. 우리의 전략은 비생산성 매개 효과로부터의 박테리오신 매개 효과의 분화를 가능하게하는 동위 원소 비 박테리오 신 돌연변이 체로 마우스를 먹이는 것을 포함한다. Sequencing 16S rDNA는 내장에서 박테리아 개체수의 동적 인 변화를 추적 할 수있게합니다. 하위등가 통계 분석은 박테리아 종과 박테리아 종과 측정 된 생리적 매개 변수 ( 예 : 체중, 혈청 생화학 매개 변수 등 ) 간의 상관 관계를 해독합니다. 우리는이 연구에서 제시된 프로토콜이 살아있는 동물의 박테리오신 연구 이외의 다른 프로 바이오 틱 또는 프리 바이오 틱 적용에도 적용 가능하다고 믿습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="826">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Balb/c mice (female)</td>
			<td style="width:141px;">Harlan</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:287px;">Mice should be 6 - 8 weeks of age</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic Petri dish</td>
			<td style="width:141px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brain-Heart-Infusion broth</td>
			<td style="width:141px;">Conda</td>
			<td style="width:183px;">1400.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">European Bacteriological Agar</td>
			<td style="width:141px;">Pronadisa</td>
			<td style="width:183px;">1800.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose D1 Low EEO</td>
			<td style="width:141px;">Pronadisa</td>
			<td style="width:183px;">8010.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1XTAE buffer</td>
			<td style="width:141px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">15558042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MRS broth</td>
			<td style="width:141px;">Difco</td>
			<td style="width:183px;">288130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS tablets</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:183px;">P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">scale</td>
			<td style="width:141px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:183px;">PB602-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sterile forceps</td>
			<td style="width:141px;">Levantina de Laboratorios S.L.</td>
			<td style="width:183px;">260-3710014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:141px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:183px;">5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:141px;">Hermle</td>
			<td style="width:183px;">Z383K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:141px;">AppliChem Panreac</td>
			<td style="width:183px;">121659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Realpure SSS Kit</td>
			<td style="width:141px;">Real Life Science Solutions, Durviz, Spain</td>
			<td style="width:183px;">RBME04 (300 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:141px;">AppliChem Panreac</td>
			<td style="width:183px;">131090.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:141px;">AppliChem Panreac</td>
			<td style="width:183px;">131086.1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit fluorometer</td>
			<td style="width:141px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:141px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:183px;">Q32851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AMPure XP beads</td>
			<td style="width:141px;">Beckman Coulter Genomics, USA</td>
			<td style="width:183px;">A63881 (60 ml)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PerfeCta NGS library quantification kit</td>
			<td style="width:141px;">Quanta BioSciences, Maryland, USA</td>
			<td style="width:183px;">733-2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MiSeq v3 reagent kit</td>
			<td style="width:141px;">Illumina, San Diego, California, USA</td>
			<td style="width:183px;">MS-102-3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Primers for 16S rRNA gene amplification</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:287px;">Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5&#8217;-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3&#8217; and 5&#39;-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nextera XT Index kit</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:183px;">FC-131-1002</td>
			<td>Indices and Illumina sequencing adaptors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropestle for 1.5 ml tubes, Eppendorf / Sigma , Ref.</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:183px;">Z317314-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass beads, 0.1 mm diameter</td>
			<td style="width:141px;">Biospec Products</td>
			<td style="width:183px;">11079-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td>
			<td style="width:141px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:183px;">740609.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Omni Bead Ruptor 24</td>
			<td style="width:141px;">Omni International Inc.</td>
			<td style="width:183px;">19-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mutanolysin</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:183px;">M9901-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">lysozyme</td>
			<td style="width:141px;">Roche</td>
			<td style="width:183px;">10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">proteinase K</td>
			<td style="width:141px;">Roche</td>
			<td style="width:183px;">3115887001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase A</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:183px;">R4875</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to assess bacteriocin effects on the gut microbiota of mice

매우 흥미로운 질문은 소화관 미생물 군의 구성과 건강과의 관계, 특히 인구 균형 유지에 기여하는 요인과 관련된 우리의 발전 지식에 의해 발생한다. 그러나 이러한 요소를 평가할 수있는 방법은 제한되어 있습니다. 박테리오신은 많은 박테리아에 의해 생산되는 항균 펩타이드로서 식품 획득 및 / 또는 틈새 설립에 경쟁 우위를 제공 할 수 있습니다. 많은 프로 바이오 틱 젖산균 (LAB) 균주는 병원균의 번식을 막음으로써 인간 및 동물의 건강을 증진 할 수있는 큰 가능성을 가지고 있습니다. 그들은 박테리오신을 생산하기 때문에 면역 조절에도 사용할 수 있습니다. 그러나 박테리오신의 길항 작용은 일반적으로 박테리아가 숙주와 수백 가지의 미생물 종으로부터 다기능 영향을받는 인간과 동물의 복잡한 내장 환경에 비해 잘 정의되었지만 단순화 된 조건 하에서 실험실 생물학적 검사에 의해 결정됩니다같은 틈새 시장을 노리고있다. 이 연구는 효과를 평가할 수있는 완전하고 효율적인 절차를 설명합니다 뮤린 시스템에서 다양한 표적 특이성을 갖는 다양한 박테리오신의 연구가 진행되고있다. 박테리오신 치료 동안 미생물 구성의 변화는 조성 16S rDNA 시퀀싱을 사용하여 모니터링된다. 우리의 접근법은 박테리오신 생산자와 균체 동성 비 박테리오 신 생성 돌연변이 체 모두를 사용하는데, 후자는 박테리오신 관련이 아닌 박테리오 신 관련 변형과 박테리오 신의 변형을 구분할 수있는 능력을 부여한다. 분변 DNA 추출 및 16S rDNA 시퀀싱 방법은 일관되고 생물 정보학과 함께 박테리아 프로파일의 희미한 변화를 발견하고 콜레스테롤 및 트리글리세리드 농도면에서 세균 집단과 건강 지표 사이의 상관 관계를 확립하는 강력한 절차를 구성합니다. 우리의 프로토콜은 일반적이므로 호스트 마이크를 변경할 가능성이있는 다른 화합물이나 영양소를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.독성 또는 유익한 효과를 연구 할 때 로비오타 조성물.

박테리오신의 생산은 기회 ​​주의적 박테리아와 병원체의 성장을 막는 것으로 가정 되었기 때문에 LAB에서 긍정적 인 probiotic 특징으로 간주되어왔다. 이 연구의 목적은 쥐 모델에서 장내 미생물 군을 조절하는 박테리오신의 능력을 보여주는 것이 었습니다. 이 목적을 위해, 박테리오신 생산 균주 및 이들의 동종 비 생산 균주의 섭취 효과를 비교하기위한 절차가 개발되었다. 접종의 절차와 분석의 시간 연장은 그림 1에 표시됩니다. 마우스를 11 개의 우리 (어떤 치료도하지 않은 대조군, 박테리오신 생산 균주로 처리 한 5 개의 계사 및 박테리오신 생산을 감소 시키거나 동반하지 않는 상응하는 동종 돌연변이 체로 처리 한 5 개의 계사)로 분류 하였다. 시험 된 박테리오신 생산 LAB 및 식수 및 대변에서의 각 카운트 (cfu / mL)는 다음에 요약되어 있습니다. <strong&gt; 표 1. 대변에서 회수 된 LAB에 의한 박테리오신 생산의 결정은 그림 2에 나와있다 . 모든 샘플과 모든 박테리아 그룹을 함께 고려한 경우 박테리오신 처리와 동종 균주 간에는 유의 한 차이가 없었다 ( 그림 3 ). 그러나 그림 4 에서 볼 수 있듯이 특정 세균성 장군을 독립적으로 연구했을 때 차이가있을 수 있습니다. 또한 Pearson의 상관 관계 분석은 세균성 장군과 트리글리 세라이드와 혈청 내 LDL의 상관 관계를 보여 주며 그림 5 에서 CoNet에 구축 된 네트워크에서 볼 수 있습니다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56053/56053fig1.jpg" /> 그림 1 : Expe의 시간 코스 디자인을 보여주는 스키마림. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56053/56053fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56053/56053fig2.jpg" /> 그림 2 : 3 단계 프로토콜에 의한 대변에서 회수 한 LAB에서의 박테리오신 생산 검출 (절차에서 설명한대로). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56053/56053fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56053/56053fig3.jpg" /> 그림 3 : 박테리아 트리 트먼트의 조성 비교. unweighted UniFrac 행렬에서 계산 된 거리를 기반으로 PCoA 플롯이 생성되었습니다. 동일한 샘플과 다른 시점 ( <strong class = &quot;xfig&quot;&gt; 그림 1)은 동일한 색을 가지며 각 색은 치료 그룹을 나타냅니다. 이 그림의 명확성을 위해 garvicin과 sakacin 생산자 및 비 생산 균주 (색상 및 처리 관련 그림에서 범례 참조) 만 네 가지 변종으로 나타납니다. 샘플 시간은 T0 (접종 전), 7d (7 일), 14d (14 일), 21d (21 일) 및 28d (28 일)로 주석 처리됩니다. 통계에 대해서는 프로 시저를 참조하십시오. Umu et al. , 2016 12 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56053/56053fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56053/56053fig4.jpg" /> 도표 4 : 처리와 처리 기간 중 속 수준에 LAB와 박테리오 신 목표로 한 박테리아 그룹의 관계되는 풍부에있는 변화. 변화s를 대조군 (CON)과 비교 하였다. 이 그림의 명확성을 위해 garvicin과 sakacin 생산자 및 비 생산 균주 (색상 및 처리 관련 그림에서 범례 참조) 만 네 가지 변종으로 나타납니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 유의도는 다음과 같이 표현된다 : 도트 (.)로 P &lt;0.1; 1 별 (*)로 P &lt;0.05; 별 2 개 (**)로 P &lt;0.01. Umu et al. , 2016 12 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56053/56053fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56053/56053fig5.jpg" /> 그림 5 : 14 일째와 혈청 수준에서의 OTU의 상대적 존재 량의 상관 관계 네트워크. 상관 관계는 caCoNet에서 Pearson 상관 관계를 사용하여 계산됩니다. 유의 한 것들만 (P &lt;0.05) 네트워크 상에 나타납니다. 혈청 총 콜레스테롤 ( Chol ), 고밀도 지단백질 ( HDL ), 저밀도 지단백질 ( LDL ), 트리글리 세라이드 ( Trig) 는 단색 (회색)으로 표시되는 반면, 다른 가족에 속한 OTU는 서로 다른 색 (범례 참조). 양의 상관 관계는 녹색 가장자리와 빨간색 가장자리와 음의 상관 관계로 표시됩니다. 노드의 OTU는 OTU 번호 또는 속한 속으로 표시됩니다. Umu 외 2016 12 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56053/56053fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td><strong&gt; 스트레인 </td><td> 식수에 접종 </td><td></td><td> 대변에 젖산균이 포함됩니다. </td><td> 지표 균주 </td></tr><tr><td></td><td> CFU / ml (log10) </td><td></td><td> CFU / g (평균 log10) </td><td></td></tr><tr><td> 제어 </td><td> ---- </td><td> 10 마리 마우스 </td><td> 노스 다코타 </td><td></td></tr><tr><td> 락토 바실러스 사 케이 B1500 (sakA +) </td><td> 1.6 </td><td> 9 마리 마우스 </td><td> 8.53 ± 0.18 </td><td> Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) </td></tr><tr><td> 락토 바실러스 사 케이 B1501 (sakA -) </td><td> 2.0 </td><td> 9 마리 마우스 </td><td> 8.22 ± 0.05 </td><td></td></tr><tr><td> Pediocccus acidilactici B1502 (페드로 +) </td><td> 26 세 </td><td> 9 마리 마우스 </td><td> 8.73 ± 0.12 </td><td> Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) </td></tr><tr><td> Pediocccus acidilactici B1503 (ped -) </td><td> 25 세 </td><td> 9 마리 마우스 </td><td> 8.75 ± 0.09 </td><td></td></tr><tr><td> Enterococcus faecium B1504 (L50 wt +) </td><td> 6 </td><td> 9 마리 마우스 </td><td> 8.83 ± 0.14 </td><td> Pediococcus damnosus (LMG 3397) </td></tr><tr><td> Enterococcus faecium B1505 (L50 경화 -) </td><td> 10 </td><td> 9 마리 마우스 </td><td> 8.72 ± 0.14 </td><td></td></tr><tr><td> 락토 바실러스 플랜 귤 ( Lactobacillus plantarum) B1507 (planta +) </td><td> 26 세 </td><td> 9 마리 마우스 </td><td> 9.14 ± 0.14 </td><td> 락토 바실러스 spp. 965 (LMG 2003) </td></tr><tr><td> 락토 바실러스 플랜 귤 ( Lactobacillus plantarum) B1508 (planta -) </td><td> 23 </td><td> 9 마리 마우스 </td><td> 8.60 ± 0.18 </td><td></td></tr><tr><td> 락토 코커스 garviae B1515 (GarML +) </td><td> 17 세 </td><td> 9 마리 마우스 </td><td> 8.41 ± 0.08 </td><td> 락토 코커스 락 티스 IL1403 (LMG2705) </em&gt; </td></tr><tr><td> 락토 코커스 garviae B1516 (GarML -) </td><td> 17 세 </td><td> 9 마리 마우스 </td><td> 8.05 ± 0.18 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Enterococcus faecium P21 (LMG 2783)은 SakA이고 PedPA-1, Pediococcus damnosus (LMG 3397)는 엔테로 신, Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003), GarML 용 락토 코커스 락 티스 IL1403 (LMG2705) 등이있다. </td></tr></tbody></table> 표 1 : 배설 된 균주 및 대변 샘플의 계수.

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A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

마우스의 장내 미생물에 대한 박테리오신 효과 평가 방법

박테리오신은 다양한 생태 학적 틈새에서 미생물 다양성을 정의하는 데 중요한 역할을한다고 여겨집니다. 여기서 우리는 박테리오신이 동물 모델에서 장내 미생물 구성에 어떻게 영향을 미치는지 평가하는 효율적인 절차를 설명합니다.

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K 조회수.  Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC).  박테리오신은 다양한 생태 학적 틈새에서 미생물 다양성을 정의하는 데 중요한 역할을한다고 여겨집니다. 여기서 우리는 박테리오신이 동물 모델에서 장내 미생물 구성에 어떻게 영향을 미치는지 평가하는 효율적인 절차를 설명합니다. 

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Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and species-rich microbial population that assists in the degradation of lignocellulose predominantly into acetate, the key nutrient fueling termite metabolism (Odelson &amp; Breznak, 1983).  Within these microbial populations are bacteria, methanogenic archaea and, in some ("lower") termites, eukaryotic protozoa. Thus, termites are excellent research subjects for studying the interactions among microbial species and the numerous biochemical functions they perform to the benefit of their host.  The species composition of microbial populations in termite guts as well as key genes involved in various biochemical processes has been explored using molecular techniques (Kudo et al., 1998; Schmit-Wagner et al., 2003; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). These techniques depend on the extraction and purification of high-quality nucleic acids from the termite gut environment.  The extraction technique described in this video is a modified compilation of protocols developed for extraction and purification of nucleic acids from environmental samples (Mor  et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) and it produces DNA from termite hindgut material suitable for use as template for polymerase chain reaction (PCR).

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

This video illustrates the technique for extracting DNA from the species of microbes resident in the termite hindgut. The preparation of a wet mount slide, which is useful for visualizing the gut microbial community is also illustrated, and a tour through the species-rich gut environment is given.

마이트의 굿 미생물 (Zootermopsis Angusticollis)에서 DNA를 추출하고 굿 미생물을 떠올리

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

연구

생물학

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

에서 Hypoxia의 효과를 연구하기 위해 정의된 기체 환경 만들기<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

파장과 산화 스트레스에 레드 / 근적외선 치료의 강렬의 범위의 효과의 평가를위한 방법<em&gt; 체외</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

세포 외 산 생산의 측정 및 분석은 당분 속도를 확인하는

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. However, similar to other antibody-based protein assays, optimization of capillary-based immunoassay parameters, such as protein concentration, antibody dilution, and exposure time is an important prerequisite to the generation of meaningful and reliable data. Measurements must fall within the linear range of the assay where changes in signal are directly proportional to changes in lysate concentration. The process of choosing appropriate lysate concentrations, antibody dilutions, and exposure times in the human bronchial epithelial cell line, BEAS-2B, is demonstrated here. Assay linearity is shown over a range of whole cell extract protein concentrations with p53 and &#945;-tubulin antibodies. An example of signal burnout is seen at the highest concentrations with long exposure times, and an &#945;-tubulin antibody dilution curve is shown demonstrating saturation. In addition, example experimental results are reported for doxorubicin-treated cells using optimized parameters.

A capillary-based immunoassay using a commercial platform to measure target proteins from total protein preparations is demonstrated. In addition, assay parameters of exposure time, protein concentration, and antibody dilution are optimized for a cell culture model system.

절차 및 자동화 된 모 세관 전기 이동 기반 Immunoassay 방법에 대 한 중요 한 최적화 전략

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract metabolic abnormalities. So far, different types of IF models with varying durations of fasting and feeding periods have been documented. However, interpreting the outcomes is challenging, as many of these models involve multifactorial contributions from both time- and calorie-restriction strategies. For example, the alternate day fasting model, often used as a rodent IF regimen, can result in underfeeding, suggesting that health benefits from this intervention are likely mediated via both caloric restriction and fasting-refeeding cycles. Recently, it has been successfully demonstrated that 2:1 IF, comprising 1 day of fasting followed by 2 days of feeding, can provide protection against diet-induced obesity and metabolic improvements without a reduction in overall caloric intake. Presented here is a protocol of this isocaloric 2:1 IF intervention in mice. Also described is a pair-feeding (PF) protocol required to examine a mouse model with altered eating behaviors, such as hyperphagia. Using the 2:1 IF regimen, it is demonstrated that isocaloric IF leads to reduced body weight gain, improved glucose homeostasis, and elevated energy expenditure. Thus, this regimen may be useful to investigate the health impacts of IF on various disease conditions.

The current article describes a detailed protocol for isocaloric 2:1 intermittent fasting to protect and treat against obesity and impaired glucose metabolism in wild-type and ob/ob mice.

쥐에서 등칼로리 2:1 간헐적 단식의 대사 효과의 평가

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...

Divergence of Root Microbiota in Different Habitats based on Weighted Correlation Networks

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, which can effectively explore the interaction relationship or co-occurrence model of different microbial species in different environments. The purpose of this manuscript is to provide details on how to use the weighted correlation network algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in microbial communities due to different ecological environments. All analysis of the experiment is performed in the WGCNA package. WGCNA is an R package for weighted correlation network analysis. The experimental data used to demonstrate these methods were microbial community data from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database for three niches of the rice (Oryza sativa) root system. We used the weighted correlation network algorithm to construct co-abundance networks of microbial community in each of the three niches. Then, differential co-abundance networks among endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil were identified. In addition, the core genera in network were obtained by the "WGCNA" package, which plays an important regulated role in network functions. These methods enable researchers to analyze the response of microbial network to environmental disturbance and verify different microbial ecological response theories. The results of these methods show that the significant differential microbial networks identified in the endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil of rice.

Network analysis was applied to evaluate the association of various ecological microbial communities, such as soil, water and rhizosphere. Presented here is a protocol on how to use the WGCNA algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in the microbial communities due to different ecological environments.

가중 상관 관계 네트워크에 따라 다른 서식지에서 루트 미생물의 발산

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>생쥐의 내림프낭 해부

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

생쥐의 내림프낭 해부

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...