STORM 현미경에 대한 액세스를 위해 Xufeng Wu에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 암 연구소 (NCI) 암 연구소와 국립 심장 폐 혈액 연구소 (NHLBI)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었습니다.

주의 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 프로토콜에 사용 된 화학 물질 중 일부는 독성 및 발암 성입니다. 엔지니어링 제어 (흄 후드, 글러브 박스) 및 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험복, 긴 바지, 닫힌 발가락 신발)의 사용을 포함하여 프로토콜을 수행 할 때 모든 적절한 안전 관행을 사용하십시오. 1. 활성화 된 T 세포의 멀티플렉싱 이미징 <ol><li> Alexa 647 항체 라벨링 키트를 사용하여 항체를 Alexa-647 (A647) 염료와 직접 결합시킵니다. 제조자가 제공 한 라벨링 프로토콜을 따른다. 참고 :이 단계 전에 항체 라벨링 효율을 높이려면 1x PBS에서 항체 용액 투석을 권합니다. </li><li> 20,800 rcf에서 5 분 동안 항체를 표지하고 상등액을 수집하여 응집 된 항체를 제거합니다. </li><li> 형광 나노 다이아몬드 코팅 커버 슬립 준비 <ol&gt; <li> 0.01 % Poly-L-Lysine (PLL) 250 μL와 함께 8- 웰 coverslip 챔버 (시약 / 재료 목록 참조)를 15 분 동안 코팅하고, 대기음을 내고 65 분 동안 30 분 동안 건조시킵니다. (건조하기 전에 헹구지 마십시오.) </li><li> 1X PBS에서 100nm FND 희석을 준비하십시오. 여러 희석액을 테스트하여 1.2.7 단계 (각 제조사에서 제공하는 FND의 1 : 200 희석액 사용)에서 각 FND를 볼 수있게하십시오. </li><li> 1 분 동안 희석 된 FND를 와동시킨다. </li><li> 고출력 설정에서 30 초 동안 FND 상등액을 초음파 처리하십시오. </li><li> 상온에서 30 분 동안 PLL 코팅 8 잘 coverslip 챔버 sonicated FND의 뜨는을 품어. </li><li> 1x PBS로 5x를 세척하고 TIRF 현미경에서 647 nm 레이저 여기를 사용하여 FND 코팅 챔버를 시각화하십시오. 이상적으로, 1.2.2 단계에서 FND의 적절한 희석이 주어지면 4-10 개의 개별 FND가 시야에 있어야합니다 (우리는 61 x 61 μm의 시야를 산출하기 위해 256 x 256 카메라 픽셀 설정의 100X 대물 렌즈를 사용합니다) 와이미징 필드의 ​​각 사분면에 존재하는 적어도 하나의 FND. FND가 밀집된 것처럼 보이는 경우 ( 즉, 주변 FND보다 상당히 높은 FND 및 200 nm보다 큰 포인트 확산 함수) FND를 6,800 rcf에서 1 분간 원심 분리하고 FND 상등액을 사용하여 코팅 절차를 반복합니다. </li><li> 각 우물에 안티 CD3 항체 (10 μg / ML) 250 μl를 추가하고 37에서 1 시간 품어 ° C. 또는 4 밤새 ° C. </li><li> 솔루션을 제거하고 30 초 동안 1x PBS를 추가합니다. 이 세척 단계를 5 번 반복하십시오 (5x 세척). </li></ol></li><li> Jurkat T 세포의 활성화 <ol><li> 6 분 동안 800 rcf에서 Jurkat T 세포 1 ml를 스핀하고 300 μl 1x HBS 용액에 resuspend. Jurkat T 세포는 회전하기 전에 이상적으로 0.5-1.0 x 106 세포 / ml의 농도가 있어야합니다. 1x HBS 용액은 HEPES buffer saline과 1 % Bovine serum albumin으로 구성되어있다. </li><li> 150 μL 추가각 우물에 1X HBS 용액을 넣고 37 ° C에서 15 분 동안 배양합니다. </li><li> 각 잘 50 μL resuspended Jurkat T 세포를 추가하고 37 분 3 분 품어. </li><li> 각 우물에 4 % Paraformaldehyde 300 μL를 추가하고 37에서 30 분 품어 ° C. </li><li> 1x PBS로 3 번 씻으십시오. </li><li> 실내 온도에서 5 분 동안 0.1 % Triton-X 용액 250 μL를 첨가하여 세포를 투과시킨다. </li><li> 1x PBS로 3 번 씻으십시오. </li><li> 방 온도에서 30 분 각 우물에 1x PBS에 250 μL 1 % 생선 젤라틴 솔루션을 추가합니다. </li><li> 1x PBS로 3 번 씻으십시오. </li></ol></li><li> Imaging은 madSTORM을 사용하여 Jurkat T 세포를 활성화했습니다. <ol><li> 실내 온도에서 1 시간 동안 고정 세포에 0.1-0.5 μg / mL의 표시 항체 200 μL를 추가합니다. </li><li> 1x PBS로 5 번 씻으십시오. </li><li> STORM 버퍼 1 ML을 추가하고 공기에 노출을 제한하는 유리 coverslip과 챔버를 덮는다. STORM 버퍼는 이전에 10 에서 설명했습니다. 우리는 엄마를 추천합니다.STORM 버퍼를 20,800 rcf에서 2 분간 회전시켜 침전물을 제거합니다. </li><li> TIRF 모드에서 647 nm의 낮은 레이저 파워를 사용하여 시야에서 적어도 3 개의 FND가있는 스테인드 셀을 찾습니다. FND 위치 파악을 돕기 위해 568 nm 레이저를 사용하여 여기를 활성화하여 FND 신호의 밝기를 높일 수 있습니다. 참고 : 2.1 절에 설명 된 평균 기점 보정 성능은 더 많은 FND를 포함하면 향상됩니다. </li><li> 647 nm 레이저 파워를 높이고 이미지를 획득하십시오. 우리는 일반적으로 200ms 노출, 125mW 647nm 레이저, 100X TIRF 대물 렌즈 (1.49 NA), 100X EM 이득 (16 비트에서 5MHz, 변환 이득 1)에서 10,000 프레임을 획득합니다. 우리의 이미징 설정에 대한 자세한 내용은 이전에 설명했습니다 10 . </li><li> 1x TBS로 5 배 씻으십시오. </li><li> 1 ml를 추가하십시오(3.5M MgCl 2 , 20mM PIPES, 0.1 % Tween-20, pH 6.5)로 세척하고 실온에서 1 분 동안 인큐베이션한다. </li><li> 용리를 3 번 ​​반복하십시오. (사용 된 각 항체에 대해 정확한 용출 조건과 신호를 제거하는 데 필요한 용출 린스 수를 확인해야합니다). </li><li> 1X TBS로 3X 씻고 1X PBS 1 ML을 추가합니다. </li><li> 405nm 레이저로 2-5mW의 고출력 (125mW)에서 647nm 레이저를 사용하는 Photobleach는 어두운 상태에서 A647 염료를 광 활성화합니다. 비 용출 항체의 잔류 신호가 모두 사라질 때까지 기다리십시오. 일반적으로 이것은 레이저 노출의 2-5 초 걸립니다. 용리 및 광 표백 후 1.3.5의 STORM 설정을 사용하여 샘플 이미지 (~ 100 프레임)를 수집하여 신호 제거를 확인하는 것이 좋습니다. 우리는 일반적으로이 방법을 사용하여 신호의 99.8 %를 제거합니다. 이전에 설명한대로 madSTORM에서 사용하기 전에 각 항체의 용출 효율을 테스트하는 것이 좋습니다. </li><li> 15 분 동안 250 μL 4 % Paraformaldehyde를 첨가하십시오. 이 pr이벤트는 세포에서 고정 된 분자의 가교를 역전시킵니다. </li><li> 1x PBS로 3 번 씻으십시오. </li><li> 여러 대상의 순차적 레이블링에 대해서는 1.3.1-1.3.12 단계를 반복하십시오. 그림 1 은 madSTORM을 사용하여 활성화 된 Jurkat T 세포에서 여러 분자의 합성 이미지를 보여줍니다. </li></ol></li></ol> 2. 다중화 된 이미지 스택의 드리프트 보정 및 정렬 <ol><li> madSTORM 이미지 스택의 드리프트 보정 <ol><li> ImageJ를 사용하여 이미지를 엽니 다. ImageJ에서 열기 전에 이미지 파일을 TIFF 형식으로 변환하는 것이 좋습니다. 사각형 ROI를 사용하여 단일 FND를 선택하십시오. FND가 이미지 스택의 모든 프레임에서 볼 수 있는지 확인하려면 시간 경과를 재생하십시오. ThunderSTORM 플러그인에서 Run Analysis를 사용하여 FND를 현지화하십시오. 2.1.5에 설명 된 평균 기점 보정 방법의 경우 단일 FND가 각 이미지 프레임에 국한되어 있어야합니다 ( 즉 식별 된 피크의 수는 equal의 프레임 수). </li><li> FND가 모든 프레임에서 식별되지 않으면 다른 FND를 선택하십시오. 하나의 프레임에 여러 개의 피크가있는 경우 이전 피크에서 가장 많이 벗어난 피크를 제거하십시오. </li><li> 이미지 스택의 각 FND에 대해 2.1.2를 반복하십시오. 일부 FND는 드리프트 보정 프로세스에 포함되지 않아야하므로 2.1.7 단계에서 설명한대로 드리프트 보정 정밀도에 대한 독립적 인 게이지 역할을 할 수 있습니다. </li><li> 더 빠르고 덜 정밀한 드리프트 보정을 위해 FND 이미지를 수정하기 위해 ThunderSTORM에 포함 된 상호 상관 또는 정점 보정 알고리즘을 사용하십시오. 일반적으로 교차 상관 및 10 개의 최대 거리, 0.1 분 마커 가시성 비율 및 0.01 궤도 평활화 계수에 대해 100 개 저장고, 5 배율 및 0.1 궤도 평활화 계수를 기준 보정에 사용합니다. 상호 상관 및 기점 보정은 드리프트 보정 정밀도를 테스트하기 위해 다른 FND에 적용 할 수있는 보정 파일을 생성합니다. </li><li> 좀 더 엄격하고 정확한 드리프트 보정을 위해서는 이전에 설명한대로 평균 기점 보정 (AFC) 알고리즘을 사용하십시오 10 . 이 과정은 매개 변수의 최적화를 필요로하지 않으며 SMLM 현지화 알고리즘에 의해 예측 된 것보다 더 높은 위치 파악 정확도를 산출합니다. 그러나, 평균 드리프트 보정은 적어도 4 개의 FND를 필요로하며 FND는 이미지 스택의 모든 프레임에 위치해야합니다. 많은 수의 국부 화 된 FND가 주어진 프레임에서 특이점의 왜곡 효과를 줄이므로 AFC 드리프트 보정은 더 많은 FND를 포함하면 더 잘 수행됩니다. </li><li> 앞서 설명한 ThunderSTORM을 사용하여 이미지 스택 내의 모든 포인트 스프레드 기능을 현지화하십시오. 10 . 우리는 일반적으로 100nm의 픽셀 크기, A / D 수 4.28, 기본 레벨 A / D 수 100, EM 게인 100, PSF : 통합 가우스 로컬라이제이션, 5 픽셀 피팅 반경, 최대 우도 피팅 방법 및 1.3 픽셀 초기 시그마.</li><li> FND에서 얻은 드리프트 보정 계수를 전체 이미지 스택의 현지화에 적용합니다. 올바른 드리프트 보정을 위해 최종 이미지를 육안으로 검사하십시오 ( 그림 2 ). 결과 드리프트 보정 계수는 드리프트 보정 정밀도를 측정하기 위해 AFC 절차에 포함되지 않은 FND에 대해 독립적으로 테스트해야합니다. 드리프트 보정 된 독립 FND의 정밀도는 2.1.6에서 사용 된 위치 파악 알고리즘으로부터 계산 된 평균 정밀도 / 불확도 값에 근접해야한다. </li><li> 순차적으로 표시된 항체의 madSTORM 이미지 스택에 대해 2.1.1 ~ 2.1.7 단계를 반복합니다. 각 madSTORM 이미지 스택에서 동일한 FND 세트를 현지화하는 것이 다음 정렬 절차에 중요합니다. </li></ol></li><li> madSTORM 이미지의 정렬 <ol><li> 각 madSTORM 이미지에서 드리프트 보정 된 FND의 중심 위치를 계산합니다. 이렇게하려면 평균 x 및 y 축 Po를 찾습니다.각 지방화 된 FND에 대한 위치를 측정하고 각 madSTORM 이미지에서 모든 FND의 평균 x 및 y 위치를 평균합니다. 이 단계에 대한 자세한 알고리즘은 이전에 설명했습니다. 10 . FND 기준 마커의 중심 위치를 사용하여 순차적 madSTORM 이미지를 정렬합니다. 정렬을 수행하려면 두 번째 madSTORM 이미지에서 FND의 중심 위치를 첫 번째 위치에서 빼서 두 개의 현지화 된 madSTORM 이미지 사이의 오프셋을 계산합니다. 그런 다음 두 번째 madSTORM 이미지의 모든 현지화에서 오프셋 양을 뺍니다. </li><li> 첫 번째 madSTORM 이미지를 참조 이미지로 사용하고 첫 번째와 세 번째, 첫 번째 및 네 번째 등의 정렬 단계를 반복하는 것이 좋습니다. 정렬 프로세스에 포함되지 않은 FND 간 오프셋을 측정하여 정렬 정밀도를 테스트합니다. 큰 오프셋은 순차적 madSTORM 이미지의 중심 위치를 계산할 때 FND 세트가 다름을 나타낼 수 있습니다. </li><li> 그렇다면 2.2.1-2.2.2 단계를 수행하십시오.정렬을 수행하기 위해 동일한 세트의 FND를 사용하여 반복된다. 참고 : AFC 드리프트 보정 및 정렬 절차에 대한 사용자 정의 코드가 제공됩니다. </li></ol></li></ol>

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우리는 공개 할 것이 없습니다.

madSTORM의 순차 멀티플렉싱, 드리프트 보정 및 정렬 절차를 통해 세포 내 이종 구조의 정밀하고 고도로 다중화 된 시각화가 가능합니다. 또한 madSTORM은 색이 다른 STORM의 제한 사항 (예 : 색수차 및 비 원거리 적색 염료 9 , 12의 최적의 광 스위치 / 방출 특성)을 피합니다. 용출 단계가 순차적으로 결합 된 항체로부터 입체감을 현저히 감소 시킴에 따라 madSTORM을 사용하여 이전의 기술 9 , 15 , 21에 의해 달성 된 6-10 회의 다중 이미지를 넘어서 세포 샘플의 반복 이미징을 수행 할 수 있습니다. 또한, 순차적 인 용출 및 염색 단계는 SMLM에 국한되지 않으며 공 초점 현미경, SIM 및 2 광자 현미경과 같은 다른 영상 기술에 사용될 수 있습니다. 그러나, 그 화를 주어진TORM은 순차적 인 면역 염색 기술이며,이 기술은 각 표적 분자에 대한 항체의 이용 가능성에 의해 제한됩니다. 특이성, 표지 효율 및 용리 능력을 보장하기 위해 각 항체를 신중하게 시험해야합니다. madSTORM에 대한 수집 설정은 개별 사진 전환 이벤트를 최대로 감지하도록 선택되어 2.5nm 평균 현지화 정밀도를 달성했습니다. 그러나 높은 정밀도는 이전에 논의 된 바와 같이 madSTORM 이미징의 매 라운드마다 ~ 3 시간을 필요로하는 시간 소모로 발생합니다. 더 낮은 위치 파악 정밀도 (5-10 nm)에서 더 빠른 이미지 획득을 위해 짧은 노출 시간과 높은 EM 게인을 권장합니다 ( 예 : 20 ms 노출, 300X EM 게인, 16 비트에서 17 MHz, 변환 게인 3). 또한 madSTORM 이미징의 각 라운드마다 멀티 컬러 이미징 ( 예 : Atto-488, Alexa-568 및 Alexa-647 nm)을 수행하여 다중화의 규모를 늘릴 수 있습니다.색수차에 의한 얼라인먼트 정밀도의 저하를 초래한다. 우리는이 프로토콜을 사용하여 최대 25 회의 madSTORM 이미징을 성공적으로 수행했습니다. 전체 절차는 현미경 스테이지에 장착 coverslip 챔버와 함께 수행되므로 같은 위치에 coverslip 챔버를 확보하는 것이 중요합니다. 이렇게하려면 자동 초점 모드를 사용하고 금속 클램프를 사용하여 현미경 스테이지에 챔버를 장착하십시오. 상당한 스테이지 드리프트가 발생하면 FND 기준 마커의 알려진 위치를 사용하여 셀 샘플을 다시 센터링합니다. 정렬 된 madSTORM 이미지의 동시 시각화는 어려울 수 있습니다. 7 개 이하의 madSTORM 이미지를 동시에 보려면 ImageJ에서 채널 색상 / 병합을 사용하여 의사 색상 합성 이미지를 만듭니다. 8 개 이상의 이미지의 경우, madSTORM 이미지를 다른 그룹으로 분류하고, 각 그룹을 합성 이미지로 병합하고, 각 합성 이미지에 단일 LUT 색상을 적용하는 것이 좋습니다. <p class=&quot;jove_content&quot;&gt; 우리는 100 nm 질소 공극 중심의 나노 다이아몬드를 사용했습니다.이 다이아몬드는 밝기와 PLL 코팅 커버 슬립에 충실했습니다. 80 nm보다 작은 FND는 PLL 코팅 된 커버 슬립에 잘 접착하지 못했고 647 nm 레이저를 사용하여 여기 시켰을 때 Alexa-647 염료보다 100 nm 이상의 FND가 현저히 밝아서 Alexa-647 방출의 카메라 수집 설정 최적화가 제한되었습니다. 100 nm 질소 결원 중앙 FND가 이미징 설정에 적합하지 않은 경우 다양한 FND 크기 또는 색상을 사용하여 실험하는 것이 좋습니다. 또는 나노 골드 입자 또는 형광 비드가 기준 마커로 사용될 수 있지만 아래 2.1에서 사용 된 평균 포인트 보정 절차에는 적합하지 않습니다. 마지막으로, NV - vacancy FND의 경우, 방출 세기는 정적 자기장의 적용으로 현장에서 ~ 50 %까지 감소 될 수 있습니다. 강도의 감소는 ~ 500 Gauss까지 대략 직선입니다.이 시점에서 effect는 포화 상태이다. 실제로, 시야의 다이아몬드 강도는 영구 ​​자석을 위로부터 현미경 슬라이드에 더 가깝게함으로써 원하는 정도로 감소시킬 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 T 세포 마이크로 클러스터의 분자 구성 요소를 표적으로하는 항체의 제거를위한 용리 완충액을 최적화했습니다. madSTORM은 미세 관, 미토콘드리아, F-actin, Vimentin 및 기타 분자 구조가이 기술을 사용하여 이미지화되기 때문에 TCR 미세 클러스터에 국한되지 않습니다 10 . 다른 세포 구획을 표적으로하는 항체의 경우 고온, 저 pH 및 용출 완충액의 더 긴 항온 배양과 같은 에피토프 결합을 방해하기위한 추가 단계가 필요할 수 있습니다. 반대로, 용리 완충액은 Tween-20없이 민감한 막 구조를 표적화하여 비이 온성 상호 작용의 방해를 방지 할 수 있습니다. 우리는 향후 실험에서 용출 완충액 성분이 개별 항체 t에 맞춰질 것이라고 예측한다o 용출 효율과 시료 보존을 최적화하십시오. 또한, 활성화 T 세포에서의 적용을 넘어, madSTORM은 in vitro 분자 복합체, 상이한 세포 유형 및 조직 절편을 포함하는 다른 시스템 에서 실행 가능할 수있다. 고정, 투과성, 항체 염색 및 용리 완충액 조성과 같은 madSTORM 프로토콜의 다양한 매개 변수는 각 대상 시스템에 맞게 조정해야합니다.

광학 현미경 (~ 200 nm)의 회절 한계를 극복하기 위해 다양한 초고 해상도 현미경 기술이 개발되었습니다. 이 중에는 PALM (optical-activation localization microscopy)과 STORM (stochastic optical reconstruction microscopy)이 포함 된 단일 분자 위치 확인 현미경 (SMLM)이라는 기술 범주가 있습니다. SMLM 기술은 on (형광) 상태와 off (dark / photo-switched) 상태 사이에서 전환 할 수있는 형광체의 사용을 공유하므로 단일 분자 1 , 2 , 3 의 형광을 연속적으로 위치시킬 수 있습니다. 시중에서 판매되는 염료 및 현미경과의 호환성으로 인해 직접 STORM (dSTORM)은 널리 채택 된 SMLM 기술입니다. dSTORM은 회절의 중심 계산시 불확실성으로 정의되는 ~ 10 nm의 위치 정밀도를 일상적으로 달성 할 수 있습니다이온 제한점 확산 기능 (PSF). 그러나, 국소화 알고리즘 5 , 6 , 7을 사용하여 추정 된 고정밀도에도 불구하고 단일 분자의 실제 위치를 정확하게 결정하는 데는 많은 문제가있었습니다. 첫째, 이미지 획득 중에 현미경 스테이지의 기계적 움직임은 위치 정밀도에 상당한 불확실성을 추가합니다. 수천 개의 시간 경과 프레임에서 SMLM 이미지가 얻어지기 때문에 현미경 스테이지의 나노 스케일 이동은 최종 초 해상도 이미지의 정밀도를 크게 떨어 뜨릴 수 있습니다. 이미지 획득 중에 스테이지 이동을 보정하기 위해 스테이지 드리프트는 일반적으로 이미지 자체 (교차 상관) 또는 기준 마커 (기준점 보정) 1,9의 순차적 현지화에서 회귀 기반 피팅으로 추정됩니다. 호프이러한 방법은 각 이미지 스택에 대해 여러 매개 변수를 최적화해야하며 기계적 진동과 같은 짧은 시간 범위에서 스테이지 이동을 설명 할 수 없습니다. 금 나노 입자 및 다색 형광 구슬은 SMLM에서 기준 마커로 사용되었지만 광 안정성이 아니므로 드리프트 보정 후 사용 된 질소 공공 중심 형광 나노 다이아몬드 (FND)보다 훨씬 낮은 정확도를 갖습니다. madSTORM 10 . 회절 한계 외에도, 광학 현미경 검사는 스펙트럼 한계에 의해 더 제한됩니다. 여러 대상을 동시에 시각화하려면 일반적으로 형광 기반의 광학 현미경을 6 색으로 제한하고 SMLM을 2-3 색 4 , 11 , 12로 제한하는 비 중첩 스펙트럼 프로파일이있는 형광 프로브가 필요합니다. 더욱이, 비선형 색수차는 다색 이미지의 정렬 불일치를 야기한다.hich는 멀티 컬러 기준 마커 8 , 13을 사용하여 광범위한 정렬 절차가 필요합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 이전의 연구에서는 순차적으로 결합 된 형광체 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19의 반복적 인 photobleaching 또는 chemical quenching을 사용하여 여러 대상을 이미징했습니다. 이러한 방법은 현미경의 스펙트럼 한계를 극복 할 수 있지만, 형광 표백은 유독 한 과정으로 알려져 있으며, 오래 지속되는 표백 또는 담금질은 가교 결합의 손실과 같은 원치 않는 부작용을 유발할 수 있습니다. 또한, 형광 프로브의 축적은 표본에서 결합 부위의 입체적 차단 (steric blocking)을 초래하여 대규모 멀티 플렉스 (multiplexing) 및 에피토프의 견고한 표적화를 방지한다. 이러한 입체적인 간섭을 피하기 위해 최근의tudy는 자유롭게 확산하는 단백질 단편의 확률 적 교환을 이용하여 다중화를 달성했다. 이 방법은 세포 구조의 고밀도 라벨링을 허용하지만, 펩타이드 단편을 분리하기위한 광범위한 생화학 적 준비를 필요로하고, 단일 분자 위치를 찾을 수 없으며 상업적으로 이용 가능한 프로브를 사용하여 대규모 멀티플렉싱을 용이하게하지 못한다. 우리는 멀티플렉싱, 항체 크기 제한 dSTORM (madSTORM) 이미징을위한 형광 항체의 순차적 인 결합 및 용출을 기술하고 정확한 드리프트 보정 및 정렬을 달성하기 위해 형광 나노 다이아몬드를 사용하는 상세한 비디오 프로토콜을 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>8 well coverslip chamber</td><td>Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Poly-L-Lysine solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>NV-100 nm Fluorescent Nano-diamond</td><td>Adamas</td><td>Red FND</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3&amp;epsilon; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin, Fraction V</td><td>KSE Scientific</td><td>98-100P</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>10% Paraformaldehyde</td><td>EMS</td><td>15712</td><td>Carcinogen</td></tr><tr><td>Gelatin from fresh water fish skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647 antibody labeling kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154</td><td>Highly toxic, air sensitive</td></tr><tr><td>Cysteamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Cyclooctatetraene 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td>Highly toxic, air sensitive</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3210</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3385</td><td></td></tr></tbody></table>

highly multiplexed, super-resolution imaging of t cells using madstorm

단일 분자 위치 결정 현미경을 이용한 이질적인 세포 구조의 영상화는 부적절한 위치 파악 정밀도와 다중화 능력으로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 형광 나노 다이아몬드 기준 마커를 사용하여 단일 분자 현지화 현미경에서 높은 정밀도를 얻기 위해 필요한 드리프트 보정 및 정렬 절차를 설명합니다. 또한, 다중 항체 전략 인 madSTORM은 여러 분자가 형광 항체의 순차적 인 결합 및 용출을 이용하여 동일한 세포에서 표적화되는 것으로 기술된다. madSTORM은 활성화 된 T 세포에서 T 세포 수용체 마이크로 클러스터라고 불리는 막 결합 다중 단백질 구조 내 다른 구성 요소의 위치를 ​​시각화합니다. 또한, 다중 단백질 구조의 시각화를위한 일반적인 도구로서 madSTORM의 응용이 논의되었다.

순차적 인 용리 및 염색 방법은 활성화 된 Jurkat T 세포 ( 그림 1 , 확인 숫자 정렬)에서 마이크로 클러스터 및 기타 구조의 다중화 된 madSTORM 이미지를 생성하는 데 사용되었습니다. 각각의 의사 컬러 이미지는 1.1.1에서 1.3.13 단계에서 얻은 madSTORM 이미징의 한 라운드를 나타냅니다. 앞에서 설명한 것처럼, 다중 표적 사이의 혼선을 피하기 위해 이전의 용출되지 않은 항체의 잔류 신호에 대해 시야를 모니터링해야합니다. 더욱이, 용출 효율이 항체 들간에 다양 할 수 있기 때문에, 순차 멀티플렉싱의 순서는 에피토프의 입체적 차단을 최소화하기 위해 가장 좋은 것에서 최악의 용출 항체까지 배열되어야한다. 그림 1 의 최종 madSTORM 이미지는 2 절에서 설명한대로 AFC 및 FND 기준 마커를 사용하여 드리프트 및 정렬을 위해 보정되었습니다. 그림 2A , 2B ) 및 활성화 된 Jurkat T 세포 ( 그림 2C , 2D )에서 현지화에 대해 AFC를 수행하는 데 사용되었습니다. 제공된 알고리즘을 사용하여 2.1.1-2.1.8 단계에서 설명한대로 AFC 표류 보정을 수행했습니다. 첫째, 표류 보정 ( 그림 2C ) 후의 이미지를 시각적으로 검사하여 표류 보정 알고리즘을 올바르게 적용하는 것이 좋습니다. 둘째, AFC에서 달성 한 정밀도를 확인하려면 X 및 Y 축의 표준화 표준 편차를 측정하는 것이 좋습니다. 이전에보고 된 바와 같이, AFC는 일반적으로 다양한 지역화 알고리즘에 의해 예상 된 것보다 더 나은 정밀도를 산출합니다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55997/55997fig1.jpg" /> 그림 1 : ( A </strong&gt;) 활성화 된 Jurkat T 세포가 다중 라운드의 madSTORM 영상을 사용하여 순차적으로 영상화됩니다. (적색), pLAT-Y171 (마젠타), pLAT-Y191 (분홍색), pLAT-Y226 (보라색), PLCγ1 (연한 파란색), pSLP76-Y128 (녹색), pSRC-Y416 (아쿠아), pTCRζ-Y142 파란색), TOM20 (노란색), αTubulin (주황색), ZAP70 (갈색). 스케일 바 = 2.5 μm. ( B ) A. 스케일 막대에서 박스 영역의 확대 이미지 = 500 nm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55997/55997fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55997/55997fig2.jpg" /> 그림 2 : 평균 Fiducial 보정으로 드리프트 보정 전과 30,000 이미지 프레임 ( A )에 국한된 단일 FND의 SMLM 이미지. 스케일 바 = 20 nm (A와 B). 활성화 된 Jurkat T 세포의 SMLM 이미지(P12) 항체와 FND 기준 마커 ( C )의 평균값을 보정 한 후 드리프트 보정을 한 결과를 보여줍니다. 눈금 막대 = 2 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55997/55997fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

우리는 형광 표지 항체의 순차적 인 결합 및 용출을 사용하여 단일 분자 정밀도로 이질적인 나노 구조 내의 다중 분자를 이미지화하는 방법을 시연합니다.

madSTORM을 이용한 T 세포의 고해상도 이미징

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

highly-multiplexed-super-resolution-imaging-of-t-cells-using-madstorm

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.3K 조회수.  National Institutes of Health.  우리는 형광 표지 항체의 순차적 인 결합 및 용출을 사용하여 단일 분자 정밀도로 이질적인 나노 구조 내의 다중 분자를 이미지화하는 방법을 시연합니다. 

비디오: Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

연구

면역학 및 감염병학

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the structure-function relationship of these receptors in situ, we need to visualize and track them on the live cell surface with enough spatiotemporal resolution. Here we show how to use recently developed Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) to image T-cell receptors (TCRs) four-dimensionally (4D, space and time) at the live cell membrane. T cells are one of the main effector cells of the adaptive immune system, and here we used T cells as an example to show that the signaling and function of these cells are driven by the dynamics and interactions of the TCRs. LLSM allows for 4D imaging with unprecedented spatiotemporal resolution. This microscopy technique therefore can be generally applied to a wide array of surface or intracellular molecules of different cells in biology.

The goal of this protocol is to show how to use Lattice Light-Sheet Microscopy to four-dimensionally visualize surface receptor dynamics in live cells. Here T cell receptors on CD4+ primary T cells are shown.

격자 광 시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4 차원 시각화

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

생화학

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is an effective methodology for tumor evaluation that improves the understanding of the tumor microenvironment. The visualization of protein expression in formalin-fixed, paraffin-embedded&#160;tissues is achieved when a specific fluorophore is annealed to an antibody-bound barcode via complementary oligonucleotides and then sample imaging is performed; indeed, this method allows for the use of customizable panels of more than 40 antibodies in a single tissue staining reaction. This method is compatible with fresh frozen tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, cultured cells, and peripheral blood mononuclear cells, meaning that researchers can use this technology to view a variety of sample types at single-cell resolution. This method starts with a manual staining and fixing protocol, and all the antibody barcodes are applied using an antibody cocktail. The staining fluidics instrument is fully automated and performs iterative cycles of labeling, imaging, and removing spectrally distinct fluorophores until all the biomarkers have been imaged using a standard fluorescence microscope. The images are then collected and compiled across all the imaging cycles to achieve single-cell resolution for all the markers. The single-step staining and gentle fluorophore removal not only allow for highly multiplexed biomarker analysis but also preserve the sample for additional downstream analysis if desired (e.g., hematoxylin and eosin staining). Furthermore, the image analysis software enables image processing-drift compensation, background subtraction, cell segmentation, and clustering-as well as the visualization and analysis of the images and cell phenotypes for the generation of spatial network maps. In summary, this technology employs a computerized microfluidics system and fluorescence microscope to iteratively hybridize, image, and strip fluorescently labeled DNA probes that are complementary to tissue-bound, oligonucleotide-conjugated antibodies.

Multiplexed barcoding image analysis has recently improved the characterization of the tumor microenvironment, permitting comprehensive studies of cell composition, functional state, and cell-cell interactions. Herein, we describe a staining and imaging protocol using the barcoding of oligonucleotide-conjugated antibodies and cycle imaging, which allows for the use of a high-dimensional image&#160;analysis technique.

파라핀 조직 샘플의 단일 세포 분석에서 면역 프로파일링 및 공간 매핑 특성 분석을 위한 멀티플렉스 바코드 이미지 분석

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

암 연구학

종양 미세환경의 다중 면역형광 및 공간 이미지 분석(Multiplex Immunofluorescence and Spatial Image Analysis of the Tumor Microenvironment)

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending on its composition and the interactions between cancer cells and peri-tumoral cells, the TME may affect cancer progression. The characterization of tumors and their complex microenvironment could improve the understanding of cancer diseases and may help scientists and clinicians to discover new biomarkers.
We recently developed several multiplex immunofluorescence (mIF) panels based on tyramide signal amplification (TSA) for the characterization of the TME in colorectal cancer, head and neck squamous cell carcinoma, melanoma, and lung cancer. Once the staining and scanning of the corresponding panels are completed, the samples are analyzed on an image analysis software. The spatial position and the staining of each cell are then exported from this quantification software into R. We developed R scripts that allow us not only to analyze the density of each cell type in several tumor compartments (e.g. the center of the tumor, the margin of the tumor, and the stroma) but also to perform distance-based analyses between different cell types.
This particular workflow adds a spatial dimension to the classical density analysis already routinely performed for several markers. mIF analysis could allow scientists to have a better understanding of the complex interaction between cancer cells and the TME and to discover new predictive biomarkers of response to treatments, such as immune checkpoint inhibitors, and targeted therapies.

저자 스포트라이트: 종양 미세환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 다중 면역형광  

In this article, a protocol for manual tyramide signal amplification (TSA) multiplex immunofluorescence (mIF) combined with image analysis and spatial analysis is described. This protocol can be used with formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) sections for the staining of two to six antigens per slide depending on the slide scanner available in the laboratory.

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending ...

종양 면역 환경 매핑: 심층 멀티플렉스 IHC 분석 프로토콜

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. Multiplex immunohistochemistry is a valuable tool to visualize and identify different types of immune cells in tumor tissues while retaining its spatial information. Here we provide detailed protocols to analyze lymphocyte, myeloid, and dendritic cell populations in tissue sections. Starting from cutting formalin-fixed paraffin-embedded sections, automatic multiplex staining procedures on an automated platform, scanning of the slides on a multispectral imaging microscope, to the analysis of images using an in-house-developed machine learning algorithm ImmuNet. These protocols can be applied to a variety of tumor specimens by simply switching tumor markers to analyze immune cells in different compartments of the sample (tumor versus invasive margin) and apply nearest-neighbor analysis. This analysis is not limited to tumor samples but can also be applied to other (non-)pathogenic tissues. Improvements to the equipment and workflow over the past few years have significantly shortened throughput times, which facilitates the future application of this procedure in the diagnostic setting.

저자 스포트라이트: 종양의 면역 세포 환경에 대한 통찰력 확보

This protocol describes in detail how immune cell characterization of the tumor microenvironment using multiplex immunohistochemistry is carried out.

종양 미세환경의 공간 면역 세포 풍경에 대한 다중 면역조직화학적 분석

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

madSTORM을 이용한 T 세포의 고해상도 이미징

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

격자 광 시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4 차원 시각화

파라핀 조직 샘플의 단일 세포 분석에서 면역 프로파일링 및 공간 매핑 특성 분석을 위한 멀티플렉스 바코드 이미지 분석

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

종양 미세환경의 공간 면역 세포 풍경에 대한 다중 면역조직화학적 분석

종양 미세환경의 공간 면역 세포 풍경에 대한 다중 면역조직화학적 분석

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구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름