K.A.V.와 P.A.A.의 작품 유럽 연구 위원회 (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), 공학 및 물리 과학 연구 위원회 IB 촉매 상 EP/N013514/1, 그리고 생명 공학 및 생물 과학 연구에 의해 지원 되었다 위원회 (BB/L009722/1 및 BB/N006321/1). 상대습도 정부의 데 많은 y Tecnologìa, 코스타리카 대학, 링컨 대학, 옥스포드에 의해 지원 되었다. 저자 찰리 존스 씨, 씨 찰리 Evans 및 기계 워크숍 (화학과)의 설계 및이 작업에 사용 하는 spectroelectrochemical 세포의 제조에 도움에 대 한 인정 합니다.

1. 혐 기성, 건조 글러브 및 일반적인 실험적인 요구는 FTIR 계의 내부 샘플 실 재현
<ol><li>외부 수은 카드뮴 텔 룰라 이드 (MCT) 검출기와 ATR 액세서리 상업 연결 분석기를 사용 합니다. 건조 한 공기 또는 이질소, 분석기의 시체를 제거 하거나 또는 한 분석기를 사용 하 여 대피 광학 벤치와 함께 합니다.</li>
	<li>혐 기성으로 같은 높이에서 안정, 진동 없는 테이블에 분석기를 배치 (< 1 ppm O2), (노점 <-75 ° C) 글러브를 건조. 충분히 큰 defocused 빔 IR 투명 창을 통해 글러브에는 분석기의 IR 광선을 전환. 참고: 중요 하다 글러브와 분석기 사이의 간격도 제거 또는 대피, NaCl 등 케이시 검 습기 창 소재, 예를 들어 사용 하는 경우에 특히.</li>
	<li>
복제는 글러브 안에 계의 내부 샘플 구획.
	<ol>
<li>이상적으로 계의 내부 초점 거울으로 동일한 초점 거리와 함께 축에서 타원 거울에 글러브 안에 빔 직접. 참고: 그것은 높이 글러브; 내부 조정 IR 광선의 방향으로 수 있도록이 초점 거울 앞에 배치 하는 두 추가 평면 거울에 유용 이 계의 초기 배치에 있는 부정확을 상쇄 된다.</li>
		<li>외부 MCT 발견자, 적당 한 완전 한 글러브, 내부 (짧은 초점 거리 ZnSe 렌즈, 또는 꺼짐-축 포물선 거울, 짧은 초점 거리) 등 시 초점 위치와 같은 내부 샘플의 크기를 복제 분석기의 구획입니다.</li>
		<li>적외선 빔 초점 거울 및 MCT 발견자 사이 대략 등거리 수의 '초점'을 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>액체 질소로 외부 MCT 발견자의 dewar 쿨.</li>
	<li>ATR 액세서리 글러브 샘플 구획에 탑재. 입력 및 출력 광학 및 MCT 발견자에 최대 처리량을 달성 하기 위해 ATR 액세서리에 초점을 맞춥니다. 필요한 경우, 검출기 신호의 oversaturation을 조리개 또는 다른 적당 한 감쇠 (와이어 그리드) 등을 사용 합니다. 참고: 위해 데이터 제시 여기, 모든 반사 광학 및 내부 반사 요소 (분노)를 사용 하는 이동식 사다리꼴 시 5-반사 ATR 액세서리 (크리스탈 GmbH, 차원 ca 5 × 8 × 1 m m3, 얼굴 각도 39.5 °). 분노는 폴 리 에테르 에테르 케 톤 (PEEK)에서 가공 하는 이동식 baseplate에 거치 된다.</li>
	<li>글러브를 사용 하 여 외부에서 지 내게 potentiostat 연결할 수 있도록 적당 한 피드스루와 재현된 샘플 구획 집 (가스 꽉 BNC 연결은 유용 하 게이 목적을 위해), 가스 접속과 MCT에서 신호를 전송 하는 케이블 탐지기입니다. 그것은 어떤 소개 또는 측정에 간섭을 피하기 위해 감지기 케이블에 차폐 유지 해야 합니다.</li>
	<li>연동 펌프, 유량 60 mL/min은 글러브 안에 보다 큰 수를 놓습니다. 계의 도식 보기, ATR 액세서리, 연동 펌프 및 potentiostat 설치 그림 1에 표시 됩니다.</li>
	<li>Spectroelectrochemical 셀에에서 표시 된 개요로 그림 2ATR에 물개는 액세서리 등을 생성 합니다. 셀 높은 표면적 카운터 전극 Pt 와이어 (거 즈), 작업 전극 (탄소 막대)과 소형 기준 전극에 대 한 연결을 포함 해야 합니다. 셀은 입구와 셀 통해 솔루션의 빠른 흐름에 대 한 콘센트로 적어도 2 개의 추가 포트를 포함 해야 합니다. 참고: 미니어처 포화 calomel 참조 전극이이 목적을 위해 이상적입니다. 36
</li>
</ol>2. 카본 블랙의 입자 대장균 Hydrogenase 1로의 준비
<ol><li>'젖은' 혐 기성 글러브 혼합 높은 표면적의 20 밀리 그램 카본 블랙의 입자 (> 1000 m3/g) 1 mL 초고 순도 물 (저항력 > 18 m ω c m) microcentrifuge 관에서. 낮은 전력 쥡니다에 의해 입자를 분산 (< 100 W) 적어도 15 분, 또는 때까지 분산 유니폼 이며 약 20 mg/mL에의 한 로드 카본 블랙 분산을 주고 1 시간 안에 침전 하지 않는다.</li>
	<li>
~ 7 mg 단백질/mL의 농도에서 대장균 hydrogenase 1 (Hyd1, 약 50 µ L,55게시 절차 따라 준비)의 약 수를 받아 하 고 (전자 포인트 가까운 pH에서 낮은 이온 강도 버퍼 교환 예를 들어 칼륨 인산 염, 15 m m, pH 5.8, 추가 소금). 최상의 결과 얻기 위해 가능한 활성화 효소 준비 사용 하 여. 농도와 희석 한 적절 한 분자량 컷오프와 원심 필터 장치에 버퍼 교환 (50 kDa 작품 잘 Hyd1에 대 한)을 수행 합니다.
	<ol>
<li>필터 장치에는 Hyd1를 추가 합니다.</li>
		<li>교환 버퍼의 약 450 µ L로 희석.</li>
		<li>온화한 원심 분리를 사용 하 여 50 µ L의 볼륨을 reconcentrate (< ~ 2700 × g) 돌이킬 수 없는 강 수를 방지 하기 위해.</li>
		<li>2.2.2, 2.2.3 단계를 반복 하 여 버퍼 교환 완료 되 면 (일반적으로 이내 ~ 5 주기).</li>
	</ol>
</li>
	<li>버퍼 교환 Hyd1의 50 µ L 약 수 카본 블랙 분산 (2.1에서 준비) 20 mg/mL의 5 µ L 볼륨 믹스. (0 ° C)에서 냉장고에 효소 입자 혼합을 저장 하룻밤 adsorb 효소 수 있도록 합니다. 그것은 때때로 입자 분산 유지 되도록 혼합을 흔들 해야 합니다.</li>
	<li>Microcentrifuge (~ 2700 × g)에서 연속적으로 침전 및 재 분산 주기에 의해 낮은 이온 강도 버퍼 (칼륨 인산 염, 15 m m, pH 5.8, 추가 소금) Hyd1 수정 입자를 씻어. 이 과정을 3-5 회 반복 비 흡착 효소를 제거 하. 참고: 첫 번째 세척 하기 전에 상쾌한 이어야 한다 거의 무색, 효소의 좋은 흡착을 나타내는.</li>
	<li>효소 수정 입자의 ~ 20 mg/mL의 최종 로드를 주고 ~ 5 µ L의 최종 볼륨을 입자를 집중. 참고: Hyd1 수정 입자 경우 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 2 주 동안 그들이 남아 화; 이 가장 ~ 50 µ L의 초고 순도 물 희석 하는 입자를 저장 하 여 이루어집니다.</li>
</ol>3. 대장균 Hydrogenase 1에 PFIRE 측정을 위한 준비
<ol><li>그래서 저전력 쥡니다 (< 100 W), H2에서 처음으로 시 분노를 청소4 (< 90 %w / w) 15 ~ 분, 그리고 HNO3 (70 %w / w)에 대 한 최대 1 시간. 이 청소 절차는 친수성 분노 표면에 연결 되어야 합니다. 분노 피 솔루션에 놓일 수 있습니다 더 청소 하는 것이 필요한 경우 (H2O2의 1:3 비율: H2등4) 어떤 잔여 유기 물질을 산화. 참고: 가혹한 산 성 청소 방법 모든 분노 재료로 사용 하기 위해 적합 한 않을 수 있습니다. 피 라 솔루션 높게 부식성 이며 강한 산화 제, 표면 되어야 합리적으로 깨끗 한 피 솔루션 및 관리의 사용 준비 하는 동안 이동 해야 하기 전에 과정-항상 발열 특성상 피 솔루션의 사용 추가 H2O 2 천천히 H2이렇게4 고 준비, 사용 및 폐기에 대 한 적절 한 안전 절차를 참조 하십시오.</li>
	<li>초고 순도 물에 깨끗 한 분노를 헹 구 고 건조 질소 가스의 흐름에서 건조. 깨끗 한 핀셋을 사용 하 여 오염을 방지 하는 모든 프리즘 처리를 실시 합니다.</li>
	<li>전기 등급 실리콘 실 란 트의 얇은 스트립을 사용 하 여 ATR 액세서리 baseplate에 분노를 봉인. 분노의 가장자리에 실 란 트를 제한 하는 것을 주의. 완전히 건조 실 란 트를 허용 합니다.</li>
	<li>ATR 액세서리 baseplate 분석기 글러브에 전송 그리고 ATR 액세서리에 탑재. 4000-1000 c m-1 4 cm-1 해상도 사용 하 여 표준 급속 사이 참조 (배경) 스펙트럼 측정 검사는 계의 모드와 1024 평균된 interferograms (측정 시간 3-5 분). 입력으로이 스펙트럼을 사용 하 여 실험의 뒷부분에 나오는 흡 광도 스펙트럼의 계산을 허용. 참고: 작은 흡 광도 Hyd1 활성 사이트에 대 한 기대로 인해 그것은 잡음 비율 높은 신호 스펙트럼을 수집 하는 데 필요한.</li>
	<li>미리 준비 된 Hyd1 수정 입자 분산 (제 2)를 포함 하는 '젖은' 글러브 ATR 액세서리 baseplate 전송. 드롭-캐스트는 분노의 큰 얼굴에 입자 분산의 1 µ L 약 수 표면에 걸쳐 균일 하 게 그들을 확산. 참고: 팬 들은 분노에 완전히 건조 될 입자의 정보를 허용 하지 않습니다.</li>
	<li>M m (즉, ca. 8.2 × 4.9 m m2) 분노의 표면 크기 보다 작은 크기 ~0.1을 연료 전지, 가스 확산 층 재료로 사용 하는 것과 같은 탄소 종이의 한 조각 잘라. 탄소 종이의 표면 영역 드롭 캐스트 Hyd1 수정 입자를 커버 하기에 충분 해야 하지만 이렇게 중복으로 큰 실리콘 실 란 트 사용 하는 분노를 확보. 물, 탄소 종이 담근 다 고 부드럽게 입자 필름 위에 그것을 배치. 탄소 종이 전체 입자 필름에서 좋은 전기 연결을 제공 합니다. 참고: 사전에 여러 조각의 탄소 종이 준비 하 고 미리 '젖은' 혐 기성 글러브 안에 초고 순도 물에 담가 저장에 유리 하다.</li>
	<li>분노를 통해 spectroelectrochemical 셀 (1.7에서 설명 하 고 개요로 그림 2에 표시 된)를 탑재, 나사 baseplate에 그것을 확보. 계속 수산화 효소 실험 버퍼의 ~ 200 µ L를 추가 합니다. 넓은 pH 범위, 버퍼링 수 혼합된 버퍼 시스템 유용 NiFe hydrogenases에 대 한 연구:56 나트륨 아세테이트, 2-[N'-morpholino] 탄 sulfonic 산 (MES), N'-[2-hydroxyethyl] piperazine-N' -[2 탄-sulfonic 산] (HEPES), N'-트라이앵글 [hydroxymethyl] 메 틸-3-아미노-프로 판-sulfonic 산 (도청), 그리고 2-[N'-cyclohexylamino] 탄 sulfonic 산 (CHES), 15 mM의 최종 농도에 각 구성 요소와 포함 된 0.1 M NaCl 전해질, 산도 pH 6을 사용 하 여 조정 지원 집중 NaOH 및 HCl. 참고: 작업 전극 연결 해야 내 다 약간 탄소 종이 (그림 2)에 좋은 전자 연결 spectroelectrochemical 셀 상단 (~0.1 m m)의 비행기 아래.</li>
	<li>연동 펌프 튜브와 실험 버퍼의 유리병을 포함 하는 흐름 시스템 솔루션 입구와 출구 spectroelectrochemical 셀의 연결. 포함 하는 분석기 '건조' 글러브 조립된 셀 전송.</li>
	<li>Spectroelectrochemical 셀 어셈블리 ATR 액세서리에 장착 합니다. potentiostat에 연결할 작업, 카운터 및 기준 전극. 연동 펌프 튜브 펌프에 연결 합니다.</li>
	<li>4000-1000 c m-1의 스펙트럼 범위 4 cm-1 해상도 1024 평균 interferograms로 흡 광도 스펙트럼을 기록, 참조/배경으로 3.4에서 수집 된 스펙트럼을 사용 하 여. 이 시점에서 스펙트럼 중요 한 포함 한다 (> 100 mO.D.) 아 미드 II ~ 1,540 c m-1 에서 밴드와 Hyd1의 활성 사이트 밴드는 스펙트럼 영역 1,850 2,150 cm-1, 산화, 비활성 상태 (그림 3에서 크게에 분명 해야한다 ).</li>
</ol>4. 대장균 Hydrogenase 1 및 Spectroelectrochemical 셀 테스트 활성화
<ol><li>Hyd1 수정 입자 필름을 감소 잠재력 (−0.8 V vs SCE)를 적용 합니다. Spectroelectrochemical 셀 통해 천천히 H2 와 흐름 버퍼와 실험 버퍼 포화. 예제는 Hyd1를 활성화 완전히 하룻밤 둡니다. 참고: 그것은 중요 한 혐 기성 H2, N2 등, 그래서 모든 혐 기성 가스를 사용 하는 O2 필터를 통해 전달 되어야 합니다.</li>
	<li>활성화 후 샘플의 흡 광도 스펙트럼을 기록 합니다. ΝCO 와 활성 사이트의 vCN 밴드 이제 감소, '활성'의 배포를 표시 합니다. 이것은 스펙트럼 3.10 (그림 4)에 기록 된 상대적인 차이 스펙트럼의 사용을 통해 가장 쉽게 관찰 된다.</li>
	<li>Spectroelectrochemical 셀의 전기 연결을 테스트 합니다. 이 위해 실험 버퍼 N2 가스로 포화. 일련의 산화 (0 V vs SCE)와 Hyd1 수정 입자 필름 (−0.8 V vs SCE) 후보 ( ca 30 분 기간)의 감소를 적용 하 고 각에서 흡 광도 스펙트럼을 기록. Hyd1 해야 될 급속 하 게 산화 하 고 감소, 그리고 입자 영화는 잘 연결 하는 경우 샘플의 100% 적용된 가능성에 응답 해야 합니다.</li>
	<li>실험적인 버퍼의 적절 한 흐름 속도 설정 합니다. 이렇게 하려면 샘플, 감소 잠재력 (−0.8 V vs SCE)를 적용 하 고 실험 버퍼 H2와 함께 포화. -0.707 사이 순환 voltammograms의 일련을 기록-0.039 V vs SCE 10 mV/s 스캔 속도에 점차적으로 H2의 흐름 속도 증가-voltammograms 촉매 형상 평면 회전에서 그를 닮을 때까지 사이 포화 버퍼 디스크 전극55 고 최대 전류는 유량 (그림 5)의 독립. 참고: H2 물에서의 용 해도 293 K와 1 개의 막대기에 ~0.8 m m 이다.</li>
	<li>샘플은 지금 PFIRE 측정을 위한 준비, 스펙트럼 솔루션 조건 (pH, 온도, H2 의 농도 등)의 범위 내에서 전위의 범위에서 수집 합니다. Electrocatalytic 프로세스 Hyd1에 의해 H2 산화 등을 공부 하는 때에 특히 광 및 전기 화학 데이터를 연결할 수 있어야 하는 것이 중요 하다 potentiostat 소프트웨어를 사용 하 여 모든 전기 화학 데이터를 기록 합니다.</li>
</ol>5. 분 광 데이터 처리
<ol><li>그 활성 사이트는 영구적으로 변경 되지 측정 과정 0 V −0.8 V vs 실험의 끝에 SCE에서 스펙트럼을 기록 하 여 확인 합니다. 이러한 스펙트럼 4.3에 기록 된 동일 해야 하 고 활성 사이트의 손실 측정 (그림 6) 동안 관찰 해야 합니다.</li>
	<li>적합 한 형태로 분석기 소프트웨어에서 절대 흡 광도 스펙트럼을 내보내기 (.csv, ASCII, 'matlab', Jcamp 등) 원본 또는 Matlab과 같은 소프트웨어를 사용 하 여 처리를 위해.</li>
	<li>
초기 계획 데이터를 그림 7에 나와 있는 프로세스를 사용 하 여 수정 합니다.
	<ol>
<li>작은 식별 범위 1800 2,150 cm-1에 각 흡 광도 스펙트럼의 두 번째 파생을 받아 (< 1 mO.D입니다.) 액티브 사이트 밴드 높은 곡선 물 배경.</li>
		<li>원래 흡 광도 스펙트럼에 기준선 마커 포인트를 놓고 ' 스냅 ' 실험 스펙트럼에 포인트를 설정 합니다.</li>
		<li>입방 스플라인 보간된 함수 또는 다항식 함수를 사용 하 여 포인트를 통해 기준에 맞게. 이 초기 함수를 실험 데이터에서 뺍니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 경쟁 금융 관심을 선언합니다.

PFIRE 산화 환 원 전극 움직일 단백질을 해결 하기 위한 광범위 하 게 적용 가능한 IR 분 광 기술입니다. 특히, 산화 환 원 효소의 electrocatalytic 반응 빠른 회전율 조건 하에서 조사 될 수 있습니다. PFIRE 메서드는 PFE 없습니다 직접 구조 정보를 제공 하 고 탄소 전극에 IR 분광학을 커플의 기술에 의해 제공 하는 직접 전기 컨트롤 작성 합니다. PFIRE 접근 따라서 혼자 전기 화학에서 사용할 수 있는 정보에 화학 통찰력을 추가 하 고 공부에 매우 적합 한 산화 단백질 및 효소의 분자 바인딩 및 활성화에 관여. 또한, PFIRE 촉매 회전율의 부재에 있는 단백질에 잠재력 종속 구조 변화에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 이러한 비-매출 전자 전송 이벤트 들은 PFE의 '표준' 응용 프로그램을 사용 하 여 감지 하기 어려운 푸리에 변환 AC voltammetry PFE의 확장 큰 성공을. 와 함께 사용 되었습니다. 45 , 46
PFIRE 메서드는, 원칙적으로, PFE를 사용 하 여 공부 될 수 있다 산화 환 원 단백질 든 지의 연구에 적합. 따라서, PFE와 마찬가지로 단백질 흡착 성공적인 PFIRE 실험에 대 한 중요 한 단계입니다. 이 프로토콜에서 우리는 PFIRE 기술 사례 연구로 대장균 Hyd1를 사용 하 여 응용 프로그램을 설명 합니다. 36 , 그러나 43 , 우리는 또한 적용 PFIRE 기술을 R. eutropha,44 에서 세포질 규제 hydrogenase 플 라빈 mononucleotide 카본 블랙에 흡착 하 고. 40 이 모든 경우에 수정 되지 않은 높은 표면적 카본 블랙 (로이 프로토콜에서 설명)을 간단한 물리적 흡착 높은 신호 대 잡음 비율 기록 좋은 품질 적외선 스펙트럼을 충분히 높은 단백질의 표면 적용을 제공 합니다. 흡착의 이러한 높은 레벨을 얻을 수 없는 경우에 그것은 전극 표면에 단백질의 공유 첨부 파일을 허용 하도록 예, 탄소 입자의 표면 수정 해야 합니다. 60 , 61 , 62 PFIRE 측정 한 글러브를 사용 하 여 때만 필요한 공부 샘플을 anaerobically를 처리 해야 합니다. 그러나 매우 일정 한 연습 및 글러브 분위기에서 제공 하는 수증기의 낮은 (< 80 ° C 이슬점) 수준에서 아주 작은 absorbances의 추출 수 있는 높은 신호-잡음 레벨을 제공 합니다. 44 많은 경우에는 혐 기성 환경, 글러브에서 제공 하는 또한 전기 화학 측정 (PFIRE 기술에 통합)에 대 한 바람직한 작업 전극에 O2 감소 때문에 현재를 피하기 위하여.
대량, 실험적인 버퍼에 샘플 흡착은 탄소 입자 IR absorbances 모든 실험 스펙트럼에 크게 기여할 고의 밴드를 겹칠 수 있는 관심, 특히는 아 미드에에서 I, II 및 III의 지역에서 스펙트럼입니다. 63 아 미드 지역에는 또한 flavins 또는 니코틴 cofactors로 기판 및 많은 산화와 감소 반응의 제품 유기 종에서 정보가 들어 있습니다. NiFe hydrogenases의 경우 활성 사이트의 ν ν와공동 CN 밴드 스펙트럼의 상대적으로 명확한 지역에 빠지게 하 고 그래서 PFIRE 기술을 아주 잘이 효소의 연구에 적합 하다. 그러나 다른 경우에, 차이 스펙트럼 동위 원소 라벨 접근 함께 필요할 수 있습니다 변경 고정된 단백질 인 분리. 비슷한 접근 식별, 예를 들어 protonation 변경, 구조상 재배열 하 고 Michaelis Menten 단지 적외선 분광학을 사용 하 여 공부에 사용 되었습니다. 64 , 65 , 66 PFIRE는, 그러므로, hydrogenases의 연구 하지만 모든 산화 단백질 포함 된 (또는 누구의 기판, 제품 또는 억제제 포함)에 적용할 수 있는 그룹 진단 IR 액티브 진동; 일산화 탄소 dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,14 flavoproteins,40 및 편대 dehydrogenases, 예를 들면.
관련된 기술, 세이 라, 아주 잘 biomimetic 환경에서 막 관련 단백질의 연구에 적합 하다. 32 세이 라 IR 분광학을 또한 ATR IR 구성을 사용 하 여 ATR 프리즘 (분노)의 표면에 분자 내에 있는 가까운 (몇 nm)의 IR 흡 광도 증폭 하는 표면 강화 효과의 사용의 적응 이다. 세이 라 절 묘하게 용 매에서 경쟁 신호에서 상대적으로 자유롭다 흡착된 단백질 및 막 아키텍처 내에서 발생 하는 스펙트럼 변화에 민감한 따라서 이며 기판/억제제 솔루션에서 제시. 이것은 분노의 표면 위에 상당히 큰 침투 깊이에 의존 하는 여기에 설명 된 PFIRE 기술은 달리 약간 (~ 1 μ m), PFIRE는 기판에 더 민감한 의미, 제품 또는 억제제 솔루션에서 제시. 이 증가 감도 '대량' 용 매를 유리할 수 있다; 기판 또는 제품 적외선에 의해 직접 관찰 될 수 있다, PFIRE 스펙트럼 긴 활성 종 및 electrocatalysis 중 관련된 제품 형성의 두 안정 상태 활동에 보고 합니다. 69 기질과 제품의 정상 상태 농도 관찰 하는 능력 (는 CO에 CO2, 강한 적외선 흡수의 가역 산화 catalyzes) 일산화 탄소 효소 등 효소에 대 한 특히 도움이 될 것입니다 또는 (는 CO2편대의 가역 산화 catalyzes) 편대 효소
현재, PFIRE 데이터 수집 및 ATR IR 형상에 대 한 분노의 표면에 효소를 '집중' 하는 데 사용 하는 거시적인 탄소 전극 인 효소 electrocatalysis의 정상 상태 운동 연구로 제한 됩니다. 이 점에서 NiFe hydrogenases의 PFIRE 학문은 빛 트리거 과도 흡수 적외선 분광학을 사용 하 여 하위 매출 달성 속도 론 연구49,50 다이어와 동료 들의 작품을 보완. 작업은 진행 spectroelectrochemical 셀,40 을 소형화 하 고 microelectrodes의 사용으로 달성 해야 마이크로초 순서 시간 분해능. 이 ca 까지 회전율 주파수와 효소에 대 한 하위 매출 달성 속도 론 연구-1100-500의 하면 그리고 감소 그리고 산화 과정의 연구를 수 있게 된다.
전반적으로, PFIRE 정상 상태 조건 하에서 산화 환 원 효소의 electrocatalytic 반응의 화학 특성을 허용 하는 광 기술입니다. PFIRE 접근 여러 화학 및 전기 화학 titrations를 단백질의 강력한 흡착을 제공 하는 높은 표면적 전극 사용으로 ATR IR 형상 허용 손쉬운 솔루션 exchange 같은 효소 샘플에 실행 될 수 있습니다. 효소 기능 중 같은 구조 정보를 현장에서 수집 하는 더 넓은 bioelectrochemistry 지역 사회에 대 한 귀중 한 도구입니다.

단백질 기능 연구에 핵심 과제 중 vivo에서 또는 사용 하 여 그들의 생리 적 역할을 수행 하는 단백질의 직접 관찰 절연 단백질 샘플을 허용 하는 현장에서 방법의 개발을 포함 한다. 이 단백질 기능 동시에 측정 하는 동안 컨트롤 또는 트리거링 실험 절차와 평가 될 모두 반응성을 허용 하는 결합 된 기술의 사용 프로세스의 통합 및 개별 화학 단계 필요 합니다. 산화 단백질의 경우이 종종 동일한 정확 하 게 적용 된 잠재력을 제어 하지만 화학적으로 특정에 민감한 분 광 기술로 직접 아무 화학 정보를 제공 하는 전기 화학 기법을 결합 하 변경 연관 단백질 기능입니다. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry는 다양 한 분 광 기술 및 전기 제어의 수준을 포함 하는 결합 된 전기 및 분 광 방법의 범위에 대 한 일반적인 용어입니다. 이 작은 분자를 사용 하 여 전자 전송, UV-표시,4,5 와 결합을 포함 하 여 중재를 연구에 이용 되 고 많은 단백질 인공, 수용 성 전자 기증자와 수락자로 전자를 교환할 수 있습니다. , 6 , 7 자석 원형이 색 성8 및 적외선5,,910,11,12,13,14 (IR) spectroscopies입니다. 제한 된 수의 경우 단백질과 전극 unmediated, 보급 통제 전자 교류를 악용 수 입증 했다. 15 , 16
촉매 반응에 대 한 실시 산화 환 원 효소, 현재의 솔루션 전기 화학 방법에 의해 명확한 불리. 될 가능성이 높습니다 확산 제어 전자 전송을 통해 redox 중재자 솔루션에서 속도 제한. 효소에 대 한 운동 및 기계 정보 손실 될 수 있습니다 또는 적어도 실험 방법에서 발생 하는 확산 유물에서 deconvolute 어려워. 직접, unmediated 전기 제어 따라서 산화 단백질 및 효소의 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 단백질 필름 전기 (PFE)의 기술 산화 환 원 전극 움직일 단백질, 전극 잠재력의 시리즈에서 편광으로 직접 또는 산화 환 원 공동 인자 단백질 내에서 전자 전송 되는 방식으로 사용 합니다. 17 , 18 , 19 PFE은 산화 환 원 효소에 의해 촉매 산화 또는 감소 반응의 연구에 대 한 특정 값의 계면 전자 전송 매우 높은 속도로 달성 될 수 있다. 예를 들어 Allochromatium vinosum 에서 니켈-철 합금 ([NiFe]) hydrogenase의 electrocatalytic 이직 률 PFE에 의해 H2 산화에 대 한 ca 1000-10000의− 1 로 측정 되었다. 20 잠재적인 전극 촉매 '' 또는 '해제' 및 효소 활동에 electrocatalytic 현재 보고서를 방 아 쇠 역할을 합니다. PFE 잠재력, [페]의 디-철 활성 사이트의 반응 등을 속속들이 의존 하는 복잡 한 효소의 반응성을 분석 하기 위한 유용한 방법 이므로-CO와 O2,21 hydrogenases 또는 잠재력 유도 hydrogenases,22 일산화 탄소 효소,23 및 다른 복잡 한 산화 환 원 효소의 비활성화 반응. 24
산화 환 원 효소, 1-2 pmol cm-2 [NiFe] hydrogenase A. vinosum에서 순서의 낮은 표면 범위에서 발생 하는 주요 장벽 PFE에 의해 받으면 직접 전기 제어와 분 광 기법을 결합 하 대량 금속 전극에 작은 분자 adsorbates의 표면 과학 연구 현장에 상대적인 20 . 이 분 광 측정의 감도 대 한 도전을 선물 한다. 여러 가지 spectroelectrochemical 방법을 보고 되었습니다 공부에 대 한 다양 한 다른 전극에서 산화 환 원 단백질 움직일: 투명 금속 산화물 전극;에서 UV 보이는 분광학 25 , 26 , 금 전극;에서 27 형광 분광학 28 , 29 (세이 라) 표면 강화 된 적외선 흡수 분광학에서 금 전극; 30 , 31 , 32 , 33 그리고 표면 강화 라만 분 광 기술을, 주로 실버 전극. 34 , 35
여기는 커플링 PFE IR 분광학, 단백질 영화 적외선 전기 화학 (PFIRE)로 알려져 있는 기술에 대 한 방법에 설명 합니다. 36 는 PFIRE 메서드는 산화 환 원 효소를 이용 하는 다양 한 탄소 표면에 단백질의 흡착의 용이성 감쇠 총 반사율 (ATR-IR) IR 기하학와 함께에서 높은 표면적 탄소 작업 전극에 움직일 수를 공부 한다. 적외선 분광학은 많은 작은 분자, ligands 및 공동 인자는 반응성, 바인딩, 억제 및 산화 환 원 상태를 평가 하는 데 사용할 수 있는 진단 absorbances 산화 환 원 효소와 단백질의 연구에 유용 합니다. 아니 철 황 센터, flavoproteins,38,,3940 작은 분자 헤 센터 등을37 연구의 바인딩을 등이 있습니다. 41 는 ATR-IR 형상 최적화 된 3-전극 (spectro) 전기 화학 셀42 의 건설을 허용 하 고 따라서 우수한 전기 제어를 제공 합니다. 솔루션 저항 및 잠재적인 드리프트 작업 전극 가까이 참조 전극 배치 하 여 최소화 됩니다. 높은 표면적 카운터 전극 빠른 효소 회전율 작업 전극에 의해 생성 하는 높은 electrocatalytic 전류와 호환 되는 사용 됩니다. Spectroelectrochemical 셀 솔루션의 흐름 손쉬운 제어를 기판, 저 해제 및 pH의 농도 수 있습니다. 36 , 43 , 44 는 PFIRE 메서드는 따라서 IR 스펙트럼이 지속적인된 효소 electrocatalysis 동안 기록 된 위치에 있을 수 있습니다. 36 , 44 PFIRE PFE 산화 환 원 효소에서 이외의 촉매 프로세스에서 정보를 추출이 어려울 수 있습니다 어디 달리 촉매 현재,43 의 부재에 화학 정보를 제공 하는 능력 이기도 합니다. 45 , 46
우리는 [NiFe] hydrogenases, 바이메탈 액티브 사이트에서 Fe를 조정 하는 내장 CO와 CN ligands를 포함 하 여 electrocatalytic H2 산화의 연구에 대 한 PFIRE 메서드를 증명 하고있다. 36 , 43 , 44 [NiFe] hydrogenases는 따라서 PFIRE에 의해 공부 하는 데 특히 적합. PFIRE 메서드를 사용 하면 정상 매출 중 존재 하는 종족에 대 한 정보를 제공 합니다. 및 따라서 실험적인 통제 없이 hydrogenases의 IR 분광학에 문학 부 뿐만 아니라 중요 한 기계적 통찰력을 제공 합니다. 동안 회전율. 47 , 48 다이어와 동료 고용 시간 해결 IR 메서드 NiFe hydrogenases,49,50,51 작은 부정적인 잠재적인 단계 (를 통해 사용 하거나 적용할 빛 방 아 쇠를 사용 하 여 연구를 솔루션 중재자와는 '감 금된' 전자 소스) 또는 photolyse 바운드 수소. PFIRE 메서드를 사용 하면 수 없습니다, 현재 제공 시간 분해능이이 측정에 맞게40 연구 공정의 감소와 산화 촉매, 잘 정의 된 잠재력의 범위에 액세스를 허용 하지 않으며 대량 전송에서 무료 제한입니다.
PFIRE 메서드는 산화 환 원 단백질, 또한 ATR IR 기하학을 사용 하 고 전극 표면에 흡착 분자의 IR 흡 광도 향상 시키기 위해 나노 roughened 금속 전극 사용의 세이 라 연구에 다릅니다. 30 세이 라 막 단백질, 특히 흡착 공부에 대 한 매우 중요 한 기술 또는 모방 막 내 아키텍처,32 그러나 금속 전극에 대 한 필요성 때문에 반응성 기판 및 억제제 범위를 제한할 수 있습니다. 작은 분자 CO, CN-, 공동2 등 을 향한 전극 지원의 양성자 감소와 자기 조립된 단층 탈 착은 매우 부정적인 잠재력에 금속 표면에 문제가 될 수 있습니다,1,52 보호에 효소 electrocatalysis 금속 전극 비록 보고 되었습니다. 53 , 54 세이 라를 기준으로 PFIRE의 단점은 막 단백질 네이티브 또는 모방 멤브레인 구조에 통합의 상대 어려움입니다. 그러나, 경쟁 작은 분자 활성화 반응에 탄소 전극의 상대 화학 inertness는 PFIRE 효소 electrocatalysis, 생물학 산화 환 원에 관련 된 낮은 잠재력 도메인에 특히 공부에 대 한 우수한 기술 hydrogenases에 의해 양성자 감소 등 프로세스입니다. 1 , 43
이 문서의 목표는 산화 환 원 전극 움직일 단백질, 예를 들어 대장균 에서 NiFe hydrogenase 1 (Hyd1)를 사용 하 여 공부에 대 한 기법으로 PFIRE 메서드를 소개 하는 것입니다. 샘플 준비, 좋은 기질 흐름과 데이터 처리에 대 한 요구의 고려 사항은 설명 합니다. PFIRE은 광범위 하 게 적용 가능한 기술, (와 함께 독특한 IR absorbances) 수 흡착 될 탄소 전극에도 직접 모든 산화 단백질을 공부 하 고 또는 그것으로 전자를 교환할 수 있는 그런 표면 개 질를 사용 하 여 적합된 합니다 전극입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">680-IR</td>
			<td style="width:167px;">with an external MCT detector</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ATR accessory</td>
			<td style="width:71px;">Pike Technologies</td>
			<td style="width:119px;">GladiATR</td>
			<td>Customised for use with a 5-reflection Si IRE</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glovebox</td>
			<td style="width:71px;">Glove Box Technology Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Custom designed &#39;wet&#39; and &#39;dry&#39; box for anaerobic sample handling and measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KBr window</td>
			<td style="width:71px;">Crystran</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Additional optics</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Components from a PM-IRRAS accessory</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Silicon IRE</td>
			<td style="width:71px;">Crystal GmbH</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potentiostat</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;">Autolab PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nova 10.1</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling the potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:71px;">Williamson Manufacturing Company Ltd</td>
			<td>QL-1000-024-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pt wire</td>
			<td style="width:71px;">Surepure Chemetals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3272</td>
			<td>99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon rod</td>
			<td style="width:71px;">WH Smith</td>
			<td align="right">30729209</td>
			<td>0.7 mm HB pencil lead</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbon black</td>
			<td style="width:71px;">Cabot Corporation</td>
			<td style="width:119px;">Black Pearls 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultrasonic bath</td>
			<td style="width:71px;">Ultrawave</td>
			<td style="width:119px;">U100</td>
			<td>35 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal filter</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC5050BK</td>
			<td>Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5452000018</td>
			<td>MiniSpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S/9240/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HNO3</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">N/2300/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">silicone sealant</td>
			<td style="width:71px;">Cow Corning Toray Co., Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">SE 4486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon paper</td>
			<td style="width:71px;">Toray</td>
			<td style="width:119px;">TGP-H-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OriginPro 2015</td>
			<td style="width:71px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data analysis/graphing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resolutions Pro 4.0</td>
			<td style="width:71px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling FTIR spectrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase

단백질 내 센터 화학 산화 환 원 정밀 하 게 제어를 제공 하는 산화 환 원 단백질 요구 방법의 이해. 있는 단백질은 움직일 전극 표면에 전극 대체 생리 전자 기증자 또는 수락자, 그런 단백질 필름 전기 화학의 기술을 다양 한 다른의 산화 환 원 반응으로 기능 통찰력 제공 단백질입니다. 전체 화학 이해 전기 제어를 추가 구조 및 기계적 통찰력을 추가할 수 있는 다른 기술로 결합 될 필요 합니다. 여기 기술, 단백질 영화 적외선 전기 화학, 산화 환 원 단백질의 적외선 분 광 샘플링 단백질 영화 전기 화학을 결합 하 여 설명 합니다. 기술은 높은 표면적 카본 블랙 전극에 움직일 산화 단백질을 다중 반사 감쇠 총 반사율 기하학을 사용 합니다. 흐름의 셀이 전극의 결합 솔루션 pH 또는 용 질 농도를 측정 하는 동안 변경 될 수 있습니다. 이것은 특히 강력한 산화 환 원 효소, 촉매 급속 한 회전율을 지속 수 있으며 촉매 메커니즘에 긴 중간 종의 분 광 관측을 허용 하는 전극에서 제어 해결. 회전율 (H2 산화)와 비-매출 조건에서 대장균 hydrogenase 1에 실험 기술을 설명합니다.

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Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

여기, 우리 기술, 단백질 영화 적외선 전기 화학, 탄소 전극에 직접 전기 통제 시선 공부 고정된 산화 단백질을 수 있는 설명 합니다. 단일 단백질 시료의 적외선 스펙트럼 적용된 잠재력의 범위는 다양 한 솔루션 조건 아래에 기록할 수 있습니다.

단백질 영화 적외선 전기 화학 [NiFe] Hydrogenase에 의해 H2 산화의 연구에 대 한 설명

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

protein-film-infrared-electrochemistry-demonstrated-for-study-h2

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

12.1K 조회수.  University of Oxford, Inorganic Chemistry Laboratory. 여기, 우리 기술, 단백질 영화 적외선 전기 화학, 탄소 전극에 직접 전기 통제 시선 공부 고정된 산화 단백질을 수 있는 설명 합니다. 단일 단백질 시료의 적외선 스펙트럼 적용된 잠재력의 범위는 다양 한 솔루션 조건 아래에 기록할 수 있습니다.

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Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

연구

생화학

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, cross-linking and/or disassembly. This protocol describes a technique &#8211; the actin co-sedimentation, or pelleting, assay &#8211; to determine whether a protein or protein domain binds F-actin and to measure the affinity of the interaction (i.e., the dissociation equilibrium constant). In this technique, a protein of interest is first incubated with F-actin in solution. Then, differential centrifugation is used to sediment the actin filaments, and the pelleted material is analyzed by SDS-PAGE. If the protein of interest binds F-actin, it will co-sediment with the actin filaments. The products of the binding reaction (i.e., F-actin and the protein of interest) can be quantified to determine the affinity of the interaction. The actin pelleting assay is a straightforward technique for determining if a protein of interest binds F-actin and for assessing how changes to that protein, such as ligand binding, affect its interaction with F-actin.

This protocol describes a method to test the ability of a protein to co-sediment with filamentous actin (F-actin) and, if binding is observed, to measure the affinity of the interaction.

공동 침강에 의한 F-actin에 대한 단백질 결합 측정

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing approaches suffer from significant limitations, we have developed a new method for determining TF-DNA binding affinities with high sensitivity on a large scale. The assay relies on the established fluorescence anisotropy (FA) principle but introduces important technical improvements. First, we measure a full FA competitive titration curve in a single well by incorporating TF and a fluorescently labeled reference DNA in a porous agarose gel matrix. Unlabeled DNA oligomer is loaded on the top as a competitor and, through diffusion, forms a spatio-temporal gradient. The resulting FA gradient is then read out using a customized epifluorescence microscope setup. This improved setup greatly increases the sensitivity of FA signal detection, allowing both weak and strong binding to be reliably quantified, even for molecules of similar molecular weights. In this fashion, we can measure one titration curve per well of a multi-well plate, and through a fitting procedure, we can extract both the absolute dissociation constant (KD) and active protein concentration. By testing all single-point mutation variants of a given consensus binding sequence, we can survey the entire binding specificity landscape of a TF, typically on a single plate. The resulting position weight matrices (PWMs) outperform those derived from other methods in predicting in vivo TF occupancy. Here, we present a detailed guide for implementing HiP-FA on a conventional automated fluorescent microscope and the data analysis pipeline.

Here we present a novel method for determining binding affinities at equilibrium and in solution with high sensitivity on a large scale. This improves the quantitative analysis of transcription factor-DNA binding. The method is based on automated fluorescence anisotropy measurements in a controlled delivery system.

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used for ATP production. The amphiphilic nature of membrane proteins requires particular attention to their handling, and reconstitution into the natural lipid environment is indispensable when studying membrane transport processes like proton translocation. Here, we detail a method that has been used for the investigation of the proton-pumping mechanism of membrane redox enzymes, taking cytochrome bo3 from Escherichia coli as an example. A combination of electrochemistry and fluorescence microscopy is used to control the redox state of the quinone pool and monitor pH changes in the lumen. Due to the spatial resolution of fluorescent microscopy, hundreds of liposomes can be measured simultaneously while the enzyme content can be scaled down to a single enzyme or transporter per liposome. The respective single enzyme analysis can reveal patterns in the enzyme functional dynamics that might be otherwise hidden by the behavior of the whole population. We include a description of a script for automated image analysis.

Here, we present a protocol to study the molecular mechanism of proton translocation across lipid membranes of single liposomes, using cytochrome bo3 as an example. Combining electrochemistry and fluorescence microscopy, pH changes in the lumen of single vesicles, containing single or multiple enzyme, can be detected and analyzed individually.

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with neurodegenerative conditions such as Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s diseases. In particular low molecular weight aggregates, amyloid oligomers, have been shown to possess generic cytotoxic properties and are implicated as neurotoxins in many forms of dementia. We illustrate the use of methods based on atomic force microscopy (AFM) to address the challenging task of characterizing the morphological, structural and chemical properties of these aggregates, which are difficult to study using conventional structural methods or bulk biophysical methods because of their heterogeneity and transient nature. Scanning probe microscopy approaches are now capable of investigating the morphology of amyloid aggregates with sub-nanometer resolution. We show here that infrared (IR) nanospectroscopy (AFM-IR), which simultaneously exploits the high resolution of AFM and the chemical recognition power of IR spectroscopy, can go further and enable the characterization of the structural properties of individual protein aggregates, and thus offer insights into the aggregation mechanisms. Since the approach that we describe can be applied also to the investigations of the interactions of protein assemblies with small molecules and antibodies, it can deliver fundamental information to develop new therapeutic compounds to diagnose or treat neurodegenerative disorders.

We describe the application of infrared nanospectroscopy and high-resolution atomic force microscopy to visualize the process of protein self-assembly into oligomeric aggregates and amyloid fibrils, which is closely associated with the onset and development of a wide range of human neurodegenerative disorders.

적외선 나노 스펙트로펙트 및 원자력 현미경으로 개별 단백질 응집체 특성화

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the dissection and manipulation of biological pathways. Currently, only a limited number of chemically induced dimerization (CID) systems exist and engineering new ones with desired sensitivity and selectivity for specific small-molecule ligands remains a challenge in the field of protein engineering. We here describe a high throughput screening method, combinatorial binders-enabled selection of CID (COMBINES-CID), for the de novo engineering of CID systems applicable to a large variety of ligands. This method uses the two-step selection of a phage-displayed combinatorial nanobody library to obtain 1) &#34;anchor binders&#34; that first bind to a ligand of interest and then 2) &#34;dimerization binders&#34; that only bind to anchor binder-ligand complexes. To select anchor binders, a combinatorial library of over 109 complementarity-determining region (CDR)-randomized nanobodies is screened with a biotinylated ligand and hits are validated with the unlabeled ligand by bio-layer interferometry (BLI). To obtain dimerization binders, the nanobody library is screened with anchor binder-ligand complexes as targets for positive screening and the unbound anchor binders for negative screening. COMBINES-CID is broadly applicable to select CID binders with other immunoglobulin, non-immunoglobulin, or computationally designed scaffolds to create biosensors for in vitro and in vivo detection of drugs, metabolites, signaling molecules, etc.

Creating chemically induced protein dimerization systems with desired affinity and specificity for any given small molecule ligand would have many biological sensing and actuation applications. Here, we describe an efficient, generalizable method for de novo engineering of chemically induced dimerization systems via the stepwise selection of a phage-displayed combinatorial single-domain antibody library.

결합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계별 파지 선택에 의해 고도로 특이적 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템 생성

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

체노하브디염 예쁜꼬마선충의 단백질 상호작용 연구를 위한 생체내 하이드록실 라디칼 단백질 발자국

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...