이 연구는 국립 암 연구소 (NCI) 보조금 U54CA143798 및 U54CA143907에 의해 자금 지원을 받아 Dana-Farber Cancer Institute 및 Southern California 대학에서 물리 과학 종양 센터 (PS-OC)를 설립했습니다. SM Mumenthaler는이 작업 중 일부를 지원하는 PS-OC 트랜스 네트워크 상을 수상했습니다. 우리는 Operetta HCS 플랫폼을 기부 한 박애주 의자, 특히 Stephenson 가족, Emmet, Toni 및 Tessa에게 깊은 감사의 말을 전합니다. J. Foo 교수와 응용 분자 과학 센터 팀 : D. 임상 지침 및 멘토링을위한 Agus, 실험 디자인과의 의미있는 토론을위한 Patsch, R. Rawat, 이미지 분석 프로토콜 지원 , Operetta와의 기술 지원에 대한 J. Katz, 그리고 도움이되는 토론과 피드백을위한 P. Macklin과 D. Ruderman.

1. 세포 배양 참고 : 여기서 폐 섬유 아세포 (CCD - 19Lu GFP)와 공동 배양했을 때 EGFR 표적 제제 인 erlotinib에 대한 NSCLC 세포 (H3255)의 표현형 반응을 조사했습니다. 동일한 데이터 세트의 경우, 두 개의 세포 집단 (H3255 및 CCD-19Lu GFP)의 형광성 및 형태 학적 분류를 통해 일치도를 예시했습니다. 그러나 하나의 분류 방법 만 사용해야하고 응용 프로그램을 기반으로 선택해야합니다. <ol><li> 10 % 열 불 활성화 FBS와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 RPMI - 1640 500 ML을 준비합니다. 참고 : 성장 매체와 보충제는 다른 세포 유형에 따라 필요에 따라 교체 할 수 있습니다. </li><li> 37 ℃에서 5 % CO 2의 순수한 개체로 10cm 3 판에 배양 한 다음 3-4 일마다 적절한 비율로 통과시킵니다. </li></ol> 2. 세포의 준비 <ol><li> 세포 현탁액을 준비하려면 c배지를 말리고 5 ML 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세포를 씻으십시오. </li><li> PBS에서 대기음을 제거하고 37 ° C로 가온 한 0.05 % 트립신 1 mL를 넣고 37 ° C에서 5 분간 (또는 세포가 더 이상 플레이트에 붙지 않을 때까지) 품어 둔다. </li><li> 트립신을 중화시키기 위해 H3255와 CCD-19Lu GFP 플레이트에 RPMI 4 mL를 넣고 세포 용액을 15 mL 원추형 튜브에 넣으십시오. </li><li> RT에서 5 분 150 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 상등액을 대기음으로 옮기고 원추형 튜브에 RPMI 배지 10 mL에 resuspend cell pellets를 뿌려 시딩 준비를하십시오. </li></ol> 3. 셀 도금 <ol><li> 씨 뿌리기를 표준화하기 위해 세포 수를 세십시오. <ol><li> 튜브를 반전시켜 용액에서 세포를 혼합합니다. microcentrifuge 튜브에 각 세포 현탁액 10 μL 피펫과 10 μL trypan 파란색을 추가합니다. </li><li> 이 용액 10 μL를 셀 계수 슬라이드에 넣고 자동 셀 카운터에 넣습니다. 참고 : 세포 계수의 다른 방법 ( 즉. 혈구 계)를 사용할 수있다. </li><li> 적어도 세 번이나 셀 카운트가 일치 할 때까지 셀 카운트를 반복하십시오. </li></ol></li><li> 멀티 웰 판에 씨앗 세포를 뿌린다. 참고 : 시드 할 플레이트 수는 이미지화 할 시점 수에 따라 다릅니다. 또는 세포가 histone-2B-GFP (또는 적절한 핵 분할을 제공하는 기타 안정한 렌티 바이러스 핵 염색제)로 형질 전환되면 한 번에 한 장의 플레이트를 재 이미징 할 수 있습니다. <ol><li> RPMI 100 μL에 총 1,500 세포 / 웰을 씨닝하십시오. H3255, CCD - 19Lu GFP 및 50 % H3255 + 50 % CCD - 19Lu GFP 세 세포 인구를 판금 세 세포 현탁액을 준비합니다. 각 시점마다 동일한 플레이트 셋업을 사용하여 각각을 3 번씩 수행하십시오. 참고 : 초기 시딩 밀도는 각 세포주 및 플레이트 크기에 맞게 최적화해야합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 3 x 96- 웰 플레이트에서 세포를 시드. 37 ° C, 5 % CO 2 에서 세포 O / N을 품어. </li></ol> &lt;/ li&gt; </ol> 4. 약물 투약 <ol><li> erlotinib 분말에 DMSO를 넣어 10mM 농도의 최종 erlotinib 저장 용액을 만듭니다. 참고 : 약물은 원하는대로 대체 할 수 있습니다. </li><li> 세포 배양 배지로 약물을 희석하여 10 μM에서 가장 높은 최종 농도의 최종 농도로 만들고 1:10 비율로 4 회 연속 희석하여 총 5 가지 약물 농도와 약물 관리 없음으로합니다. 참고 : DMSO의 농도가 가장 높은 약물 용량에서 0.1 % v / v와 같거나 초과하는 경우 관찰 된 효과가 DMSO 독성으로 인한 것이 아닌지 확인하기 위해 무 약물 대조군에 DMSO가 동량 포함되어야합니다. </li><li> 약 100 μL의 약물 용액을 적절한 웰에 피펫 팅하여 최종 약물 농도를 1 배로 희석한다. </li></ol> 5. 이미지 수집 참고 : 이미지는 0 일, 2 일 및 3 일에 획득했습니다. 세포 유형과 세포 과정에 따라 연구 할 때,원하는 시점들이 연구 될 수있다. <ol><li> 이미징을 준비하기 위해 세포를 얼룩지게하십시오. <ol><li> 염료 용액을 다음 최종 농도로 보충하십시오. <ol><li> 형광 기반 분류의 경우, 5 μg / ML 핵 얼룩과 PBS에 5 μm의 죽은 세포 얼룩을 준비합니다 ( 재료 표 참조). </li><li> 형태학 기반 분류의 경우, 5 μg / mL의 핵 염색, 5 μM의 죽은 세포 얼룩 및 PBS에서 5 μM의 세포 얼룩을 준비하십시오 ( 재료 표 참조). </li></ol></li><li> 각 우물에 20 μL 염료 솔루션을 추가하십시오. 빛으로부터 보호 된 37 ° C에서 30 분 동안 품어 낸다. </li></ol></li><li> 이미지 최적화 및 획득. <ol><li> 인큐베이터에서 잘 플레이트를 제거하고, 70 % EtOH와 플레이트의 하단을 닦아 및 이미징 챔버에 접시를 놓습니다. </li><li> &#39;설정&#39;탭에서 &#39;채널 선택&#39;아래의 &#39;+&#39;버튼을 클릭하여 채널을 추가하십시오.이미지 ( 즉, brightfield, 핵 얼룩, 죽은 세포 얼룩, GFP 및 RFP 신호). </li><li> &#39;레이아웃 선택&#39;을 클릭하고 초점 평면을 확인하기 위해 0 μm에서 시작하여 20 μm에서 끝나는 2 μm마다 z- 스택 테스트 이미지를 가져옵니다. &#39;높이&#39;아래의 모든 채널에 대해이 거리를 입력하십시오. </li><li> 강도를 평가하고 노출 시간을 최적화하려면 각 채널 아래의 &#39;Snapshot (스냅 샷)&#39;을 클릭하십시오. 필요에 따라 &#39;시간&#39;아래에서 더 높거나 낮은 값을 입력하십시오. </li><li> 화면의 오른쪽에서 플레이트 구조도의 적절한 우물 (이미지 할 수 있음)을 강조 표시합니다. 아래의 우물 도식에서 유사한 방식으로 이미지화 할 25 개의 필드를 강조 표시하십시오. </li><li> &#39;실험 실행&#39;에서 왼쪽 탭의 &#39;플레이트 이름&#39;에있는 플레이트를 식별하고 &#39;시작&#39;버튼 (아래)을 클릭하여 전술 한 채널에서 그레이 스케일 TIFF 이미지를 생성하는 10X 대물 렌즈로 이미지 수집 프로토콜을 실행합니다. 참고 : 단계별 설치이미징 프로토콜의 폐색은 계측기마다 다를 수 있지만 매개 변수 값은 여전히 ​​최적화되어야합니다. </li><li> 2 일과 3 일에 이미징을 반복하십시오. </li></ol></li></ol> 6. 이미지 분석 참고 : 모든 이미지 분석은 독점 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 그러나 공개적으로 사용할 수 없기 때문에 CellProfiler 2.2 및 CellProfiler Analyst 2.0에 대한 간략한 프로토콜과 자세한 프로토콜이 보충 자료로 제공됩니다 (테스트 이미지는 이미 워크 플로를 테스트하기 위해 파이프 라인으로로드 됨). 이 실험의 이미지를 각 웰을 개별적으로로드 할 수 있도록 웰 단위로 그룹화했습니다. 아래의 CellProfiler 파이프 라인에는 각 이미지 파일 이름의 메타 데이터 정보를 구문 분석하는 정규 표현식이 포함되어있어 채널별로 이미지를 그룹화 할 수 있습니다. <ol><li> 오픈 소스 소프트웨어 다운로드 및 설치 : &#39;CellProfiler9; 및 &#39;CellProfiler Analyst&#39;. 설치 중에 모든 기본 옵션 및 애드온을 수락하십시오. </li><li> heterocellular 문화를 subpopulations로 분류하십시오. <ol><li> &#39;CellProfiler&#39;소프트웨어를 열고 &#39;파일&#39;| &#39;파이프 라인 가져 오기&#39;| &#39;From File&#39;을 선택하고 적절한 파일 (형광 기반 분류의 경우 &quot;Fluorescence_Classification.cppipe&quot; , 형태 기반 분류의 경우 &quot;Morphology_Classification.cppipe&quot;)을 선택하십시오. 참고 :이 파일에는 기본 이미지 처리 및 핵 / 셀 세분화를위한 프로토콜이 포함되어 있습니다. 이 세포들 사이에 고르지 않은 Hoechst 염색이 있었기 때문에 핵을 분할하고 확대 한 다음 낮은 강도의 핵을 분할 할 수 있도록 이미지를 가면 사용했습니다. <ol><li> 형광 기반 분류 파이프 라인을 선택하여 세포를 eGFP 강도에 따라 H3255 또는 CCD-19Lu로 분류하고 형태 특징을 계산합니다. 참고 : CCD-19Lu 세포는 GFP로 형질 도입되었다. </li><li> 모폴로지 기반 분류 파이프 라인을 선택하여 핵과 셀을 분류하고 모폴로지 기능을 계산합니다. 참고 : 분류를 위해서는 &#39;CellProfiler Analyst&#39;의 추가 다운 스트림 분석이 필요합니다. 죽은 세포는 형광에 기초한 분류를 통해 분류됩니다. </li></ol></li><li> 화면 왼쪽 하단의 &#39;출력 설정보기&#39;를 클릭하십시오. 분석 할 이미지 파일의 위치 ( &#39;기본 입력 폴더&#39;)와 추출 된 데이터의 대상 ( &#39;기본 출력 폴더&#39;)을 선택하십시오. </li><li> &#39;Analyze Images&#39;를 클릭하여 분석을 시작하십시오. 분석이 완료되면 &#39;확인&#39;을 클릭하고 &#39;기본 출력 폴더&#39;로 이동하여 계산 된 데이터를보십시오. 참고 : 예제 매개 변수 값 및 이미지는 Supplemental File 1-CellProfilerProtocol.pdf 에서 볼 수 있습니다. </li><li> 형태학 기반 분류 (only)의 경우 다음을 수행하십시오. <ol><li> &#39;CellProfiler Analyst&#39;소프트웨어를 열고 CellProfiler에서 생성 된 데이터베이스 속성 파일을 선택하고 &#39;열기&#39;를 클릭하십시오. </li><li> 화면 왼쪽 상단의 &#39;분류 자&#39;탭을 클릭하십시오. 실험에서 임의의 셀 이미지를 호출하려면 &#39;가져 오기&#39;를 클릭하십시오. 이미지가 분류되지 않은 창에 나타납니다. </li></ol></li><li> 세포를 적절한 bin으로 선택하고 끌어서 세포를 양성 (H3255) 또는 음성 (CCD-19Lu)으로 수동 분류합니다 ( 보충 파일 2-Pipeline.pdf : 그림 B 참조 ). 하위 집단 당 적어도 50 개의 세포를 분류 한 후 &#39;Train Classifier&#39;를 클릭 한 다음 &#39;Check Progress&#39;를 클릭하십시오. 참고 : 셀은 사용자가 감독하는 무작위 포리스트 시스템 학습 알고리즘 12 를 통해 분류됩니다. 정확도가 승인 된 임계 값 (&gt; 90 %)을 초과하지 않으면 &#39;CellProfiler&#39;에서 셀 세분화를 최적화하거나 셀을 classi에 적합하지 않을 수 있습니다형태학에 의해 fying. </li><li> 각 하위 집단에 대한 세포 계수가있는 표를 생성하려면 &#39;점수 모두&#39;를 클릭하십시오. </li></ol></li></ol>

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The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features. 
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately. 
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations. 
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.

세포 기반 분석은 기초 연구 및 약물 개발 환경에서 중요한 역할을했습니다. 그러나 이러한 표준 분석법의 한계는 시험관 내 및 임상 데이터 간의 불일치와 대부분의 약물이 FDA 승인을받지 못함에 따라 점차 명백해졌습니다. 여기에서, 우리는 관련있는 공동 발생 환경 자극에 대한 응답으로 heterocellular phenotypes를 동시에 분석하기 위해 정량 이미징을 이용하는 새로운 방법을 제시한다. 세포 생존 능력을 측정하는 데 사용되는 전통적인 세포 기반 분석에는 trypan blue exclusion assay, MTT / MTS 및 Annexin V-FITC 유동 세포 계측법 염색이 있습니다. Trypan Blue 배제 분석은 간단하면서도 저렴하면서 많은 수의 세포가 필요하며 시간이 많이 걸리고 사용자 편향 1의 영향을 받는다. MTT 및 MTS는 미토콘드리아 신진 대사 속도 측정을 통해 간접적으로 세포 생존력을 측정합니다. 그러나, 대사 활성세포의 종류는 다른 배양 조건 (배지 또는 산소 농도)에 의해 영향을받을 수 있으며 부정확 한 결과를 초래하고 세포 유형 및 조건 2 , 3에서의 표준화를 방지합니다. 이 기술의 또 다른 주요 단점은 여러 세포 유형을 구별 할 수 없다는 것입니다. 대부분의 생물학적 시스템은 이종 세포입니다. 유동 세포 계측법은 여러 세포 집단을 구별 할 수있는 능력을 가지고 있지만 세포 표지가 필요하고 동적 시료 채취가 어려우며 부착 세포를 사용할 때이 응용 프로그램은 시간이 많이 걸리고 오류가 발생하기 쉽습니다. 형태 학적 변화를 포함하여 다른 중요한 세포 표현형은 환경 적 자극에 반응하여 발생하지만 전통적인 세포 기반 검정법에 의해 포착되지 않는다. 형태 학적 특성화 및 샘플 간의 유사성 매핑을 통해 셀 상태를 프로파일 링하는 것은 강력하고 편향되지 않은 도구로서기본 세포 생물학 및 약물 발견을 포함하여 기본 및 번역 연구의 여러 측면에 대한 새로운 통찰력 제공 4 . 또한, 종양 세포 형태는 종양 아형 5 및 공격성 6 과 상관 관계가있는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 세포의 특징을 연구하고 특정 환경 섭동과 관련되는 방법을 연구하는 것은 큰 관심사입니다. 또한, 형태 학적 특징의 차이를 이용하여 공동 배양 시스템에서 부분 집단을 구별 할 수있다. 형광 라벨링 세포는 고유 한 세포 특성을 변경하고 시간이 오래 걸리므로 세포 유형을 분류하는 추가 방법이 유리합니다. 현미경 기반 이미징은 다중화되고 정량적이며 견고한 방식으로 세포 표현형을 프로파일 링하는 대체 방법입니다. 이 원고에서는 Evolutio를 강조하기 위해 양적 이미징 파이프 라인을 적용합니다종양 내 이종 세포 집단의 역 동성 우리는 비소 세포 폐암 (NSCLC) 세포와 종양에서 발견되는 가장 흔한 간질 세포 유형 인 암 관련 섬유 아세포 (CAF) 간의 상호 작용에 중점을 둡니다. CAF는 종양 발생, 진행 및 치료 반응에 관련되어왔다. 따라서 CAF가없는 경우 종양 세포에서 표현형 검사를 수행하는 것은 오해의 소지가있을 수 있습니다 ( 7 , 8 , 9) . 특히 우리는 NSCLC의 임상 치료에 종종 사용되는 상피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 표적으로하는 작은 분자 인 erlotinib에 대한 반응으로 종양 세포에 대한 CAF의 효과를 평가했다. 우리는 평가를 위해 고화질 심사 플랫폼 및 관련 이미지 분석 소프트웨어를 활용했습니다. 그러나이 방법론을 다른 연구자가 이용할 수 있도록하기 위해 오픈 소스 소프트웨어를 사용하는 유사한 다운 스트림 프로토콜을 개발했습니다.CellProfiler 10 및 CellProfiler Analyst 11 . 대부분의 이미지 기반 고감도 스크리닝 분석은 특정 기기 모델에 특화된 상용 소프트웨어로 분석됩니다. 기본 알고리즘이 종종 독점적이기 때문에 다른 소프트웨어를 사용하는 다른 랩에서 결과를 복제하기가 어렵습니다. 이 이미지 기반 파이프 라인을 사용하여 형광 및 형태 기반 분류를 사용하는 약물 치료에 대한 이종 세포 배양의 각 하위 집단의 세포 증식, 사망 및 형태를 측정했습니다. 다음 프로토콜은 복잡한 셀룰러 프로세스를 프로빙하는 강력한 방법을 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="677">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td style="width:191px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">FBS</td>
			<td style="width:127px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15-140-122</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450102</td>
			<td>cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">TC20 slides with trypan blue</td>
			<td style="width:127px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1450003</td>
			<td>cell counter slides</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">96-well plates</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3904</td>
			<td>clear bottom black plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Erlotinib</td>
			<td style="width:127px;">LC Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">E-4007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">DMSO</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">317275-100ML</td>
			<td>solution to resuspend drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Hoechst</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">H21491</td>
			<td>nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td>dead cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Cell Tracker Orange CMRA</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34551</td>
			<td>whole cell stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">Operetta high content imaging system</td>
			<td style="width:127px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:240px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:127px;">Broad Institue</td>
			<td style="width:119px;">version 2.2.0 (rev 9969f42)</td>
			<td>http://cellprofiler.org/releases/</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:240px;">Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:191px;">Any cell culture incubator will be suitable - cells were cultured under 37 &#186;C at 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">15 mL Falcon conical tubes</td>
			<td style="width:127px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:240px;">10 cm2 cell culture plates</td>
			<td style="width:127px;">TPP</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discrimination and characterization of heterocellular populations using quantitative imaging techniques

세포 과정은 복잡하고 여러 세포 유형과 환경 사이의 상호 작용으로 발생합니다. 현존하는 세포 생물학 기술은 종종이 상호 작용의 정확한 해석을 허용하지 않습니다. 정량적 이미징 기반 접근법을 사용하여, 우리는 환경 적 자극의 변화에 ​​대한 이종 세포 집단의 동적 표현형 반응 ( 즉, 형태학 변화, 증식, 세포 사멸)을 특성화하기위한 고 내용 프로토콜을 제시한다. 우리는 형광 강도 또는 응용 프로그램에 따라 고유의 형태학 기능을 기반으로 세포 유형을 구별하는 우리의 능력을 강조 표시합니다. 이 플랫폼은 전통적인 세포 생물학 분석보다 짧은 시간, 적은 양의 시약 및 오류 가능성을 활용하면서 섭동에 대한 하위 집단 반응의보다 포괄적 인 특성 분석을 가능하게합니다. 그러나 어떤 경우에는 세포 집단이 복잡한 cellu를 기준으로 확인 및 정량하기가 어려울 수 있습니다lar 기능과 추가 문제 해결이 필요합니다; 우리는 프로토콜에서 이러한 상황의 일부를 강조합니다. 우리는 암 모델에서 약물에 대한 반응을 사용하여이 응용 프로그램을 시연합니다. 그러나, 그것은 다른 생리적 인 과정에 더 넓게 쉽게 적용될 수있다. 이 프로토콜은 공동 문화 시스템 내에서 하위 집단을 식별하고 각각 외부 자극에 대한 특정 반응을 특성화 할 수있게합니다.

우리는 총 4,050 개의 개별 이미지를 위해 3 개의 플레이트에서 25 개 / 웰, 54 웰 / 플레이트 (3 개 세포 집단 x 6 약물 농도 x 3 복제본)로 구성된 이미지 세트를 생성했습니다. 실험 과정 동안 생성 된 이미지 세트는 독점 소프트웨어 (물질 표 참조)를 사용하여 세포의 다양한 양적 특성 ( 즉 형태, 형광)을 추출하여 세포 부분 집단을 분류하는 데 사용할 수있었습니다. 그러나 사용 된 상업용 소프트웨어에는 액세스가 제한되어 있기 때문에 CellProfiler 및 CellProfiler Analyst의 유사한 다운 스트림 파이프 라인이 만들어졌습니다. 부분 집단으로의 이종 세포 분류 핵은 DNA 염색 (여기에서는 Hoechst)을 기반으로 확인되고 분절화되었으며 세포 집단은 형광 또는 MO( 그림 1 ). 형광 기반 분류의 경우, 섬유 아세포 (CCD-19Lu)는 이전에 GFP- 렌티 바이러스로 형질 도입되었다. GFP 강도 수준은 각각의 핵에 대해 측정되었고, 허용 된 문턱 값 (배경 신호에 기초) 이상으로 계산 된 것들은 CCD-19Lu로 분류되었지만 아래의 것들은 종양 세포 (H3255)로 분류되었다. 형태학 기반의 분류를 위해, 세포는 이전에 무독성 세포 염색 (물질 표 참조)으로 염색되었으며 이것은 세포질을 확인하고 분할하는 데 사용되었습니다. 기계 학습 알고리즘은 각 집단으로부터 ~ 50-100 개의 세포로 훈련되었다. 형태 학적 특징은 개체군간에 현저히 다르며, CCD-19Lu와 H3255 세포를 구별하기 위해 선형 분류기를 설계하는 데 사용되었다. 형광 및 형태 분류 프로토콜은 두 세포 포퓰을 구별하는데있어서 97.4 % (n = 1403) 일치 하였다약물 치료 조건 (1μM erlotinib)에서 92.5 % (n = 916)의 일치 성을 보였다 ( 그림 2 ). 부분 집단의 표현형 분석 세포 유형을 구별하는 것 외에도 우리는 각 하위 집단의 표현형 특성을 특성화하는 것을 목표로했다. 멀티 플렉스 분석은 시간과 시약을 절약하고, 일관성을 추가하며, 연구중인 시스템에 관한 추가 정보를 제공합니다. 많은 잠재적 인 표현형 산출물이 있으며, 관심있는 질문에 따라 선택해야한다. 여기 erlotinib 치료에 대한 반응으로 세포 형태와 생존력의 변화가 조사되었다. 3 일간의 약물 치료 후 핵 영역의 감소와 H3255 세포 ( 도 3A )의 세포 면적의 증가가 관찰되었다. 핵 면적의 평균 차이&quot;약물 없음&quot;및 &quot;약물 치료&quot;집단은 양면성 2 형 (균등 변이) t 검사 ( p = 7.92 x 10 -16 )를 통해 통계적으로 유의미한 것으로 나타났다. 우리는이 관찰이 약물 치료에 의해 부과 된 스트레스에 대한 세포 반응이라는 가설을 세웠다. 그것은 또한 임상 적으로 심각한 영향을 미치기 때문에 약물이 세포 독성 ( 즉 , 시간에 따라 죽은 세포의 수가 증가 함) 또는 세포 분열 ( 즉 , 시간에 따른 세포 출생의 수를 감소 시킴) 효과를 갖는지 여부를 연구하는 것도 중요합니다. 예를 들어, 세포 증식 억제 약물 효과는 성장 정지를 유도하지만 종양에서 세포를 제거하지 않으므로 일단 약물이 제거되면 암세포가 세포 증식을 재개 할 가능성이 있습니다. 약물 효과는 종종 문맥, 농도 및 세포 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 이전에 erlotinib가 하나의 세포 유형에서 세포 독성 반응을 이끌어내는 것을 관찰하면서 ac다른 13 에서의 반응. 전통적인 생존 능력 분석은 상대적 세포 수를 산출하므로 성장 정지와 세포사를 구별하지 않습니다. 여기에서, 죽은 세포는 propidium iodide stain을 기반으로 확인되었다 ( 그림 3B ). H3255 세포에 대한 erlotinib의 세포 독성 및 세포 증식 억제 효과는 약물 치료 후 사망 수의 증가와 출생 수의 감소와 함께 관찰되었다 ( 그림 3C ). 죽은 세포의 수가 1 일 후에 세포 누출로 인해 떨어지게된다는 사실은 주목할 가치가있다. CCD-19Lu 세포는 약물에 의해 영향을받지 않았다. 이 플랫폼의 또 다른 이점은 정량적 데이터 생성입니다. 예를 들어, 우리의 공동 배양 실험에서, H1155 세포를 함유하지 않은 3 일 동안, 또는 erlotin으로 H3255 세포의 초기 부 집단이 2,817 (87.9 %) 또는 396 (57.2 %) 인 것으로 밝혀졌다( 그림 4 ). 우리는 상대적인 비율 대신에 실제 세포 수를 산출 할 수 있기 때문에 (유동 세포 계측법에서와 같이), 약물 치료 동안의 조성의 변화는 H3255 세포의 감소 때문이고 CCD-19Lu의 증가는 아니라고 결론 지었다. 실험적으로 평가하기 어렵고 세포 유형에 따라 다를 수있는 세포 허가 (cell clearance)로 인해 사망률이 과소 평가 될 수 있다는 것은 아무 가치가 없습니다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig1.jpg" /> 그림 1 : 이미지 분석 프로토콜 개요. 형태 기반 분류 또는 형광 기반 분류를 사용하여 이종 세포 집단을 분류 할 수있는 두 가지 잠재적 다운 스트림 이미지 분석 파이프 라인. 스케일 바 = 100 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55844/55844fig1large.jpg" target="_blank">그녀를 클릭하십시오.</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 e를 누르십시오. <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig2.jpg" /> 도표 2 : 형태학과 형광 근거한 분류 사이의 일치. ( A ) 두 분류 프로토콜의 중첩을 나타내는 일치도 그림. 동일한 세포는 형태학 및 형광 기반 분류를 사용하여 H3255로 분류되었다. 두 가지 프로토콜은 치료되지 않은 세포의 97.4 % (n = 1403)와 erlotinib로 치료 한 세포의 92.5 % (n = 916) (참고 : 흰색 영역은 너무 작아서 시각화 할 수 없음)에 대해 일치했다. ( B ) 형광 기반 및 형태 기반 분류 사이의 양호 및 불량 일치의 예를 묘사하는 10X 이미지. 흰색 화살표는 플랫폼간에 불일치하게 분류 된 셀을 가리 킵니다. 입력 이미지 : 파란색 - 핵 (Hoechst); 녹색 - CCD19Lu (GFP). Classi약물 이미지 : 적색 - H3255; 녹색 - CCD-19Lu. 스케일 바 = 100 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55844/55844fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig3.jpg" /> 그림 3 : 단일 실험 설정에서 멀티 플렉스 된 표현형 측정. ( A ) 핵 및 세포 면적과 같은 형태 학적 특징은 약물의 존재 및 부재하에 단일 세포 수준에서 계산되었다. 참고 : 100 μm 2 보다 작은 셀 면적은 잔해로 간주되어 분석에서 제외됩니다. 상자 플롯은 1 분위 및 3 분위 범위와 95 % 신뢰 구간 오차 막대를 갖는 중앙값을 나타냅니다. ( B ) H3255 (청색) 및 CCD-19Lu (녹색) 세포를 공동 배양하고 프로피트의 강도에 따라 사균을 확인 하였다ium iodide stain (적색)으로하고 10X 대물 렌즈를 사용하여 이미지화합니다. 눈금 막대 = 1 mm (상단 패널); 100 μm (하단 이미지). ( C ) 살아있는 세포와 죽은 세포의 총 수는 약물 치료 여부에 관계없이 3 일 동안 계산되었으며, erlotinib의 추가로 생존 세포 수와 죽은 세포의 양이 현저히 감소했다. 오차 막대는 세 번의 반복을 바탕으로 한 평균의 표준 오차를 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55844/55844fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig4.jpg" /> 그림 4 : 시간의 경과에 따른 집단 기반의 역학. 약물 사용 여부에 따라 0 일 또는 3 일째에 H3255 (파란색) 및 CCD-19Lu (녹색)가 포함 된 우물의 대표적인 10X 이미지. 각 하위 집단에 속하는 세포를 세었고 비례 원형 차트는표본 전체의 인구 구성 변화. 스케일 바 = 1 mm (중간 패널, shpwn in, eftmost 패널), 1 mm (상단 이미지), 100 μm (하단 이미지). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55844/55844fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

우리는 섭동에 반응하여 이종 세포 집단 역학을 연구하기위한 새로운 프로토콜을 개발했다. 이 원고는 heterocellular population의 여러 세포 phenotypes의 강력한 특성화를위한 정량적 인 데이터 세트를 견고한 방식으로 생산하는 이미징 기반 플랫폼을 설명합니다.

정량적 이미징 기법을 이용한 이종 세포 집단의 차별화 및 특성 규명

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

discrimination-characterization-heterocellular-populations-using

Research

JoVE Journal

Biology

7.4K 조회수.  University of Southern California (USC).  우리는 섭동에 반응하여 이종 세포 집단 역학을 연구하기위한 새로운 프로토콜을 개발했다. 이 원고는 heterocellular population의 여러 세포 phenotypes의 강력한 특성화를위한 정량적 인 데이터 세트를 견고한 방식으로 생산하는 이미징 기반 플랫폼을 설명합니다. 

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Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

연구

생물학

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

이미징 CA의 기술 2 + 인간 정자의 시그널링

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

특정 엔도와 exoglycosidases를 사용하여 단백질 글리코 실화의 식별 및 특성

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

세포 내 칼슘 측정<sup&gt; 2 +</sup개의 기술하여 인간 정자에서&gt; 변경 : 기존 Fluorometry은 흐름 Fluorometry, 유동 세포 계측법 및 단일 세포 이미징을 중지

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

개발 및 특성화의<em&gt; 체외</em&gt; 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; 전</sub&gt; 및 질소 산화물 생산

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

고정의 이미지 Prometaphase 및 중기 감수 분열의 I위한 기술<em&gt; 초파리</em&gt; 난 모세포

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

해양 tubeworm 인 라이브 광학 및 전자 현미경 기술을 사용하여 석회화 이벤트의 특성

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...