Name: production of chemicals by klebsiella pneumoniae using bamboo hydrolysate as feedstock
Uploaded: 2017-06-29T14:00:00.000+00:00
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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (Grant No. 21576279, 20906076)과 KRIBB Research Initiative Program (KGM2211531)에 의해 지원되었다.

1. 대나무 가수 분해물의 제조 <ol><li> 대나무 분말 5 g을 40 mL의 NaOH 용액에 넣고 250 mL 플라스크에서 10 % (g / g) 최종 농도를 얻습니다. 0.05M ~ 0.50M 범위의 NaOH 용액을 0.05M 단위로 사용하십시오. <ol><li> 혼합물을 60 ° C 또는 100 ° C의 수욕에서 60 분간 품어 낸다. 121 ° C에서 고압 멸균기에서 인큐베이션하십시오. </li></ol></li><li> 배양 후, 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 방치한다. 그런 다음 상층 액을 제거합니다. 신선한 물 100 ML을 추가하고 섞는다. <ol><li> 상청액의 pH가 6.8에이를 때까지 5-6 회 세척한다. 효소 가수 분해의 다음 단계에서 얻어진 고체를 사용하십시오. </li></ol></li><li> 가수 분해를 위 해 98 % H 2 SO 4를 사용하여 50 mL의 상기 혼합물을 pH 5.0으로 조절한다. 그런 다음 200 개의 여과지 활동 (FPU) / mL 셀룰라아제 0.5 mL를 첨가하십시오. 참고 : 대나무 sh에 cellulase의 최종 비율대나무 1g 당 20FPU가되어야합니다. </li><li> 셰이커에서 혼합물을 50 ° C에서 36 시간 동안 인큐베이션한다. 참고 : 가수 분해가 끝나면 일부 고형물이 혼합물에 남아있게됩니다. </li><li> 7,690 xg에서 5 분간 원심 분리하여 맑은 가수 분해물을 얻습니다. </li><li> 굴절률 검출기와 광 다이오드 어레이 검출기가 장착 된 고압 액체 크로마토 그래프 시스템으로 포도당, 자일 로스 및 기타 화학 물질을 정량하십시오. HPX-87H 컬럼 (300mm x 7.8mm)과 5mM H 2 SO 4 용액의 이동상을 0.8mL / min의 유속으로 사용하십시오 12 . </li><li> 다량의 가수 분해물을 제조하려면 대나무 분말 2 kg과 0.25 M NaOH 18 L을 30 L 스테인레스 스틸 탱크에 섞으십시오. <ol><li> 121 ℃에서 60 분 동안 오토 클레이브에서 탱크를 인큐베이션한다. 배양 후 60L 플라스틱 탱크에서 40L의 물로 혼합물을 씻는다. 이 세척을 5 번 반복하십시오. </li><li> 물을 사용하여 씻은 대나무 전체를 20L의 볼륨으로 조절하십시오.98 % H 2 SO 4를 사용하여 혼합물의 pH를 5.0으로 조정한다. </li><li> 혼합물이 잘 분산되도록하기 위해 기계적 교반기가 장착 된 수정 된 진탕 수조에서 혼합물을 효소 적으로 가수 분해하십시오. 200 FPU / ML cellulase 200 ML을 추가하고 혼합물을 50 ° C에서 36 시간 동안 항온 배양하십시오. </li><li> 가수 분해 한 후, 혼합물을 4,700 xg에서 10 분간 원심 분리한다. </li></ol></li></ol> 2. Wildtype K. pneumoniae에 의한 2,3- 부탄디올 생산 <ol><li> 중간 준비 용 용매로 3L의 대나무 가수 분해물을 사용하십시오. </li><li> 4 g / L 옥수수 침지액, 2 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 6 g / LK 2 HPO 4 , 3 g / L KH 2 PO 4 및 0.2 g / L MgSO 4를 함유 한 발효 배지를 준비한다. 2.5 M NaOH를 사용하여 중성의 pH를 조정한다. 발효를 위해 3L의 오토 클레이브 발효 배지가 들어있는 5L 바이오 리액터를 사용하십시오. </li><li> K. pneumoniae 사용-80 ° C 저온 냉장고에 보관 된 세포. </li><li> 종자 배양을 위해 Luria-Bertani (LB) 배지 50 mL가 들어있는 250 mL 플라스크를 37 ° C에서 밤새 배양하고 200 rpm으로 흔들어 준다. 10 g / L 트립 톤, 5 g / L 효모 추출물 및 10 g / L NaCl을 함유하는 LB 배지를 사용한다. 참고 : 종자 배양의 세포 밀도는 OD 2 (600 nm에서의 광학 밀도)에 도달해야합니다. </li><li> 바이오 리액터에 50 mL의 씨드 배양 플라스크를 접종한다. pH 6.0 및 37 ° C에서 배양 물을 유지하십시오. 2 L / min의 공기 보충 속도와 250 rpm의 교반 속도를 사용하여 미세 혐기성 조건을 만듭니다. </li><li> 발효 중에 2 시간마다 5 mL의 샘플을 채취하고 고농도 액체 크로마토 그래피로 분석하여 브로 쓰의 화학 물질 농도를 측정하십시오 4 . <ol><li> MFCS / DA를 사용하여 온라인으로 생물 반응기에 첨가 된 알칼리를 모니터링하십시오. 참고 : 유기산은 발효 과정에서 생성됩니다.NaOH를 첨가하여 배양 pH를 안정되게 유지하십시오. 첨가 된 알칼리의 부피는 생성 된 산의 양을 나타낸다. 알칼리 첨가 라인이 평탄 해지면, 탄소원 소진 또는 세포 사멸로 인해 공정이 완료됩니다. </li></ol></li></ol> 3. K. pneumoniae 의 budC 돌연변이에 의한 R- 아세토 인 생산 <ol><li> 4 g / L 옥수수 침지액, 2 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 3 g / L 나트륨 아세테이트, 0.4 g / L KCl 및 0.1 g / L MgSO 4를 함유 한 아세토 인 생산 용 배지를 준비한다. </li><li> R- 아세토 인 생산에는 K. pneumoniae-ΔbudC 를 사용하십시오. 2.4-2.5 단계를 반복하십시오. 참고 : budC 는 2,3- 부탄디올 탈수소 효소를 암호화합니다. K. pneumoniae-ΔbudC 는 2,3- 부탄디올 탈수소 효소 활성을 잃고 2,3- 부탄디올 대신 R- 아세토 인을 생산합니다. </li><li> pH 6.0 및 37 ° C에서 배양 물을 유지하십시오. 4 L / min의 공기 보충 률을 사용하십시오.호기성 조건 인 450 rpm의 속도. 참고 : 산소 보충은 2,3- 부탄디올 생산보다 높습니다. </li><li> 단계 2.6에서와 같이 샘플을 분석합니다. </li></ol> 4. K. pneumoniae 의 budA 돌연변이에 의한 2-Ketogluconic Acid 생산 <ol><li> 2- ketogluconic acid 생산을 위해서는 R- acetoin 생산과 동일한 배지를 사용하십시오. </li><li> 2- 케토 글루 콘산 생산에는 K. pneumoniae-ΔbudA 를 사용하십시오. 2.4-2.5 단계를 반복하십시오. 참고 : budA 는 α- 아세토 락 테이트 디카 르 복실 라제를 암호화합니다. K. pneumoniae-ΔbudA 는 포도당을 기질로 사용하여 α- 아세토 락 테이트 디카 르 복실 라제 활성을 잃고 2- 케토 글루 콘산을 생산합니다. 주 : 2- 케토 글루 콘산 합성은 산성 조건에 따른 과정이다. 2- 케토 글루 콘산 생산을 위해 2- 단계 발효가 개발되었다. 첫 번째 단계에서는 종자 배양 물을 바이오 리액터에 접종한다. </li><li&gt; pH 7.0 및 37 ℃에서 배양한다. 4 L / min의 공기 공급 속도와 500 rpm의 교반 속도를 사용하십시오. 참고 :이 조건에서 세포는 매우 빠르게 성장합니다 (세포 밀도는 약 4 시간 후 OD 7에 이릅니다). 그런 다음 발효가 두 번째 단계로 진행되는 동안 배양 pH는 5.0으로 감소합니다. 산은 첨가하지 않는다; 배양 물에서 생성 된 유기산은 자연적으로 pH 감소로 이어진다. 이러한 산성 조건에서 세포 성장은 멈추지 만 2- ketogluconic acid가 합성되어 수프에 축적됩니다. </li><li> 단계 2.6에서와 같이 샘플을 분석합니다. 대나무의 가수 분해물을 탄소원으로 사용. 주 : 배지의 포도당은 2- 케토 글루 콘산으로 전환되고, 크실 로스는 크 실로 닉산으로 전환됩니다. 따라서, 2- 케토 글루 콘산과 크 실론 산의 혼합물이 얻어진다. </li></ol>

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K. pneumoniae 는 Enterobacteriaceae 에 속하는 Klebsiella 속에 속한다. K. pneumoniae 는 토양, 식생 및 물과 같은 자연 환경에 널리 분포합니다 14 . 이 연구에서 사용 된 야생형 K. pneumoniae 균주는 토양으로부터 분리되어 1,3- 프로판 디올 생산에 사용되었다. K. pneumoniae 와이 종의 돌연변이 체는 다른 조건에서 많은 화학 물질을 생산합니다. 문화 pH와 공기 보충은 K. pneumoniae의 화학 생산에 영향을 미치는 핵심 요소입니다. Wildtype K. pneumoniae 는 pH 6에서 주요 catabolite로 2,3- 부탄디올을 생산하지만, 2- 케토 글루 콘산은 pH 5 또는 9 에서 배양 할 때 주요 catabolite로 변합니다. 공기 보충 물의 증가는 2,3- 부탄디올 합성을 감소 시키지만, R- 아세토 인 합성은 개선된다 8 </s업&gt;. 세포 배양 용 플라스크 대신에 안정한 배양 pH 및 정확한 공기 보충을 돕는 생물 반응기가 사용됩니다. 따라서, 매체의 리터가 필요합니다. 이 연구에서 사용 된 전처리 방법은 Hong et al. 16 실험실에서, 특히 리터 규모에서 수행하기 쉽습니다. 전처리 온도가 높을수록 효소 가수 분해 동안 설탕 생산이 유리합니다. ≤ 100 ℃에서의 처리는 수조에서, 그리고 오토 클레이브에서 121 ℃에서 수행되었다. 이 두 가지 장비는 실험실에서 흔히 볼 수 있으며 여러 배치의 액체가 여러 리터 처리되었습니다. 고온에서는 고압 원자로가 필요합니다. 예를 들어, 우리 연구실은 50-mL 및 1-L 고압 반응기를 가지고 있지만,이 리액터의 부피는 바이오 매스 전처리 동안의 사용을 제한합니다. 이 연구에서 보여준 대나무 가수 분해물 준비는 flasks에서 수행하기 쉬웠다.. 그러나, 대량으로 행해지면,보다 낮은 수준의 글루코오스 및 크 실로 오스가 때때로 얻어진다. 가수 분해 혼합물은 잘 분산되어 있어야합니다. 바이오 매스의 침전은 가수 분해 수준을 낮추게된다. 순수한 글루코오스 및 크 실로 오스와 달리 바이오 매스 가수 분해 물은 미생물의 성장을 억제하는 많은 독성 화학 물질에 의해 오염됩니다. 이러한 저해제를 제거하기 위해 많은 방법이 개발되었지만 공정 비용이 추가되고 설탕 생산량이 감소하는 경향이 있습니다. 이 연구에서는 억제제를 제거하기위한 특별한 작업이 수행되지 않았습니다. 본 연구에서 생성 된 대나무 가수 분해물을 원료로 사용하여 포도당 소비시 첫 번째 단계에서 포도당 대 2,3- 부탄디올의 생산성 (0.95 g / Lh)과 전환율 (0.25 g / g)이 낮았다 정제 된 포도당이 탄소원으로 사용되었을 때보 다 이전에보고되었다 (각각 1.4g / Lh 및 0.3g / gm). 2,3- 부탄의 생산성자일 로스가 소비 된 제 2 단계 동안의 iol은 제 1 단계에서보다 느렸다. 그러나 크 실로 오스의 2,3- 부탄디올 전환율은 0.34g / g에 달했으며, 이는 정제 된 포도당을 탄소원으로 사용했을 때보 다 높았다. 대나무 가수 분해 생성물을 원료로 사용하는 R- 아세토 인 생산은 생산성 및 기질 전환율이 각각 0.92 g / Lh 및 0.29 g / g이었다. 이 두 비율은 정제 된 포도당이 기질로 사용되었을 때보 다 낮았다 (각각 1.7g / Lh 및 0.34g / g). 본 연구에서 2- 케토 글루 콘산의 생산성과 전환율은 각각 2.3g / Lh와 0.91g / g로, 정제 된 포도당을 탄소원으로 사용했을 때보 다 낮았다 (각각 4.2g / Lh와 1g / g ) 10 . 크 실로 오스는 글루코스 다음으로 자연에서 두 번째로 풍부한 설탕입니다. 포도당과 달리, 자일 로스는 대부분의 미생물에 쉽게 이용되지 않습니다. 이 스터드화학 생산을 위해 K. pneumoniae 에 의해 자일 로스가 완전히 소비되었다. R- 아세토 인, 2- 케토 글루 콘산 및 자일로 닉산은 모두 가치있는 화학 물질이며, 이들의 생산 공정은 소기류에서 고도의 호기성 조건으로 다양하다. 발효 결과는 대나무 가수 분해물의 당류가 K. pneumoniae의 성장 및 다른 조건에서의 화학 생산에 적합한 탄소원임을 나타냅니다. 공급 원료로서 바이오 매스 가수 분해물을 사용하는 것은 화학 생산을위한 유망한 방법입니다. 그러나 전처리 된 바이오 매스를 세척하는 데 필요한 많은 양의 물과 효소 가수 분해에 필요한 시간이 길어서 해결해야하는 많은 단점이 여전히 남아 있습니다.

Klebsiella pneumoniae 는 호기성과 혐기성 조건 모두에서 잘 자라는 박테리아입니다. K. pneumoniae 는 많은 화학 물질 생산에 사용되는 중요한 산업 미생물입니다. 1,3- 프로판 디올은 폴리 트리 메틸렌 테레 프탈레이트를 합성하는 모노머로서 주로 사용되는 유용한 화학 물질입니다. 폴리 트리 메틸렌 테레 프탈레이트는 1,2- 프로판 디올, 부탄디올 또는 에틸렌 글리콜 1 보다 우수한 특성을 나타내는 생분해 성 폴리 에스테르입니다. 1,3- 프로판 디올은 K. pneumoniae 가 산소 제한 조건에서 글리세롤을 기질로 사용하여 생산됩니다 2 . 2,3- 부탄디올 및 그 유도체는 플라스틱, 용매 생산 및 합성 고무 분야에서 응용 분야를 가지며 바이오 연료로 사용될 잠재력을 가지고있다 3 . 글루코스를 기질로하는 2,3- 부탄디올은 야생형 4 주 대사 산물입니다. 2,3- 부탄디올은 synthesiz피루브산에서 에드. 첫째, 두 분자의 pyruvate가 응축되어 α-acetolactate를 생성한다. 이 반응은 α- 아세토 락 테이트 신타 제에 의해 촉매된다. α-acetolactate는 α-acetolactate decarboxylase에 의해 acetoin으로 전환된다. 부탄디올 탈수소 효소에 의해 촉매 될 때 R- 아세토 인은 2,3- 부탄디올로 더 감소 될 수있다. K. pneumoniae에 적합한 효율적인 유전자 대체 방법이 연구되었으며, 많은 돌연변이 체가 5 , 6 , 7 구축되었다. 2,3- 부탄디올 탈수소 효소 활성을 잃은 budC 돌연변이 체는 배양액에서 높은 수준의 아세토 인을 축적합니다. 아세트 인은 식품의 풍미를 향상시키는 첨가제로 사용됩니다 8 . α- acetolactate decarboxylase를 코딩하는 budA 가 돌연변이되면 2- 케토 글루 콘산이 배양액에 축적된다. 2- 케토 글루 콘산은 에리 토르 브산 (isoascorbic acid)의 합성에 사용되며,, 식품 산업에서 사용되는 산화 방지제 9 . 2- 케토 글루 콘산은 포도당 산화 경로의 중간체이며; 페리 플라 즘 공간에 위치한이 경로에서 글루코스는 글루 콘산으로 산화 된 다음 2- 케토 글루 콘산으로 더 산화된다. 페리 플라 즘에서 생성 된 글루 콘산 및 2- 케토 글루 콘산은 추가 대사를 위해 세포질로 수송 될 수있다. 2- 케토 글루 콘산의 축적은 산성 조건에 달려 있으며, 공기 보충이 높을수록 2- 케토 글루 콘산 생산이 유리합니다 10 . Gluconate dehydrogenase ( 갓 에 의해 코드화 됨) 글루 콘산의 2- 케톨 구연산으로의 전환을 촉매한다. K. pneumoniae 의 gad 돌연변이 체는 2- ketogluconic acid 대신에 고농도의 gluconic acid를 생산했으며,이 과정은 또한 산성 조건에 달려있다. 글루 콘산은 벌크 유기산으로 시멘트 1 의 물성을 높이기위한 첨가제로 사용됩니다.1. 글루 콘산으로의 글루코스 산화는 글루코오스 탈수소 효소에 의해 촉매된다. Xylose는 포도당 탈수소 효소의 적절한 기질이기도합니다. 기질로 키 실로 오스를 사용하면 키모로 오스 산이 생성됩니다. 바이오 매스를 원료로 사용하는 화학 생산은 생명 공학 분야에서 가장 중요한 주제입니다 13 . 바이오 매스의 주성분은 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 리그닌이다. 그러나 이러한 거대 분자 화합물은 대부분의 미생물 ( K. pneumoniae 포함)에 의해 직접적으로 대사 될 수 없습니다. 바이오 매스의 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스는 반드시 가수 분해되어 포도당과 크 실로 오스가되어야하며 미생물에 의해 사용될 수 있습니다. 리그 노 셀룰로오스에 리그닌이 존재하면 효소에 의한 바이오 매스 가수 분해를 방지하는 보호막이 형성됩니다. 따라서, 리그닌 및 헤미셀룰로오스를 제거하고 셀룰로오스의 결정 성을 감소시키는 전처리 공정은 마이크에 의한 바이오 매스 이용 중에 항상 수행된다roorganisms. 많은 전처리 방법이 개발되었습니다 : 산성, 알칼리성, 암모니아 및 증기 전처리가 일반적입니다. 대나무는 열대 및 아열대 지역에 풍부하며 중요한 바이오 매스 자원입니다. 여기서는 대나무 가수 분해물의 제조 및 대나무 가수 분해물을 이용한 화학적 생산이 제시된다

<table><tbody><tr><td>autoclave</td><td>SANYO</td><td>3780</td><td></td></tr><tr><td>bioreactor</td><td>Sartorius stedim biotech</td><td>Bostat Aplus</td><td></td></tr><tr><td>agitator</td><td>IKA</td><td>RW 20</td><td></td></tr><tr><td>water bath shaker</td><td>Zhicheng</td><td>ZWY-110X50</td><td></td></tr><tr><td>high performance liquid chromatograph system</td><td>Shimadzu Corp</td><td>20AVP</td><td></td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Hitachi</td><td>CR22G III</td><td></td></tr><tr><td>Bamboo powder</td><td>purchased from Zhejiang Province, China</td><td></td><td>mesh number, 50</td></tr><tr><td>cellulase</td><td>Youtell Biochemical, Shandong, China</td><td></td><td>200 PFU/mL</td></tr></tbody></table>

production of chemicals by klebsiella pneumoniae using bamboo hydrolysate as feedstock

대나무는 중요한 바이오 매스이며 대나무 가수 분해 물은 화학 물질 생산을위한 공급 원료로 Klebsiella pneumoniae에서 사용됩니다. 여기서, 대나무 분말을 NaOH로 전처리하고 중성 pH로 세척 하였다. 셀룰로오스를 전처리 된 대나무 분말에 첨가하여 글루코오스 30g / L 및 크실 로스 15g / L를 함유하는 가수 분해물을 생성시키고 화학 생산 용 매질을 제조하기위한 탄소 공급원으로 사용 하였다. 미세 혐기 조건에서 배양되었을 때 야생형 K. pneumoniae에 의해 12.7 g / L 2,3- 부탄디올이 생성되었다. 호기 조건에서 K. pneumoniae 의 budC 돌연변이 체에 의해 13.0g / L의 R- acetoin이 생산되었다. 25.5 g / L 2- 케 토글 루콘 산과 13.6 g / L 크 실로 닉산의 혼합물은 높은 공기 보충을 통한 2 단계, pH 조절 발효에서 K. pneumoniae 의 budA 돌연변이 체에 의해 생산되었다. 발효의 첫 번째 단계에서, 배양 물은 중성 pH로 유지되었다; 세포 성장 후, 발효n 단계는 문화가 산성화되는 것을 허용하는 두 번째 단계로 진행되었다.

이 프로토콜에서는 대나무가 알칼리를 사용하여 사전 처리되었습니다. 그림 1 과 2 에서 121 ℃와 0.25M NaOH의 최적 인큐베이션 매개 변수가 결정되었습니다. 전처리 된 대나무를 효소 적으로 가수 분해하고, 가수 분해물에서 얻은 포도당과 자일 로스의 농도를 측정 하였다. 온도가 높을수록 설탕 생산에 유리하므로 121 ℃가 최적 온도로 선택되었습니다. 가수 분해물에서 생성 된 포도당과 자일 로스는 0.05-0.25 M 범위의 NaOH 농도로 증가 하였다. NaOH 농도의 증가는 설탕 생산에 긍정적 인 영향을 미치지 않았다. 따라서, 0.25M에서 NaOH가 최적 농도로 선택되었다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55828/55828fig1.jpg" /> 그림 1 : 전처리 온도가 포도당과 자일로 오스에 미치는 영향대나무 가수 분해물에 집중. 빨간 란 : 포도당; 파란색 열 : xylose. 높은 온도는 설탕 생산에 유리했으며 121 ℃는 대량의 가수 분해물 제조를 위해 선택되었습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55828/55828fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55828/55828fig2.jpg" /> 그림 2 : 대나무 가수 분해물의 포도당과 자일 로스 농도에 대한 전처리 과정에서 사용 된 NaOH 농도의 영향. 빨간 선 : 포도당; 파란색 선 : xylose. 가수 분해물에서 생성 된 포도당과 자일 로스는 0.05-0.50M 범위의 NaOH 농도로 증가하였으며, 0.25M이 대량 가수 분해물 제조를 위해 선택되었다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55828/55828fig2large.jpg" target="_blank">그 사람을 클릭하십시오.</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 플라스크 스케일의 효소 적 가수 분해에서 약 20g / L 글루코오스와 10g / L 크실 로스가 생성되었다. 대량의 가수 분 해산물로부터 30g / L 글루코오스 및 15g / L 크 실로 오스를 얻었다. 이는 대량 수 량 준비가 개방 수조 쉐이커에서 수행되었고 일부 수분이 공정에서 증발되어 가수 분 해산물의 농도를 초래했기 때문입니다. 대나무 가수 분해물의 글루코오스와 크 실로 오스는 화학 생산을위한 탄소 공급원으로 K. pneumoniae에 의해 사용되었습니다. 가수 분해물의 다른 화합물은 다음과 같다 : 1.4g / L의 셀로 오스 오스, 8.9g / L의 아라비 노스, 1.9g / L의 아세트산, 0.2g / L의 포름산. 2,3- 부탄디올은 소 혐기 조건에서 K. pneumoniae 에 의해 생산되었다 ( 그림 3 ). 과정은 2 개의 기간으로 분할되었다. f에서첫째, 포도당은 7.6 g / L의 2,3- 부탄디올을 생산하기 위해 세포에 사용되었고, 브로 쓰의 크실 로스 수준은 변하지 않았다. 포도당은 8 시간에 소진되었으며, 이번에는 다음 기간으로 이동했다. 두 번째 기간에서는 배지의 크 실로 오스가 세포에 사용되었고 추가로 5.1g / L의 2,3- 부탄디올이 생성되었다. 2,3- 부탄디올의 생산은 두 번째 기간에서 더 느렸다. 이 과정이 끝나면 총 12.7g / L의 2,3- 부탄디올이 생성되었다. 이 공정의 부산물은 젖산, 아세트산 및 에탄올입니다. 젖산과 에탄올은 주로 (포도당을 탄소원으로 사용하는) 첫 번째 기간에 합성되었고, 아세트산은 연속적으로 합성되었다. <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55828/55828fig3.jpg" /> 그림 3 : 대나무 가수 분해물을 원료로 사용하는 2,3- 부탄디올 생산. 빨간 선 : 포도당; 청색 라인 : 크 실로 오스; 엄마젠타 라인 : 2,3- 부탄디올; 오렌지 라인 : 젖산; 검은 선 : 아세트산; 녹색 라인 : 에탄올. 가수 분해물의 글루코오스와 크 실로 오스는 모두 2,3- 부탄디올 합성에 사용되었지만 글루코스가 먼저 사용되고이어서 크 실로 오스가 사용되었습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55828/55828fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> R- acetoin은 호기성 조건 하에서 K. pneumoniae 의 budC 돌연변이 체에 의해 생산되었다 ( 그림 4 ). 야생형 균주에 의한 2,3- 부탄디올 생성에서와 마찬가지로, 글루코스 및이어서 크 실로 오스가 K. pneumoniae-ΔbudC에 의해 연속적으로 사용되었다. Xylose는 16 시간에 소진되었으며, 소비량은 야생형에 의한 2,3- 부탄디올 생산에서보다 빠르다. R- 아세토 인의 생성은 공정 말기에 13 g / L이었고, 부산물은 2,3- 부탄디올, 아세트산 및 e고맙다. <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55828/55828fig4.jpg" /> 그림 4 : 대나무 가수 분해물을 원료로 사용하는 R- 아세토 인 생산. 빨간 선 : 포도당; 청색 라인 : 크 실로 오스; 바이올렛 라인 : 아세토 인; 자홍색 선 : 2,3- 부탄디올; 검은 선 : 아세트산; 녹색 라인 : 에탄올. 가수 분해물의 글루코오스와 크 실로 오스는 모두 R- 아세토 인 합성에 사용되었으며, 그 사용법은 순차적이었다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55828/55828fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2-ketogluconic acid와 xylonic acid는 K. pneumoniae 의 budA 돌연변이에 의해 생산되었다 ( 그림 5 ). 이 과정에는 높은 공기 보충이 필요했습니다. 배지 중의 글루코스를 먼저 글루 콘으로 전환시켰다ic acid를 함유하고 있습니다. 글루 콘산은 8 시간 배양시 15g / L의 최대 수준에 도달하였으며, 그 후 농도가 감소 하였다. 2-ketogluconic acid는 6 시간까지 배양되지 않았다. 그런 다음 높은 속도로 합성되었고, 25g / L 2- 케 토글 코콘 산이 공정의 끝까지 생산되었다. 배지 중의 크 실로 오스를 크 실로 닉산으로 전환시켰다. 이 반응은 글루 콘산으로의 글루코오스 전환보다 나중에 시작되었다. 일부 아세트산은 공정 중에 부산물로 생성됩니다. <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55828/55828fig5.jpg" /> 그림 5 : 대나무 가수 분해물을 원료로 사용하는 2- ketogluconic acid와 xylonic acid 생산. 빨간 선 : 포도당; 오렌지 라인 : 글루 콘산; 자홍색 라인 : 2- 케토 글루 콘산; 청색 라인 : 크 실로 오스; 검은 선 : 아세트산; 녹색 라인 : 에탄올. 가수 분해물의 글루코오스를 글루 콘산추가로 2- 케토 글루 콘산으로 전환시켰다. 가수 분해물 중의 크 실로 오스는 크 실로 닉 산으로 전환되었다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55828/55828fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

대나무 분말을 NaOH로 전처리하고 효소 적으로 가수 분해시켰다. 대나무의 가수 분해물은 Klebsiella pneumoniae에 의한 2,3- 부탄디올, R- 아세토 인, 2- 케토 글루 콘산 및 크 실로 산 생산을위한 공급 원료로 사용되었다.

화학 제품의 생산<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Bamboo 가수 분해물을 공급 원료로 사용

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

production-chemicals-klebsiella-pneumoniae-using-bamboo-hydrolysate

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

8.9K 조회수.  Chinese Academy of Sciences.  대나무 분말을 NaOH로 전처리하고 효소 적으로 가수 분해시켰다. 대나무의 가수 분해물은 Klebsiella pneumoniae에 의한 2,3- 부탄디올, R- 아세토 인, 2- 케토 글루 콘산 및 크 실로 산 생산을위한 공급 원료로 사용되었다. 

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Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high quality paper. Black liquor is a pulping waste generated by the kraft process that has potential for downstream bioconversion. However, the recalcitrant nature of the lignocellulose resources, its chemical derivatives that constitute the majority of available organic carbon within black liquor, and its basic pH present challenges to microbial biodegradation of this waste material. Methods for the collection and modification of black liquor for microbial growth are aimed at utilization of this pulp waste to convert the lignin, organic acids, and polysaccharide degradation byproducts into valuable chemicals. The lignocellulose extraction techniques presented provide a reproducible method for preparation of lignocellulose growth substrates for understanding metabolic capacities of cultured microorganisms. Use of gas chromatography-mass spectrometry enables the identification and quantification of the fermentation products resulting from the growth of microorganisms on pulping waste. These methods when used together can facilitate the determination of the metabolic activity of microorganisms with potential to produce fermentation products that would provide greater value to the pulping system and reduce effluent waste, thereby increasing potential paper milling profits and offering additional uses for black liquor.

Industrial wastes can be collected and modified to analyze microbial growth. Lignocellulose extraction techniques provide components to analyze specific biodegradation ability. Gas chromatography-mass spectrometry identifies fermentation products of microorganisms grown on pulping waste. These methods determine the metabolic capacity of microorganisms to degrade pulping waste.

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

연구

환경과학

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.

The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.

도구로 에틸렌 방출 화합물, 2- 클로로 에틸 산을 활용하여 박테리아의 에틸렌 응답을 공부하기

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

생화학

Evaluation of Integrated Anaerobic Digestion and Hydrothermal Carbonization for Bioenergy Production

Lignocellulosic biomass is one of the most abundant yet underutilized renewable energy resources. Both anaerobic digestion (AD) and hydrothermal carbonization (HTC) are promising technologies for bioenergy production from biomass in terms of biogas and HTC biochar, respectively. In this study, the combination of AD and HTC is proposed to increase overall bioenergy production. Wheat straw was anaerobically digested in a novel upflow anaerobic solid state reactor (UASS) in both mesophilic (37 &#176;C) and thermophilic (55 &#176;C) conditions. Wet digested from thermophilic AD was hydrothermally carbonized at 230 &#176;C for 6 hr for HTC biochar production. At thermophilic temperature, the UASS system yields an average of 165 LCH4/kgVS&#160;(VS: volatile solids) and 121 L CH4/kgVS&#160;at mesophilic AD over the continuous operation of 200 days. Meanwhile, 43.4 g of HTC biochar with 29.6 MJ/kgdry_biochar was obtained from HTC of 1 kg digestate (dry basis) from mesophilic AD. The combination of AD and HTC, in this particular set of experiment yield 13.2 MJ of energy per 1 kg of dry wheat straw, which is at least 20% higher than HTC alone and 60.2% higher than AD only.

A novel Upflow Anaerobic Solid State (UASS) reactor was used for biogas production from fibrous feedstock. Digestate from UASS reactor was hydrothermally carbonized into HTC biochar in a pressurized batch reactor. The integration of the two bioenergy concepts was applied in this study to increase overall bioenergy production.

바이오 에너지 생산을위한 통합 혐기성 소화 및 열수 탄화의 평가

Lignocellulosic biomass is one of the most abundant yet underutilized renewable energy resources. Both anaerobic digestion (AD) and hydrothermal ...

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

수성 환경에서 탄화수소 전환을 사용하는 툴킷

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

생체공학

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst immobilization for improved production yield and sustained synthesis. Described herewith is the experimental procedure for the development of such a system consisting of two E. coli strains that express functionally complementary enzymes. Together, these two enzymes can function co-operatively to mediate the regeneration of expensive cofactors for improving the product yield of the bioreaction. In addition, the method of synthesizing an immobilized form of the coupled biocatalytic system by encapsulation of whole cells in calcium alginate beads is reported. As an example, we present the improved biosynthesis of L-xylulose from L-arabinitol by coupling E. coli cells expressing the enzymes L-arabinitol dehydrogenase or NADH oxidase. Under optimal conditions and using an initial concentration of 150 mM L-arabinitol, the maximal L-xylulose yield reached 96%, which is higher than those reported in the literature. The immobilized form of the coupled whole-cell biocatalysts demonstrated good operational stability, maintaining 65% of the yield obtained in the first cycle after 7 cycles of successive re-use, while the free cell system almost completely lost the catalytic activity. Therefore, the methods reported here provides two strategies that could help improve the industrial production of L-xylulose, as well as other value-added compounds requiring the use of cofactors in general.

Presented is the protocol for co-immobilizing whole-cell biocatalysts for cofactor regeneration and improved reusability, using the production of L-xylulose as an example. The cofactor regeneration is achieved by coupling two Escherichia coli strains expressing functionally complementary enzymes; the whole-cell biocatalyst immobilization is achieved by cell encapsulation in calcium alginate beads.

공동 인자 재생 및 개선 재사용에 대한 알긴산 구슬의 다중 생체 촉매의 고정화

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

화학

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, lower vapor pressure, non-flammability, higher heat capacity, and tunable solubility and acidity. Here, we demonstrate a method for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from the pentosan present in jute biomass in a one-pot process by utilizing a catalytic amount of Br&#248;nsted acidic 1-methyl-3-(3-sulfopropyl)-imidazolium hydrogen sulfate IL. The acidic IL is synthesized in the lab and characterized using NMR spectroscopic techniques for understanding its purity. The various properties of BAIL are measured such as acid strength, thermal and hydrothermal stability, which showed that the catalyst is stable at a higher temperature (250 &#176;C) and possesses very high acid strength (Ho 1.57). The acidic IL converts over 90% of pentosan into sugars and furfural. Hence, the presenting method in this study can also be employed for the evaluation of pentosan concentration in other kinds of lignocellulosic biomass.

We present a protocol for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from a renewable non-edible lignocellulosic biomass (i.e., jute) with the presence of Br&#248;nsted acidic ionic liquids (BAILs) as the catalyst in water. The BAILs catalyst exhibited better catalytic performance than conventional mineral acid catalysts (H2SO4 and HCl).

당 분석에 대 한 새로운 방법을 황 바이오 매스 및 산 성 이온 성 액체를 사용 하 여 설탕 단위체로 그것 변환에

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

Enhanced Oil Recovery using a Combination of Biosurfactants

Biosurfactants are surface-active compounds capable of reducing the surface tension between two phases of different polarities. Biosurfactants have been emerging as promising alternatives to chemical surfactants due to less toxicity, high biodegradability, environmental compatibility and tolerance to extreme environmental conditions. Here, we illustrate the methods used for screening of microbes capable of producing biosurfactants. The biosurfactant producing microbes were identified using drop collapse, oil spreading, and emulsion index assays. Biosurfactant production was validated by determining the reduction in surface tension of the media due to growth of the microbial members. We also describe the methods involved in characterization and identification of biosurfactants. Thin layer chromatography of the extracted biosurfactant followed by differential staining of the plates was performed to determine the nature of the biosurfactant. LCMS, 1H NMR, and FT-IR were used to chemically identify the biosurfactant. We further illustrate the methods to evaluate the application of the combination of produced biosurfactants for enhancing residual oil recovery in a simulated sand pack column.

We illustrate the methods involved in screening and identification of the biosurfactant producing microbes. Methods for chromatographic characterization and chemical identification of the biosurfactants, determining the industrial applicability of the biosurfactant&#160;in enhancing residual oil recovery are also presented.

생체 계면활성제의 조합을 사용한 향상된 오일 회수

Biosurfactants are surface-active compounds capable of reducing the surface tension between two phases of different polarities. Biosurfactants have been ...

돼지 폐기물 바이오 가스로부터의 바이오 메탄 억제를 위한 미세조류 배양

Biogas Purification through the use of a Microalgae-Bacterial System in Semi-Industrial High Rate Algal Ponds

In recent years, a number of technologies have emerged to purify biogas into biomethane. This purification entails a reduction in the concentration of polluting gases such as carbon dioxide and hydrogen sulfide to increase the content of methane. In this study, we used a microalgal cultivation technology to treat and purify biogas produced from organic waste from the swine industry to obtain ready-to-use biomethane. For cultivation and purification, two 22.2 m3 open-pond photobioreactors coupled with an absorption-desorption column system were set up in San Juan de los Lagos, Mexico. Several recirculation liquid/biogas ratios (L/G) were tested to obtain the highest removal efficiencies; other parameters, such as pH, dissolved oxygen (DO), temperature, and biomass growth, were measured. The most efficient L/Gs were 1.6 and 2.5, resulting in a treated biogas effluent with a composition of 6.8%vol and 6.6%vol in CO2, respectively, and removal efficiencies for H2S up to 98.9%, as well as maintaining O2 contamination values of less than 2%vol. We found that pH greatly determines CO2 removal, more so than L/G, during cultivation because of its participation in the photosynthetic process of microalgae and its ability to vary pH when solubilized due to its acidic nature. DO, and temperature oscillated as expected from the light-dark natural cycles of photosynthesis and the time of day, respectively. Biomass growth varied with CO2 and nutrient feeding as well as reactor harvesting; however, the trend remained primed for growth.

저자 스포트라이트: 바이오메탄 생산 향상을 위한 미세조류 생명공학 확장 

Air pollution impacts the quality of life of all organisms. Here, we describe the use of microalgae biotechnology for the treatment of biogas (simultaneous removal of carbon dioxide and hydrogen sulfide) and the production of biomethane through semi-industrial open high-rate algal ponds and subsequent analysis of treatment efficiency, pH, dissolved oxygen, and microalgae growth.

Semi-Industrial High Rate Algal Ponds에서 Microalgae-Bacterial System을 사용하여 바이오 가스 정화

In recent years, a number of technologies have emerged to purify biogas into biomethane. This purification entails a reduction in the concentration of ...

화학 제품의 생산

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공동 인자 재생 및 개선 재사용에 대한 알긴산 구슬의 다중 생체 촉매의 고정화

당 분석에 대 한 새로운 방법을 황 바이오 매스 및 산 성 이온 성 액체를 사용 하 여 설탕 단위체로 그것 변환에

생체 계면활성제의 조합을 사용한 향상된 오일 회수

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