Name: assessment of sarcoplasmic reticulum calcium reserve and intracellular diastolic calcium removal in isolated ventricular cardiomyocytes
Uploaded: 2017-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

이 작품은 중국의 국가 자연과학 기초에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (No. 81100159, Dongwu 라이, 81401147, Juhong 장), 의료 및 건강 과학 프로그램의 강성 (No. 201646246, Dongwu 라이), 건강 과학 및 항저우 시 (No. 2013A28, 딩 린)의 기술 계획.

모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 실험 연구 센터, 중국 과학 아카데미의 중국 의료 및 절 강 대학에 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행 되었습니다.
 1. 솔루션 준비 <ol><li>표 1에 설명 된 대로 모든 솔루션을 준비.</li></ol>
 2. 격리의 왼쪽 심 실 (LV) Cardiomyocytes 참고: LV cardiomyocytes는 효소 Langendroff 관류 시스템을 사용 하 여 앞에서 설명한 7 , 8 , , 9 10 , 11.
<li><ol>Langendroff 관류 시스템을 설정합니다. 관류 시스템 표준 Tyrode (NT) 솔루션, 36.5 ° C에서 온도 설정를 튜브에서 모든 기포를 제거.</li>
	<li>그리고 무게 chloral 하이드 레이트 (400 mg/kg)의 복 주사 (ip)에 의해 Sprague-Dawley 쥐를 anesthetize. 5 분 후 꼬리 또는 발가락을 꼬집어 응답을 평가 하 여 마 취 상태 확인</li>
	<li>수술 시저와 칼 프로세스 아래 복 부 구멍을 열고, 칼 프로세스 들어올린는 시저와 가슴을 열고. 심 낭을 제거, 약간 리프트 심장 곡선된 겸 자와, 대동맥 아치, 식별 및 대동맥의 루트에서가 위, 심장 차단.</li>
	<li>60 mm 접시에는 마음을 전송 하 고 NT 솔루션으로 그것을 씻어. 대동맥 두 마이크로 해 부 집게와 고 Langendorff 관류 정에 마운트 누른 다음 단단히 대동맥 수술 봉합을 사용 하 여 정 맥에 선. 
	참고: 숙련 된 연산자 15이이 프로세스를 완료할 수 있다 s.</li>
	<li>심장 관상 동맥의 순환 회복을 30 mL NT 솔루션 perfuse. 그런 다음 Ca 2 + 30 mL는 perfusate 전환-무료 Tyrode 솔루션 (10 mM 황소자리, 1 mg/mL BSA)는 심장 박동을 중지. 다음, 효소 소화의 콜라 A 격리 솔루션 (0.6 mg/mL)는 perfusate 전환. 
	참고: 당뇨병 쥐 없이 당뇨병 쥐, 또는 콜라 II와 실험에 대 한 실험에 대 한 사용 콜라 A.</li>
	<li>소화 20-25 분, 후 신속 하 게 변경 관류 솔루션 캘리포니아 2 +-무료 Tyrode 솔루션 추가 소화 중지. 다음, 집게로 마음을 잡고, 정에서 그것을 잘라 고 KB 솔루션을 포함 하는 35 mm 접시에는 마음을 배치 (표 1 참조).</li>
	<li>LV 벽 집게와가 위를 해 부. 심 방, 우 심 실 및 것 접합 영역을 잘라. 나머지 조직이 이다 라스베가스; KB 솔루션과 새로운 35 mm 접시에 그것을 전송. 작은 조각으로 LV 조직 말하다.</li>
	<li>부드럽게 필터링 된 플라스틱 스 포 이트와 조각 플라스틱 하 고 다시 10 mL KB 솔루션에 중단.</li>
	<li>150 µ m 조리개 스테인레스 스틸 필터와 15 mL 원심 분리기 튜브에 셀 필터링. 30 s 및 삭제는 상쾌한 150 x g에서 원심. 다시 10 mL KB 솔루션, 무료 myocytes 정착 6 분에 대 한 일시 중단 상쾌한, 삭제 하 고 다시 10 mL KB 솔루션에 펠 릿을 중단. 
	참고: 모든 단계 솔루션 100% O 2 기름에 36 ° C에서 수행 했다.</li>
</ol> 3. 칼슘 Reintroduction <ol><li>KB 솔루션에서 20 분 동안 정착 후 상쾌한, 삭제 하 고 다시 칼슘 reintroduction 솔루션 A myocytes를 일시 중지 (0.3 m m 캘리포니아 2 +, 4.5 mL 캘리포니아 2 +-무료 Tyrode 솔루션, 1.5 mL NT 솔루션) 10 분에 대 한</li>
	<li>칼슘 reintroduction 솔루션 B 위의 절차를 반복 (0.3 m m 캘리포니아 2 +, 3 mL 캘리포니아 2 +-무료 Tyrode 솔루션, 3 mL NT 솔루션).</li>
	<li>NT 솔루션 (1.2 m m 캘리포니아 2 +) 가능한 myocytes 정화 위의 절차를 반복 합니다. 이 솔루션에서 격리 된 LV myocytes를 저장 하 고 4-6 헤 내 공부</li>
</ol> 4. 설정 최대의 관류 시스템 <ol><li>챔버 관류 ( 그림 1A)에 대 한 NT 솔루션 유입 튜브를 연결.</li>
	<li>대상 myocyte의 바늘 관류에 대 한 연결 (예를 들어, 관류 연필, 연필 이제부터 하 라고) 멀티 배럴 매니폴드 팁는 micromanipulator에 고정, 관류 시스템 제어 밸브에. 연필 ( 그림 1A)의 각 열에 NT 솔루션 및 10mm 카페인 솔루션 추가.</li>
	<li>어떤 공기 방울을 공기 막힘을 피하기 위해 튜브에 대피.</li>
	<li>물방울 개수 미크론 팁에서 10 연필 s, 수동으로 조정 흐름 레 귤 레이 터 3 물방울/10 미의 대략적인 속도에서 흐름의 속도 유지 하 고</li>
</ol> 5. 측정 세포내 캘리포니아 2 + 변이 및 Sarcomere 단축 7 , , 8 9 <ol><li>슬라이드에서 피 펫 10 µ L 세포 현 탁 액 현미경, 셀 카운터로 핸드폰 번호를 계산 하 고 밀도 계산. 50, 000 셀/mL의 대략 농도에 myocytes 희석.</li>
	<li>추가 Fura-2 acetoxymethyl (오전) 주식 (칼슘 민감한 염료) 2 µ M. 최종 농도가지고 myocytes의 1 mL 정지로 실 온에서 20 분 동안 어둠 속에서 유지.</li>
	<li>30 s, 그리고 다시 중단 NT 솔루션 cardiomyocytes 2 번에 대 한 150 g에서 원심 분리기.</li>
	<li>차례 빛와 어둠 속에서 셀을 계속. 15 분 동안 관류 챔버에 myocytes 장소. 그런 다음 NT 솔루션 챔버 관류 (1.5 mL/min)를 시작 합니다. 5 분에 대 한 자극 (파 기간 4.0 ms, 펄스 진폭 8.0 V)를 사용 하 여 1 Hz 필드 자극에 myocytes 속도</li>
	<li>좋은 모양 myocyte 선택 (막대 모양, 가장자리, 샤 프와 크로스 강선 취소) 및 현미경 대물 렌즈 10x에서 안정적인 자극된 경련 (자발적 수축). 다음, 40 x, 현미경 배율 변경 하 고 수평 위치에 있는 myocyte를 유지 수 있는 CCD 카메라 방향 회전.</li>
	<li>셀 프레임 어댑터를 조정 하 여 단일 myocyte 프레임. 배경 지우기 확인.</li>
	<li>340 또는 380 nm 파장 여기 필터와 크 세 논 램프에서 방출 되는 빛에 myocytes 고 40 x 목표를 통해 myocytes 이미지. 510에서 형광 신호를 감지 nm. 한편,는 myocytes의 sarcomere 길이 변화 및 소프트에 지 모듈을 사용 하 여 동시에 녹화.</li>
	듀얼-여기 형광 광 전 증폭 관 시스템의 기록 <li>형광 칼슘 이미징 시스템의 녹음 프로그램 실행, 클릭 합니다 &#34; 파일/새 파일 &#34; 새로운 기록 파일을 만들고 클릭 하는 &#34; 시작 &#34;를 동기적으로 형광 및 sarcomere 버튼.</li>
</ol> 6. SR 캘리포니아 2 + 예약 및 확장기 캘리포니아 2 + 제거 기능 7 , , 8 9 평가 <ol><li>Interlink는 &#34; 보조 아웃 &#34;에 포트 와 자극 기는 &#34; 아날로그에 &#34; 밸브 제어 시스템에 포트 (예를 들어, 밸브 사령관, 재료의 표 참조) BNC 케이블 (TTL 신호를 동기화)을 여.</li>
	<li>미리 관류 밸브를 자동으로 앞에서 설명한 8 , 9; 전환 프로그램 작업에 대 한 자세한 내용은 다음과 같습니다.
	<ol><li>프리셋 밸브에서 매개 변수 표 2에 의하여 소프트웨어를 제어 하 고 클릭에 &#34; 다운로드 &#34; 다운로드 순서 단추를 프로그램에 로드 된. 클릭은 &#34; Trigg어 &#34; 트리거 기능을 사용 하도록 단추. 
		참고: 밸브 제어 시스템 TTL 신호를 받은 후 시퀀스를 실행할 수 있습니다.</li>
		<li>미리 시퀀스 모드를 자극 하 고 표 3에 의하여 매개 변수 설정.</li>
	</ol></li> <li>설정에서 자극 기 &#34; s 1 단계 &#34; LV 페이스를 myocytes에서 1 Hz. NT 솔루션 1.5 mL/min의 속도로 바늘 관류 시작. 
	참고: 챔버 관류 보다 바늘 스트림의 속도 이므로 바늘 스트림의 빛 굴절은 다릅니다 챔버 관류의 빛 굴절. 빛 굴절의 차이 대상 myocyte를 포위 하는 효과적인 바늘 관류의 범위를 나타냅니다.</li>
	<li>(순서로 다운스트림 업스트림 하의), 낮은 전력 미세한 보기 아래 대상 myocyte를 선택 하 고 있는지 확인 하십시오 그것은 연필의 마이크로 팁에 의해 도달 될 수 있다. 400 x 현미경 배율을 변경 합니다. CCD 카메라 방향을 수평 위치에 있는 myocyte를 계속 회전 합니다. 셀 프레임 어댑터는 myocytes 채웁니다 적당 한 창 아래 사각형 조리개를 조정 합니다. 최소한의 배경; 인지 확인 다른 myocytes 또는이 창에서 죽은 세포 파편을 허용 하지 않습니다.</li>
	<li>Micromanipulator에 고정 하는 연필의 위치를 조정 하 고 신중 하 게 마이크로 팁 현미경 배율 x 400 미만 대상 myocyte 비전 필드의 반지름의 거리에서 장소.</li>
	<li>주로 대상 myocyte를 커버 하는 myocyte 수 없습니다 휩 쓸 바늘 흐름 확인을 바늘 스트림 범위 조정.</li>
	<li>후 60 s 기본 자극 커서를 롤, 속도 &#34; d 2 단계 &#34;. 
	참고: 프로토콜의 나머지 자극 기 밸브 제어 시스템에 의해 자동으로 실행 될 것입니다. 위의 설정에 따라 프로토콜 수 자동으로 실행 될 그림 2A, 1 Hz 60 NT 솔루션으로 서 기본에서 s. 성 고 2 지연 일시 중지 s, 10mm 카페인 관류 15로 빠르게 전환 s (기능 SR에서 캘리포니아 2 + 스토리지 출시), 다음 NT 솔루션으로 다시 전환 하는 고.</li>
	<li>개별 myocytes의 배경 형광 검출 기록의 끝에. 클릭은 &#34; 일시 중지 &#34; 근처 빈 영역에 미세한 보기 이동 파일 녹음, 일시 정지 버튼. 클릭은 &#34; 기록 &#34; 초, 녹화 재개 버튼 및 숫자 340 및 380 nm 강도 값 배경 보정에 대 한 기록.</li>
	<li>오픈는 &#34; 작업/정 &#34;에 값을 입력 하 고 대화 상자는 &#34; 배경 &#34; 형성, 각각, 소프트웨어 백그라운드를 빼서 Fura 2 비율 값을 수정할 수 있습니다.</li>
</ol> 7. 데이터 분석 9 <ol><li>칼슘 과도 및 기본 서 성 단계에서 단축 sarcomere의 측정, 평균 트 위치 펄스, 고 칼슘 과도의 시간 상수 같은 동적 매개 변수 분석 칼슘 과도 감퇴 (타우 1 Hz) 자동으로 소프트웨어를 사용 하 여. 
	참고: 소프트웨어 부패 세그먼트에 잘 맞지 않는, 수동 모노 지 수 곡선 맞춤에 대 한 감소 추적 내보냅니다.</li>
	<li>카페인 유발 칼슘 펄스에 대 한 칼슘 제거 기능 분석에 대 한 가파른 파도 펄스를 선택. 신호 방해, 비정상적인 펄스, 또는 멀리 미드웨이 흘러 그 셀 제외.</li>
	<li>카페인 유발 칼슘 펄스 (Ca-카페인, 미술관 2 + 예비에의 인덱스)의 진폭을 측정.</li>
	<li>모노 지 수 곡선 피팅 (10 s 내구) 수동으로 소프트웨어 ( 그림 2C)에서 카페인을 이용한 칼슘 펄스 (타우-카페인)의 붕괴 시간 상수 얻을.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Capel, R. A., Terrar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+Ca+(2+)-dependent+mechanisms+for+the+initiation+of+the+heartbeat.">The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat.</a> Front Physiol. 6, 80 (2015).</li><li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes.">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li><li>Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+decay+of+Ca2++homeostasis+in+the+development+of+diabetic+cardiomyopathy.">Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy.</a> Cardiovasc Diabetol. 13, 75 (2014).</li><li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+diabetic+cardiomyocytes.">Calcium signaling in diabetic cardiomyocytes.</a> Cell calcium. 56 (5), 372-380 (2014).</li><li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+sodium+current+inhibition+reverses+electromechanical+dysfunction+in+human+hypertrophic+cardiomyopathy.">Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 127 (5), 575-584 (2013).</li><li>Ferrantini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R4496C+RyR2+mutation+impairs+atrial+and+ventricular+contractility.">R4496C RyR2 mutation impairs atrial and ventricular contractility.</a> J Gen Physiol. 147 (1), 39-52 (2016).</li><li>Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myocyte+calcium+transport+in+phospholamban+knockout+mouse+relaxation+and+endogenous+CaMKII+effects.">Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects.</a> Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+inhibition+in+heart+failure,+beneficial,+harmful,+or+both.">CaMKII inhibition in heart failure, beneficial, harmful, or both.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, H1454-H1465 (2012).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+kinase+inhibitor,+fasudil,+ameliorates+diabetes-induced+cardiac+dysfunction+by+improving+calcium+clearance+and+actin+remodeling.">The Rho kinase inhibitor, fasudil, ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction by improving calcium clearance and actin remodeling.</a> J Mol Med (Berl). 95 (2), 155-165 (2017).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+Current-Induced+Abnormal+Impulses+in+CaMKII&#948;+Knockout+Mouse+Ventricular+Myocytes.">Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKII&#948; Knockout Mouse Ventricular Myocytes.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+L-type+calcium+current+and+cardiac+function+in+CaMKII{delta}+knockout+mice.">Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKII{delta} knockout mice.</a> Circ Res. 107 (3), 398-407 (2010).</li><li>Roussel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoyl-carnitine+increases+RyR2+oxidation+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++leak+in+cardiomyocytes:+Role+of+adenine+nucleotide+translocase.">Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).</li><li>Yaras, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+diabetes+on+ryanodine+receptor+Ca2++release+channel+(RyR2)+and+Ca2++homeostasis+in+rat+heart.">Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart.</a> Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Overexpression+of+O-GlcNAcase+Improves+Contractile+Function+in+the+Diabetic+Heart.">Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart.</a> Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).</li></ol>

저자는 공개 없다.

SR에서 발표 하는 칼슘 속은 systole에에서 대 한 주요 캘리포니아2 + 소스입니다. 어느 정도, SR 캘리포니아2 + 콘텐츠의 진폭 및 소수 Ca2 + SR에서 발표 반영 SR Ca2 + 예비 심장 수축에 사용할 수 있는. 다른 한편으로, SR의 Ca2 + 예약에 따라 SR 캘리포니아2 + 재흡수, SR의 캘리포니아2 + 누출 그리고 그들의 균형의 능력 SR에 걸쳐 심장12,,1314동안. 우리의 실험에서 10 mM 카페인의 신속한 응용 프로그램 총 캘리포니아2 + 출시와 RyR 채널을 개방 하 여 SR에 캘리포니아2 + 재흡수를 방지 유도 목적 이다. 따라서, 카페인 유발 Ca2 + 펄스의 진폭 SR 캘리포니아2 + 예약에 대 한 인덱스로 사용 될 수 있습니다. 또한, 기본 서 1 Hz에 3 Hz, 사용 우리 더 SR 부하와 그 기본 메커니즘6주파수 의존 조사할 수 있습니다.
캘리포니아2 + 세포질에서 제거 심장 심장 확장 기능을 위해 중요 하다. 1 Hz 필드 자극의 단계에서 그림 2A와 같이 칼슘 과도의 쇠퇴에 있던, 그리고 느린 전송 시스템 (미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + uniporter 및 sarcolemmal Ca2 + SR에 SERCA, NCX에 기인 했다 -ATPase). 느린 메커니즘의 기여도 무시할 수, 캘리포니아2 + 과도 (타우 1 Hz)의 붕괴 시간 상수 SERCA 및 NCX7,,89의 결합 된 활동을 반영 합니다. 카페인 관류의 단계에서 SERCA SR 칼슘 보유를 구축 하지 못했습니다. 따라서, 카페인을 이용한 칼슘 펄스 (타우-카페인)의 감소는 주로 NCX에 기인 된다. 대응 하 게, NCX 함수 관련 타우-카페인으로 부정적 이다. 확장기 캘리포니아2 + 제거 NCX 기여 타우 1 Hz/타우-카페인의 비율에 관련 된으로 긍정적 이다. SERCA 기여 타우 카페인과 타우 1 Hz7,,89의 차이에 관련 된으로 긍정적 이다.
성공적으로 절차를 완료 하려면 (그림 2), 몇 가지 기술 키 포인트는 주목 해야 한다. 첫째, 자동화 시스템 구축 스위칭 속도 및 관류 시스템 정확 하 게 중요 하다. 미리 설정 된 프로그램 지연 시간 정확 하 고 빠르게 카페인 관류를 적용. 둘째, 과정에 myocytes 관류 솔루션에 의해 멀리 세척 되 고 위험에 있습니다. 유지는 myocytes 안정적 챔버 접시 준수, 셀 녹음 하기 전에 15 분 이상 접시에 배치 합니다.
또한, 카페인의 응용 프로그램에 대 한 안정적인 바늘 관류 시스템을 설정 하는 것은 또 다른 중요 한 단계입니다. 이 단계에 대 한 세 가지 핵심 포인트는: (1) 빠른 채널 스위치와 매끄러운 바늘 관류, (2) 잘 제어 관류 흐름 속도, 및 (3) 적절 한 바늘 끝 사이 거리 및 myocyte를 대상. 흐름 속도, 팁의 거리, 또는 간섭 솔루션 채널 스위치에서의 부적절 한 설정 허용 카페인 유발 칼슘 펄스를 획득의 실패 될 수 있습니다. 카페인을 이용한 칼슘 펄스, 칼슘 제거 기능 분석에 대 한 가파른 웨이브 크레스트와 펄스만 선택 수 있습니다.
패치 클램프 시스템에 따라 다른 방법을 상대적으로 정확한 데이터를 제공할 수 있습니다. 그러나, 내부 조정 K+ 전류, 등 몇 가지 요소 정확도 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 첨단된 장비, 숙련 된 기술자와 시간 소비의 높은 요구 사항 또한 패치 클램프의 응용 프로그램을 제한할 수 있습니다. 어느 정도 우리의 프로토콜 제한 SR 부하의 직접 값 또는 SERCA NCX의 활동을 제공 하지 수는 있습니다. 매개 변수 (예를 들어, 캘리포니아-카페인, 타우 카페인)만 반영 하지 변화 SR 콘텐츠 및 확장기 캘리포니아2 + 제거에 기여 직접. 그러나,이 프로토콜 편의 기술 및 장비의 적은 제한의 이점이 있다.

세포내 칼슘 ([캘리포니아2 +]나) 재활용 cardiomyocytes1에서 수축 기 및 확장기 함수 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 우리가 알고 있듯이, 칼슘 유도 Ca2 + 릴리스는 수축 하는 전기 신호를 변환 시킵니다 흥분 수축 연결, 시작 합니다. 막 도발은 유도 캘리포니아2 + 2 + 채널, SR에서 ryanodine 수용 체 2 (RyR2)를 통해 세포질으로 출시 sarcolemmal L 형 Ca를 활성화 합니다. 과도 높은 세포질 캘리포니아2 + myofibrils의 수축을 시작합니다. SR 캘리포니아2 +를 사용 하 여 SR에 reuptaken는 심장, 동안 세포질 캘리포니아2 + -ATPase 2 (SERCA2)와 나+-캘리포니아2 + 교환기 (NCX)2를 통해 cardiomyocyte 밖으로 펌핑. 이 프로세스는 cardiomyocyte 재활용 수축-이완 이끌어 낸다.
심장 SR은 세포내 막 네트워크 주변 수축 성 기계입니다. 그것은 캘리포니아2 + , 수축에 대 한 저수지 역할을 하 고 reabsorbs 세포내 캘리포니아2 + 휴식 중. SR 캘리포니아2 + 예약 비트 사용할 수 심장 수축에 대 한 결정 이다. 한편, 세포내 캘리포니아2 + 의 제거가 심장 심장에 대 한 중요 합니다. 일부 병 태 생리 조건 등 당뇨병과 심장 마비, 장애인된 캘리포니아2 + 클리어런스 우울 SR 캘리포니아2 + cardiomyocytes에 저장소 관련 되어있을 수 있습니다 심장 부전2,3 과정 ,4.
SR 캘리포니아2 + 릴리스 및 cardiomyocytes에 확장기 Ca2 + 제거 측정, 널리 사용 되는 방법은 두 가지: 패치 클램프5,6, 카페인 유발 Ca 기반으로 NCX 전류의 무결성 2 + 캘리포니아2 + 형광 이미징7,,89에 따라 펄스. 전 접근 그는 캘리포니아2 + SR에서 발표는 크게 셀에서에 의해 펌핑 NCX 사실에 따라 달라 집니다. 그러나,이 접근의 고급 장비와 숙련 된 작업의 요구에 의해 제한 됩니다. 현재 연구에서 우리가 SR 캘리포니아2 + 예비 그리고 캘리포니아2 + 제거 myocytes에서 카페인 유발 Ca2 + 펄스는 캘리포니아2 + 형광 이미징 시스템에 따라 측정 하 여 평가 하는 편리한 접근 방식을 설명 합니다. 간단히, 세포내 캘리포니아2 + 형광 Fura-2로 표시 됩니다. Interlinking 자극 시스템 및 관류 시스템, 선물이 관류를 전환 하 고 시스템을 자동으로 속도 위한 프로그램. 10mm 카페인 빠르게는 미스터에 총 캘리포니아2 + 출시를 유도 하기 위해 고용 되었다 지 수 감퇴 시간 상수 (타우) 칼슘 과도 및 카페인을 이용한 칼슘 펄스의 확장기 캘리포니아2 + 제거 SERCA NCX의 기여를 적절 하 게 반영 하는 피팅, 모노 지 수 곡선에서 얻은 했다.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>012314</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Alfa Aesar</td><td>012315</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>11595</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16828</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18395</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>011594</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>3337</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15031</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12403</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Roche</td><td>735094</td><td></td></tr><tr><td>caffeine</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX 71</td><td></td></tr><tr><td>Langendorff system</td><td>Beijing Syutime Technology Co</td><td>PlexiThermo-S-LANGC</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Marchauser</td><td>MM33 links</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion chamber</td><td>IonOptix</td><td>FHD</td><td></td></tr><tr><td>Valve Controlled Gravity Perfusion System</td><td>ALA</td><td>VC 3-8</td><td></td></tr><tr><td>valve commander software</td><td>ALA</td><td>VC 3 1.0.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Precision flow regulator</td><td>Delta Med</td><td>3204315</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil</td><td>AutoMate Scientific</td><td>04-08-[360]</td><td></td></tr><tr><td>Micron Removable Tip</td><td>AutoMate Scientific</td><td>360um i.d.</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems</td><td>IonOptix</td><td>Hyperswitch</td><td></td></tr><tr><td>Recording software</td><td>IonOptix</td><td>IonWizard 6.2.59</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-dawley rats</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.</td><td>SCXK 2016-01-007436</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of sarcoplasmic reticulum calcium reserve and intracellular diastolic calcium removal in isolated ventricular cardiomyocytes

세포내 칼슘 재활용 cardiomyocytes에 수축 기 및 diastolic 기능의 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 심장 sarcoplasmic 그물 (SR) Ca2 + 수축, 어떤 reuptakes 세포내 캘리포니아2 + 휴식 동안에 대 한 저수지 역할을 합니다. SR Ca2 + 예약 비트 사용할 수 심장 contractibility에 대 한 결정 이며, 세포내 캘리포니아2 + 의 제거는 심장 심장 확장 기능에 대 한 중요 한. 당뇨병과 심장 마비 같은 병 태 생리 조건에서 장애인된 칼슘 클리어런스 및 SR Ca2 + 저장소 cardiomyocytes에 심장 부전의 진행에 관련 수 있습니다. 여기, 우리는 미술관2 + 예약 및 확장기 Ca2 + 제거 프로토콜을 설명 합니다. 간단히, 단일 cardiomyocyte 효소 고립 되었고 세포내 캘리포니아2 + 형광 Fura-2에 표시 된 칼슘 이미징 시스템에 의해 기록 되었다. 총 SR 캘리포니아2 + 릴리스 유도 대 한 카페인을 고용, 우리 interlinking 자극 시스템 및 관류 시스템에 의해 자동 관류 스위치 프로그램을 미리. 다음, 모노 지 수 곡선 피팅 칼슘 과도 및 카페인을 이용한 칼슘 펄스의 붕괴 시간 상수를 분석 하는 데 사용 되었다. 따라, 기여의 SR 캘리포니아2 +-ATPase (SERCA) 및 Na+-캘리포니아2 + 교환기 (NCX) 확장기 칼슘 제거를 평가 했다.

여기, 우리가 설명 streptozotocin (STZ)-당뇨병 쥐 (DM)를 유도 및 나이 일치 Sprague-Dawley (SD) 쥐 예. 8 주 오래 된 남성 SD 쥐 (200 ± 20g) 컨트롤 그룹에 대 한 DM 그룹 또는 구 연산 염 버퍼 STZ (70 mg/kg, ip)의 단일 복 주사를 받았다. STZ 관리 후 1 주일 혈당과 쥐 &#62; 16.7 mmol/L 당뇨병으로 간주 됐다. 8 주 후, LV myocytes 효소 격리 했다. 칼슘 reintroduction 후 myocytes 생존 상태에 남아 있는의 약 70-80%입니다. 막대 모양, 명확한 강선 및 안정적인 수축만 myocytes 기록 (그림 1B)에 대 한 선정 됐다. 그림 1A에서 같이, 우리 챔버 관류와 바늘 관류 myocytes에 대 한 설정 합니다. 관류 밸브 및 시스템 속도 자동으로 전환 되었다 미리 프로그램에 의해 그림 2A에 설명 된 대로. 세포내 칼슘 형광 칼슘 이미징 시스템에 의해 기록 되었다. 값은 평균 ± SEM.로 보고 되었다
SD 그룹에 비해, DM 그룹 카페인 유발 칼슘 펄스 (Ca-카페인)의 중요 한 낮은 진폭 보여준 (0.332 ± 0.008 vs. 0.276 ± 0.008, t-검정: p &#60; 0.05)와 낮은 소수 칼슘 릴리스 SR (Ca 1 Hz / Ca-caffeine) (78.5 ± 1.5% 대 72.1 ± 1.0%, t-검정: p &#60; 0.05) (그림 2B). 타우-1 Hz와 타우 카페인 모노 지 수 곡선 맞춤;에서 가져온 DM 그룹 보여준 놀라운 더 긴 감퇴 카페인 유발 칼슘 펄스 (타우-카페인)의 시간 상수 (1.822 ± 0.07 ms vs. 2.896 ± 0.088 ms, t-검정, p &#60; 0.05), 그리고 타우 1 Hz/타우-카페인 비율 (0.076 ± 0.003 vs. 에서 더 높은 수준 0.086 ± 0.003, t-검정, p &#60; 0.05) SD 그룹 (그림 2D) 보다. 이러한 결과 우울된 SR 캘리포니아2 + 예비 표시 하 고 캘리포니아2 + 클리어런스 당뇨병 cardiomyocytes에 장애인.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55797/55797fig1.jpg"> 
그림 1입니다. 관류 시스템 및 고립 된 LV myocytes 그림. (A) 챔버 관류와 연필 관류의 그림. 화살표는 관류 챔버에 NT 솔루션의 흐름 방향을 나타냅니다. 연필 관류를 NT 또는 카페인 솔루션 대상 myocyte 주변을 제공 합니다. 미크론 팁 챔버 위에 자유롭게 조작할 수 있습니다. (B)의 미세한 보기 막대 모양으로 LV myocytes를 격리 하 고 크로스 강선을 취소 합니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55797/55797fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55797/55797fig2.jpg"> 
그림 2입니다. SR 칼슘 보유 및 칼슘 제거 기능 평가. (A) 스위칭 관류 밸브 및 자동으로 시스템을 서 성 대 한 프로토콜의 그림. (B) 통계 값 SR 캘리포니아2 + 예약 및 SR 소수 캘리포니아2 + 의 출시 1 자극에 대 한 DM 및 SD 그룹 기. DM 그룹2 + 예비 SR 소수 캘리포니아2 + 릴리스 SD 그룹 보다 상당한 감소 SR Ca 보였다. (C) 소프트웨어 패널 카페인 유발 칼슘 펄스 (타우-카페인)의 지속적인 부패에 대 한 피팅 수동으로 모노 지 수 곡선을 보여주는. (D) 타우 카페인과 타우 1 Hz/타우-카페인 DM 및 SD 그룹 사이 비교 막대 그래프. DM 그룹 타우 카페인과 타우 1 Hz/타우-카페인 보다 SD 그룹의 중요 한 증가 값을 보여주었다. 값 = 평균 ± SEM, t-검정을 수행 했다, *p &#60; 0.05 SD 그룹에 비해. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55797/55797fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>솔루션</td>
			<td>내용 (mM)에</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>보통 Tyrode (NT) 솔루션</td>
			<td>135 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 MgCl2, 10 포도 당, 10 HEPES, 1.2 나2HPO의4, 1.2 CaCl2, 7.35에 NaOH로 pH를 조정</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>캘리포니아2 + 무료 Tyrode 솔루션</td>
			<td>135 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 MgCl2, 10 포도 당, 10 HEPES, 1.2 나2HPO4, 10 taurine 7.35에 NaOH로 pH를 조정</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>콜라 격리 솔루션</td>
			<td>A 콜라 또는 콜라 II + 캘리포니아2 + 무료 Tyrode 솔루션</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KB 솔루션</td>
			<td>120 코, 120 L-글루타민, 5 MgCl2, 10 HEPEs, 1 EGTA, 10 포도 당, 20 Taurine pH 7.35 코와를 조정합니다</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>카페인 관류 솔루션</td>
			<td>NT 솔루션에서 10 카페인</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1입니다. LV myocytes 고립과 휴대 관류에 대 한 솔루션입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>밸브</td>
			<td>시간 (초)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>60</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2입니다. 밸브 제어 시스템 (밸브 사령관)에 매개 변수를 미리.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>패널 디스플레이</td>
			<td>댓글</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.0 ms 기간</td>
			<td>전기 자극 필드 시간</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.0 V</td>
			<td>전기 전압</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 1.0 HZ 999S</td>
			<td>성 상태에서 대상 myocyte 찾기</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D 2 001S</td>
			<td>일시 중지 성에이 단계를 선택 하 고 기저 트 위치 기록 후 1s를 지연</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D3 015S *</td>
			<td>"*" 표시는 자극 5V TTL 신호를 출력할 수 있습니다</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D4 060S</td>
			<td>마침 카페인 관류와는 myocyte 정상 상태로 복구</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>끝</td>
			<td>s 1 단계로 롤백</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 3입니다. 매개 변수는 자극에의 사전 설정 합니다.

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

세포내 칼슘 재활용 cardiomyocytes에 수축 기 및 diastolic 기능의 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리가 칼슘 이미징 시스템에 의해 sarcoplasmic 그물 캘리포니아2 + 예약 및 cardiomyocytes에 확장기 칼슘 제거 기능을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다.

격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

assessment-sarcoplasmic-reticulum-calcium-reserve-intracellular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.1K 조회수.  Zhejiang University School of Medicine. 세포내 칼슘 재활용 cardiomyocytes에 수축 기 및 diastolic 기능의 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리가 칼슘 이미징 시스템에 의해 sarcoplasmic 그물 캘리포니아2 + 예약 및 cardiomyocytes에 확장기 칼슘 제거 기능을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다.

비디오: Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리<sup&gt; 2 +</sup&gt; 과도하고 막 전류

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

연구

생물학

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

칼슘의 평가는 그대로 골격 근육 섬유에서 불꽃

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

마우스 심근의 분리 및 생리 학적 분석

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

피부 심근세포를 이용한 심장 기능의 체외 평가

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

의학

고립된 림프관의 칼슘 및 수축률에 대한 실시간 분석

Real-time Evaluation of Absolute, Cytosolic, Free Ca2+ and Corresponding Contractility in Isolated, Pressurized Lymph Vessels

The lymphatic vasculature, now often referred to as &#34;the third circulation,&#34; is located in many vital organ systems. A principal mechanical function of the lymphatic vasculature is to return fluid from extracellular spaces back to the central venous ducts. Lymph transport is mediated by spontaneous rhythmic contractions of lymph vessels (LVs). LV contractions are largely regulated by the cyclic rise and fall of cytosolic, free calcium ([Ca2+]i).
This paper presents a method to concurrently calculate changes in absolute concentrations of [Ca2+]i and vessel contractility/rhythmicity in real time in isolated, pressurized LVs. Using isolated rat mesenteric LVs, we studied changes in [Ca2+]i and contractility/rhythmicity in response to drug addition. Isolated LVs were loaded with the ratiometric Ca2+-sensing indicator Fura-2AM, and video microscopy coupled with edge-detection software was used to capture [Ca2+]i&#160;and diameter measurements continuously in real time.
The Fura-2AM signal from each LV was calibrated to the minimum and maximum signal for each vessel and used to calculate absolute [Ca2+]i. Diameter measurements were used to calculate contractile parameters (amplitude, end diastolic diameter, end systolic diameter, calculated flow) and rhythmicity (frequency, contraction time, relaxation time) and correlated with absolute [Ca2+]i measurements.

저자 스포트라이트: 림프부종 및 고혈압 연구의 혁신적인 방법

This protocol describes a method to simultaneously measure cytosolic, free calcium [Ca2+]i and vessel diameter in contracting lymph vessels in real time and then calculate absolute Ca2+ concentrations as well as contractility/rhythmicity parameters. This protocol can be used to study Ca2+ and contractile dynamics across a variety of experimental conditions.

격리된 가압된 림프관에서 Absolute, Cytosolic, Free Ca2+ 및 해당 수축성의 실시간 평가

The lymphatic vasculature, now often referred to as &#34;the third circulation,&#34; is located in many vital organ systems. A principal mechanical ...

면역학 및 감염병학

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑<sup&gt; 2 +</sup&gt;와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial malfunction in the diseased heart remains to be fully clarified. Recent compelling evidence demonstrates that changes in the myofilament Ca2+ sensitivity affect intracellular Ca2+ homeostasis and ion channel activities in cardiac myocytes, the essential mechanisms responsible for the cardiac action potential and contraction in healthy and diseased hearts. Indeed, activities of ion channels and transporters underlying cardiac action potentials (e.g., Na+, Ca2+ and K+ channels and the Na+-Ca2+ exchanger) and intracellular Ca2+ handling proteins (e.g., ryanodine receptors and Ca2+-ATPase in sarcoplasmic reticulum (SERCA2a) or phospholamban and its phosphorylation) are conventionally measured to evaluate the fundamental mechanisms of cardiac excitation-contraction (E-C) coupling. Both electrical activities in the membrane and intracellular Ca2+ changes are the trigger signals of E-C coupling, whereas myofilament is the functional unit of contraction and relaxation, and myofilament Ca2+ sensitivity is imperative in the implementation of myofibril performance. Nevertheless, few studies incorporate myofilament Ca2+ sensitivity into the functional analysis of the myocardium unless it is the focus of the study. Here, we describe a protocol that measures sarcomere shortening/re-lengthening and the intracellular Ca2+ level using Fura-2 AM (ratiometric detection) and evaluate the changes of myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from rat hearts. The main aim is to emphasize that myofilament Ca2+ sensitivity should be taken into consideration in E-C coupling for mechanistic analysis. Comprehensive investigation of ion channels, ion transporters, intracellular Ca2+ handling, and myofilament Ca2+ sensitivity that underlie myocyte contractility in healthy and diseased hearts will provide valuable information for designing more effective strategies of translational and therapeutic value.

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Myofilament 칼슘의 평가<sup&gt; 2 +</sup&gt; 감도 근본적인 심장 여진 수축 커플 링

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial ...

격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리

칼슘의 평가는 그대로 골격 근육 섬유에서 불꽃

마우스 심근의 분리 및 생리 학적 분석

피부 심근세포를 이용한 심장 기능의 체외 평가

격리된 가압된 림프관에서 Absolute, Cytosolic, Free Ca²⁺ 및 해당 수축성의 실시간 평가

격리된 가압된 림프관에서 Absolute, Cytosolic, Free Ca²⁺ 및 해당 수축성의 실시간 평가

격리된 가압된 림프관에서 Absolute, Cytosolic, Free Ca²⁺ 및 해당 수축성의 실시간 평가

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

Myofilament 칼슘의 평가