저자는 재정 지원을 위해 Radiobiology 서비스 (Lyon-Sud 병원) 및 Fond National Suisse (FNS)의 Anne Charrié를 인정합니다.

세포 배양 용 배지 및 용액의 제조 <ol><li> 배양 배지 준비 <ol><li> 글루타민 (2 MM), 페니실린 / 스트렙토 마이신 (5 μg / ML 최종), 2 % 태아 송아지 혈청 (FCS) 및 2 % 혈청 대체물을 햄의 F - 10 매체를 보충하여 확산 매체 (PM)를 준비합니다. </li><li> 글루타민 (2 MM), 페니실린 / 스트렙토 마이신 (5 μg / ML 최종) 및 2 % FCS와 Dulbecco의 수정 독수리 매체 (DMEM) 보완하여 차별화 매체 (DM)를 준비합니다. </li></ol></li><li> 포도당 섭취 용액의 제조 주의 : 방사성 물질 취급은 허가 된 요원이 제한되고 통제 된 구역에서만 허용됩니다. 물질 및 폐기물은 적절한 절차, 지침 및 현지 법규에 따라 처리해야합니다. <ol><li> X-Dulbecco의 인산 완충 식염수 (X-DPBS)를 준비하기 위해 0.2 % (w / v) (최종 농도)의 소 혈청 알부민umin (BSA). 0.2 μm 필터를 통해 용액을 여과하십시오. 4 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 차가운 2- 데 옥시 -D- 포도당 (2dG) 용액을 준비하기 위해 2dG 16.4mg을 가하고 증류수 10mL에 용해시켜 10mM 용액을 만든다. 4 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 방사성 표지 된 2dG (2dG *) 용액을 얻기 위해 차가운 ​​2dG 600 μL와 X-DPBS 5400 μL에 방사성 표지 된 [ 3 H] 2dG 6 μL를 첨가한다. 참고 : 최종 농도는 1 mM 2dG이고 표지는 1 μCi / mL입니다. <ol><li> 방사성 표지 된 2dG * 용액의 20 μL 분액 (TC20)을 따로 보관하십시오. </li></ol></li></ol></li><li> 배양 혼합물의 준비 <ol><li> 사이토 카라 신 B 혼합물의 경우, 방사성 표지 된 2dG * 용액 2 mL에 20 mM cytochalasin B 2 μL를 첨가한다. 참고 : cytochalasin B의 원액은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에서 10 mg / mL이다. </li><li> DMSO 혼합물의 경우 나머지 4 mL의 방사성 동위 원소 표지 된 2dG * 용액에 4 μL의 DMSO를 첨가한다. </li></ol&gt; </li></ol> 2. 인간 일차 근육 세포의 배양 <ol><li> 인간의 근육 인공 위성 세포로 6-well 판의 씨앗 뿌리기 참고 : 냉동 바이알 (250,000 개의 세포 포함)에서 사내 (자세한 내용은 참조 24 참조) 또는 상용 근육 세포를 사용하십시오. 단일 조건에서 포도당 섭취의 측정에 필요한 하나의 6- 웰 플레이트를 얻기 위해 250,000 개의 세포에 대해 다음 절차를 수행합니다. <ol><li> 급속 냉동 된 물 (37 ° C)에서 사내 24 의 냉동 된 유리 병 또는 인체 근육 인공 위성 세포의 상업적 준비를 신속하게 해동하여 작은 얼음 블록 만 유리 병에 남아있게합니다. </li><li> 예열 된 (37 ° C) PM 10 mL가 들어있는 50 mL 플라스틱 관에 직접 붓습니다. </li><li> 500 XG에서 5 분 동안 원심 분리기와 뜨는을 폐기하십시오. </li><li> 부드럽게 pre-warmed 오후 18 ML (세포 당 42,000 세포를 얻기 위해 세포 펠렛을 resuspend3 mL의 배지). 6-well plate (9.6 cm 2 )의 각 well에 3 mL를 분배한다. 참고 : 플레이트의 6 개의 개별 웰은 수동 수송 억제 (웰 1 및 2), 기초 속도 (웰 3 및 4) 및 인슐린 자극 속도 (웰 5 및 6)에 대한 글루코스 흡수의 이중 측정을 수행하도록 요구된다. 6). 뚜렷한 치료법이 필요한만큼 많은 6- 웰 판을 반복하십시오. </li><li> 세포가 90 %의 합류점에 도달 할 때까지 표준 배양 조건 (37 ° C, 5 % CO2)에서 인큐베이션하십시오. 참고 :이 단계는 세포 배치에 따라 48 ~ 72 시간이 소요됩니다. 이 단계에서 매체를 바꾸지 마십시오. </li></ol></li><li> 근육 세포의 분화 <ol><li> PM을 제거하고 (48-72 h 후) 예열 된 DM (우물 당 3 mL)로 교체하십시오. 37 ° C, 5 % CO 2 에서 배양하십시오. 참고 : 세포가 정렬되고 다핵 핵이 형성되는 안정된 상태에 도달하기까지 5 일이 걸립니다. 일반적으로 기본myotubes은 1g / L 글루코스 배지에서 배양됩니다. 따라서 배양 중에 포도당이 고갈되지 않도록하려면 플레이트를 3 mL 배지로 채워 충분한 포도당 기질이 항상 세포에 사용 가능한지 확인하십시오. </li><li> 2 일마다 DM 배지를 교체하십시오. 참고 :이 시점부터 myotubes는 중요한 변화없이 최대 7 일 동안 안정적이며 포도당 섭취량 측정은 언제든지 수행 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 근육 세포 치료 (선택 사항) 참고 : 일차 근전도는 인슐린 자극 및 포도당 섭취 측정 전에 변형 (약물 검사, 신호 전달 경로의 억제제 / 활성제 등 )을 유도하기 위해 며칠 동안 치료할 수 있습니다. 근육 세포는 인슐린 감수성에 영향을 미칠 수있는 치료에 투여 할 수 있으며, 포도당 섭취량 측정은 이러한 영향을 수치화합니다. 예를 들어, 근육 세포와 포화 지방산 팔미틴산 염 배양은 인슐린 저항성을 촉진하고,nsulin은 포도당 섭취를 자극했다. <ol><li> 10 % BSA (지방산이없는)와 0.5 mL의 팔미틴산 염 (팔미)이 보충 된 DM 12 mL를 준비하십시오. 10 % BSA (지방산이없는) 만 보충 된 DM 12mL를 준비하십시오. </li><li> 인간의 기본 myotubes와 함께 두 개의 6 잘 접시를 준비하고 섹션 2.1 및 2.2 (차별의 5 일)에 설명 된대로 그들을 문화. </li><li> 5 일에 PBS 2 mL로 각 웰을 씻으십시오. 한 접시에 PALM이 들어있는 DM 2 mL를 넣으십시오. 다른 판에는 DM이 들어있는 BSA 2 mL를 넣으십시오. </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2 에서 48 시간 동안 품어 낸다. </li></ol></li></ol> 3. 인슐린 자극 <ol><li> 2 ML PBS로 두 번 differentiated 근육 세포를 씻으십시오. </li><li> 조심스럽게 PBS를 제거하고 혈청 고갈에 대한 3 시간 (37 ° C, 5 % CO 2 ) FCS없이 DM 3 ML과 품어. </li><li> 모든 웰의 배지를 FCS없이 DM 3 mL로 교체하십시오. 우물 5와 6에 100 nM 인슐린을 첨가하십시오. </li><li> 인간의 myotubes 문화를 위해 품어1 시간 (37 ℃, 5 % CO2). </li></ol> 4. 포도당 섭취량 <ol><li> 인슐린 자극 1 시간 후, X-DPBS (세척 당 1 mL)로 두 번 우물을 씻는다. </li><li> cytochalasin B 혼합물 1 mL를 웰 1과 2에 넣고 1 mL의 DMSO 혼합물을 웰 3 - 6에 첨가합니다. 15 분 (37 ° C, 5 % CO 2 ) 동안 항온 처리합니다. 잠복기가 끝나면 즉시 판을 얼음 위에 놓습니다. </li></ol> 5. 세포 용해 <ol><li> 얼음처럼 차가운 PBS 1 ML로 세포를 두 번 씻으십시오. </li><li> 50 MM NaOH 600 μL로 각 우물에있는 세포를 Lyse. 얼음 위에서 5 분 동안 배양하고 느린 궤도 회전으로 부드럽게 섞는다. 참고 : lysate가 너무 점성이 있다면 1.5 mL NaOH로 희석하십시오. </li><li> 피펫을 사용하여 resuspend하고 세포 lysate를 수집합니다. </li></ol> 6. 방사성 표지 포도당의 측정 <ol><li> 각 세포 용 해물 400 μL를 액체 섬광 계수 약병에 넣으십시오. 네거티브 컨트롤 바이알 400 개 준비50 mM NaOH μL 및 TC20 20 μL를 포함한 양성 대조 바이알 (단계 1.2.3.1에서). </li><li> 각 바이알에 액체 섬광 솔루션 4 ML을 추가합니다. 캡을 닫고 각 약병을 철저히 섞으십시오 (1-2 초). </li><li> 각 바이알을 액체 섬광 계수기에 넣고 제조자의 지시에 따라 방사능을 측정합니다. 10 분 동안 각 신틸레이션 바이알에 대한 분당 카운트 (CPM)를 기록하십시오. 참고 : CPM = &quot;분당 분해&quot;x &quot;계수 효율&quot;. </li></ol> 7. 포도당 섭취의 비율 <ol><li> 남은 lysate (200 μL, 단계 5.2)를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. Bradford 25 또는 이와 동등한 방법을 사용하여 각 세포 용 해물의 단백질 농도를 결정합니다. 각 우물에 대한 총 단백질 양 (mg)을 mg 단위로 계산하십시오. </li><li> TC1 (방사성 표지 2dG * 1 μL 값)을 얻으려면 TC20의 CPM 값을 20으로 나눕니다. </li><li> 각 바이알에 대해 t그는 포도당 섭취의 속도를 다음과 같이 계산합니다 : <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq1.jpg" /> 참고 : R은 pmol / mg / min 단위로 측정됩니다. 우물 1 - 2에 대한 R의 평균은 수동 수송 속도, R p를 제공한다 . 우물 3-4에 대한 R의 평균은 기초 총 수송 율 Rbt를 제공한다 . 우물 5-6에 대한 R의 평균은 인슐린이 총 수송 속도를 자극하게 한다 . <ol><li> 다음과 같이 기초 활성 수송율 (R ba )을 계산하십시오 : <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq2.jpg" /></li><li> 다음과 같이 인슐린 자극 활성 수송율 (R ia )을 계산하십시오 : <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq3.jpg" /> 참고 : myotubes와 같은 인슐린 반응 세포에서 포도당 흡수 속도는 일반적으로 R ba , R ia 및 R ia / R ba 와 같은 폴드 인슐린 자극의 세 값으로 표시됩니다. </li></ol></li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

포도당 섭취는 세포 배양에 대한 활성제 또는 억제제와 포도당 사용에 미치는 영향, 세포가 인슐린에 반응하는 능력을 시험하는 중요한 생물학적 측정입니다. 여기에 설명 된 방법은 빠르고 신뢰할 수있는 것으로 나타 났으며 건강한 대상 및 / 또는 신진 대사에 영향을받은 6 , 7 , 10 , 12 , 21 , 26 , 27 , 36 , 37 명의 주요 근육 튜브를 사용하는 많은 연구에서 널리 사용되었습니다. 하나의 6-well plate 만 있으면 총 기초 수송, 기초 활성 수송 및 인슐린 자극 활성 수송에 대해 중복하여 속도를 얻을 수 있습니다. 이 세 가지 값 은 체외 배양 된 근육 세포의 인슐린 민감도를 완벽하게 설명합니다. <p cla1 차 근육 세포는 콜라겐 코팅 판에서 일상적으로 배양됩니다. C2C12 또는 L6과 같은 세포주를 사용하는 경우 코팅되지 않은 플레이트를 사용할 수 있습니다. 인슐린 반응을 극대화하려면 자극 전에 근육 세포에서 인슐린을 고갈시켜 가능한 한 기본 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 표시된 3 시간 부화 시간은 인슐린 및 / 또는 혈청 기아시 세포 안정성에 따라 수정할 수 있습니다. 인슐린과 함께 3 시간 동안 항온 처리 한 다음 방사성 표지 된 포도당으로 15 분간 항온 처리한다. 인슐린과의 1 시간 배양의 목적은 최대 포도당 섭취율을 달성하기 위해 가능한 모든 GLUT4 함유 소포를 막으로 전이시키는 것입니다. 이전 시험에서 배양 시간이 짧을수록 (15 분 및 30 분) 최대 비율을 달성하지 못한다는 사실이 나타났습니다. 방사성 표지 된 2dG로 15 분 동안 인슐린 자극의 지속성은 측정 (개인 데이터)에 영향을 미치지 않으므로 의무 사항은 아닙니다. 또한, 동일한 방사성 표지<html> 2dG 혼합물을 모든 시험 된 웰에 첨가 할 수 있습니다. 세포 용해를 위해 NaOH의 부피는 세포의 특성에 따라 변경 될 수 있습니다. 매우 높은 지방산을 함유 한 세포, 즉 매우 점성이있는 용 해물을 사용할 때, NaOH의 양은 1.5 mL까지 증가 할 수 있습니다. 이 방법은 측정의 민감도를 향상시키는 방사성 표지 물질을 사용하지만 프로토콜이 관리 구역에서 수행되어야한다. 자재 및 폐기물은 현지 안전 지침에 따라 처리해야합니다. 설비가 갖추어지지 않은 실험실의 경우, 다른 비색 및 형광 정량법을 이용할 수 있습니다. 비 방사성 검정에서 형광 강도는 형광 D- 포도당 유사체 2 - [ N - (7- 니트로 벤조 -2- 옥사 -1,3- 디아 졸 -4- 일) 아미노] - 2- 데 옥시 -D- 글루코스 (2-NBDG)이다. 이 아날로그와 함께 일부 그룹에서는 인슐린이 L6 세포에서 생리적 효과를 잃었다 고보고합니다다른 그룹은 인슐린이 여전히 포도당 섭취를 증가 시킨다는 것을 보여 주었다 (인간 1 차 근육 세포에서) 38 . 낮은 GLUT4 발현으로 인하여, 배양 된 근육 세포에서 인슐린 자극 된 포도당 섭취의 정량화는 생체 내 조건에 비해 감소합니다 6 , 16 . 따라서 다른 접근법을 통해 배양 된 근육 세포의 인슐린 반응성을 더 특성화하는 것이 중요합니다. 면역 검출을 사용하는 인슐린 신호 전달 경로 (Akt / PKB 및 / 또는 GSK3와 같은)의 주요 단백질의 인산화 상태의 측정은 14 , 21 , 31에서 사용할 수 있습니다. 효소 수준에서 글리코겐 합성, 포도당 및 / 또는 지질 산화는 또한 인슐린이 있거나없는 상태에서 평가할 수 있습니다 14 , 26 , 31 . 다른 모든 세포<html> l 타입 (인슐린에 반응하든 그렇지 않든)은 이론적으로 모든 세포가 포도당을 능동적으로 또는 수동적으로 흡수 할 수 있기 때문에 분석 할 수 있습니다. 따라서 인슐린 자극 된 우물은 다른 적절한 치료로 대체 될 수 있습니다. 인간의 주요 myotube의 사용은 근육 세포가 GLUT4 단백질의 충분한 표현과 일치하는 차별 상태에 도달 것을 의미합니다. 제제가 비 근육 세포 또는 필수적으로 myoblast를 함유하고 있다면, 인슐린 자극 조건에서 포도당 섭취 값은 기본적으로 GLUT1 전달 인자의 우세로 인하여 기저 상태 (R ia 대 Rba )와 다르지 않을 것이다. 인슐린은 근육 세포 증식과 분화를 촉진하고 향상시키기 위해 일차 근육 세포 배양 배지에 첨가 될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 인슐린은 만성 자극에서 인슐린 저항성을 유도하는 것으로 입증되었습니다 40 , 41 ,class = &quot;xref&quot;&gt; 42. 우리의 실험에서, 인간의 일차 근육 세포는 혈청을 감소시킨 중간 변화시에만 적절하게 분화한다. 따라서 우리는 인슐린 반응성을 평가하기 전에 만성 자극으로부터 세포를 보호하기 위해 배양 중에 외부 인슐린을 추가하지 않는 것을 선호합니다. 마지막으로,이 방법은 몇 가지 세척 단계가 필요합니다. 따라서 일차 세포에서 일어날 수 있으므로 플레이트에서 세포를 분리하지 않도록주의해야합니다.

골격근은 포유 동물에서 가장 큰 글루코즈 침전물이며 포도당 항상성에 크게 기여합니다. 이 인슐린 반응 조직은 인슐린 자극에 의해 유발되는 포도당 섭취의 주요 부위입니다 1 . 제 2 형 당뇨병에서 인슐린 저항성은 골격근을 포함한 여러 조직에서 관찰되며 정상 혈당 농도 이상으로 이어집니다. 따라서,이 조직과 그 세포의 인슐린 감수성 수준을 결정하는 것이 목적과 상관없이 대상의 결함을 특성화하거나 개선하고자하는 치료의 효율성을 평가하는 것이 중요합니다. 인체 또는 동물 대상에서 인슐린 감수성을 평가하는 표준 표준 기술은 고 인슐린 혈증 클램프입니다. DeFronzo가 1979 년 2 월에 도입하여 3 , 4 년 이후로 수정 된이 방법은 전신을조직 인슐린 반응은 정상적인 혈당 농도를 유지하기 위해 인슐린 자극하에 포도당이 관류되는 비율로 측정됩니다. 인슐린 감도 탐사는 또한 체외 근육 모델을 사용하여 세포 수준에서 수행 할 수 있으며, 포도당 섭취량 측정은 인슐린 자극 5 , 6 , 7 에 대한 세포의 생물학적 반응을 정량화하는 효율적이고 신뢰할 수있는 도구로 남아 있습니다. 실제로 포도당 섭취량 측정은 인슐린이 수용체에 결합하여 GLUT4가 농축 된 소포를 전이시키고 세포 내 신호 전달 및 인산화 캐스케이드를 포함하여 인슐린 자극에 대한 세포 생물학적 반응을 정량화합니다. 이것은 분화 된 myotubes가 신진 대사 특성을 포함한 기증자 표현형의 많은 특징을 유지하기 때문에 인간 표본에 대한 주요 관심사이다환자 및 환자에서 관찰 된 장애 9 , 10 , 11 , 12 . myotubes는 골격근 13,14에 구조적, 대사 적 및 표현형 유사성을 표시하며 , 포도당 전달체 15 및 세포 인슐린 신호 전달기구 16 의 발현을 포함합니다. 따라서 기본 근육 세포에서 포도당 섭취량을 측정하는 것은 기증자의 근육 표현형을 특성화하거나 근육 세포에서 인슐린 감수성에 대한 중재 (약물, 영양 또는 신체 활동)의 효과를 조사하는 것과 관련이 있습니다. 배양 된 myotubes에서 포도당 섭취량을 측정하는 것은 또한 인슐린 감수성을 수정하는 실험을 수행 할 때 신뢰할 수있는 도구입니다 17 , 18 . 시험 관내 </em&gt; 모델은 인슐린 반응성을 향상시킬 수있는 화합물의 검사에 적합하거나 인취 또는 유도 된 인슐린 저항성을 예방하거나 역전시킬 수있는 화합물 19 , 20 , 21 , 22 , 23에 적합 합니다. 여기서 우리는 인간의 myotubes를 배양하고 분화시키고 세포 포도당 섭취율을 측정하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 실험실에서의 준비, 협동 또는 상업적으로 이용 가능한 공급 업체에서 유래하든 인간 근육 전구 세포의 모든 공급원에 적용 할 수 있습니다. 마우스 및 쥐 기원의 각각 C2C12 및 L6과 같은 불멸 근육 세포주도이 프로토콜을 사용하여 포도당 섭취 측정에 사용할 수 있습니다. 우리는 방사성 표지 된 [3H] 2dG를 사용하여 기저 및 인슐린 자극 상태의 속도를 정량화하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 티그는 라벨이 붙어있는 글루코스 아날로그를 사용하여 1 차 세포로 작업 할 때 일반적인 상태 인 감소 된 출발 물질로 글루코오스 진입을 정확하게 측정 할 수 있습니다. 변형 된 포도당 분자는 신진 대사 경로를 입력 할 수 없으므로 세포 내에 축적되어 총 세포 방사능을 통한 신뢰할 수있는 정량을 가능하게합니다. 실험 조건은 포도당 수송 억제제 (cytochalasin B)의 사용을 포함하며, 측정은 인슐린 유무에 관계없이 수행됩니다. 이 조합은 인슐린 반응 지수의 배수 변화 계산뿐만 아니라 포도당 활성 진입 속도의 결정을 가능하게합니다. 이 방법은 단일 배양 시간 동안 인슐린 1 회 투여 량으로 제시되지만, 프로토콜은 투여 량 반응 또는 시간 경과 실험을 위해 쉽게 수정할 수 있습니다 12 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="868">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:180px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:257px;">If not available, use commercial source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">Promocell</td>
			<td>C-12530</td>
			<td style="width:257px;">Should be cultured with associated media C23060 and C23061</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">6-well plate</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">356400</td>
			<td style="width:257px;">BioCoat Collagen I Multiwell Plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0145-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">X0551-100</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">penicilin/streptomycin 100x</td>
			<td style="width:171px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15140122</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Serum substitute UltroserG</td>
			<td style="width:171px;">Pall France</td>
			<td style="width:180px;">15950.017</td>
			<td style="width:257px;">serum substitute in text</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0064-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:171px;">Eurobio</td>
			<td style="width:180px;">CVFSVF00-01</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0625-500</td>
			<td style="width:257px;">Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">I9278</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">D6134</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Albumin bovine</td>
			<td style="width:171px;">euromedex</td>
			<td style="width:180px;">04-100-812-E</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">fatty acid-free BSA</td>
			<td style="width:171px;">Roche</td>
			<td style="width:180px;">10,775,835,001</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">palmitate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P0500</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">NET328A001MC</td>
			<td style="width:257px;">Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">c2743</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PICO PRIAS VIAL 6ml</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">6000192</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ultima gold MW CA&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td>6013159</td>
			<td style="width:257px;">scintillation liquid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">b&#234;ta counter&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">2900TR</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes

골격근은 포유 동물에서 가장 큰 글루코즈 침전물이며 포도당 항상성에 크게 기여합니다. 근육 세포의 인슐린 감수성 평가는 근육 포도당 대사를 탐색하고 대사 변화를 특징 짓는 모든 연구에 중요한 관련성이 있습니다. 근육 세포에서 글루코스 전달 인자 4 형 (GLUT4) 단백질은 인슐린에 반응하여 세포막으로 전이되어 세포 내로 포도당을 대량으로 주입합니다. 포도당 흡수 속도를 증가시켜 인슐린에 반응하는 근육 세포의 능력은 인슐린에 대한 근육 세포 민감성을 정량화하는 표준 판독 값 중 하나입니다. 인체의 주요 myotubes는 세포가 인슐린 감도를 포함하여 기증자 표현형의 많은 특징을 유지하기 때문에 시험 관내 모델에 적합합니다. 이 생체 외 모델은 또한 인슐린 반응에 영향을 줄 수있는 화합물의 검사에도 적합합니다. 분화 된 myotubes에서 포도당 섭취량의 측정 반영인슐린 민감성. 이 방법에서는 인간의 일차 근육 세포 를 시험관 내 에서 배양 하여 분화 된 근육 세포를 얻고 인슐린 자극이 있거나없는 포도당 섭취율을 측정합니다. 우리는 방사성 표지 된 [3H] 2-deoxy-D-Glucose ([ 3 H] 2dG)를 사용하여 수동 및 활성 포도당 수송 속도를 정량화하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 활성 기저 및 인슐린 자극 속도와 자극 배수를 정량화하는 계산 방법이 제공됩니다.

3 일에 myoblast는 합류점에 도달합니다 ( 그림 1A ). 이 단계의 근육 아세포는 전형적으로 단핵 세포이다. 배지를 교환하고 8 일째 분화를 완료 하였다 ( 도 1b ) (프로토콜 섹션 2). 분화 5 일 후, myotubes 정렬 및 일반적으로 polynucleated 있습니다. 글루코오스 섭취량 측정 전에 사람의 주요 근육 세포를 팔미틴테이트 또는 BSA 만 처리 하였다. 세포는 BSA (PALM) 또는 BSA 단독 (BSA)에서 팔 미트 산염 0.5 mM로 48 시간 동안 배양되었다. 인슐린 자극이 수행되었고 (프로토콜 섹션 3) 포도당 섭취가 측정되었다 (프로토콜 섹션 4). 도 2 는 대조 조건 (BSA) 및 처리 조건 (PALM)에서의 포도당 흡수 속도를 나타낸다. 비특이적 흡수는 사이토 카라 신 B와 함께 배양 된 근육 세포에서 정량화됩니다. 기초 및 인슐린 자극 된 포도당 흡수 속도는 BSA와 PAL에서 비교할 수 있습니다<html> M 조건. 인슐린은 BSA 조건에서 포도당 수송을 유의하게 증가시킨다 (p &lt;0.01). 인슐린 자극 포도당 섭취율은 PALM으로 치료 한 근육 튜브에서 유의하게 낮았다 (p &lt;0.05). 또한, 인슐린에 대한 인간 myotube 세포 반응은 fold change로 나타낼 수 있습니다. 그림 3 은 대조군과 비교했을 때 PALM으로 치료 한 근관에서 인슐린에 대한 반응이 감소 함을 보여줍니다 (p &lt;0.05). 배양 된 근육 세포에서 제한된 GLUT4 단백질의 발현에도 불구하고, 일차 근육 세포는 포도당 섭취의 증가와 함께 인슐린에 반응 할 수 있습니다 ( 그림 2 ). 관찰 된 평균 배수 변화는 ~ 1.3이며, 인간 근육 세포 6 , 7 , 10 , 26 ,&gt; 27. 포화 지방산을 가진 근육 세포에서 인슐린 저항성의 유도는 마우스, 래트 및 인간 근육 세포에서 일반적으로 기술되며, 처리 된 근육 세포의 포도당 흡수를 감소 시킨다는 것이 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 입증되었다. 우리는 48 시간 동안 palmitate (0.5 mM) 인큐베이션을 수행하여 인슐린 저항성 상태를 반영하여 기초 및 인슐린 자극 포도당 흡수 속도 감소 및 인슐린 배수 변화 감소를 관찰했습니다. 이 원고에 사용 된 배양 시간은 포도당 섭취에 대한 억제 효과를 충분히 입증하기 위해 선택되었습니다. 배양 시간이 짧아지면 인슐린 저항성이 생기고 포도당 섭취량은 감소합니다 31 , 32 , 33 </34 . 더 낮고 생리적 인 농도는 시험 관내 뿐만 아니라 투여 량 반응 및 / 또는 시간 경과 실험과 올레 에이트 29,35와 같은 불포화 지방산의 효과와 비교할 수 있습니다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55743/55743fig1.jpg" /> 그림 1 : Vitro Primary Human Myotubes. 광학 현미경을 사용하여 얻어진 2 단계 배양시의 인간 근관 영상을 나타내었다. ( A ) 합류에 myoblast 문화의 날 3. ( B ) 8 일 (분화 5 일)에 근관이 정렬된다. 스케일 바 = 200 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55743/55743fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 2 : 인슐린 자극이 BSA 및 팜 조건에서 인간의 근육 세포에서 포도당 섭취량에 미치는 영향. Myotubes는 48 시간 동안 BSA 단독 또는 0.5 mM PALM으로 처리 하였다. 중성 변화 및 3 시간 혈청 고갈 후에, 인슐린이없는 경우 (+) 또는 인슐린 존재 (+) (1 시간, 100nM)에서 특정 포도당 섭취율 (pmol / mg / min)을 측정 하였다. 데이터는 네 명의 서로 다른 기증자의 myotubes를 사용하는 4 개의 독립적 인 실험의 평균 ± SEM입니다. 기본 값과 비교 된 #P &lt;0.05; * BSA 인슐린 자극 값과 비교하여 P &lt;0.05. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55743/55743fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55743/55743fig3.jpg" /> 그림 3 : 접기 IBSA 및 PALM 문화 조건에서의 nsulin 반응. BSA와 PALM 조건에서 기초 포도당 수송 속도에 자극되는 인슐린의 비율. 이 비율은 인슐린 자극 (100 nM)시 배당 포도당 흡수 속도를 나타냅니다. * BSA 조건 (n = 4)에 비해 P &lt;0.05. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55743/55743fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

이 방법에서는 인간의 일차 근육 세포 를 체외에서 배양 하여 분화 된 근육 세포를 얻고 포도당 섭취율을 측정합니다. 우리는 방사성 표지 된 [ 3 H] 2-deoxy-D-Glucose를 사용하여 기저 및 인슐린 자극 상태의 비율을 정량화하는 상세한 프로토콜을 제공합니다.

포도당 섭취량 측정 및 인슐린 자극에 대한 반응<em&gt; In Vitro</em&gt; 배양 된 사람의 주요 근육 세포

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

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Nanyang Technological University

Research

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JoVE Journal

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Biology

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Cellular Processes

Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

19.7K 조회수.  University of Lyon.  이 방법에서는 인간의 일차 근육 세포 를 체외에서 배양 하여 분화 된 근육 세포를 얻고 포도당 섭취율을 측정합니다. 우리는 방사성 표지 된 [ 3 H] 2-deoxy-D-Glucose를 사용하여 기저 및 인슐린 자극 상태의 비율을 정량화하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 

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Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

연구

생물학

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

인슐린 주입 및 성인에서 인슐린 민감도를 측정하는 Hemolymph 추출 Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

교양있는 세포 기관 전송<em&gt; 초파리</em&gt; 셀 : S2 세포주 및 기본 뉴런.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

세포질 DNA 검출 진학의 자극<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

히드라의 글루타티온 유도 먹이 반응을 측정

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the large size of the human BRCA2 protein (approximately 390 kDa). We report modifications of standard siRNA transfection and immunoblotting protocols to silence human BRCA2 and detect endogenous BRCA2 protein, respectively, in human epithelial cell lines. Key steps include a high siRNA to transfection reagent ratio and two subsequent rounds of siRNA transfection within the same experiment. Using these and other modifications to the standard protocol we consistently achieve more than 70% silencing of the human BRCA2 gene as judged by immunoblotting analysis with anti-BRCA2 antibodies. In addition, denaturation of the cell lysates at 55 &#176;C instead of the conventional 70-100 &#176;C and other technical optimizations of the immunoblotting procedure allow detection of intact BRCA2 protein even when very low amounts of starting material are available or when BRCA2 protein expression levels are very low. Efficient silencing of BRCA2 in human cells offers a valuable strategy to disrupt BRCA2 function in cells with intact BRCA2, including tumor cells, to examine new molecular pathways and cellular functions that may be affected by pathogenic BRCA2 mutations in tumors. Adaptation of this protocol for efficient silencing and analysis of other &#39;large&#39; proteins like BRCA2 should be readily achievable.

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

의 침묵<em&gt; BRCA2</em&gt; 배양 된 인간 세포에 소설 BRCA2 규제 생물학적 기능을 확인하는

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Dictyostelium discoideum 응답 심각한 기계적인 자극의 평가

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...