우리는 재닌 베커, 캐롤라인 비켈만와 루스 니클스의 우수한 기술 지원을 감사하고 있습니다. (- 독일 연구 재단 DFG) - LA 2682 / 7-1 본 연구는 독일 Forschungsgemeinschaft의 연구비 지원을 받았다.

모든 절차는 실험 동물의 사용을위한 건강 지침의 국립 연구소에 따라 수행 및 제도적 지침 (Landesamt 대 Soziales, 어디 아퍼? 싶게 Verbraucherschutz,의 Abt. Lebensmittel- 싶게 Veterinärwesen, Zentralstelle, 자르브뤼켄, 독일)을 추적 관찰 하였다. 수술 도구 (1)의 제조 <ol><li> 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 100 U / ㎖ 페니실린, 0.1 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 준비 절개 위 수술 집게, 소규모 제조 위 미세 겸자 15ml의 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM으로 무균 페트리 접시에 보관 ) 부고환 지방 패드를 수확합니다. </li><li> 5 분간 소독 용액에 노출 수술 도구. 대안 적으로, (증기 멸균을 121 ° C, 20 분)들을 소독. </li></ol> 2. 동물 및 마취 <ol><li> 연구 및 적응증으로 조심스럽게 쥐의 변형을 선택<html> 조사중인 될 수 있습니다. 참고 :이 연구에서 우리는 부고환 지방의 수확을위한 기증자로 남성 야생 형 C57BL / 6 마우스를 사용했다. 관심, 광고 MVF는 유전자 변형 녹색 형광 단백질 (GFP) 양성 기증자 동물 (C57BL / 6-Tg는 (CAG-EGFP) 1Osb / J) (22)로부터 분리 될 수있다. 이 단편은 GFP 음성 야생형 마우스 (14)에 주입 한 후 GFP의 면역 조직 화학 염색에 의해 쉽게 검출 할 수있는 큰 이점을 맺는다. </li><li> 자일 라진 (15 ㎎ / ㎏) 및 케타민 (/ kg 75 mg)을 복강 내 주사하여 동물을 마취. 동물 깊이 만 응답이 발가락 핀치를 수행하여 마취되어 있는지 확인합니다. 기증자 동물은 지방 수확 후 희생으로 눈 윤활제는 표시되지 않습니다. 참고 : 진통 및 수술 불임이 실험을 계획하는 국가 및 기관의 각각의 가이드 라인과 일치 있는지 확인합니다. </li></ol>부고환 지방 패드의 제작 &quot;&gt; 3. 수확 <ol><li> 작업 테이블에 동물을 전송합니다. 수술 실체 현미경 하에서 앙와위에서 동물을 배치하고 발가락 핀치를 사용하여 깊은 마취를 확인합니다. </li><li> 수술 용 드레이프에 테이핑하여 발을 고정 및 솔루션을 소독으로 복부를 소독. </li><li> 해부 가위로 기본 근육 층의 무료 복부 피부를 분리합니다. </li><li> 해부 가위 정중선 개복술을 수행하고 옆으로 복부 벽의 플랩을 전개. </li><li> 양측 고환, 부고환 및 미세 집게 (그림 1)를 사용하여 부고환 지방 패드를 식별합니다. 지방 패드의 분변 오염을 방지하기 위해 장 구조를 손상시키지 마십시오. </li><li> 실체 현미경 아래에있는 작은 준비 가위 및 미세 집게로 부고환 지방 패드를 수확. 부고환과 지방을 사이에 몇 mm의 안전 마진을 유지실수로 부고환 수확의 위험을 줄일 수 있습니다. 참고 :이 절차는 또한 실체없이 수행 할 수 있습니다. 그러나이 더 부고환 및 정삭의 사고 부상의 위험을 증가시킬 수 있습니다. </li><li> DMEM 15 mL를 함유하는 페트리 접시로 부고환 지방 패드를 이동시켜 세포 기관에 반송하여 37 ℃에서 사전 - 가열 하였다. </li><li> 복부 대동맥 경부 전위의 절개에 의해 동물을 희생. </li></ol> 광고 MVF 4. 분리 <ol><li> (15) 인산 완충 식염수 용액 (PBS), 멸균 수 14 ㎖의 폴리 프로필렌 (PP) 튜브, 멸균 된 50 mL의 삼각 플라스크에, 멸균 1.5 ㎖의 원추형 마이크로 원심 튜브 멸균 미세 위 세 멸균 페트리 접시를 준비한다. </li><li> 층류 후드 아래에 PBS의 15 mL의 페트리 접시에 세 번 지방 패드를 씻으십시오. </li><li> 14 mL의 PP 튜브에 지방을 전송합니다. t를 이용하여 (ML)에서 수확 된 지방 조직의 부피를 결정그는 튜브 규모. 조직 균질 현탁액이 얻어 질 때까지 미세 가위 기계적으로 지방 조직을 잘게. </li><li> 피펫을 측정 10 mL를 이용하여 50 mL의 삼각 플라스크에 NB4G 콜라게나 제 (0.5 U / ㎖ PBS)의 두 개의 볼륨으로 다진 조직을 옮긴다. 총 부피는 단계 4.3에서 측정 된 지방 조직의 체적 배로된다. 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 대기 조건 : 자동 교반기 (25mm 자기 교반 막대의 크기)을 이용하여 격렬한 교반하에 10 분 동안 항온 조직 분해를 수행한다. </li><li> 소화를 중지 할 수 있는지 여부를 판단하기 위해 현미경으로 소화 조직의 작은 부분 (10 μL)을 관찰한다. 효소 소화 과정 (그림 2)를 중지하는 적절한 시점을 나타내는 다 이제 주로 다음 하나의 셀에 &quot;무료&quot;광고 MVF 포함되어 있음을 확인. 참고 :이 단계는 절차에 경험을 필요로하며, 품질에 대한 중요의 광고 MVF을 격리합니다. 광고 MVF없이 단일 세포 현탁액 지방 소화 결과를 장시간. </li><li> PBS / 20 % FCS의 두 개의 볼륨으로 효소를 중화. 총 부피는 단계 4.4에서 세포 현탁액 용기의 용적 배로된다. PP 새로운 튜브에 다시 세포 현탁액 용기 전송. </li><li> 중력에 의해 지방 잔류 광고 MVF 별도 37 ° C에서 5 분 동안 현탁액을 인큐베이션. 그런 다음 조심스럽게 1 mL를 정밀 피펫 주요 지방 상층 액을 제거합니다. 서스펜션은 지방이없는 것으로 나타날 때까지 100 μL 정밀 피펫이 사이클을 여러 번 반복합니다. </li><li> 50ml의 원추형 원심 분리 튜브 위에 500 ㎛의 필터를 넣어. 지방 덩어리 나머지 제거하는 여과막에 14 mL의 PP 튜브에서 10 mL로 측정 피펫으로 셀 용기 현탁액을 전송. 개별 광고 MVF의 개수에 따라 새로운 14 mL의 PP 관으로 현탁액을 여과로 이동하면 계획된 실험 분리. 참고 : 대한의 vitr미세 혈관 망 형성을 중심 O의 분석은, 더 나아가 현미경 분석시 이미지 품질을 개선하기 위해 혈관 세포 현탁액을 정화하는 것이 유리할 수있다. 이를 위해, 현탁액을 추가로 필터에 수집 된 광고 MVF으로부터 단일 세포를 제거하기 위해 20 ㎛의 필터로 여과 한 번 할 수있다. </li><li> 광고 MVF를 함유하는 펠렛을 얻기 위해 세포 현탁액을 용기 (600 XG, 5 분, 실온)를 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 용액이 남아 1까지 상청액을 제거한다. 이 1 ㎖의 광고 MVF와 펠렛을 재현 탁하고, 1.5 mL의 원추형 마이크로 원심 튜브에 현탁 옮긴다. </li><li> 펠렛을 얻기 위해 마이크로 원심 튜브 내의 광고 MVF 현탁액 (600 XG, 5 분) 원심 분리기. </li><li> PBS / 20 % FCS의 필요한 최종 부피 펠렛을 재현 탁하는 상청액을 제거한다. 참고 : 분리 당 광고 MVF의 수는 미세한 계산에 의해 평가 될 수있다. 최종 세포 vesse의 목적 들어 1/10L 현탁액을 PBS에 1:10으로 희석하고,이 희석액 100 ㎕를 96- 웰 플레이트의 웰에 전달된다. 선박과 같은 형태를 보이는 광고 MVF의 전체 수는 계산하고 전체 분리로 추정된다. 필요한 광고 MVF 농도 및 정제는 개별적으로 시험 관내 또는 광고 MVF 생체 응용에 각각에 적용될 수있다. 이것은 미세 혈관 망 형성의 시험 관내 분석하거나 조직 결함으로 생체 내 이식 용 지지체에 광고 MVF 시드의 콜라겐 겔에 MVF 광고의 삽입을 포함 할 수있다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

이 연구에서 우리는 광고 MVF의 절연을위한 잘 확립 된 프로토콜을 제시한다. 쥐의 지방 조직에서 광고 MVF을 얻는 것은 몇 가지 중요한 단계를 간단한 절차입니다. 마우스는 다른 피하 및 복강 내 지방 예금을 나타낸다. 이전에 래트에 대해 기재된 바와 같이, 광고 MVF의 분리를위한 가장 적합한 지방 원 인해 큰 혈관 (11) 크기, 균일 한 구조와 최소한의 오염 (12)을 부고환 지방 패드이다. 반면, 마우스의 피하 지방 침착은 주변 조직에 더 작고 더 부착된다. 그러나, 부고환 지방 패드의 절제술은 정자와 수확 조직의 오염의 결과로, 부고환 및 정삭의 사고 부상의 위험을 맺는다. 따라서, 부고환, 고환 및 정삭의 식별이 절차의 주요 중요하다. 또한, 지방 패드 rapidl해야Y는 생체 조직의 손상을 최소화하기 위해 수확 후 처리. 마지막으로,이 쥐의 부고환 지방 패드 (23)의 혈관의 주요 연령에 따라 차이가 있다는 것을 고려해야한다. 우리의 경험에서, 6 ~ 12 개월 된 남성 기증자 마우스의 사용은 체외 및 생체 내 연구에서 광고 MVF의 충분한 양을 제공한다. 그러나, 또한 작지만 매우 혈관 지방 패드 (24)을 나타내는 젊은 쥐에서 광고 MVF을 분리 할 수 있습니다. 수확 부고환 지방 패드의 소화 효소는 결정적으로 고립 광고 MVF의 최종 품질을 결정합니다. 콜라겐에 너무 짧은 박람회는 주변의 지방 세포에서 광고 MVF의 불완전한 분리에 연결됩니다. 한편, 단일 세포 현탁액 광고 MVF의 파괴를 장기간 분해 결과, 소위 간질 혈관 분획 (SVF). SVF는 이종 세포 집단 함유 m이고esenchymal 줄기 세포, 내피 세포, 혈관 주위 세포, 대 식세포 및 분비 및 분화 메커니즘 (25)을 통해 회생 가능성이있는 많은 다른 세포 유형. 광고 MVF의 사용은 SVF 기반의 접근 방식에 비해 상당한 장점을 나타낸다. 광고 MVF의 완전한 기능을 미세 혈관의 형태는 체외 배양에 시간이 많이 소요되는 복잡한없이 생체 실험에 대한 즉각적인 이식을 할 수 있습니다. 또한, SVF의 분리는 일반적으로 90 분 내지 26까지 콜라게나 조직의 분해를 필요로한다. 대조적으로, 티슈 열화 광고 MVF의 분리를위한 10 분을 초과하지 않아야한다. 이 광고 MVF 9 수술 한 단계 응용 프로그램의 아이디어를 지원합니다. 이를 위해, 광고 MVF 자동자가 lipoaspirates에서 고립 될 수 있으며 동작 극장을 떠나지 않고 환자의 조직 결함으로 다시 옮겼다. 이것은 현실적인 고아입니다lipoaspirates로부터 SVF의 자동 분리 이미 성형 27, 28, 29 일에 임상 적 설정 절차는 사실을 고려 L. 최근에, 우리는 뼈 (14)과 피부 (15) 대체의 생체 내 혈관에 광고 MVF의 강력한 효과를 증명하고있다. 관심, 우리는 그들이 광고 MVF (13)의 높은 혈관 용량에 기여하는 더 생리적 환경을 제공 할 수 있기 때문에, 분리 광고 - MVF에서 단일 세포를 제거하지 유익한 것으로 나타났습니다. 따라서, 우리는 더 큰 비 소화 지방 혈전을 제거하기위한 광고 MVF의 분리 동안 500 μm의 필터를 사용했다. 또한, 우리는 이식 된 피부가 광고 MVF가 유도 림프관 15를 대체 발견했다. 따라서, 광고 MVF도 lymphat을위한 빌딩 블록을 약속 할 수있다IC의 조직 공학 및 림프 부종 치료. 임상 적으로 이러한 실험 결과의 성공적인 번역의 경우, 다음 논리적 단계는 인간 지방 조직은 설치류 지방 등의 광고 MVF의 절연을위한 동등하게 적합 여부를 명확히하는 것입니다. 이러한 맥락에서, 중요한 문제는 광고 MVF 많은 양을 분리하는 데 필요한 지방의 양입니다. 프로토콜 설명 본 mL의 지방 조직 당 약 40,000 광고 MVF의 결과. 따라서, 3 ㎖의 지방 조직은 피부, 피부 (15)의 대체 1cm 2 prevascularize 할 필요가있을 것이다. 따라서,이 방법으로 인해 광고 MVF 분리 할 수 ​​지방 조직의 제한된 양에 큰 상처 또는 심각하게 아픈 환자의 치료를 위해 가능하지 않을 수 있습니다. 조직 공학 및 재생 의학 생체 내 응용 프로그램의 잠재적 광범위한 스펙트럼의 옆에, 광고 MVF 또한 혈관 시저의 체외 모델링에 적합esses. 예를 들어, 쥐 광고 MVF 새로운 미세 혈관 네트워크 (30)의 형성을 연구하기 위해 입체 콜라겐 하이드로 겔에서 배양되었다. 비슷한 접근 방식은 혈관 신생 31시 neovessel 성장 (13) 간질 매트릭스 리모델링의 시각화를위한 정교한 이미징 기술을 평가하는 데 사용되었다. 함께 찍은, 이러한 결과는 광고 MVF 만 아니라 혈관 신생과 혈관 생리학 분야의 기초 연구에 대한 미래 치료 전략에 대한 혈관 및 lymphangiogenic 단위를 약속하지 않는 나타냅니다.

조직 공학에서는 생체 대응 1, 2에서 불가능한 기능을 복원하거나 보강 조직 및 장기를 유지한다 대체품의 제조에 초점을 맞추고있다. 조직 공학 구조물의 운명은 결정적 적절한 혈관 3에 의존한다. 이러한 구조 내에서 미세 혈관 네트워크는 계층 적으로받는 사람의 혈관 4 inosculation 후 효율적인 혈액 관류를 허용하는 소동맥, 모세 혈관과 정맥으로 구성되어야한다. 이러한 네트워크의 생성은 조직 공학의 주요 과제 중 하나입니다. 이를 위해 실험 혈관 전략의 폭 넓은 스펙트럼은 지난 20 년 5, 6을 통해 소개되었다. 혈관 접근 방식은 설계, 담배 마는으로받는 미세 혈관의 증식을 자극이러한 성장의 혼입 7 요인 구조적 또는 물리 골격 변형 수단에 의해 단말. 그러나 대형 입체 구조의 혈관에 대한 혈관 신생에 의존하는 전략은 크게 미세 혈관 (8) 개발의 느린 성장 속도에 의해 제한됩니다. 조직들은 주입하기 전에 9 내에 구축 반대로 prevascularization의 개념은 네트워크 기능 미세 혈관의 생성을 목적으로한다. 종래 prevascularization는 골격 내의 내피 세포 벽화 세포 또는 줄기 세포 (10)와 같은 혈관 형성 세포의 공동 배양을 포함한다. 미세 혈관 망 형성 후 prevascularized 구조이어서 조직 결함을 주입 할 수있다. 이 복잡하고 시간이 많이 소요되는 체외 기반으로하기 때문에 주목,이 prevascularization 접근 방식은 임상에 적용하기 어려운 &lt;/ EM&gt; 주요 규제 장애물 (9)에 의해 제한되는 절차. 따라서, 폭 넓은 임상 응용 프로그램에 더 적합한 새로운 prevascularization 전략의 개발에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 이러한 prevascularization 전략은 지방 조직 유래의 미세 혈관 단편 (AD-MVF)을 적용 할 수있다. 광고 MVF 쥐 (11), (12)와 마우스 (13)의 지방 조직에서 다량으로 수확 할 수있는 강력한 혈관 단위를 나타냅니다. 그들은 세동맥, 모세 혈관 및 루멘 생리 미세 혈관 형태를 나타내는 세정맥 용기 세그먼트 및 안정화 혈관 주위 세포를 14, 15로 구성된다. 이 독특한 기능은 precultivation없이 조직 결함에 광고 MVF 시드 발판의 즉각적인 이식을 할 수 있습니다. 이 광고-MVF 빠르게에서 재 조립기능성 미세 혈관 네트워크. 또한, 광고 MVF은 또한 자신의 놀라운 재생 능력에 기여할 수 중간 엽 줄기 세포 (16)의 풍부한 소스를 나타냅니다. 따라서, 광고 MVF 점점 조직 공학 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21의 다양한 분야에서 사용된다. 광고 MVF의 분리는 원래 12 쥐 11 년에 설립되었습니다. 여기서, 우리는 부고환 지방 패드에서 쥐의 광고 MVF의 표준화 분리를 허용하는 프로토콜을 설명합니다. 이 형질 전환 마우스 모델을 사용하여 광고 MVF 기능을 기본 분자 메커니즘에 더 많은 통찰력을 제공 할 수있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5-mL conical microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR, Kelsterbach, Germany</td>
			<td>700-5239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-&#181;L precision pipette</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>4920000059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-mL measuring pipette</td>
			<td>Costar, Corning Inc., New York, USA</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14-mL PP tubes</td>
			<td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>187261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL precision pipette</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>4920000083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500-&#181;m filter (pluriStrainer 500 &#181;m)</td>
			<td>HISS Diagnostics, Freiburg, Germany</td>
			<td>43-50500-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR, Kelsterbach, Germany</td>
			<td>214-0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>65518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell detachment solution (Accutase)</td>
			<td>eBioscience, San Diego, CA USA</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Charles River, Cologne, Germany</td>
			<td>027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA</td>
			<td>003291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117-FITC</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>553373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>553354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase NB4G&#160;</td>
			<td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>17465.02</td>
			<td>Lot tested by manufacturer for enzymatic activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Braun Aesculap AG &#38;CoKG, Melsungen, Germany</td>
			<td>BC 601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM)&#160;</td>
			<td>PAN Biotech, Rickenbach, Germany</td>
			<td>P04-03600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>S&#38;T AG, Neuhausen, Switzerland</td>
			<td>FRS-15 RM-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>503261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermal skin substitute (Integra)</td>
			<td>Integra Life Sciences, Sain Priest, France</td>
			<td>62021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine&#160;</td>
			<td>Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany</td>
			<td>7005294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-IgG2akAL488&#160;&#160;</td>
			<td>eBioscience, San Diego, CA USA</td>
			<td>53-4724-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octeniderm (disinfecting solution)</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayer, Norderstedt, Germany</td>
			<td>118211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lonza Group, Basel, Switzerland</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer 20-&#181;m (20 &#181;m filter)</td>
			<td>HISS Diagnostics, Freiburg, Germany</td>
			<td>43-50020-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-IgG2akFITC</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>553988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-IgG2akPE</td>
			<td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td>
			<td>553930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small preparation scissors</td>
			<td>S&#38;T AG, Neuhausen, Switzerland</td>
			<td>SDC-15 R-8S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>Braun Aesculap AG &#38;CoKG, Melsungen, Germany</td>
			<td>BD510R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm</td>
			<td>Fink &#38; Walter GmbH, Mechweiler, Germany</td>
			<td>1671801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine&#160;</td>
			<td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td>
			<td>1320422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-SMA-AL488</td>
			<td>eBioscience, San Diego, CA USA</td>
			<td>53-9760-82</td>
			<td>Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering

기능성 미세 혈관 네트워크는 생존과 설계 조직 구조의 통합을위한 중요한 중요하다. 이러한 목적을 위해, 여러 혈관 및 prevascularization 전략이 수립되었다. 그러나, 대부분의 셀 기반 접근 방식은 미세 혈관 네트워크의 형성에 시간이 많이 소요되는 체외 단계를 포함한다. 따라서, 그들은 수술 한 단계 절차에 적합하지 않다. 지방 조직 유래 미세 혈관 조각 (광고 MVF)는 유망 혈관 단위를 나타냅니다. 그들은 쉽게 지방 조직에서 분리 및 기능성 미세 혈관의 형태를 나타낼 수 있습니다. 또한, 이들은 생체 빠르게 주입 후 새로운 미세 혈관 망으로 조립. 또한, 광고 MVF은 림프관을 유도하는 것으로 나타났다. 마지막으로, 그들은 더 높은 혈관 잠재력에 기여할 수 중간 엽 줄기 세포의 풍부한 소스. 이전의 연구에서 우리는 놀라운 vascularizati을 증명하고있다설계 뼈와 피부 대체에 광고 MVF의 용량에. 본 연구에서 우리는 쥐의 지방 조직에서 광고 MVF의 효소 분리를위한 표준화 된 프로토콜에보고한다.

본 연구에서 우리는 12 개월 된 수컷 야생형 C57BL / 6 마우스 (35 ± 1g 체중을 의미)에 7-에서 지방 조직과 육 광고 MVF 분리 절차를 수행. 도 1은 후속 기계적 및 효소 광고 MVF 절연 및 뮤린 부고환 지방 패드의 채취를 나타낸다. 지방의 수확에 필요한 시간은 30 분이었고, 광고 MVF의 분리 120 분이었다. 전체적으로, 절차는 150 분 걸렸다. 우리는 기증자 동물 당 지방 조직의 1.2 ± 0.1 mL를 수확. 지방이 금액은 용액 당 42,000 ± 2,000 광고 MVF의 분리를 허용했다. 단리 광고 MVF의 평균 길이가 42 ± 1 ㎛ (도 2a)이다. 도 2b에 도시 된 바와 같이, 소화 효소의 기간은 미세한 제어를 이용하여 결정 하였다. 광고 MVF 계층 보이는 군 전형적인 미세 혈관의 형태를 전시SEL 세그먼트 (도 2C). 우리는 또한 유동 세포 계측법에 의해 광고 MVF 특징. 이를 위해, 광고 MVF는 또한 단일 셀 (15)에 30 분 동안 세포 분리 용액에서 분해되었다. 유동 세포 계측은 광고 MVF는 중간 엽 줄기 세포 마커 양성 26 ± 2 % CD31 양성 내피 세포를 17 ± 2 % α - 평활근 액틴 (SMA) 양성 혈관 주위 세포, 9 ± 1 %의 세포를 함유하는 것이 밝혀 분석 CD117 (도 3A-C). 고정 및 조직 학적 분석을 위해 즉시 구분 된 피부 피부 대신,에 파종 한 후 더 큰 광고 MVF는 주로 임플란트의 표면 (그림 3D)에 국소했다. 그러나, 모세 혈관 세그먼트는 공극 내에서 검출 될 수있다. 시드 광고 MVF의 면역 조직 화학 염색은 상기 세동맥, 세정맥과 생리 미세 혈관 구조를 보여모세관 형 단편 (도 3e). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55721/55721fig1.jpg" /> 그림 1 : 광고 MVF 절연. A) 중간 선 개복술 후, 부고환 지방 패드 (별표)가 식별됩니다. 지방 조직은 소규모 제조 가위로 수확하고, 동물은 복부 대동맥 (화살촉)의 절개에 의해 희생된다. B) 조직 현탁액까지 미세 위 지방 패드의 기계적 닦지 균질 나타난다. 효소 소화 C)는, 콜라겐 조직의 현탁액에 첨가된다. D), 셀 용기 현탁액 배양 상청 지방 층은 폐기된다. E)는 원심 분리 후, 광고 MVF를 포함하는 펠렛을 재현 탁 및 microvasc의 체외 분석과 같은 다양한 애플리케이션에 사용할 수 있습니다울라 망 형성 또는 조직 결함으로 생체 내 주입 (F)에 대한 발판 광고 MVF의 시드. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55721/55721fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55721/55721fig2.jpg" /> 그림 2 : 광고 MVF의 형태 학적 특징. 갓 격리 광고 MVF의) 길이 배포. 평균 ± 평균의 표준 오차 (N = 6). 큰 (화살표 셀 혈관 서스펜션 스미어 B) 현미경 화상), 중형 (이중 화살표) 작은 (흑색 화살촉) 광고 MVF뿐만 아니라 하나의 셀 (흰색 화살표 머리). 스케일 바 = 110 μm의. 높은 배율은 (C 그런 광고 MVF 전시 계층 미세 혈관 세그먼트 성숙한 미세 혈관 형태를 보여준다 <stroNG&gt;) B의 인셋. 스케일 바 : C 50 μm의 =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55721/55721fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55721/55721fig3.jpg" /> 그림 3 : 유세포, 조직 학적 및 광고 MVF의 면역 조직 화학적 특성. AC)는 도시는 유세포 갓 절연 광고 MVF CD31 양성 내피 세포 (A), α-SMA 양성 혈관 주위 세포 (B) 및 CD117 양성의 중간 엽 줄기 세포 (C) 분획 분석 흐른다. 적절한 아이소 타입 - 동일한 컨트롤이 임계 값 레벨을 조정하는 데 사용되었다. 평균 ± 평균의 표준 오차 (N = 6). D) 헤 마톡 실린 및 시딩 된 경피 피부 대체물 에오신 염색 섹션. 몇 모세 혈관 세그먼트가 임플란트에 위치 &amp;# 39; S 기공 (화살촉). 세정맥 (이중 화살표) 또는 동맥 (화살표) 형태로 큰 미세 혈관은 표면에 국부적된다. 스케일 바는 40 μm의 =. 깨진 라인 = 임플란트 테두리. E) 면역 내피 세포 마커 CD31 (적색의 검출) 및 혈관 주위 세포 마커 α-SMA (녹색)에 의해 광고 MVF 특성화. 세포핵은 DNA 결합 형광 염료 (파란색)으로 염색 하였다. 큰 루멘 (이중 화살표)으로 단편 세정맥에 비해 세동맥 광고 MVF (화살표)가 두꺼운 α-SMA 양성 세포 층을 특징으로한다. 화살촉 = 모세관 광고 MVF. 스케일 바는 25 μm의 =. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55721/55721fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

우리는 유망한 혈관 단위를 대표하는 지방 조직 유래 미세 혈관 조각을 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이들은 신속 분리 될 수 있으며, 따라서, 조직 공학 분야의 다른 한 단계 prevascularization 위해 사용될 수 있고, 체외 처리에 필요로하지 않는다.

조직 공학 혈관 신생 단위로 쥐 지방 조직 유래 미세 혈관 조각의 분리

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

isolation-murine-adipose-tissue-derived-microvascular-fragments-as

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.3K 조회수.  Saarland University.  우리는 유망한 혈관 단위를 대표하는 지방 조직 유래 미세 혈관 조각을 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이들은 신속 분리 될 수 있으며, 따라서, 조직 공학 분야의 다른 한 단계 prevascularization 위해 사용될 수 있고, 체외 처리에 필요로하지 않는다. 

비디오: Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

심근 조직 공학을위한 생물학 유래 주사용 재료의 제조

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

연구

생체공학

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

조직 공학을위한 Electrospun의 Fibres의 Postproduction 처리

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

손쥐 모델에서 창자의 조직 공학

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

조직 공학 Thermoresponsive 나노 구조 표면의 제조

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

에 내장 혈관 신생에 의하여 조직 공학<em&gt; 생체</em&gt; 조직 공학 상공 회의소

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Decellularization 식물 조직의 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 두 가지 방법

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...