CM은 C1- 저해제 결핍증 (HAEi), Vladen van Het UMC Utrecht 및 수혈 연구를위한 Landsteiner 재단 (LSBR)에 대한 국제 환자기구의 재정 지원을 인정합니다.

University Medical Center Utrecht의 지역 의료 윤리위원회 (Medical Medical Committee)는이 연구를 포함한 생체 외 연구 목적으로 혈액을 채취하는 것을 승인했습니다. 1. 솔루션 준비 <ol><li> 10mM HEPES, 0.5mM Na 2 HPO 4 , 145mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgSO 4 및 5.55mM D- 글루타민을 용해시켜 4- (2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) Tyrode &#39;s 완충액을 준비한다. 증류수 내 포도당. <ol><li> 완충액의 두 가지 변종을 만드십시오 : pH를 각각 6.5와 7.4로 설정하십시오. 실험 매일에 신선한 완충액을 만드십시오. 표시된 경우 10 ng / mL 프로 스타 사이클린으로 보충하십시오. </li></ol></li><li> 증류수에 50 MM 트리스와 150 MM NaCl을 용해하여 pH를 9.0으로 조정하여 TRIS - 버퍼 식염수 (TBS)를 준비합니다. </li><li> 85 mM Tri-sodium citrate, 71 mM citric acid 및 111 mM D-glucose를 용해시켜 산성 구연산 포도당 (acid citrate dextrose, ACD)을 준비한다.경수. </li><li> HEPES Tyrode의 완충액 pH 7.4에 2 % (v / v) 파라 포름 알데히드 (PFA)를 첨가하여 고정액을 준비하십시오. 용해시키기 위해 가열 (50 - 70 ° C)하고 pH를 7.4로 설정하십시오. 분주하고 -20 ° C에서 보관하십시오. 사용 전에 37 ° C에서 해동하십시오. </li><li> HEPES Tyrode의 완충액, pH 7.4에 1 % (m / v) 인간 혈청 알부민 (HSA)을 용해하여 차단 완충액을 준비합니다 </li><li> 글리세롤 12g에 폴리 비닐 알콜 4.8g을 가하여 폴리 비닐 알콜 용액을 만들고 잘 섞는다. 12 mL의 증류수를 넣고 상온에서 로테이터에 밤새 방치한다. <ol><li> 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5) 24 mL를 넣는다. 30 분 동안 혼합하면서 50 ℃로 가열한다. 1,25- 디아 자비 시클로 [2.2.2] 옥탄 (DABCO) 1.25g을 가하고 잘 섞는다. 5 분 1,500 XG에서 원심 분리기. 나누어 진 상등액 (1 mL는 15-20 슬라이드에 충분 함) -20 ° C에 보관하십시오. 분량을 한 번 사용하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 커버 유리 준비 <ol><li> Degrease 표지희석 된 염색 황산에서 밤새 배양하여 유리 (25 x 50 mm 2 )에 옮겼다. 커버 유리를 증류수로 헹구고 오븐에서 60 ° C로 밤새 건조시킵니다. </li><li> 실험실 벤치 위에 파라핀 필름 스트립 (10 x 15cm 2 )을 물방울과 함께 붙이고 파라핀 필름을 부드럽게하여 공기를 제거합니다. paraffin 필름에 10 μg / mL VWF 또는 100 μg / mL fibrinogen의 피펫을 80 μL 떨어 뜨립니다. 방울 위에 안경을 놓으십시오. 단백질 용액은 두 표면 사이에 퍼져 유리의 전체 뒷면을 덮을 것입니다. 실온 (RT)에서 1.5 시간 동안 품어 낸다. </li><li> 파라핀 필름을 제거하고 차단 된 버퍼가있는 4-well 플레이트에 코팅면이 위로 오도록하여 커버 유리를 올려 놓습니다. 37 ° C에서 1 시간 또는 4 ° C에서 밤새 품어 둡니다. 대조군으로 VWF 또는 피브리노겐으로 코팅되지 않은 커버 글래스를 차단하십시오. </li></ol> 3. 혈소판 풍부 혈장 (PRP) </p&gt; <ol><li> 베 뉼다에 의해 구연산 전혈 (최종 농도 : 0.32 % 시트르산 나트륨 (M / V))을 수집합니다. </li><li> 브레이크없이 160 XG와 RT에서 15 분 동안 혈액을 원심 분리하십시오. 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 상청액 ( 즉, PRP)을 수집합니다. 참고 : 원심 분리 후, 위에서 아래로 3 개의 층이 관찰 될 수 있습니다 : PRP, 백혈구 및 적혈구. 흰색과 빨간색 셀을 포함하지 않도록주의하십시오. 일반적으로 9 mL 혈액 튜브를 원심 분리 한 후 PRP 3 mL를 수집 할 수 있습니다. </li><li> 세척 된 혈소판으로 실험을 수행하려면 4 절을 계속하십시오. PRP가 필요한 경우 다음 단계를 계속하십시오. </li><li> PRP 수집 후, 브레이크없이 2,000 xg에서 10 분간 다시 혈액의 나머지 (적혈구 펠렛 포함)를 원심 분리하십시오. 혈소판이 부족한 혈장 (PPP)이 들어있는 상등액을 수집합니다. 참고 : 일반적으로이 두 번째 원심 분리 단계 후에 2 mL를 수집 할 수 있습니다. </li><li> p의 수를 센다.세포 분석기의 PRP에 래트 렛을 넣고 150,000 혈소판 / μL의 농도로 PPP (단계 3.4)로 희석한다. 참고 : 희석 된 PRP의 총량은 기증자의 혈소판 수에 따라 다릅니다. 혈소판 수는 기증자에 따라 크게 다르며 PRP 희석은 개별적으로 평가해야합니다. 혈소판 수치는 150,000 ~ 450,000 혈소판 / μL 범위 내에서 정상으로 간주됩니다. </li><li> 섹션 5로 계속 진행하십시오. </li></ol> 4. 세척 된 혈소판의 제조 <ol><li> 세포 분석기를 사용하여 PRP에서 평균 혈소판 부피 (MPV)를 결정합니다. 참고 : 이것은 혈소판 사전 활성화 11 의 표시입니다. 혈소판을 쉬기위한 정상 MPV는 7.5-11.5 fL입니다 11 . MPV는 혈소판 세척 과정에서 1.5 fL 이상 증가하면 안됩니다. </li><li> 혈소판 사전 활성화를 방지하기 위해 PRD에 1/10 부피의 ACD를 넣고 브레이크없이 400 xg 및 RT에서 15 분간 원심 분리하십시오. su를 제거하십시오.HEPES Tyrode의 완충액 (pH 6.5)에서 조심스럽게 pellet을 PRP의 원래 부피로 다시 부순다. </li><li> TBS를 10 μg / mL의 농도로 첨가하여 프로스타 시클린의 분량을 녹입니다. 얼음에 보관하십시오. </li><li> 혈소판 활성화를 막기 위해 프로 그레시클린을 재조합 혈소판에 10 ng / mL의 최종 농도로 첨가하고 브레이크없이 400 xg 및 RT에서 15 분간 즉시 원심 분리하십시오. 뜨는를 제거하고 HEPES Tyrode의 버퍼, 산도 7.4에서 신중하게 펠렛을 다시 중단. </li><li> 혈소판 수를 세고 (단계 3.5) MPV (단계 4.1)의 변화를 결정하십시오 (MPV가 1.5 fL 이상 변하지 않아야 함). </li><li> HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)으로 혈소판 수를 150,000 혈소판 / μL의 농도로 조정하십시오. 실험 전에 RT에서 30 분 동안 회복하기 위해 혈소판을 남겨주세요. 격리 후 4 시간 이내에 실험을 위해 세척 된 혈소판을 사용하십시오. </li></ol> 5. 플로우 챔버 어셈블리 12를 사용 합니다. 추가 분석을 위해 우선적으로 제거 할 수있는 커버 유리를 수용 할 수있는 한 상업적으로 생산 된 다양한 유동 챔버를 사용할 수 있습니다. 설명 된 실험에 사용 된 유동 챔버는 현미경 삽입 스테이지에 정확하게 맞도록 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)로 만들어졌습니다. 여기에는 흡입구와 배출구 ( 그림 1A - C , 1, 2)와 진공 연결부 ( 그림 1A 및 C , 3)가 있습니다. 맞춤형 실리콘 시트 ( 그림 1A 및 D ; 4)가 위에 배치됩니다. 두 개의 컷 아웃은 커버 유리 ( 그림 1A , 6)를 챔버에 단단히 부착하기 위해 진공 채널을 형성합니다 ( 그림 1A 및 D ; 5). 중앙 절개 부는 유동 채널을 형성한다 ( 도 1A </strong&gt; 및 D ; 7; 폭 2.0 mm, 높이 0.125 mm). 입구와 출구는 유로에 연결되고 진공은 진공 채널에 연결됩니다. <ol><li> 플로우 챔버의 상단을 증류수로 덮고 부드러운면이 아래로 향한 맞춤 실리콘 시트를 물 위에 놓습니다. 시트를 제 위치에 유지하면서 여분의 물을 제거하여 시트를 제자리에 놓습니다. 참고 :이 실리콘 시트는 재사용이 가능합니다 (실리콘은 비활성 속성으로 알려져 있음). 일반적으로 혈소판은 부착되지 않았다. 시트는 세제로 닦고 재료가 손상 될 때까지 재사용 할 수 있습니다 ( 즉, 채널 사이의 영역에서 특히 찢어짐). 일반적으로 시트는 하루에 여러 번 실험하여 20 일 동안 사용할 수 있습니다. </li><li> 60 ° C에서 1 시간 동안 유동 챔버를 배양하여 잔류 물을 증발시켜 실리콘 시트를 유동 챔버에 단단히 부착시킵니다. </li><li> 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 한 방울을HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)을 유로에 넣습니다. 코팅 된면이 아래로 향하게하여 커버 유리 (섹션 2 참조)를 유로에 놓습니다. 진공 펌프를 진공 연결부에 연결하십시오 ( 그림 1A 및 C , 3). 10 kPa의 압력을가하십시오. </li></ol> 6. 혈소판의 사전 염색 및 항체 준비 <ol><li> 혈소판 염색 <ol><li> 37 ℃에서 30 분 동안 10 μg / mL DAPI로 세척 된 혈소판을 인큐 베이트한다. 암소에서. 결합되지 않은 DAPI를 씻어 내고 혈소판 활성화를 막기 위해 프로스타글린을 10 ng / mL의 최종 농도로 첨가하고 브레이크없이 400 xg 및 RT에서 15 분간 즉시 원심 분리하십시오. </li><li> HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)에서 혈소판 펠렛을 재생하여 150,000 혈소판 / μL의 혈소판 농도를 얻습니다. </li></ol></li><li> 항체의 제조 <ol><li> Biotin으로 표지 된 항체와 Alexa로 표지 된 strep을 혼합합니다.1 : 1의 몰비의 타비 딘. 사용하기 전에 실온에서 최소 10 분 동안 품어 둔다 (단계 7.6). 참고 : 바이오틴 표지 효율은 배치마다 다를 수 있습니다. 표적 분자의 시각화에 문제가있는 경우, 성공적인 바이오틴 일화를 확인하기위한 대조 실험과 특정 비오틴 화 항체의 표적 결합 성질을 수행해야합니다. </li></ol></li></ol> 7. 관류 <ol><li> 형광 현미경뿐만 아니라 현미경 소프트웨어를 시작합니다. 표 1에 나열된 현미경 설정을 사용하십시오. 참고 : 현미경 소프트웨어에 적절한 실험을로드하여 혈소판 및 선택된 형광 표지 항체 및 / 또는 염료의 생세 (live-cell) 시각화 및 기록을위한 현미경 및 기록 설정을 시작하십시오. RT에서 플로우 실험을 수행하십시오. </li><li> 튜브에 10mL 주사기를 연결하고 1 % HSA 블로 우를 흡입하여 흡입 튜브를 차단하십시오cking buffer를 주입 튜브에 넣으십시오. RT에서 15 분 동안 품어 둡니다. HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)을 흡 입 튜빙으로 흡입하여 흡입 튜빙을 헹굽니다. </li><li> 차단 된 입구 튜브와 처리되지 않은 출구 튜브를 직경 1.02mm 및 길이 약 20-30cm로 챔버의 입구와 출구에 연결하십시오. 콘센트 튜빙에 10 mL 주사기 (또는보다 낮은 볼륨)를 연결하십시오. 주사기 펌프의 전원을 켭니다. 참고 : 펌프에 설정된 유속과 함께 주사기의 직경이 체적 유량을 결정합니다. 유동 채널의 표면적과 함께, 전단 속도는 식 13 에 따라 계산 될 수있다 이하. 따라서 주사기 펌프의 유량을 변경하거나 유로의 치수를 변경하여 전단 속도를 조작 할 수 있습니다. 800-1600s -1 의 전단 율은 전형적으로 동맥 혈류를 모델로하며, 25-100 s-1 모델은 정맥혈흐름. 이 설정에서 7.5 μL / min의 유속은 25 s -1 의 전단 속도를 발생시킵니다. 전단 속도 = 6Q / h 2 w in s -1 Q = 체적 유량 (mL / s), h = 높이 채널 (cm) (0.0125cm, 실리콘 시트의 두께), w = 너비 채널 (cm) (이 챔버에서 0.2cm). </li><li> 100X 대물 렌즈 (1,000X의 총 증폭)에 침지 오일 한 방울을 놓고 유리 표면을 아래로하여 현미경에 챔버를 놓습니다. </li><li> 유입 튜브를 HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)이 들어있는 튜브에 넣으십시오. 출구 튜빙에 연결된 주사기의 플런저를 수동으로 당기고 챔버를 통해 용액을 당겨 시스템에서 공기를 제거합니다. 주사기 펌프 ( 그림 1B 및 C , 8)에 주사기를 놓고 펌프를 잠깐 실행하여 플런저를 조이고 안정된 흐름을 확보합니다. </li><li> 혈소판 현탁액 또는 PRP에 항체 및 / 또는 염료를 조심스럽게 추가하십시오.플라스틱 피펫으로 섞어서 1.5 mL 튜브에 옮긴다. 참고 : 전단 속도 25 s-1 (7.5 μL / min)에서 일반적인 30 분 재관류 의 경우 최소 225 μL의 혈소판 현탁액이 필요합니다. 대표 결과에 사용 된 항체를 표 2 에 나타내었다 . </li><li> HEPES Tyrode의 완충액, pH 7.4에서 주입 튜브를 PRP 또는 세척 된 혈소판과 항체 및 / 또는 염료가 들어있는 1.5 mL 튜브 ( 그림 1B 및 C ; 9)로 옮깁니다 . 참고 : 튜빙을 옮길 때 공기가 튜브 안으로 들어가는 것을 방지하기 위해 튜빙이 압착되어 있어야합니다 (공기를 밀어내는 것). 비슷한 방식으로 유입 튜브를 다른 튜브로 이동시켜 후속 단계에서 다양한 시약으로 부착 성 혈소판을 치료할 수 있습니다. 잠재적으로 유용한 시약의 목록이 표 3 에 나와 있습니다. </li><li> &#39;실시간 시각화&#39;를 선택하십시오.n &quot;옵션을 사용하여 코팅 된 커버 글래스의 표면에 현미경을 맞추고 혈소판이 유량 용기에 도달 할 때까지 1,600 s-1 (484 μL / min)의 전단 속도로 펌프를 시동하십시오. 시린지 펌프의 세팅을 7.5 μL / min의 유속으로 변경하여 전단 속도를 25 s-1 로 낮추십시오. </li><li> 커버 유리의 코팅면의 표면을 관찰하고 첫 번째 혈소판이 부착하기 시작할 때까지 기다렸다가이 혈소판에 현미경을 맞추고 소프트웨어에서 실험을 시작하여 녹음을 시작하십시오. 여기에 사용 된 녹음 설정은 표 1 을 참조하십시오. </li><li> 라이브 녹음을 시각적으로 따라하십시오. 30 분 후 주사기 펌프를 멈추십시오. 참고 : 실험 도중 혈소판에 초점이 맞춰 졌는지 확인하십시오. 전형적으로, 20-30 개의 혈소판이 1,000X의 배율로 시야에 붙습니다. 이것은 전체 흐름 채널에서 약 2,000-3,000 개의 혈소판입니다. </li><li> 사용하여 고정플로우 챔버 (옵션). <ol><li> 주사기 펌프를 멈춘 후 흐름이 멈 추면 주입 튜브 (공기가없는)를 고정 용액으로 옮기십시오. 펌프를 다시 시작하고 단계 7.8에서 언급 한 것과 같은 유속으로 채널을 통해 고정 버퍼를 최소 10 분 동안 흐르게하십시오. </li></ol></li><li> 현미경에서 챔버를 제거하고, 유리에서 침지 오일을 청소하고, 진공을 차단하고, 18G 바늘로 조심스럽게 커버 유리를 챔버에서 제거하십시오. 참고 : 커버 유리가 파손되어 실리콘 시트가 손상되지 않도록하십시오. </li><li> 증류수로 미리 적셔 놓은 조직의 상단에있는 4- 웰 플레이트에 커버 슬라이드 (셀이 위를 향하도록)를 놓습니다. 참고 : 이렇게하면 커버 유리가 표면에 달라 붙지 않고 건조되지 않습니다. </li><li> 커버 유리 위에 고정액 750 μL를 피펫과 실온에서 1 시간 품어. 샘플을 직접 분석 할 수없는 경우,안정적인 고정을 보장하기 위해 4 ℃에서 0.5 % PFA (HEPES Tyrode의 완충액, pH 7.4로 희석)에 보관하십시오. 이미징을 위해 커버 유리를 처리하려면 8 절을 계속 진행하십시오. </li><li> 사용 후에는 챔버, 튜빙 및 시트를 증류수로 헹구고 세제 용액에서 밤새 배양하십시오. 챔버 및 다른 구성 요소를 재사용하기 전에 증류수로 헹구십시오. </li><li> 모든 메타 데이터가 포함 된 현미경 원시 데이터 파일을 저장합니다. 필요할 때 동영상을 .MOV, h.264 압축 또는 .AVI 비 압축으로 내 보냅니다. 별도의 프레임을 JPEG 또는 TIF 파일로 저장하십시오. </li></ol> 8. 공 촛점 형광 현미경 검사를위한 샘플 준비 <ol><li> 덮개 유리를 새로운 4-well plates에 옮기고 3 mL의 HEPES Tyrode &#39;s buffer, pH 7.4로 5 회 헹굽니다. 차단 버퍼 3 ML / 잘 추가하고 RT에서 1 시간 품어. </li><li> 블로킹 버퍼를 제거하십시오. HEPES Tyrode의 완충액, pH 7.4에 0.15 % 글리신 (M / V) 3 mL / well을 첨가한다. R에서 15 분간 품어 둔다.티. </li><li> 글리신 용액을 제거하고 3 mL / well의 블로킹 완충액으로 5 번 씻는다. 필요에 따라 추가 염색을 위해 블로킹 완충액으로 희석 한 형광 단 결합 항체를 첨가하십시오. 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 품어 낸다. </li><li> 차단 완충액으로 5 회, 증류수로 2 회 세척한다. 세포를 만지지 말고 조직 안의 가장자리에서 과량의 액체를 제거하여 유리를 말립니다. </li><li> 현미경 슬라이드에 폴리 비닐 알코올 용액 60 μL를 피펫에 넣습니다. 세포와 함께 커버 유리를 방울 위에 놓고 폴리 비닐 알코올이 두 표면 사이에 퍼지게하십시오. 어두운 밤 RT에서 밤새 품어 낸다. </li><li> 공 촛점 현미경으로 세포를 분석 14 . </li><li> 모든 메타 데이터가 포함 된 기록 된 스택 데이터의 원시 데이터 파일을 저장합니다. 필요한 경우 원시 데이터 파일을 MOV, h.264 압축 또는 .AVI 비 압축 파일로 처리합니다. 별도의 스택을 JPEG 또는 TIF 파일로 저장하십시오. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+CD63+is+in+platelet+dense+granules,+is+deficient+in+a+patient+with+Hermansky-Pudlak+syndrome,+and+appears+identical+to+granulophysin.">The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin.</a> J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).</li><li>Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+dense+granules+contain+polyphosphate+and+are+similar+to+acidocalcisomes+of+bacteria+and+unicellular+eukaryotes.">Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes.</a> J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).</li><li>Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+von+Willebrand+Factor+under+Control:+Alternatives+for+ADAMTS13.">Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13.</a> Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).</li><li>Tersteeg, C., de Maat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+cleavage+of+von+Willebrand+factor+as+an+emergency+bypass+for+ADAMTS13+deficiency+in+thrombotic+microangiopathy.">Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy.</a> Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).</li><li>Basir, A., de Groot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Hemocompatibility+Testing+of+Dyneema+Purity+Fibers+in+Blood+Contact.">In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact.</a> Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

전 세계적으로 혈전증은 사망 및 이환율의 주요 원인이며 혈소판은 그 발달에 중심적인 역할을합니다. 이 작품은 흐름 아래 혈소판 degranulation의 라이브 셀 이미징을위한 방법을 설명합니다. 일반적으로 혈소판이 활성화되면 모든 세분화 된 내용물이 직접 용액으로 방출된다고 가정합니다. 수반되는 결과는 이것이 꼭 그런 것은 아니라는 것을 암시한다. 접착 및 탈과립시 혈소판은 상당량의 폴리 인산염을 보유합니다 ( 그림 4 ). 또한, multimeric 단백질 VWF는 degranulation 후 혈소판 표면과 관련이있다 ( 그림 5 ). 이것은 혈소판 과립 탈과립을 조절하는 분자 기작이 일반적으로 추정되는 것보다 미묘 함을 나타냅니다. 유동 하에서 혈소판 탈과립의 생세포 이미징을 가능하게하기 위해, 실험 조건은 혈소판 응집을 최소로 유지하도록 선택되었다. 혈소판 검사150,000 혈소판 / μL의 ts가 사용되었다. 이것은 정상 범위 (150,000 ~ 450,000 혈소판 / μL)의 하단부에 있습니다. 또한, 고정화 된 VWF 또는 피브리노겐에 대한 혈소판의 부착 및 퍼짐을 연구하여 가벼운 혈소판 활성화 (예 : 콜라겐과 대조적)를 유도했습니다. 세척 된 혈소판을 사용한 연구에서 증가 된 전단 속도는이 세포를 흐름의 중심으로 이동시킵니다. 이것은 접착 및 후속적인 퍼짐을 방해하고 탈과립 화의 연구를 복잡하게한다. 생리적 지혈에서 혈소판 마진이 중요합니다. 이 과정은 적혈구에 의해 유도되어 왜 저 빈혈이 때때로 출혈 체질을 동반하는지 설명합니다. 제시된 기술의 한계는 적혈구에 의해 혈소판 탈과립 (제시된 물질 및 시약 포함)의 시각화가 방해 받는다는 것입니다. 혈소판 기능은 유체의 점도 (μ)의 함수 인 전단 응력의 영향을 받는다.전단 속도의 그러므로 유사한 점도 ( 즉, 세척 된 혈소판, 재구성 된 혈액, PRP 또는 전혈)를 갖는 용액에서의 흐름 모델에서 혈소판 기능을 연구하는 것이 좋습니다. 이러한 실험을 수행 할 때 고려해야 할 몇 가지 실용적인 요소가 있습니다. 첫째, 형광 신호는 초점 영역에 의해 강하게 영향을받습니다. 현미경에 초점이 맞지 않으면 신호가 쉽게 흐려 지거나 손실 될 수 있습니다. 혈소판이 흐름 채널에 도착하기 전에 채널 자체에 초점을 맞추는 것이 가장 좋습니다 (실리콘 시트 / 흐름 채널 벽의 가장자리에서 시작). 혈소판이 부착되기 시작하면이 접착 이벤트에 집중하십시오. 두 번째 관심사는 특정 형광체 ( 예 : FITC)의 표백입니다. 반복적 인 여기는 신호 손실로 이어져 조사를 방해합니다. 이러한 장애물은 더 안정한 형광체를 사용하여 흥미 진진한 LED 조명의 강도를 줄이고 exp를 단축함으로써 극복 할 수 있습니다오스 트레 (osure) 시간 및 / 또는 프레임 속도를 낮 춥니 다. 여기에 설명 된 모델은 매우 다양한 고정 된 단백질 및 다양한 유속에서의 혈소판 반응에 대한 상세한 연구를 수행하는 데 매우 유용합니다. 잠재적으로,이 방법은 또한 활성화 된 내피 세포 18 과의 상호 작용을 연구하는데 사용될 수 있습니다. 특수 흐름 챔버의 유연한 설계를 가능하게하는 기술적 진보는 현재 생체 적합성 연구를위한 길을 열어주고 있습니다 19 . 혈류에서의 혈소판 반응성의 생세포 이미징은 혈소판 접착 반응의 복잡성에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 궁극적으로 이러한 경험은 혈소판 기능과 응고 시스템에 대한 영향을 종합적으로 조사 할 수있는 개발 실험 흐름 모델로 이어져야합니다.

혈소판은 혈류를 순환하는 무핵 세포입니다. 그들의 주요 기능은 손상 부위에서 혈관 침범을 봉쇄하고 출혈을 막는 것입니다. 이러한 부상 부위에서, 내피 내 콜라겐 섬유가 노출되고이어서 다량 단백질, 폰 빌레 브란트 인자 (VWF)로 덮힌 다. VWF는 세포 표면의 당 단백질 Ibα-IX-V 복합체에 의존하는 메커니즘으로 혈소판과 순환 적으로 상호 작용하여 혈소판의 속도를 늦춘다. 이것은 고 전단 속도에서 특히 중요합니다. 이어서 혈소판은 콜라겐으로부터 활성화 자극을받는 동안 형태 학적 변화를 겪습니다. 이것은 돌이킬 수없는 퍼짐 및 결국 혈소판 응집을 유도한다. 두 공정 모두 혈소판 - 혈소판 혼입을 촉진하기 위해 과립 내용물의 분비에 달려있다. 그 중에서도 혈소판 알파 과립에는 혈소판의 부착과 다리를 돕기 위해 섬유소원과 VWF가 포함되어 있습니다혈소판을 인테그린에 의존적으로 결합시킨다. 혈소판 고밀도 과립에는 혈소판 활성화를 강화시키는 데 도움이되는 칼슘 및 아데노신 디 포스페이트 (ADP)를 비롯한 무기 화합물 2가 포함되어 있습니다. 또한 혈소판에는 (알레르기) 염증 3 매개체, 보체 - 조절 단백질 4 및 혈관 신생 인자 5,6 이 포함되어있어 이러한 내용물이 다양한 조건에서 어떻게 다르게 방출되는지 여부와 문제에 대한 의문을 제기합니다. 1980 년대 이래로, 혈류 모델에서 혈소판 기능에 대한 연구는 혈전 메커니즘의 연구에 유용했다. 그 이후로 많은 기술적 진보가 이루어졌으며, 피브린 형성을 포함하는 유동 모델은 현재 생체 내 에서 치료 용 혈소판 농축 물의 지혈 가능성을 평가하기 위해 개발되었다.혈전 형태학에 전단 율의 교란이 미치는 영향을 조사 9 . 병리학 적 혈전 형성 (혈전증)에 비해 안정적인 접착 및 생리적 인 혈전 형성 (지혈)을 유도하는 분자 및 세포 - 생물학적 기전의 차이는 매우 미묘 할 수 있으며, 이러한 세포 내 (subcellular)의 실시간 시각화를 허용하는 흐름 모델의 개발을 동기 부여 할 수있다 프로세스. 그러한 셋업이 가치있는 과정의 예는 세포 내 폴리 인산염의 (재) 분포와 응고 인자의 동원에 의해 섬유소 미세 구조에 미치는 영향을 밝혀줍니다. 연구는 종종 종단점 분석으로 제한됩니다. 기술 된 방법의 주 목적은 혈류가 활성화 된 상태에서 혈소판 활성화 과정에서 발생하는 동적 세포 과정을 실시간으로 시각적으로 조사 할 수있게하는 것입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)&#160;</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">441476L</td>
			<td style="width:372px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">S-0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">31434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td style="width:295px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:227px;">1.05886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td style="width:295px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:227px;">1.04074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prostacyclin&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Cayman Chemical</td>
			<td style="width:227px;">18220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tri-sodium citrate</td>
			<td style="width:295px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:227px;">1.06448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citric acid&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:227px;">1.00244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:295px;">Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td style="width:227px;">BBAD02400500#A</td>
			<td>24x50mm, No. 1 = 0.13-0.16 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:447px;">Chromosulfuric acid (2% CrO3)</td>
			<td style="width:295px;">Riedel de Haen</td>
			<td>07404</td>
			<td>CAS [65272-70-0].</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Von Willebrand factor (VWF)</td>
			<td style="width:295px;">in-house purified</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibrinogen</td>
			<td style="width:295px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td style="width:227px;">FIB3L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 well dish, non-treated</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:227px;">267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Serum Albumin Fraction V</td>
			<td style="width:295px;">Haem Technologies Inc.</td>
			<td style="width:227px;">823022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood collection tubes, 9 ml, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2%</td>
			<td style="width:295px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:227px;">455322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell analyser&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Abbott Diagnostics</td>
			<td style="width:227px;">CELL-DYN hematology analyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td>30525-89-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:295px;">Harvard Apparatus, Holliston, MA</td>
			<td style="width:227px;">Harvard apparatus 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mL syringe with 14.5 mm diameter</td>
			<td style="width:295px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:227px;">305959</td>
			<td>Luer-Lok syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Anti-CD63-biotin&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Abcam&#160;</td>
			<td style="width:227px;">AB134331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Anti-CD62P-biotin&#160;</td>
			<td style="width:295px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:227px;">Dy137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:295px;">Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td style="width:227px;">9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S11223&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444963-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Detergent solution</td>
			<td>Unilever, Biotex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56-40-6&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinyl alcohol</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td>9002-89-5</td>
			<td>Mowiol 40-88.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td>1185-53-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td>280-57-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sheep Anti-hVWF pAb</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td style="width:227px;">AB9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Alexa fluor 488-NHS</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:227px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:227px;">15523-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Parafinn film</td>
			<td style="width:295px;">Bemis</td>
			<td style="width:227px;">PM-996</td>
			<td>4 in. x 125 ft. Roll.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Silicone sheet non-reinforced</td>
			<td style="width:295px;">Nagor</td>
			<td style="width:227px;">NA 500-1</td>
			<td>200mmx150mmx0.125mm.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:447px;">Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels</td>
			<td style="width:295px;">in-house made</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td>Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:295px;">Eppendorf AG</td>
			<td style="width:227px;">T9661-1000AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:295px;">Zeiss Observer Z1&#160;</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td>Equiped with LED excitation lights.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Microscope software</td>
			<td style="width:295px;">Zeiss ZEN 2</td>
			<td style="width:227px;">blue edition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">18 G needle (18 G x 1 1/2&#34;)</td>
			<td style="width:295px;">BD biosciences</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">NaCl</td>
			<td style="width:295px;">Riedel de Haen</td>
			<td style="width:227px;">31248375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Tris</td>
			<td style="width:295px;">Roche</td>
			<td style="width:227px;">10708976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Plastic pasteur pipet</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">612-1681</td>
			<td>&#160;7 ml non sterile, graduated up to 3ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Silicone tubing</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">228-0656</td>
			<td>Inner diamete. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:227px;">ABAA000001##12E</td>
			<td>76 x 26 x 1 mm, ground edges 45&#176;, frosted end.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of platelet degranulation and secretion under flow

혈소판은 혈관 침범을 봉쇄하기위한 혈전 형성의 지혈에 필수적인 요소입니다. 또한 혈전증, 혈관을 막아 장기를 손상시키는 혈전 형성에 생명을 위협하는 결과를 초래합니다. 이것은 혈소판 기능에 대한 과학적 연구와 흐름 조건에서 일어날 때 세포 생물학적 과정을 추적하는 방법 개발의 동기를 부여합니다. 혈소판 접착 및 응집의 연구를 위해 다양한 유동 모델을 사용할 수 있는데, 혈소판 생물학의 두 가지 주요 현상입니다. 이 연구는 활성화 동안 혈류에서 실시간으로 혈소판 탈과립을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 와이드 필드 역전 된 LED 기반 형광 현미경 아래에 놓인 주사기 펌프 셋업에 연결된 유동 챔버를 사용합니다. 여기에 설명 된 설정은 형광으로 표지 된 항체 또는 형광으로 전달되는 다중 형광 물질의 동시 여기를 허용합니다염료. 라이브 셀 이미징 실험 후 커버 유리는 정적 현미경 ( 즉, 공 초점 현미경 또는 주사 전자 현미경)을 사용하여 추가 처리 및 분석 될 수 있습니다.

도 1 은 유동 챔버 및 실험 장치의 이미지를 도시한다. 실리콘 시트의 위치와 치수; 및 배관 연결. 그림 2 는 플로우 챔버의 치수에 대한 세부 사항을 제공합니다. 그림 3 과 영화 1 은 고정 된 VWF에 혈소판 접착 및 퍼짐의 이미지의 시계열을 보여줍니다. CD63은 쉬고있는 혈소판의 세포 내 고밀도 과립 막에 삽입 된 막 관통 단백질이다. 혈소판 표면에 시간 의존적으로 동원되어 녹색으로 표시됩니다. 유사하게, P- 셀렉틴 (Psel)은 쉬고있는 혈소판의 세포 내 알파 - 과립 막에 삽입 된 막 횡단 단백질이다. 혈소판 표면에 시간 의존적으로 동원되어 오렌지색으로 표시됩니다. 도 3b 는 45 ° 각도에서의 대표 이미지, 유동 실험 후 공 촛점 형광 현미경에 의해 획득. 영화 2 는 같은 실험의 기울기 시리즈를 보여줍니다. CD63은 주로 중앙 육아낭에 위치하고 P- 셀렉틴은 세포체 전체에 분포하고 모서리에 집중되어있는 것처럼 보입니다. 그림 4A 와 그림 3 은 CD63의 혈소판 표면 (녹색)에 시간에 따른 동원을 보여줍니다. 이 실험에서는 혈소판 (핵 DNA가없는)을 DAPI (파란색)와 사전 배양하여 밀도가 높은 과립 16에 폴리 인산염을 얼룩지게했습니다. 놀랍게도 조밀 한 과립 방출 (단일 세포 분석이 그림 4B 및 영화 4에 표시됨)의 명확한 징후에도 불구하고 폴리 인산염은이 혈소판의 내부 또는 외부에 유지됩니다. 그림 5 와 영화 5 는 VWF의 시간 의존 동원 (또는 모집)을 보여주는데, thrombogenic multα-granules에 저장된 imeric 단백질 17을 혈소판 표면 (녹색)으로 이동시킨다. 폴리 포스페이트와 유사하게, VWF는 활성화 된 혈소판의 표면과 관련되어있다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55658/55658fig1.jpg" /> 그림 1 : Flow Chamber 및 실험 설정. ( A ) 입구와 출구 (1과 2), 실리콘 시트 (4)가 놓이는 진공 연결부 (3)가있는 흐름 챔버 설계 이미지. 실리콘 시트의 두 개의 외부 컷 아웃 (5)은 커버 유리 (6)를 부착하기위한 진공 채널을 형성합니다. 중앙 컷 아웃 (7)은 유동 채널을 형성한다. ( B ) 실험 장치의 이미지. 입구 및 출구 (1 및 2), 주사기 펌프 (8) 및 시료 홀더 (9). 실험 설정의 ( C ) 도식 개요; 숫자는 A와 B의 그것들과 동일하다. ( D ) 치수를 가진 도식 개요<html> 맞춤형 절단 실리콘 시트의 ( E ) 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트) 유동 챔버의 개략도 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55658/55658fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55658/55658fig2.jpg" /> 그림 2 : Flow Chamber의 상세 청사진 흐름 챔버는 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트) 블록 (1) , 진공 흡입구 (2)를 위한 하나의 직선 폴리 옥시 메틸렌 인서트 및 샘플 입구 및 출구 (3)를 위한 두 개의 각진 폴리 옥시 메틸렌 인서트로 구성됩니다. 각진 폴리 옥시 메틸렌 삽입물은 1.07 mm의 직경을 갖는 금속 모세관을 포함합니다. 직선형 인서트에는 직경이 1.3 mm 인 모세관이 있습니다.<html> 658 / 55658fig2large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55658/55658fig3.jpg" /> 그림 3 : 고정 된 폰 빌레 브란트 인자에 대한 혈소판 퍼짐 및 탈수소. ( A ) 혈소판의 확산 및 탈과립 표면에 CD63 및 P- 셀렉틴의 시간 의존 동원. 흰색 눈금 막대 (왼쪽 위)는 10 μm를 나타냅니다. ( B ) 45 ° 각도에서 대표 공 촛점 형광 현미경 이미지. 흰색 스케일 막대 (왼쪽 하단)는 2 μm를 나타냅니다. 그린, CD63; 오렌지, P- 셀렉틴. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55658/55658fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 55658 / 55658fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4 : 고정화 된 섬유소원에서 조밀 한 과립의 혈소판 퍼짐, 탈 과립 화 및 이동성. ( A ) 혈소판 표면에 CD63 및 폴리 인산염의 시간 의존 동원. 흰색 눈금 막대 (왼쪽 위)는 10 μm를 나타냅니다. ( B ) 단일 혈소판의 시계열 (t = 0은 표면에 대한 첫 번째 접착력을 나타냄). 흰색 스케일 막대 (오른쪽 하단)는 2 μm를 나타냅니다. 그린, CD63; 블루, DAPI. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55658/55658fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55658/55658fig5.jpg" /> 그림 5 : 고정화 된 피브리노겐의 혈소판 표면에 폰 빌레 브란트 인자의 표면 협회. 혈소판 표면에 VWF의 시간 의존 동원 (또는 모집). 티화이트 스케일 바 (왼쪽 위)는 5 μm를 나타냅니다. 그린, VWF. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55658/55658fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 환경 </td><td> 값 </td></tr><tr><td> 노출 시간 FITC (Alexa488) </td><td> 200 ms / 300 ms </td></tr><tr><td> LED 488 강도 FITC (Alexa488) </td><td> 50 % </td></tr><tr><td> 노출 시간 DIC </td><td> 30 ms </td></tr><tr><td> 전압 할로겐 램프 </td><td> 4.5 볼트 </td></tr><tr><td> 노출 시간 TRITC (Alexa 546) </td><td> 400 ms </td></tr><tr><td> LED 555 강도 FITC (Alexa546) </td><td> 50 % </td></tr><tr><td> 노출 시간 DAPI </td><td> 500ms </td></tr><tr><td> LED 365 강도 </td><td> 50 % </td></tr><tr><td> Filterset FITC </td><td> Filterset 10 </td></tr><tr><td> Filterset TRITC </td><td> Filterset 20 </td></tr><tr><td> Filterset DAPI </td><td> Filterset 01 </td></tr><tr><td> 목표 </td><td> 알파 플랜 - Fluar 100x / 1.45 오일 </td></tr><tr><td> 프레임 속도, 녹화 시간 </td><td> 1 프레임 / 10 초, 30 분 </td></tr><tr><td> 파일 압축 동영상 </td><td> MOV (h.264), AVI (압축되지 않음) </td></tr><tr><td> 파일 압축 사진 </td><td> JPEG, TIF </td></tr></tbody></table> 표 1 : 현미경 설정. 대표 실험에 사용되는 설정. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 목표 </td><td> 항체 / 염료 </td><td> 집중 </td></tr><tr><td> CD63 </td> &lt;td&gt; 항 -CD63- 바이오틴 *) </td><td> 325 ng / mL </td></tr><tr><td> P- 셀렉틴 </td><td> 항 -CD62P- 바이오틴 **) </td><td> 90 ng / mL </td></tr><tr><td> DNA </td><td> DAPI </td><td> 10 ㎍ / mL </td></tr><tr><td> VWF </td><td> 항 인간 VWF-FITC </td><td> 5 μg / mL </td></tr><tr><td colspan="3"> *) 항 -CD63- 비오틴 항체를 streptavidin-Alexa488과 1 : 1의 몰비로 혼합하여 사용한다. </td></tr><tr><td colspan="3"> **) 항 -CD62P- 바이오틴 항체는 사용 전에 1 : 1의 몰비로 스트렙 타비 딘 -Alexa546과 혼합한다 </td></tr></tbody></table> 도표 2 : 항체와 염료. 제시된 대표 실험에 대해 권장되는 항체 및 염료 농도. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 시약 카테고리 </td><td> 예제 콤보unds </td></tr><tr><td> 혈소판 작용제 </td><td> 트롬빈, ADP, PAR-1 또는 -4 활성화 펩타이드, U46619, 트롬 복산 A2, ADP </td></tr><tr><td> 효소 억제제 </td><td> Hirudin, PPACK, heparinoids (간접), 옥수수 트립신 억제제, 콩 콩 트립신 억제제 </td></tr><tr><td> 수용체 길항제 </td><td> 항 -Glyprotein 1bα, 항 -Glycoprotein VI; 클로피도그렐, (고리 형) RGD- 함유 펩타이드 </td></tr><tr><td> 활성화 억제제 </td><td> 아스피린 전처리, 고정 </td></tr></tbody></table> 표 3 : 잠재적으로 유용한 시약. 보충 영화 : 영화 1 : 혈소판 이미지의 시계열 ( 그림 1 참조), 영화 2 : 그림 3B 의 틸트 시리즈, 영화 3 : 혈소판에 CD63의 시간 의존 동원( 그림 4 참조), 영화 4 : 단일 셀 분석의 시계열 ( 그림 4B 참조), 영화 5 : VWF의 시간 의존적 동원 ( 그림 5 참조). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55658/movie_1_FINAL.mov">영화 1을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55658/movie_2.mov">영화 2를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55658/movie_3.mov">영화 3을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55658/movie_4_2.mov">영화 4를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55658/movie_5.mov">Movie 5를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

이 연구는 혈소판의 부착, 퍼짐 및 유속 하의 분비를 연구하기위한 형광 현미경 기반의 방법을 설명합니다. 이 다목적 플랫폼은 혈전증과 지혈에 대한 기계 연구를 위해 혈소판 기능을 조사 할 수있게합니다.

흐름하에있는 혈소판 탈식 및 분비의 라이브 셀 이미징

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K 조회수.  University Medical Center Utrecht.  이 연구는 혈소판의 부착, 퍼짐 및 유속 하의 분비를 연구하기위한 형광 현미경 기반의 방법을 설명합니다. 이 다목적 플랫폼은 혈전증과 지혈에 대한 기계 연구를 위해 혈소판 기능을 조사 할 수있게합니다. 

비디오: Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

형광등을 통해 F - 굴지 역학 라이브 셀 이미징은 현미경을 스페클 (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

연구

생물학

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Microfluidic 흐름 전지를 사용하여 흐름에서 혈소판 접착 및 집계

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

COS - 7 형광 라벨링는 라이브 셀 이미징에 대한 SNAP - 태그 퓨전 단백질 표현

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

단백질의 품질 관리 시스템을 공부<em&gt; D. discoideum</em&gt; 온도 제어 라이브 셀 이미징을 사용하여

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

장 내분비 세포의 굿 호르몬 분비의 연구 및 라이브 세포 이미징을위한 의도 된 쥐 소장의 혼합 차 문화

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

LDL 콜레스테롤 이해 분석 결과 라이브 셀 이미징 분석 셀을 사용 하 여 상태 모니터링

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two decades ago and since then continues to contribute greatly to our understanding of the filamentous fungal lifestyle. This paper provides a practical guide for the utilization of the two membrane dyes FM 1-43 and FM 4-64 and the four cell wall stains Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 and Congo Red. The focus is on their low-dose application to ascertain artefact-free staining, their co-imaging properties, and their quantitative evaluation. The presented methods are applicable to all filamentous fungal samples that can be prepared in the described ways. The fundamental staining approaches can serve as starting points for adaptations to species that might require different cultivation conditions. First, biophysical and biochemical properties are reviewed as their understanding is essential for using these dyes as truly vital fluorescent stains. Secondly, step-by-step protocols are presented that detail the preparation of various fungal sample types for fluorescent live-cell imaging. Finally, example experiments illustrate different approaches to: (1) identify defects in the spatio-temporal organization of endocytosis in genetic mutants, (2) comparatively characterize shared and distinct co-localization of GFP-labeled target proteins in the endocytic pathway, (3) identify morphogenetic cell wall defects in a genetic mutant, and (4) monitor cell wall biogenesis in real time.

Vital fluorescent dyes are essential tools for live-cell imaging analyses in modern fungal cell biology. This paper details the application of established and lesser-known fluorescent dyes for tracking plasma membrane dynamics, endo-/exocytosis and cell wall morphogenesis in filamentous fungi.

필라멘트 곰팡이의 살아있는 세포 이미징을 위한 막 및 세포벽 선택적 형광 염료의 적용

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...