싱가포르 (NMRC이-OF-IRG-0003-2016) 및 NTU-NHG는 연구비 노화의 국립 의료 연구위원회 (:이 작품은 부분적으로 싱가포르 교육부 (부여 ARC9 / 15 등급 2)에서 보조금에 의해 지원되었다 그랜트 ARG / 14,017). 우리는 친절이 연구 가능 포장재을 우리에게 제공 박사 앤드류 알퍼트와 PolyLC 팀에 대한 우리의 감사와 가장 진심으로 감사의 말씀을드립니다.

1. 긴 길이의 음이온 교환 포장 (LAX) 모세관 컬럼 (참고 : LAX 열에서 가정 우리가이 프로토콜에 설명으로 포장 LAX 열은 또한 상업적으로 이용 가능하다 할 수 있지만, 자세한 내용은 재료 및 시약의 표 참조). <ol><li> 슬러리를 준비하기 위해 버퍼 (표 1) 포장의 3.5 mL의 약한 음이온 교환 포장재 50mg을 일시. </li><li> 암형 - 암 피팅하는 물미와 암형 나사를 사용하여 - 모세관 컬럼 (200㎛ 인 내부 직경 (ID) 튜브 50cm 길이)의 단부를 조립한다. 암형 - 암 피팅 내부 스크린 1/16 &quot;OD 기공 크기 1 미크론의 위 (주 :. 여기서 사용 된 스크린으로부터 물질의 누출을 방지하기위한 포장 재료의 입경보다 작은 기공 크기를 가지고 있어야 기둥). </li><li> 4,500 psi에서 작동되는 고압 펌프를 사용하여 슬러리 모세관 팩. (참고 : 기둥, 트러스, 빔 팩포장재까지 백만 열의 항목)에서 볼 수 있습니다. </li><li> 지점 120에 기재된 바와 같이 캐 필러 리 컬럼의 타 단부를 조립한다. </li></ol> 2. 시료 준비 이 프로토콜은 모델 프로테옴 인간 뇌 조직을 분석 LERLIC-MS / MS의 응용 프로그램을 설명합니다. (주의 : 다른 조직 또는 프로테오믹스 샘플을 사용하는 경우, 샘플 준비 과정이 채택되어야한다.) <ol><li> 조직의 균질화 : 에이. 회 5 분 동안 1X 인산 완충 용액으로 세척 뇌 조직 (50 내지 100 mg). 비. 1 : 1의 조직 균질화 2.5 조직 / 금속 비즈 / SDC 균질화 완충액 (표 2) 비율 (w / W / V) 조직 균질화기를 사용하여 최대 강도 안전 잠금 튜브에서 39 ° C에서 5 분. (참고 : SDC 균질화 버퍼, 프로테아제 저해제를 포함 할 수있다 (3) 이전에 표시된) 기음. 아프로 얻어진 조직 파쇄 액을 원심 분리10,000 × g에서 10 분간 4 ℃에서 이전의 단계를, M, 및 1.5 mL의 새 튜브로 상청액을 수집한다. 디. 나머지 펠렛 BC 단계를 반복하고 더 펠릿이 관찰되지 않을 때까지 필요에 따라 여러 번 상층 액을 결합한다. (참고 :이 2 배 이상 기원전 단계를 반복해야하는 경우, 원심 분리 단계에서 샘플의 손실을 방지하기 위해 새로운 안전 잠금 튜브에 샘플과 구슬을 이동). 이자형. Bicinchoninic 산성 분석 (BCA) 12에 의해 얻어진 균질 액의 단백질 농도를 정량화. </li><li> 나트륨 데 옥시 콜레이트 (SDC)는 뇌 균질의에서-솔루션 트립신 소화 13 -assisted. 에이. 단백질 디설파이드 결합의 환원을 개시 얻어진 파쇄 액에 (표 3 용액 5에 나타낸 원액을 사용) 10 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT)의 최종 농도를 추가한다. 비. 욕조에서 30 분 동안 균질을 품어60 ℃에서 예비가 세트. 기음. 균질 표 4 용액 7에 나타낸 원액을 사용하는 20 mM의 요오도 아세트 아미드 (IAA)의 최종 농도를 추가한다. 디. 45 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 IAA 함유 균질 인큐베이션. 이자형. 뇌 균질 희석액을 사용하여 두 - 겹 (표 3 용액 6) 희석. 에프. 37 ° C에서 30 분 동안 제 2 감속 단계 동안 시료를 인큐베이션. 지. (w / w)의 단백질을 효소 비 1:50 표 2의 2 액에 용해 시퀀싱 등급 변성 트립신 추가. 시간. 30 ℃에서 밤새 배양하여 트립신 균질 다이제스트. 나는. 포름산 (FA)의 0.5 % 최종 농도 첨가하여 다음날 효소 소화 담금질. (참고 : FA의 첨가가 산성 조건 하에서 SDC 염의 침전을 야기한다.) J. 부드럽게 SDC의 precipi를 함유하는 샘플을 와동tates. 케이. 12,000 × g에서 10 분 동안 4 ℃에서 샘플을 원심 분리하여 SDC 염을 펠렛. 엘. 상층 액을 수집하고 깨끗한 새 튜브에 액체를 전송합니다. (참고 : SDC 펠릿에서 염을 다시 중단하지 않습니다이 단계의 피펫 팅시주의 및 / 또는 수집합니다.) 엠. 1 분 동안 격렬하게 볼 텍싱하에 SDC 다시 용해 완충액 (표 5)의 SDC 펠렛을 재용. 엔. 단계를 반복 두 번 침전 된 펩티드를 복구하고 상층 액을 결합하는 JL. (참고 :. 참조 세라 등에 대한 자세한 내용은 2016 (13)을 트립신 소화 프로토콜이 여기 적응에-솔루션 SDC-지원.) </li><li> 트립신의 탈염 샘플을 소화. 에이. 1g C-18 카트리지를 사용한 시료의 탈염 소화를 수행한다. (참고 : 큰 부피 카트리지 (5 ㎖ 사용)을 독립적으로 얻어진 단백질 보장 샘플에 남아 SDC 염의 적절한 세척 량의 사전LC-MS / MS로 주입). 비. 아세토 니트릴 5 ㎖ (ACN)와 1g C-18 카트리지의 조절을 수행한다. 기음. 남아있는 유기 용매를 제거하기 위해 조절 1g C-18 카트리지로 정리 완충액 (표 6) 5 mL를 통과한다. 디. 1g C-18 카트리지 샘플로드. 이자형. 정리 완충액 5 mL의 각 단계를 이용하여 1g C-18 칼럼에서 시료 5에 정리 단계 - 3을 수행한다. 에프. 용출 완충액 5 ㎖ (표 7)를 이용하여 1g C-18 카트리지에서 탈염 펩티드를 용출시켰다. 지. 진공 농축기에서 용출 된 펩타이드 건조. 기음. 용출 완충액 200 μL의 최종 부피로 건조 된 샘플을 재구성한다. (주 :. 사용 (격렬한 길이&gt; 30 분 동안 초음파 욕 후속 초음파이어서 10 분) 텍싱 완전히 다시 일시 주사 버퍼 건조 된 펩티드) 디. 아나 LERLIC-MS / MS에 대한 샘플의 주입량을 조절μg의 단백질 1~3 사이를 lyze. </li></ol> 3. 한 차원 LERLIC-MS / MS 분리 <ol><li> 액체 크로마토 그래피 조건 : 모바일 단계 : A : 물, 0.1 % FA (표 8). B : 0.1 % ACN FA에서 (표 9) 유속 : 0.4 μL / 분 칼럼 : LAX 모세관 컬럼 (50cm 길이 - 200 ㎛의 ID) 에이. 45 분 동안 3 % B - 434 분 동안 85 % B, 85 - - 522 분 동안 70 % B 70 - 124 분 동안 35 % B, 35 40 분 95 95 % B : 다음 1,200 분 구배 사용 5 분 동안 3 % B, (3)에서 등용 - 7 분에 걸쳐 95 % B 및 23 분 동안 95 % B로 등용 매 있었다. 비. 세라 및 Gallart-팔라우 외에 나타낸 바와 같이 LAX 모세관을 사용하여 펩티드의 분리를 수행한다. 3 초, 고압 액체 크로마토 그래피. </li><li> 질량 분석기 구성 : 에이. 데이터 수집 교류 betwe을 수행하기 위해 스캔 이벤트 세부 구성EN 전체 푸리에 변환 질량 분석 (FT-MS) 및 푸리에 변환 - 탠덤 질량 분광법 (FT-MS / MS)를 다음 매개 변수 : A.1. 데이터 수집 모드 : 긍정적 FT-MS 매개 변수 A.2 : 질량 범위 : 350 - 2,000m / z 해상도 : 60,000 Microscans : 스펙트럼 당 자동 이득 제어 : 1 × 10 (6) FT-MS / MS 매개 변수 A.3 : 분할 모드 : 고 에너지 충돌하는 해리 (HCD) A.4 질량 범위 : 150 - 2,000m / z A.5 해상도 : 30,000 A.6 상위 N 이온 : 10 Microscans : 스펙트럼 당 상태를 충전&gt; 2 + 절연 폭 : 2 다 A.7 자동 이득 제어 : 1 × 10 (6) 비. 1.5 kV로에서 작업 nanoelectrospray 이온 소스를 구비 한 orbitrap 질량 분광계를 사용하여 3에 나타낸 바와 같이, 펩티드의 질량 분석 검출을 수행. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 보호 자전거를 수행LERLIC-MS / MS에 대한 데이터베이스 검색에서 특정 프로 테오 믹 소프트웨어를 사용하여 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 데이터를 얻을 : (참고 : 자세한 내용은 3을 참조하십시오.) 에이. 이온 허용 오차 : 10 PPM 비. 조각 이온 허용 오차 : 0.05 다 기음. 거짓 검색 속도 (FDR) : 1 % 디. 데이터베이스 : UniProt 인간 데이터베이스 이자형. 고정 수정 : 시스테인에서 Carbamydomethylation 에프. 변수 수정 (소프트웨어에 의해 필요한 경우) : 산화 (메트로), 탈 아미드 화 (가 Asn 및 Gln의). </li><li> 자신감 특성화 및 LERLIC-MS / MS 데이터의 이성체 탈 아미드 제품의 정량화 : 에이. 분석을위한 spreedsheet 소프트웨어 LERLIC-MS / MS에서 내보내기 데이터베이스 검색 결과. 비. 찾기 및 탈 아미드 펩티드와 그 이외의 탈 아미드 대응의 전체 목록을 추출합니다. 기음. 참고로 얻어진 펩타이드의 목록을 이용하여 질량 공차 5ppm의 appropiate에서 소프트웨어를 사용하여 이러한 펩티드의 이온 크로마토 그램 (XICs)를 추출한다. (노트:XICs의 추출에 사용되는 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 3을 참조하십시오.) 디. 시각 3 바와 같이 이성질체 생성물의 분리 된 이중 피크 용출 식별 수득 XICs 검사. (참고 : 쉽게 데이터베이스 검색 결과에 서로 다른 두 체류 시간의 존재에 의해 유도 찾을 수 MS / MS 레벨에서 식별 된 것과 펩티드 이성질체 제품). 이자형. 각 사이트 탈 아미드 / 펩타이드의 이성체 제품의 상대적 정량 얻어진 XICs 각 식별 체의 피크 면적에 기초하여 수행되어야한다. </li></ol>

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+effect+of+trypsin+digestion+buffers+on+artificial+deamidation.">Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation.</a> J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).</li><li>Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mildly+acidic+conditions+eliminate+deamidation+artifact+during+proteolysis:+digestion+with+endoprotease+Glu-C+at+pH+4.5.">Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5.</a> Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 비디오 - 문서에서 우리는 LERLIC-MS / MS (3)의 단계별 프로토콜을 제시하는 방법은 심층 특성화를 수행하고 정확하게 단백질의 탈 아미드 화,이 단백질 변형에 관여하는 효소 처리의 정도를 결정한다. LERLIC-MS / MS는 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 (ERLIC) (27)의 원리 하에서 긴 길이 (50cm) LAX의 사용에 기초한다. 연구 3에 도시 된 바와 같이, 긴 길이의 컬럼의 사용은 그들의 등전점에 따라 분리 된 27 펩티드 ERLIC의 가능성을 최대화한다. LERLIC-MS / MS는 새로운 산탄 일차원 분리 전략 복잡한 프로테옴에 최적의 결과를 얻기 위해 3에 나타낸 바와 같이이 1,200 분 구배 필요하지만 시료 처리 중에 시간 온 손을 저장하는 흐름을 나타낸다. 60 분 gradienLERLIC-MS / MS에서 t는 샷건 프로테오믹스 3에서 처음 모델에 Gln의 화합물의 탈 아미드 이성체의 최적의 분리를 달성 할 수있다. 두 애플리케이션에 기초하여, 우리는 LAX 모세관에 의해 수행되는 두 번째 차원 분리 중간 복잡한 샘플 분석을위한 다차원 크로마토 그래피 방법에 따라 제 치수 역상 크로마토 그래피에 결합 될 수 있다는 것을 추측 플로는 이전 우리 그룹 (10)에 의해 사용된다. 단백질 탈 아미드 화의 분석을위한 시료 준비는 크게 (1)에서의 ASN 잔류 물에 artefactual 탈 아미드 화의 발생을 방지하기 위해 세심한주의를 필요로하는 중요한 단계이다. 하오 등. 약한 산성 pH 하에서 트립신 소화 크게 샘플 준비 동안 28 artefactual 탈 아미드의 출현을 방지 함을 발견 하였다. 우리는 우리의 솔루션 시도에 SDC를 이용한 본 연구에 사용했다pH가 6 이하인 (29)로 유지 될 때 PTIC 소화 13 샘플 처리 한편, pH를 6으로 수행하는 방법은, 강한 산성 조건 트립신 소화 능력에 도전 할 수 있습니다. 이 문제를 아주 최근 리우 등의 알을 주소. pH가 4.5에서 30의 Glu-C에 의해 치환하여 트립신에서 Asn 잔기에 artefactual 탈 아미드의 발생이 성공적으로 소화 방지있게 최적 소화 전략을보고했다. 리우 등의 알에 의해보고 된 소화 방법의 구현. (30) 실험 검증을 필요로하는 잠재적 인 전략이 될 수 LERLIC-MS / MS에 의한의 ASN 탈 아미드 화를 분석합니다. 이 비디오 문서에 설명 된 프로토콜은 더욱 특성화하고 노화와 인간의 질병 단백질의 탈 아미드 화의 참여를 정의하는 현재 알 수없는 이소 비율 배열을 정량 할 수있는 큰 잠재력을 가지고있다. 모피thermore, 다른 생물학적 배경에 LERLIC-MS / MS의 응용 프로그램은 분자 시계 수정과 같은 잠재력 및 단백질 탈 아미드 화의 위험을 결정하는 데 도움이 될 것입니다.

탈 아미드는 단백질의 번역 후 변형 아스파라긴 아스파라긴 (Asn) 및 / 또는 글루타민 (Gln의) 잔류 물 (1)의 변형을 통해 단백질 골격에 음전하를 도입 (PTM)이다. 2 : 1의 비율에서 Asn 잔기에 영향을 미치는 변형하면서 공통 3에서 이성질체 제품 isoaspartic 산 (isoAsp) 및 N -aspartic 산 (ASP)를 생성한다. 그럼에도 불구하고,이 비율은 수리 효소 메틸화 된 L-isoaspartyl (PIMT) (3), (4)의 조작에 의해 변경 될 수있다. 마찬가지로, Gln의 잔기의 탈 아미드 화는 기대 (1)의 이성체 감마 글루탐산 (γ-Glu가) 및 알파 글루탐산 아형 (α-가 Glu)를 생성한다 : 7 비율 3,5-을하지만,이 비율의 작용에 의해 이동 될 수있다 유비쿼터스 효소 트랜스 글 루타 미나 제 (2)와 다른 transglutaminases, 트랜스 글 루타 미나 제를 포함 하나, 전자뇌 6 세포 외 소포와 관련된으로 nzyme 최근 확인했다. 탈 아미드의 원점 (여러 만성 더욱 Gln의의 transamidation의 내용과 그 의미 3 참조 전자는 transglutaminases 다른 효소 transamidation 통해 인터 / 분자 내 가교 결합을 매개하는 Gln의 잔기에 특히 일반적이고, 자발적 또는 효소 중 하나 일 수 있고 치명적인 인간의 질병). 따라서, 탈 아미드가 영향 분자 4, 7, 8의 중요한 구조에 파급 및 기능을 갖고, 9 노화의 서비스를 분자 시계 등의 다양한 생화학 적 결과에 비추어 심층 화학적 특성 (3)을 필요로하는 PTM은 . 의 ASN 잔류의 탈 아미드 화는되어 있지만<html> 비교적 상향식 샷건 프로테오믹스가 잘 특성화 1, 10, Gln의 잔기의 탈 아미드 여전히 전자 계 라디칼 분열 (11)에 의한 모델 화합물의 도전 분석 이후 적절한 특성화 방법이 없다. 최근 하나의 분석에서 복잡한 생물학적 샘플과 모델 화합물로부터 탈 아미드가 Asn 및 Gln의 이성체의 분리를 가능하게하는 신규 한 측정 샷건 프로테오믹스 전략 (LERLIC-MS / MS) (3)을 개발 하였다. LERLIC-MS / MS는 긴 길이 (50cm) 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 (ERLIC) 모드에서 작동 이온 교환 컬럼 (LAX)를 사용 트립신 분해 펩티드의 분리에 기초하여 탠덤 질량 분석법에 결합된다 (LC- MS / MS). 이 새로운 분석 전략의 특성과 상대적으로 인간의 뇌 조직에서 각 탈 아미드 잔류의 정도를 정량하는 데 사용되었습니다F &quot;&gt; 3. 그럼에도 불구하고, 여기에 설명 된 프로토콜은 관심의 생화학 적 맥락에서 단백질 탈 아미드 화의 특수성을 연구하는 것을 목표로 LERLIC-MS / MS의 비디오 영상을 제공 할 것입니다. 윤리 선언문 이 프로토콜의 모든 절차는 싱가포르의 난양 기술 대학의 제도적 검토위원회에 의해 승인되었습니다 및 제도적 지침에 따라 수행되고있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1053">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PolyCAT 3&#181;m 100-&#197; (bulk material)</td>
			<td style="width:424px;">PolyLC Inc.</td>
			<td style="width:207px;">Special order</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 &#181;m ID</td>
			<td style="width:424px;">PolyLC Inc.</td>
			<td style="width:207px;">Special order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PEEKsil Tubing 1/16&#34; OD x 200 &#181;m ID x 50 cm length</td>
			<td>SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia&#160;</td>
			<td style="width:207px;">620050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Female-to-female fitting for 1/16&#34; OD tubbing</td>
			<td>Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:207px;">UPCHF-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Female nut for microferule</td>
			<td>Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:207px;">UPCHP-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Microferule</td>
			<td>Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:207px;">UPCHF-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pressure Bomb NanoBaume</td>
			<td style="width:424px;">Western Fluids Engineering</td>
			<td style="width:207px;">SP-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Shimadzu Prominence UFLC system</td>
			<td style="width:424px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:207px;">Prominence UFLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Bullet Blender</td>
			<td style="width:424px;">Next Advance</td>
			<td style="width:207px;">BBX24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Safe-lock tubes</td>
			<td style="width:424px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td>T9661-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel beads. 0.9 &#8211; 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile.</td>
			<td style="width:424px;">Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Table-top centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Hettich Zentrifugen</td>
			<td style="width:207px;">Rotina 380 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC</td>
			<td style="width:424px;">PolyScience 8006 6L</td>
			<td style="width:207px;">8006A11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg</td>
			<td style="width:424px;">Waters</td>
			<td style="width:207px;">WAT020805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Vacumm concentrator</td>
			<td style="width:424px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Concentrator Plus System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dionex UltiMate 3000 UHPLC&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Dionex</td>
			<td style="width:207px;">UltiMate 3000 UHPLC&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Orbitrap Elite mass spectrometer</td>
			<td style="width:424px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:207px;">ORBITRAP ELITE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Michrom Thermo CaptiveSpray&#160;</td>
			<td style="width:424px;">Michrom-Bruker Inc.</td>
			<td style="width:207px;">TCSI-SS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Incubator INCUCELL&#160;</td>
			<td style="width:424px;">MMM Group</td>
			<td style="width:207px;">INCUCELL111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sequencing-grade modified trypsin</td>
			<td style="width:424px;">Promega</td>
			<td style="width:207px;">V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:424px;">Roche</td>
			<td style="width:207px;">11836170001 (ROCHE)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phosphate buffer solution 10X (diluted to 1x)</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ammonium acetate</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">i6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Formic acid</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">F0507 (HONEYWELL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">338818 (HONEYWELL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Acetonitrile HPLC grade</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">675415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Isopropanol HPLC grade</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">675431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Water HPLC grade</td>
			<td style="width:424px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">14263</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lerlic-ms/ms for in-depth characterization and quantification of glutamine and asparagine deamidation in shotgun proteomics

단백질 탈 아미드 화의 특성은 인간의 병리 및 기타 생화학 적 맥락에서이 단백질 번역 후 변형 (PTM)의 역할 (들) 및 잠재력을 해독하는 것이 필수적이다. 단백질 탈 아미드의 특성화를 수행하기 위해, 최근 글루타민 (Gln의) 아스파라긴 아스파라긴 (Asn) 이성체를 분리 할 수있는 신규 한 긴 길이의 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LERLIC-MS / MS) 법을 개발 매우 복잡한 생물학적 샘플 모델 화합물의 탈 아미드 화의 제품. LERLIC-MS / MS 따라서,이다, Gln의의 탈 아미드 화의 동위 효소의 분리 및 정량에 대한 첫 번째 샷건 프로테오믹스 (proteomics) 전략. 우리는 또한 여기에 설명 된 샘플 처리 프로토콜은 LERLIC-MS / MS에 의해 그 특성을 허용 숙신이 미드 중간을 안정화 것을, 참신로 보여줍니다. 이 비디오 문서에서와 같이 LERLIC-MS / MS의 응용 프로그램은 현재 알 수없는 해명하는 데 도움이 될 수 있습니다단백질 탈 아미드 화의 N 분자 배열. 또한 LERLIC-MS / MS는 별개의 생물학적 배경에서 탈 아미드를 포함 효소 반응의 추가적인 이해를 제공한다.

Gln의과에서 Asn 잔류의 탈 아미드 화는 여러 만성 및 치명적 질병 (14)에 연루 퇴행성 단백질 수정 (DPM)로 간주됩니다. 이 PTM은 인체와 유사한 생물 학적 배경 (1), (15)에 항체와 다른 분자의 반감기 및 degradative 상태를 예측할 수 있음을 입증하고있다. 단백질 탈 아미드 화의 중요성은, 사실, 따라서이 수정 16, 17 및 일부 연구는 그림의 정확한 연대 측정을 수행 할 때 탈 아미드 화의 가능성을 증명하고 다양한 프로테옴에 존재하고 고고학 18, 19을 유지, 생물 의학 문맥을 넘어 . 중요성과 다양한 배경에서 단백질 탈 아미드 화의 기능은 오랜 시간 동안 단언되고 있지만,다시는이 PTM 3에 대한 심층적 인 특성을 달성하는 방법에 대한 기술 사전의 아주 최근 부족까지했다. / MS 3 LERLIC-MS의 애플리케이션,도 1에 도시 된 바와 같이, 처음 및 Gln의 그리고에서 Asn의 단일 실행 해결 분리를 제공 복잡한 프로테옴 모델에서 이소도 독립적에서 Asn 및 Gln의이 탈 아미드 두 도시 이들 펩티드 화합물 탈 아미드 proteoforms. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55626/55626fig1.jpg" /> 그림 1 : LERLIC-MS / MS 워크 플로우 다이어그램 샷건 단백질 체학하여 복잡한 샘플에서 Gln의와 ASP 탈 아미드 화 제품의 분리 및 정량. LERLIC-MS / MS는 LAX 모세관 컬럼을 사용하여 펩티드의 1 차원 분리 전에 LC-MS / MS에 의한 단백질 추출 및 소화 효소를 포함한다. 어록XICs의 용해는 다른 산도 3, 20, 21에 따라 서로 다른 머무름 시간에서 용출 탈 아미드 화 이성체 제품의 식별을 할 수 있습니다. MS / MS는 탈 아미드 및 비 펩티드 탈 아미드 및 탈 아미드 잔기의 신분 간의 차별을 허용한다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55626/55626fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 역 γ / α-글루 비율 (도 2)를 표시 transamidation의 효소 변성 중간 Gln의 잔기 발견 및 신경 퇴행성 질환 3 proteinopathy의 연구에 중요한 영향을 미칠 수 LERLIC-MS / MS, 22, 23에 의해 특성화 될 수있다 , </SUP&gt; 24. 이전 세라 및 Gallart-팔라우 2016 년보고 또한, 탈 아미드에서 Asn 잔기에 반전 isoAsp / ASP를 비를 제시하는 여러 알 PIMT 기질 단백질은 LERLIC-MS / MS (3)에 의해 인간 조직에서 발견 될 수있다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55626/55626fig2.jpg" /> 그림 2 : XICs과 탈 아미드 펩타이드의 MS / MS 수준에서 더블 유지 시간의 확인의 검사는 탈 아미드 화에서 개최 결정적인 효소 반응에서 Gln의과에서 Asn 탈 아미드 이성질체 및 제품의 식별의 특성을 허용합니다. 에이. 뇌 단백질 DPYL2에서 펩티드 FQMPDQGMTSADDFFEQ # 1 GTK의 γ / α-글루 이성질체에 대응하는 2 개 개의 피크를 도시 한 XIC의 세부 사항은 관련 단백질 2. 역 γ / α-글루 비 detecte을 dihydropyrimidinase해당 펩티드의 D는 중간체 트랜스 글 루타 미나 γ-글루로 transglutamination 반응에서 γ-글루 타밀 - 함유 종의 잠재적 의미를 나타낸다. 탈 아미드 잔류 물을 모두 보유 시간에서 MS / MS에 의해 B를 확인 하였다. 389.1 분의 α-글루 타밀 - 함유 펩타이드 및 C에 대응. 401.4 분의 γ-글루 타밀 - 함유 펩타이드에 대응. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55626/55626fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 이 논문의 신규성, 우리는 LERLIC-MS / MS는 숙신 중간체 (도 3)의 특징을 허용하였습니다. 샘플을 처리하는 동안 약한 산성 pH의 사용은 25에서 Asn 잔기 개질 중간 숙신 안정화. 따라서, LERLIC-MS / MS는 succini의 프로테옴 차원의 연구를 할 수 있습니다mide 중간, 중요한 생리적, 병리 적 의미 (26)와 불안정한하고 제대로 이해 수정. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55626/55626fig3.jpg" /> 그림 3 : LERLIC-MS / MS에 의해에서 Asn 잔류의 석신이 미드 중간의 식별. 에이. C. 탈 아미드 잔기가 Asn-Deam로 표시되는 알 돌라에서 Asn의 스펙트럼은 뇌 단백질 알도 C 과당 비스 포스페이트로부터 펩티드 YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR를 탈 아미드. 비. 이 경우에 -17 다의 질량 변화를 나타낸다 펩티드 YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR, 스펙트럼은 이전에 의한 숙신이 중간층을 형성하는 동안 일어나는 암모늄 손실에서 Asn 잔기 (SCC-에서 Asn)를 탈 아미드. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55626/55626fig3large.jpg" target="_blank">일의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>그림입니다. <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 100 ㎖의 양에 대한 </td></tr><tr><td> 아이소 프로필 알코올 </td><td> 90 mL의 </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 10 ㎖ </td></tr></tbody></table> 표 1. 포장 버퍼 구성 (90 % 이소프로판올). <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="2"> 용액 1 : 암모늄 아세테이트의 1 M. </td></tr><tr><td> 구성 요소 </td><td> 50 ㎖의 양에 대한 </td></tr><tr><td> 암모늄 아세테이트 </td><td> 3.86 g </td></tr><tr><td> 물 (50ml로 구성) </td><td> ~ 50 ㎖ </td></tr><tr><td colspan="2"> 용액 2 : 암모늄 아세테이트 100 mm이다. </td></tr><tr><td> 구성 요소 </td><td> 50 ㎖의 양에 대한 </strong&gt; </td></tr><tr><td> 해결 방법 1 </td><td> 5 ㎖ </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 45 mL의 </td></tr><tr><td colspan="2"> 해결 방법 3 : 10 % 나트륨 데 옥시 콜레이트. </td></tr><tr><td> 구성 요소 </td><td> 1 mL의 양에 대한 </td></tr><tr><td> 나트륨 데 옥시 콜레이트 </td><td> 0.1 g </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 1 mL의 </td></tr><tr><td colspan="2"> 용액 4 : SDC 균질화 완충액 (100 mM의 아세트산 암모늄 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트를 함유 함). </td></tr><tr><td> 구성 요소 </td><td> 10 ㎖의 양에 대한 </td></tr><tr><td> 해결 방법 2 </td><td> 9 mL의 </td></tr><tr><td> 해결 방법 3 </td><td> 1 mL의 </td></tr></tbody></table> 표 2. SDC 균질화 완충액 조성물 (100 mM 포름산 암모늄 아세테이트 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트를 함유 함). 주식 SOLU 준비1 암모늄 아세테이트 M (용액 1) 및 희석 기의 암모늄 아세테이트 100mM의 도착 (용액 2). 또한, 10 % 소듐 데 옥시 콜레이트의 스톡 용액 (용액 3)을 준비한다. 용액 4에 기재된 바와 같이 SDC 균질화 완충액을 준비한다. <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> 해결 방법 5 : 1 M DTT </td></tr><tr><td> 구성 요소 </td><td> 10 ㎖의 양에 대한 </td></tr><tr><td> 디티 오 트레이 톨 </td><td> 77 mg의 </td></tr><tr><td> 해결 방법 2 (표 2 참조) </td><td> 0.5 mL의 </td></tr><tr><td colspan="2"> 용액을 6 : 희석액 </td></tr><tr><td> 구성 요소 </td><td> 10 ㎖의 양에 대한 </td></tr><tr><td> 해결책 5 </td><td> 0.1 mL의 </td></tr><tr><td> 해결 방법 2 (표 2 참조) </td><td> 9.9 mL의 </td></tr></tbody></table>표 3. 희석 버퍼 조성물 (10 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 함유하는 100 mM 포름산 암모늄 아세테이트). 1 M DTT의 스톡 용액 (용액 5) 시험 용액 (6)에 설명 된대로 연속적 희석액을 준비한다. <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> 해결 방법 7 : 1 M IAA </td></tr><tr><td> 구성 요소 </td><td> 10 ㎖의 양에 대한 </td></tr><tr><td> IAA </td><td> 93 mg의 </td></tr><tr><td> 해결 방법 2 (표 2 참조) </td><td> 0.5 mL의 </td></tr></tbody></table> 표 4. 알킬화 버퍼 조성물 (100 mM 포름산 암모늄 아세테이트 20 mM의 요오도 아세트 아미드 (IAA)을 포함). 1 M IAA (솔루션 7)의 주식 솔루션을 준비합니다. <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 50 ㎖의 양에 대한 </td></tr><tr><td> 수산화 암모늄 </td><td> 0.25 mL의 </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 24.75 mL의 </td></tr></tbody></table> 표 5. SDC 버퍼 재용 조성물 (0.5 % 수산화 암모늄). <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 100 ㎖의 양에 대한 </td></tr><tr><td> 트리 플루오로 아세트산 </td><td> 0.1 mL의 </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 99.9 mL의 </td></tr></tbody></table> 표 6에 정리 완충액 (0.1 % 트리 플루오로 아세트산). <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </stroNG&gt; </td><td> 100 ㎖의 양에 대한 </td></tr><tr><td> 아세토 니트릴 </td><td> 75 mL의 </td></tr><tr><td> 개미산 </td><td> 0.1 mL의 </td></tr></tbody></table> 표 7. 용출 완충액 (75 % 아세토 니트릴, 0.1 % 포름산). <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 1,000 mL를위한 금액 </td></tr><tr><td> 개미산 </td><td> 1 mL의 </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 999 mL의 </td></tr></tbody></table> 표 8. 이동상 조성. <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 1,000 mL를위한 금액 </td></tr><tr><td> 개미산 </td> &lt;TD&gt; 1 mL의 </td></tr><tr><td> 아세토 니트릴 </td><td> 999 mL의 </td></tr></tbody></table> 표 9. 이동상 B 조성입니다.

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LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

여기서 우리는 긴 길이의 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LERLIC-MS / MS)에있어서의 단계적인 프로토콜을 제시한다. 이 산탄 총 단백질 체학에 의한 글루타민과 아스파라긴 탈 아미드 화 이소 형의 첫 번째 시간 정량화 및 특성화를 위해 할 수있는 새로운 방법입니다.

산탄 프로테오믹스 자세하게 특성화 LERLIC-MS / MS 및 글루타민 정량 아스파라긴 탈 아미드

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

lerlic-msms-for-depth-characterization-quantification-glutamine

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.0K 조회수.  Nanyang Technological University.  여기서 우리는 긴 길이의 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LERLIC-MS / MS)에있어서의 단계적인 프로토콜을 제시한다. 이 산탄 총 단백질 체학에 의한 글루타민과 아스파라긴 탈 아미드 화 이소 형의 첫 번째 시간 정량화 및 특성화를 위해 할 수있는 새로운 방법입니다. 

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Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and isobaric labeling multiplexing capacity. Here, we introduce a deep-proteomics profiling protocol that combines 10-plex tandem mass tag (TMT) labeling with an extensive LC/LC-MS/MS platform, and post-MS computational interference correction to accurately quantitate whole proteomes. This protocol includes the following main steps: protein extraction and digestion, TMT labeling, 2-dimensional (2D) LC, high-resolution mass spectrometry, and computational data processing. Quality control steps are included for troubleshooting and evaluating experimental variation. More than 10,000 proteins in mammalian samples can be confidently quantitated with this protocol. This protocol can also be applied to the quantitation of post translational modifications with minor changes. This multiplexed, robust method provides a powerful tool for proteomic analysis in a variety of complex samples, including cell culture, animal tissues, and human clinical specimens.

We present a protocol to accurately quantitate proteins with isobaric labelling, extensive fractionation, bioinformatics tools, and quality control steps in combination with liquid chromatography interfaced to a high-resolution mass spectrometer.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

연구

생화학

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of these glycoproteins possess immunoglobulin (Ig) folds and are central to immune recognition and regulation. Here, we present a platform for the design, expression and biophysical characterization of the extracellular domain of human B cell receptor CD22. We propose that these approaches are broadly applicable to the characterization of mammalian glycoprotein ectodomains containing Ig domains. Two suspension human embryonic kidney (HEK) cell lines, HEK293F and HEK293S, are used to express glycoproteins harbouring complex and high-mannose glycans, respectively. These recombinant glycoproteins with different glycoforms allow investigating the effect of glycan size and composition on ligand binding. We discuss protocols for studying the kinetics and thermodynamics of glycoprotein binding to biologically relevant ligands and therapeutic antibody candidates. Recombinant glycoproteins produced in HEK293S cells are amenable to crystallization due to glycan homogeneity, reduced flexibility and susceptibility to endoglycosidase H treatment. We present methods for soaking glycoprotein crystals with heavy atoms and small molecules for phase determination and analysis of ligand binding, respectively. The experimental protocols discussed here hold promise for the characterization of mammalian glycoproteins to give insight into their function and investigate the mechanism of action of therapeutics.

We present approaches for the biophysical and structural characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by biolayer interferometry, isothermal titration calorimetry, and X-ray crystallography.

X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

간암에서 스모 프로테오메의 농축, 격리, 식별 및 특성화를 위한 도구로 스모 결합 엔티티(SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

세포와 조직에서 코엔자임 A의 정량화

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view of the impact of a disease, treatment, or other condition on the proteome as a whole. This report provides a detailed protocol for the extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, and subsequent data analysis of protein samples. Our optimized TMT labeling protocol requires a lower tag-label concentration and achieves consistently reliable data. We have used this protocol to evaluate protein expression profiles in a variety of mouse tissues (i.e., heart, skeletal muscle, and brain) as well as cells cultured in vitro. In addition, we demonstrate how to evaluate thousands of proteins from the resulting dataset.

We present an optimized tandem mass tag (TMT) labeling protocol that includes detailed information for each of the following steps: protein extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, submission to a proteomics facility, and data analyses.

프로테오믹스 시설 제출 및 후속 데이터 분석을 위한 TMT 샘플 준비

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

식물 MicroRNAs의 검출 및 정량화를 위한 RNA 블롯 분석

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, including RNA processing, signal transduction, DNA damage response, miRNA biogenesis, and translation.
In recent years, thanks to biochemical and analytical developments, mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as the most effective strategy to characterize the cellular methyl-proteome with single-site resolution. However, identifying and profiling in vivo protein R-methylation by MS remains challenging and error-prone, mainly due to the substoichiometric nature of this modification and the presence of various amino acid substitutions and chemical methyl-esterification of acidic residues that are isobaric to methylation. Thus, enrichment methods to enhance the identification of R-methyl-peptides and orthogonal validation strategies to reduce False Discovery Rates (FDR) in methyl-proteomics studies are required.
Here, a protocol specifically designed for high-confidence R-methyl-peptides identification and quantitation from cellular samples is described, which couples metabolic labeling of cells with heavy isotope-encoded Methionine (hmSILAC) and dual protease in-solution digestion of whole cell extract, followed by off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) chromatography fractionation and affinity enrichment of R-methyl-peptides using anti-pan-R-methyl antibodies. Upon high-resolution MS analysis, raw data are first processed with the MaxQuant software package and the results are then analyzed by hmSEEKER, a software designed for the in-depth search of MS peak pairs corresponding to light and heavy methyl-peptide within the MaxQuant output files.

Protein Arginine (R)-methylation is a wide-spread post-translational modification regulating multiple biological pathways. Mass spectrometry is the best technology to globally profile the R-methyl-proteome, when coupled to biochemical approaches for modified peptide enrichment. The workflow designed for the high confidence identification of global R-methylation in human cells is described here.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...