이 작품은 (ABR에 RLM 및 R01NS25217 및 P30NS048154에 F32 NS059120)에 NIH 보조금에 의해 지원되었다.

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언합니다.

여기에 설명 된 방법은 척수의 최소 절개 후 제브라 배아 감각 뉴런과 모터의 전기적 특성과 형태 학적 허용한다. 뉴런은 적어도 1 시간이 기록에 부과 된 시간 제한에 대한 건강을 유지. 뉴런은 표준 전체 셀 구성을 사용하여 기록 된뿐만 아니라 핵 패치에서 같은; 후자의 방법은, 이온 전류 (9)의 상세한 생물 물리학 연구를 배제 할 공간 클램프 문제를 최소화한다. 중요한 도전은 피부를 제거하고 관심의 뉴런에 대한 액세스를 제공하는 데 필요한 제한 해부을 수행하기 위해 챔버에 배아 또는 유충의 확고한 첨부 파일을 달성하는 것입니다. 제조는 적절한 전체 셀 패치 - 클램프 방법을위한 기록 챔버에 고정 할 필요가있다. 수의사 봉합 접착제의 사용을 통해이 문제를 충족하는 방법은 배아 또는 유충에 첨부하기해부 / 기록 챔버, 여기서 다른 모델 유기체의 박리에 사용 된 접근법 (예를 들어 초파리) (63)를 설명한다. 우리의 경험 훈련 다른 사람에서, 우리는 마스터하는 가장 중요한 단계는 접착제의 적은 양의 제어 및 정확한 배달는 사실을 알게 될 것입니다. 여기서, 사용자에 접착제를로드 또는 마이크로 피펫의 선단에서 추방하는 음성 및 양성 압력을 적용 할 수있는 접착제 디스펜서 장치를 설명한다. 봉합 접착제를 이용하여 배아와 유충 단단히 챔버에 부착 된 위쪽 또는 좌우 어느 등쪽 측을 배향 될 수있다. 이러한 방법으로, 신경 세포의 다양한 다른 액세스 옵션을 사용할 수 있습니다. 또한, 상기 챔버의 바닥에 실리콘 엘라스토머의 층은 잠재적 인 장점을 제공 광 여기에 지정된 1mm,보다 얇게 할 수있다. 또 다른 방법은, 기록 챔버 제조를 연결하는 데 사용보다 일반적으로, 미세 텅스텐 핀의 사용을 포함 1 &lt;SUP&gt;, 2, 3, 4, 5. 방법이 다른 것을하는 동안, 둘 다 목표와 실험의 과제에 따라 선택할 수있는 옵션과 함께 연구를 수득 제브라 피쉬 척추 신경에 전기 생리 액세스 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 제브라 피쉬의 준비는 차별화 자신의 초기 단계 동안 현장에서 척추 신경의 전기 및 형태 학적 연구를 위해 수 있습니다. 이러한 방법을 이용하여 척수 신경에서 기록함으로써,도 전 병변 유전자 (6), (64), (65)의 식별에 여러 돌연변이의 세포 효과에 대한 통찰력을 얻고있다.

<html> 조지 스트라이징거 척추 동물의 개발 (10)의 유전 적 분석을위한 모델 시스템으로, 일반적으로 제브라 피쉬로 알려진 다니오 레 리오 (rerio)의 사용을 개척했다. 모델 등 여러 가지 장점을 제공한다 : (1) 상대적으로 간단하고 저렴한 축산을; (2) 체외 수정, 초기 발달 단계에서 배아에 쉽게 액세스 할 수 있도록; 및 (3) 투명 배아가 형성로서 세포, 조직 및 기관의 직접 반복 관측을 허용. 계속되는 년 동안, 여러 진보는 더 제브라 피쉬 모델의 힘을 증가했다. 특히, 앞으로 유전 화면과 전체 게놈 시퀀싱 노력이 많은 발달 과정 11, 12, 13, 14에 돌연변이 중요한 유전자의 식별에 중요한 역할을,&quot;&gt; 15, 16. 게이트웨이 클로닝 방법은 전사 활성 형 (TALENs)로 예시. 유전자의 루틴은 애플리케이션 (17), (18)에 접근 게놈 편집 최근 발전시키고 클러스터 한 정기적 interspaced 짧은 상동 반복 (CRISPR) -Cas9 클레아, 돌연변이의 목표로 도입을 허용뿐만 아니라 노크 아웃 및 노크 인은 (22). 결합은, 이러한 방법은 제브라 피쉬의 특정 행동과 여러 인간의 질병의 기초가되는 유전 적 메커니즘 연구를위한 강력한 모델 만들기, 21, 20, 19에 접근 23, 24, 25, 26, 27. 이 작품은 개발에 초점을 맞추고정신 규제와 신경 발달에 전기 활동의 역할. 초점은 제브라 피쉬 모델은 몇 가지 장점을 제공하는 척수에있다. 첫째, 배아와 애벌레 단계에서 제브라 피쉬에 액세스하는 데 상대적으로 쉽다; 따라서, 하나는 적은 수의 뉴런과 간단한 회로 (28), (29)이 발달 단계에서 척수의 기능을 연구 할 수 있습니다. 또한, 상기 제브라 척수 전사 특성과 구분 패턴에 의해 설명 30, 31, 32, 33, 34, 35 요인으로 다른 척추 유사 신경의 다양한 세트를 갖는다. 척수 회로의 기능을 기초 메커니즘을 발견하는 것을 목표로 제브라 피쉬의 연구의 대부분, 특히운동을 지원 것들, 당연 애벌레 단계 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43에 집중된다. 그러나, 척추 기관차 네트워크를 구성하는 뉴런의 많은 초기 배아 단계에서 분화를 개시 ~ 9-10 시간 후 수정 (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. 이러한 관점에서, 척추 신경 세포의 형태 학적 및 전기적 특성이 발생하고 배아와 애벌레 단계 사이의 변화는 overa 중요하다 이해하는 방법전위의 회로 형성 및 기능의 이해 LL. 여기에 설명 된 해부 방법은 척추 신경 세포에서 패치 클램프 녹음을 허용하고 성공적으로 배아 단계 (~ 17-48 HPF) 및 애벌레 단계 (~ 3~7일 게시물 수정 [DPF])에 적용되고있다. 이 방법은 관심의 뉴런에 대한 액세스를 제공하는 데 필요한 해부의 양을 제한합니다. 프로토콜은 상기 기록 챔버로 배아 또는 유충을 첨부 오히려 미세 텅스텐 핀 대신 사용되는 의사 봉합 접착제에 제브라 척수 뉴런 기록 다른 번역 메소드의 대부분 다르다. 두 개의 서로 다른 접근 방식의 가용성 (즉, 텅스텐 핀 대 봉합 접착제) 전기 생리학 분석을 위해 제브라 피쉬 배아 또는 애벌레를 장착 대체 옵션 연구진은 특정 실험 목표를 달성하기 위해 제공합니다. 첫째, 팝업에서 액세스하고 기록하기위한 절차<html> 차 감각 뉴런의 ulation는 Rohon 수염 - 셀들은 기재되어있다. 이러한 신경 세포의 세포체는 척수 척수 내에서 거짓말. Rohon - 수염 세포는 다수의 척추 동물 종에서 존재하는 초기 개발에서 차별화, 그리고 배아 터치 반응 6, 44, 47, 48의 기초가. 둘째, 액세스 및 척추 운동 뉴런에서 기록 절차의 상세한이다. Zebrafish의 척추 운동 뉴런은 신경의 두 파도 동안 발생한다. 이전 태생 일차 운동 뉴런 hemisegment 45, 46, 49에 따라 본 3-4 일차 운동 뉴런, 낭배 (~ 9-16 HPF)의 단부에서 발생한다. 반면, 보조 운동 신경의 이상 태생 인구는 더 많은입니다 ~ 14 HPF에서 시작, 오랜 기간 동안 발생EF &quot;&gt; 45, 50. 미드 트렁크 세그먼트 보조 운동 신경의 기원은 대부분 (51), HPF (50)에 의해 완성된다. 보조 운동 뉴런은 양막 류 (amniotes)의 운동 뉴런의 대응되는 것으로 간주된다 (46). 흥미롭게도, 척 주상 뉴런이 도파민을 통해 운동을 규제 유충 및 이차 운동 신경 기원 배아 및 어린 유충 50, 51. 초등 운동 뉴런은 각각 여러 가지 아형을 포함한다. 각 일차 운동 뉴런 아형 프로젝트 박힌 결과 특징 근육 그룹 innervates 주변 축색을 축삭 궤도를 식별하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 이차 운동 뉴런 이전 기본 운동 뉴런에 의해 설정된 축삭 통로를 따른다. 따라서, 축삭 궤적에 대해 일차 및 이차 운동 뉴런을 제외하고 유사하다는 축삭 두께 인 somata 크기 A를기본 운동 뉴런 45보다 재. 셋째,의 interneurons의 몇 가지 유형에서 녹화하는 방법이 설명되어 있습니다. 그러나, 이러한 경우, 다른 척수 세포 분리의 제한된 양이 필요하며, 따라서 척추가 Rohon 수염 - 셀 또는 운동 뉴런으로부터 녹화 용 미만 그대로.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6780-2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-bugarotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>11032-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4368-28-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-549 hydrazine salt</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184</td>
			<td>silicone elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-1000-100</td>
			<td>inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature barbed polypropylene fitting&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>&#160;Model P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator&#160;&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-169-1B</td>
			<td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HC-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmaseal Three-Way Stopcocks&#160;</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>K75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskop2 FS plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x/0.80w Achroplan objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition and analysis software&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td colspan="2">PClamp 10 - Clampex and Clampfit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection and Recording Solutions(in mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 - 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20&#176;C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" rowspan="1">Dissection/Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pipette (intracellular) recording solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Alexa-594 hydrazine salt stock solution.&#160;</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 &#181;l) and store at -20&#176;C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution&#160; with a centrifuge tube filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing agents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;M &#945;-bungarotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 250 &#956;M stock in ddH2O (1 mg/500 &#956;l), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM Tetrodotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons

먼저 개발 모델로 소개 제브라 피쉬는 다른 많은 분야에서 인기를 얻고있다. 급속히 발전 유기체 많은 수의 양육의 용이성, 배아 광학 선명도와 결합,이 모델의 초기 강력한 속성으로 봉사했다. 지난 20 년 동안,이 모델의 성공은 더 큰 규모의 돌연변이 유발 화면에의 복종 할 의무에 의해 형질 전환의 용이성에 의해 추진되고있다. 최근 유전자 편집 방법은 모델의 힘을 확장했다. 신경 발달 연구, 제브라 피쉬 배아와 유충은 여러 가지 방법이 적용될 수있는 모델을 제공한다. 여기, 우리는 신경 세포, 전기 흥분의 필수 속성의 연구를 할 수 방법에 초점을 맞 춥니 다. 제브라 피쉬의 척수 신경 세포의 전기 생리학 연구를위한 우리의 준비는 기록 챔버에 대한 준비를 확보하기 위해 수의사 봉합 접착제의 사용을 포함한다. 기록을위한 대체 방법제브라 피쉬 배아와 유충 미세한 텅스텐 핀 1, 2, 3, 4, 5를 이용하여 챔버 제조의 부착을 포함한다. 이 최대 4 애벌레의 등쪽 측 장착하기 위해 사용되었지만 텅스텐 핀은 대부분, 횡 방향의 제조를 탑재하기 위해 사용된다. 봉합 접착제는 두 방향에서 배아 및 유충을 장착하는 데 사용되었습니다. 접착제를 사용하여, 최소한의 절개함으로써 얻어진 임의의 손상을 피하기 위해, 효소 처리의 사용없이 척추 신경 접근 할 수 있도록 수행 될 수있다. 그러나 유충의 경우, 척수를 둘러싸고있는 근육 조직을 제거하는 간단한 효소 처리를 적용하는 것이 필요하다. 여기서 설명하는 방법은 여러 가지 developmenta에서 운동 신경,의 interneurons 및 감각 신경 세포의 고유 전기적 특성을 연구하는 데 사용되었다L은 6, 7, 8, 9 스테이지.

우리가 성공적 유충 DPF 1-7 17 개 HPF 배아 Rohon-수염 뉴런에서 기록했다 (도 5a 및도 5b). Rohon-수염 셀이 기록 된 경우, 제제는 등쪽 측까지 장착 하였다. 이러한 장착은 등쪽 표면 위치와 큰 소마 크기에 기초 Rohon 수염 - 셀의 명확한 식별을 허용한다. 식별 추가적으로 이러한 뉴런의 전형적인 과분극 휴지 막 전위 (도 5, 삽입 테이블) (6), (54)에 의해 확인된다. 또한, 차 감각 뉴런 같은 수염 - Rohon 뉴런의 시냅스 입력 부족하다. 전류 클램프 모드 (도 5B &#39;)에 기록하는 동안 따라서, 전기적 자극의 부재 하에서, 막 전위의 변경이 발생하지 않는 것이다. Rohon 수염 - 세포의 초기 레코딩 때문에 제브라 수행 하였다 &lt;SUP 클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; (6), 각종 형질 전환 라인들 (예를 들면, Tg는 (islet2b : GFP)의 Tg (NGN : GFP)과의 Tg (isletss : GFP가))이 뉴런 형광 리포터 표현 생성 된, 더 용이 자신의 식별 55, 56, 57. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55507/55507fig5.jpg" /> 도 5 : 통 셀 전압 - 전류 - 클램프 1 Rohon-수염 뉴런에서 녹음 유충 DPF 배아 DPF (2) 및 (7). (A) 전압 클램프의 외측과 내측 기록 전류 2- (굵은 검은 선), 1- (가는 흑색 선)에 Rohon-수염 뉴런에 의한, 7- DPF (회색 선) 배아 / 유생 하였다. 유지 전위였다 -80 mV의 전류와 +20 mV의 탈분극 단계에 의해 유도 하였다. (B) 단일 활동 전위가 짧은 (1 MS)에 의해 유도되는 전류주사 1- (가는 흑색 선)의 Rohon-수염 뉴런 (~ 0.35 NA), 2- (굵은 검은 선) 및 7-DPF (회색 선) 배아 / 유생. 전기 자극이없는 (B &#39;)는, 이러한 자연 시냅스 depolarizations 같은 막 전위의 변경은 Rohon-수염 뉴런에서 발생하지 않는다. 삽입 된 테이블 1- (N = 21) 및 2- (N = 9) 배아 DPF 및 7- (N = 7)의 애벌레 DPF Rohon-수염 뉴런에서 기록 막 전위 휴식의 값을 요약한다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55507/55507fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 다른 척추 신경 세포 아형의 명확한 식별을 허용 형질 전환 라인도 사용할 수 있습니다. 이 중, mnx1 형질 전환 라인의 Tg (mnx1 : GFP)은 곧 사양 (~ 14-16 HPF) 후 척수 운동 신경의 하위 집합에서 녹색 형광 단백질 (GFP) 표현 &lt;SUP 클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 58, 59. 인해 함께 mnx1 트랜스 제닉의 GFP의 발현을 각각 hemisegment (도 6A) 내의 일차 운동 뉴런의 전형적인 배치에, 상기 각종 일차 운동 신경 세포 아형 (도 6B 및 6C)를 식별 할 수있다. 라인 : 기록 전극 용액에 형광 색소를 포함하는 일부의 interneurons 또한 Tg는 (GFP mnx1)에서 GFP를 발현 같은 운동 신경 신원 추가 확인을 제공 축삭 궤적 시각화 가능하다. 대안 적으로, 운동 뉴런의 식별을 허용 다른 트랜스 제닉 라인은 ET2 라인 (60)이다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/55507/55507fig6.jpg" /> 도 6 : 피쉬 엠브리 DPF (1)의 운동 뉴런에서 전체 셀 전압 및 전류 클램프 녹음운영 체제. (A) 만화는 제브라 척수에 존재하는 기본 운동 신경 아형의 특정 형태 적 특징을 나타낸다. 기본 운동 뉴런은 세그먼트 내에서 소마의 위치에 의해 식별 (즉, 입쪽 [RoP의] 내측부 [MIP] 또는 꼬리 [CAP]) (45)된다. 또한, 각 서브 타입은 별개의 경로를 통해 주변부 축삭을 연장한다. Tg는 (mnx1 : GFP)의 병용 라인 염료 라벨링 박힌 축삭 아버 및 기록시의 운동 신경 아형의 신원을 알 수있다. 여기에 제시된 방법을 사용하여, 동일한 hemisegment 내에 세 가지 기본 운동 신경 아형에서 레코드를 순차적으로 할 수있다. (B) 전압 클램프 녹음 한 hemisegment에 미숙아 망막 병증 MIP 및 캡 모두에서 수득되었음을 나타낸다. +20 mV의 전압을 -80 mV의 단계의 유지 전위에서 전류를 유도하기 위해 사용되었다. 전류 클램프 R 중 (C)미숙아 망막 병증 MIP, 모자, 짧은 (1 밀리 초 ~ 0.4 NA)에서 ecordings 현재 주사 활동 전위를 유발하도록 적용되었다. 막 잠재력은 ~에서 열렸다 -65 mV의. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55507/55507fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 일차 및 이차 운동 뉴런 사이의 주요 차이점은 이전 태생 뉴런의 더 큰 인 somata이다. 그러나, 이차 운동 신경 아형 소마 크기 나 위치에 의해 식별되지 않는다. 특정 보조 운동 뉴런에서 레코딩을위한 두 개의 형질 전환 라인들은 (TG gata2 : GFP)과의 Tg (islet1 : GFP)은 각각 55, 61 복부 및 등쪽으로 돌출하는 축삭과 이차 운동 뉴런의 식별을 위해 사용되었다. 그러나, 2 차 제 3 운동 신경 아류 AXO으로, 제브라 피쉬 척수에 존재해당 프로젝트의 등쪽 NS 및 복부 (62). 따라서, 염료의 형태에 기초하여 (도 7A) 8, 9 서브 타입을 식별하는 기록 중에 이차 운동 뉴런을 채우기 위해 사용될 수있다. 종종, 이차 운동 뉴런으로부터 전압 클램프 (도 7b, 별표) 또는 전류 클램프 기록 (도 7C 및 7C &#39;, 화살촉) 동안 자연 또는 시냅스 이벤트가 기록된다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/55507/55507fig7.jpg" /> 도 7 : 배아 DPF (2)의 이차 운동 뉴런에서 전체 셀 전압 및 전류 클램프 레코딩. Tg는 (gata2 : GFP)을 (A) 라인은 두 개의 다른 이차 운동 신경 아형 GFP (62)을 표현한다. 왼쪽 hemisegment에서, 복부 보조 운동 신경(별표 화살표는 각각 소마 축삭을 나타냄). 인접 hemisegment에서 오른쪽 (꼬리)에 복부 / 배측 보조 모터 뉴런 (; 화살표 복부 [아래쪽 화살표] 돌출 두 축삭 번 다른 등쪽 [위쪽 화살표]를 나타내는 별표 소마을 나타냄)가있다. 이 뉴런은 녹음하는 동안 빨간색 형광 염료로 표지 하였다. 복부 / 등의 보조 운동 신경을 확인하려면, 해부함으로써 손상 또는 지느러미 축삭을 제거, 인접한 꼬리 hemisegment 근육을 제거하지 않도록하는 것이 중요합니다. 이 제조 (오른쪽 상단 별표)로부터 멀리 당겨질로 기록 후에 신경 소마는 마이크로 피펫에 부착 된 상태로 유지. 녹음시 신경을 채우기 위해 염료를 사용하는 경우, 전극은 적색 형광 배경 결과 목욕 척수 및 입쪽 [좌측] hemisegment &lt;에서 척색 (별표 하단에서 볼 때, 염료는 흔히 누출<html> / EM&gt;). (B) 전압 클램프 녹음 복부 및 복부 / 배측 보조 운동 뉴런으로부터 얻었다. 전압 단계는 (-30, -10, +10, +30은, +50, +70, +90, 및 +110 mV의)의 외측과 내측으로 유도 전류. 언 클램프 동작 전위 / depolarizations은 레코딩 (별표)에 존재할 수있다. 이차 운동 뉴런, 짧은 (1 MS)의 전류 진폭 증가로부터 주입 전류 클램프 기록 중 (C)는 활동 전위 (별표)를 트리거하는 신경에 적용 하였다. (C &#39;) ~ 0.4 NA는 전류 주입에 의해 이차 운동 뉴런 트리거 단일 활동 전위의 예로 도시된다. 이 단계에서, 자발적인 활동 전위도 (C 및 C &#39;, 화살촉)를 관찰한다. 장기간 (D) (100, MS) 주입 전류 (~ 0.35 nA의)은 활동 전위의 반복적 인 발화를 발생시킨다. 막 잠재력은 ~에서 열렸다 -65 mV의.로드 / 55507 / 55507fig7large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt; 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

이 원고는 제브라 피쉬 배아 및 유충의 척수 신경 세포에서 전기 생리 녹음하는 방법을 설명합니다. 준비는 현장에서 뉴런을 유지하고 자주 최소 절개를 포함한다. 이 방법은 초기 애벌레 단계를 통해 초기 전기 흥분의 인수, 척추 신경의 다양한 전기 생리학 연구 할 수 있습니다.

Zebrafish의<em&gt; 시츄</em&gt; 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

zebrafish-situ-spinal-cord-preparation-for-electrophysiological

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

11.4K 조회수.  University of Colorado Anschutz Medical Campus (UCAMC).  이 원고는 제브라 피쉬 배아 및 유충의 척수 신경 세포에서 전기 생리 녹음하는 방법을 설명합니다. 준비는 현장에서 뉴런을 유지하고 자주 최소 절개를 포함한다. 이 방법은 초기 애벌레 단계를 통해 초기 전기 흥분의 인수, 척추 신경의 다양한 전기 생리학 연구 할 수 있습니다. 

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

애벌레 Zebrafish의 척수 절개

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 척수의 영상

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 폐해 문화의 준비

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

신생아 생쥐의 척수 신경 세포 분리 및 배양

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

리듬-액티브의 준비 체 외 신생아 설치류 Brainstem-척수와 얇은 슬라이스

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) when compared to spinal motor neurons (SMNs). The ability to isolate and culture primary mouse CN3s, CN4s, and SMNs would provide an approach to study mechanisms underlying this selective vulnerability. To date, most protocols use heterogeneous cell cultures, which can confound the interpretation of experimental outcomes. To minimize the problems associated with mixed-cell populations, pure cultures are indispensable. Here, the first protocol describes in detail how to efficiently purify and cultivate CN3s/CN4s alongside SMNs counterparts from the same embryos using embryonic day 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenic mouse embryos. The protocol provides details on the tissue dissection and dissociation, FACS-based cell isolation, and in vitro cultivation of cells from CN3/CN4 and SMN nuclei. This protocol adds a novel in vitro CN3/CN4 culture system to existing protocols and simultaneously provides a pure species- and age-matched SMN culture for comparison. Analyses focusing on the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of motor neurons are feasible in this culture system. This protocol will enable research into the mechanisms that define motor neuron development, selective vulnerability, and disease.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

This work presents a protocol to yield homogeneous cell cultures of primary oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons. These cultures can be used for comparative analyses of the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of ocular and spinal motor neurons.

태아 기 이슬mn에서 Oculomotor, Trochlear 및 척추 모터 뉴런의 격리 및 문화 :GFP 형질전환 마우스

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Zebrafish의

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