이 작품은 보조금의 원조 심장에서 지원되었다 스트로크 캐나다 (G-14-0006265)의 재단, 건강 연구 (137352 및 143066), 그리고 JP 비켈 보조금의 캐나다 연구소에서 운영 보조금 (1013821 ) SSN합니다.

1. 마스터 디자인 및 제작 참고 : 장치 제조를위한 소프트 리소그래피를 사용합니다. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 성형 용 이층 SU-8을 마스터. <ol><li> 장치 (왼쪽 그림 1A) 디자인을 사용하고 제도 소프트웨어를 디자인합니다. 별도로 마스터의 각 층을 그린다. 마스터 (15)의 두 개의 층에 대응하는, dpi로 20,000 개의 포토 마스크에서 디바이스 디자인 인쇄. 투명 같은 디바이스 패턴과 같은 어두운 주변 영역을 설정; 마스크는 (다른 사람 (15)에 의해 기술 된 바와 같이) 광 리소그래피에 의해 SU-8에 디바이스 패턴을 전사하는 템플릿으로서 역할을한다. </li><li> 4 인치 실리콘 웨이퍼의 중심에 SU-8 (50)의 약 4 mL로 분배. 코트 SU-8 (50) 30 초 동안 균등 분 (RPM) 2,000 rpm의 속도로 회전하는 스핀 코터를 사용하여 웨이퍼상의. 10 분 동안 95 ° C에서 핫 플레이트 상에 웨이퍼 굽는다. 자외선 (UV)에 리튬 웨이퍼 폭로200에서 엠제이 GHT / cm 2. </li><li> 30 초 동안 2,500 RPM으로 상기 웨이퍼 및 회전 중심 상에 SU-8 2050 약 4 mL를 부어. 15 분 동안 95 ° C에서 핫 플레이트상에서 구워. 실온 (RT) 쿨. </li><li> 단계를 반복 1.3 두 번 더. </li><li> 제 1 층의 투명 마스크로 코팅 된 웨이퍼를 커버. 제 층을 만들기 위해 270 mJ의 / cm 2의 UV 광에 웨이퍼를 노출. 15 분 동안 95 ° C에서 핫 플레이트상에서 구워. </li><li> 두 번 단계 1.3를 반복하여 SU-8 2050의 두 번째 레이어를 확인합니다. </li><li> 노광 마스크를 이용하여 제 층에있는 기능을 2 층째 마스크 정렬. 그 후, 240 mJ의 / cm2로 UV 광에 노출. 15 분 동안 95 ℃에서 구워. 주 : 노광 시간이 필요한 총 UV 조사량 사용하기 전에 날에 측정 된 UV 광 출력 세기에 의해 결정된다. </li><li> 프로필렌 글리콜 모노 메틸 에테르 아세테이트 (PGMEA)에 침수 및 오비탈 진탕 기에서 30 분 동안 200 RPM으로 진탕하여 웨이퍼를 개발한다. </li><li> 장소웨이퍼의 중심 :주의 배양 접시에 마스터는 (1 내지 10 중량의 비율 가교제 염기)를 PDMS 액을 붓는다. 모든 기능을 커버 및 공기 방울을 피하십시오. </li><li> 2 시간 동안 70 ° C의 오븐에서 가열한다. PDMS의의 biowire 템플릿의 가장자리 (오른쪽 그림 1A) 주위를 잘라 날카로운 칼날을 사용합니다. 마스터에서 PDMS를 껍질입니다. 블레이드와 트리밍 장치. 20 분 동안 121 ℃에서 멸균 봉지 증기 오토 클레이브에서의 PDMS biowire 템플릿을 넣어. </li><li> 바이오 안전성 캐비닛 (BSC)에서, 페트리 접시에 템플릿 biowire PDMS의 배치합니다. 채 채널 (그림 1B-I)의 양쪽에있는 홈에 착석하여 PDMS의 마이크로 웰의 채널의 중앙에 무균 수술 실크 봉합사 (6-0)의 조각을 탑재 핀셋을 사용합니다. </li></ol> 전기 자극 상공 회의소 2. 창조 <ol><li> 2cm의 X : 폴리 직사각형 조각 (세로 × 가로 × 두께 쌍을0.85 cm X 0.35 cm)와 전기 자극 챔버의 구조로 사용 (도 2). </li><li> 각각의 폴리 카보네이트 구조 부재의 중심선을 따라 2cm 떨어진 두 3mm 와이드 구멍을 뚫는다. </li><li> 1.5 cm 길이 탄소봉 두 조각을 잘라. 끝에서 약 3mm 탄소봉으로 1mm의 폭 구멍을 뚫는다. 카본로드 관통 구멍 백금선 스레드 및 탄소 막대 주위를 감싸는 와이어를 조인다. 전기 자극기와 나중에 연결하기위한 백금 와이어의 타단에 클립을 첨부. </li><li> 폴리 카보네이트 프레임 부분에 카본 봉을 삽입한다. 여섯 웰 플레이트의 웰에 탄소봉으로 조립 된 프레임을 놓는다. </li><li> 웰에 PDMS 2 용액을 붓는다. 가까운 PDMS 표면 레벨을 유지하지만, 탄소봉의 저부에 도달하지 동안 PDMS에 폴리 카보네이트 프레임의 바닥을 담근다. 2 시간 동안 70 ° C의 오븐에서 가열한다. </li><li> 여섯에서 전기 자극 챔버를 타고웰로 20 분 동안 121 ℃에서 증기 멸균 멸균 봉지에 넣고. </li></ol> hPSC-의 CM 3. 효소 해리 <ol><li> 확립 된 프로토콜을 사용하여 4 심근 세포로 분화를 유도하는 hPSC. 주 : 간단히 확립 배아 체를 통해 심근 세포를 생성 (EB) 프로토콜 뼈 형태 형성 단백질 (4), 염기성 섬유 아세포 성장 인자, 액 티빈 A, 혈관 내피 성장 인자 및 Dickkopf 상동 1~4와 순차 보급 통해 줄기 프로 매체이다. biowires를 만들기 위해 차별화의 하루 20-34에서 사채를 사용합니다. </li><li> P1,000 피펫 팁과 저 부착 판의 EB를 모아서 원추형 튜브에 옮긴다. 125 XG 및 RT에서 5 분 동안 원심 분리하여 펠렛. 하여 펠렛을 상층 액을 제거하고 재현 탁 미리 가온 (37) I 1 %의 데 옥시 리보 뉴 클레아 제를 함유하는 콜라게나 ° C 타입 I (DNase를 I). 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션소화. </li><li> 예열, 37 ° C 5 mL를 넣고 125 XG 및 RT에서 5 분 동안 원심 분리하고 배지를 세척한다. 상층 액을 버린다. 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액 2 mL를 펠렛을 재현 탁하고, 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 3 %를 함유 정지 배지 1 mL를 넣고 (V / V)의 DNase의 I. </li><li> 3-5 회 5 ml 주사기에 20 G (0.9 mm) 바늘을 부착하고이를 통해 EB 현탁액을 통과한다. </li><li> 5 분 동안 280 XG에서 세탁 매체 원심 7 mL를 넣고. 상층 액을 버린다. Iscove의 수정 둘 베코의 매체 (IMDM)에서 펠렛을 재현 탁하고 얼음에 저장합니다. 혈구와 휴대폰 번호를 확인합니다. 5 분 동안 280 XG에서 원심 분리하여 0.5 × 106 세포 펠렛을보십시오. 상층 액을 제거합니다. </li><li> 멸균 튜브를 혼합하기 전에 얼음에 사전 멋진 모든 젤 구성 요소. 다음 콜라겐 겔 성분 (최종 농도)을 믹스 : 2.1 ㎎ / ㎖ 래트 꼬리 콜라겐 타입 I, 24.9 mM의 글루코오스 23.8 mM의 NaH를CO 3 14.3 mM의 NaOH를 10 mM의 HEPES 및 1X M199 배지에서 10 % 세포 외 기질. 콜라겐과 마지막 세포 외 기질을 추가합니다. 로 pipetting 아래로 섞는다. </li><li> 콜라겐 겔 3.5 μL와 0.5 × 106 세포를 재현 탁하고 잘 혼합한다. </li><li> 0.5 cm 길이의 채널 (도 1B-II)로 세포 현탁액 4 μL를 추가하는 P10 피펫 팁을 사용한다. 멸균 된 핀셋 필요하다면 봉합사의 위치를 ​​조정한다. </li><li> 확인 젤을 건드리지 않도록주의하면서 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 페트리 접시의 바닥을 커버. 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. </li><li> 세포 (그림 1B-III)를 커버하기에 충분한 배지 12 mL를 (예를 들어, 프로 또는 중간 셀 제조업체에서 권장하는 줄기)와 PBS를 교체합니다. 일주 37 ° C에서 인큐베이터에서 문화. 매일 매체를 변경합니다. </li></ol> Biowire 재배 4. 전기 자극 <ol><li> 에서BSC는, 전기 자극기 챔버를 수용하는 여섯 웰 플레이트의 각 웰에 PBS 2 mL를 넣고. 부드럽게 잘으로 멸균 전기 자극 장치를 배치 멸균 핀셋을 사용합니다. 우물에서 PBS를 폐기하십시오. </li><li> 예열 배지 5 ㎖과 탄소봉 커버. 전기 자극 챔버 내의 biowires 마운트 무균 핀셋을 사용하여 상기 탄소봉 (도 2)에 수직 한 방향들을. </li><li> 6 웰 플레이트의 상부에 뚜껑을 배치하지만, 전기 자극기와 연결 플레이트 외부 도달 충분한 백금 와이어를 떠난다. 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터에서 6 웰 플레이트를 배치하고, 전기 자극에 백금 와이어를 연결한다. </li><li> 이상성 반복 펄스, 1-MS 펄스 듀레이션, 3 V / cm, 초당 1 펄스 (PPS) 전기 다음 설정으로 자극기를 사용 biowires을 자극한다. 다음 값으로 PPS를 24 시간마다 상향 : 1.83, 2.66, 3.49, 40.82, 5.15 및 6 변경 매체 매일. </li><li> 10 배 배율에서 현미경으로 전기 자극에 대한 응답으로 심근 수축력을 준수하십시오. 참고 : 자극 일주일의 biowires이 성숙하게되면 (결과 섹션 참조). </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

이 원고는 hPSC-CM의 성숙을 향상시키기위한 엔지니어링 플랫폼 인 biowire의 설정과 구현을 설명합니다. 이 장치는 표준 미세 제조 시설에서 만들 수 있으며, 바이오 와이어는 일반적인 세포 배양 기술과 전기 자극기로 생산할 수 있습니다. 우리가 알기로는, 바이오 와이어와 비슷한 방법은보고 된 바 없다. 이 전략은 개선 된 성숙 특성이보다 높은 자극 속도 상승 요법 (6Hz 대 3Hz)을받은 바이 와이어에서 얻어진 성숙도가 높다는 것을 입증하는 것과 같이 전기 자극 요법에 의존한다는 것을 보여준다. biowires의 심근 세포는 20 일 (EBd20) 또는 40-44 일 (EBd44) 동안 재배 EBs에 비해 적은 자동 성과 높은 hERG 전류와 I K1 을 보여 주었다. EBd20 심근 세포는 biowires에 통합되기 전에 세포의 성질을 나타내는 반면, EBd44 심근 세포는 10 일 동안 배양되었다.onger에도 EB 형식 배양 시간 이상, 심근은 biowires에 전기 자극에 의해 유도되는 것과 동등한 특성 성숙에 도달 할 수 biowire 배양 시간보다 방송. 그러나 biowires를 통해 얻은 심근는 여전히 성인 심근만큼 성숙하지 않습니다. 기계적 자극 hPSC 여기서 CMS의 구조 단백질의 유도에 효과적인 것으로 제시되었다. 그러나 기계적인 자극은 전기 생리 성숙 (12)에 연결되지 않았다. 이것은 hPSC 심근 유래의 말단 분화를 유도하기 위하여, 순차적으로 또는 동시에, 전기 자극 및 기계공 응력을 결합 할 필요성을 제안 할 수있다. 생화학의 제공을 포함하는 다른 방법으로 전기 자극의 조합은 17 계수와 3 차원 셀 정렬은 더욱 효과적인 친 성숙 STRATE을 달성 할 수있을 것, 어떤 조직이 18생체 내 연구의 미래에 대한 GY. 여기서 사용 biowire 장치의 크기 5 mm이다 X X 0.3 mm (길이 x 폭 x 높이) 1mm하지만 이상 biowires 있도록 장치를 변경하는 것이 가능하다. 그러나 biowires의 높이 (겔 압축시 ~ 300 ㎛의 반경)는 0.3 mm로 제한 큰 조직에서 산소 공급의 제한이 주어진다. 두꺼운 조직의 생성이 제한을 극복하기 위해 관류 방법 19 필요할 것이다. 그럼에도 불구하고, 0.5 × 106 세포 / 와이어 길이 0.5 cm의 비율을 유지하는 것이 권장된다. 이상 biowires 들어 콜라겐 겔 중합이 오래 걸릴 수 있으며, 더 빈번한 매체 변화로 인해 세포의 증가 된 수에 필요할 수있다. 또한, 실크 봉합사를 사용하여 biowire의 현재 설정은 시드 심근 세포에 의해 생성 수축의 힘의 측정을 허용하지 않습니다. 그러나, 생분해 성 봉합사의 사용은 막 &#39;수앞으로이 수를 전자. 여기에 설명 된 biowire을 위해 사용되는 세포 유형은 Hes2 세포주를 사용하여 20-hESC의 CM이다. 이 프로토콜은 또한 hiPSC 세포주 (예를 들면, CDI-MRB와 HR-I-2CR-2R) (14)를 사용할 수 있습니다. 다른 인간 줄기 세포의 cardiomyogenic 능력은 다를 수 있습니다,이 플랫폼에 대한 적합성을 실험적으로 결정되어야하며, 필요에 따라 조건을 최적화. (표 1 참조) 프로토콜 내에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 또한, biowires는 6 웰 플레이트에 맞도록 설계되었고, 예는 여기에서 biowire의 결정을 보여 주었다. 그러나, 배양하는 것이 가능하고 또한 전기적으로 동시에 여러 biowires을 자극한다.

세포 기반 치료는 심장 수리 / 재생을 달성하기 위해 가장 유망한 및 조사 전략 중 하나입니다. 그것은 심장 조직 공학 및 생체 재료 1, 2의 공동 배달의 도움되었습니다. 대부분의 가능한 셀 소스 손상, 질병, 또는 세 마음 3에 잠재적으로 유익한 효과에 대한 동물 모델에서 연구되고있다. 특히, 상당한 노력이 인간 만능 줄기 세포를 사용되었습니다 (hPSC)은 심근 세포 (hPSC-CM), 심장 조직 공학에 대한 잠재적으로 무제한자가 세포 소스 - 유래. hPSC-CMS는 몇몇 확립 된 프로토콜 4, 5, 6을 사용하여 제조 될 수있다. 그러나, 수득 된 세포는 성체 심실의 심근 대비 7 미성숙 특성의 범위와 태아의 형상 표현형을 표시 </sup&gt; 8. 이는 신약 개발 연구에 성인 심장 질환 모델 (9)의 개발에 성인 심장 조직의 모델로 hPSC-의 CM 응용 프로그램에 장애물이 될 수 있습니다. 표현형 미숙의 이러한 한계를 극복하기 위해 새로운 접근 방식을 적극적으로 심근의 성숙을 촉진하기 위해 조사되었다. 초기 연구는 순환 기계 (10) 또는 전기 자극 (11)을 통해 신생아 래트 심근 세포의 효과적인 친 성숙 특성을 밝혀. 젤 압축 및 고리 기계적 자극은 또한 전기 생리 칼슘 취급 특성의 향상과 최소 hPSC-CM 성숙 (12, 13)의 일부 측면을 개선하는 것으로 나타났다. 따라서, &quot;생물학적 와이어&quot;(biowire)라는 플랫폼 시스템은 큐 구조와 전계 stimulatio 모두를 제공하여 고안된N은 hPSC의 CM-14의 성숙을 증진한다. 이 시스템은 전기장 자극 의무가 정렬 된 심장 조직을 만들기 위해 미세 플랫폼을 사용한다. 이것은 hPSC-CM이의 구조 및 전기 생리학적인 성숙을 개선하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 biowires을의 세부 사항을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>L-Ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>A-4544</td><td>hPSC-CM culture media componet</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk, Inc</td><td></td><td>Software to design device</td></tr><tr><td>Carbon rods, &amp;Oslash; 3 mm</td><td></td><td></td><td>Electrical stimulator chamber component</td></tr><tr><td>Collagen, type 1, rat tail</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td>Collagen gel: 2.1 mg/mL of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.</td></tr><tr><td>Collagenase type I&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Sterilize with 0.22 &amp;mu;m filter and make 12 mL aliquots. Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I (DNase I)</td><td>EMD Millipore</td><td>260913-25MU</td><td>Make 1 mg/mL DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 mL aliquots at &amp;minus;20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Drill &amp;amp; drill bits (&amp;Oslash; 1 mm and 2 mm)</td><td>Dremel</td><td></td><td>Drill holes in polycarbonate frames</td></tr><tr><td>Electrical stimulator</td><td>Grass</td><td>s88x</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>WISENT Inc.</td><td>080-450</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td>Collagen gel component</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>MilliQ</td><td></td><td>18.2 M&amp;Omega;&amp;middot;cm at 25 &amp;deg;C, ultrapure, to make all solutions</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Collagen gel component</td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Torrey Pines</td><td>HS40</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium(IMDM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>EVG&amp;nbsp;</td><td>EVG 620</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, growth factor reduced&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Collagen gel component</td></tr><tr><td>Medium 199 (M199)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11825015</td><td>Collagen gel component</td></tr><tr><td>Monothioglycerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M-6145</td><td>hPSC-CM culture media componet</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (P/S)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Plate (6-well)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Plate (6-well), low attachment</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Platinum wires, 0.2 mm</td><td></td><td></td><td>Electrical stimulator chamber component</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)</td><td>Doe &amp;amp; Ingalls Inc.</td><td></td><td>To develop the wafer</td></tr><tr><td>Pouch, peel-open</td><td>Convertors</td><td>92308</td><td>For steam sterilization</td></tr><tr><td>Silicon wafer, 4 inch</td><td>UniversityWafer Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Collagen gel component</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Collagen gel component</td></tr><tr><td>Sprin coater</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>StemPro-34 culture medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10639011</td><td>hPSC-CM culture medium. To make 50 mL, add 1.3 mL supplement, 500 &amp;mu;L of 100&amp;times; L-Glutamine, 250 &amp;mu;L of 30 mg/mL transferrin, 500 &amp;mu;l of 5 mg/mL ascorbic acid, 150 &amp;mu;L of 26 &amp;mu;l /2 mL monothioglycerol (MTG), and 500 &amp;mu;L (1 %) penicillin/streptomycin.</td></tr><tr><td>Stop media</td><td></td><td></td><td>Wash medium:FBS (1:1)</td></tr><tr><td>SU-8 50&amp;nbsp;</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>photoresist, master component</td></tr><tr><td>SU-8 2050&amp;nbsp;</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>photoresist, master component</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche</td><td>10-652-202</td><td>hPSC-CM culture media componet</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA, 0.25%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td>hPSC-CM culture media componet</td></tr><tr><td>Wash medium</td><td></td><td></td><td>IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin</td></tr></tbody></table>

maturation of human stem cell-derived cardiomyocytes in biowires using electrical stimulation

인간 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMS)은 유망한 셀 원천이되어있다, 따라서 약물 발견, 질병 모델링, 조직 공학 및 재생 의학을 포함한 심장 연구에서의 응용 가능성의 조사를 격려했다. 그러나, 기존의 프로토콜에 의해 생산 세포는 네이티브 성인 심실의 심근에 비해 미성숙의 범위를 표시합니다. 많은 노력은 지금까지 달성 완만 한 성숙으로, hPSC-CM이 성숙되었습니다. 따라서 biowire라는 설계 시스템은, 시험 관내에서 성숙 상태 hPSC-CMS에 이끌 물리적 및 전기적 신호를 모두 제공하여 고안되었다. 시스템 I은 점진적으로 증가하는 주파수 전기장 자극을 받는다 정렬 심장 조직 (biowire)에 조립 강성 템플릿 봉합사 따라 겔화 콜라겐 타입 hPSC-CMS에 시드하는 미세 플랫폼을 사용한다. nonstimulated 컨트롤에 비해,biowired 심근 구조적 및 전기 생리 학적 성숙의 강화 정도를 나타내는 자극. 이러한 변화는 자극의 속도에 따라 달라집니다. 이 원고는 구체적으로 biowires의 설계 및 제작에 대해 설명합니다.

biowires의 봉합사를 사용하는 이성 한 축에 정렬하고 심장 섬유의 형상을 모방하는 3 차원 구조물의 형성을위한 템플릿으로서 역할을한다. 우리는 biowire 문화의 7 일 후에, 세포가 봉합 (그림 3A)의 주위에 젤을 개조 한 것으로 나타났습니다. 봉합사의 축을 따라 어셈블 세포는 심장 조직 (도 3)를 배열 형성한다. 예비 배양 7 일 후, 7 biowires 전기장 자극 일 심근의 구조적 및 기능적 성숙 호환 상기 전시 특성을 실시 하였다. biowires에서 PSC-CM이 인간 심장 수축성 단백질의 강한 발현 sarcomeric α-티닌 및 액틴 (도 4a)을 나타내었다. 우리는 myofibrilar 협착 hPSC-CM 수축성 장치 및 배향 sarcomeric 밴딩 관찰봉합사의 축을 따라. 이것은 성인 심장 (그림 4A)의 구조를 질적으로 유사하다. 둘째는 EBS에 비해, 이들 biowired hESC의-CMS는 낮은 증식 속도 (도 4b)를 표시. 셋째, biowired hESC의-CMS는 칼슘 등록 처리 (도 5) 및 심근 전기 생리학 성숙 (도 6)을 향상 나타냈다. 성숙한 심근 세포에서 카페인 치료는 근질 세망 (8)에서 칼슘의 갑작스러운 방출을 유도한다. 이러한 칼슘 과도 전기적 자극의 hESC-CMS의 발견 아니라 비 자극 제어 (도 5A-C)에서 세포 하였다. 비 자극 대조군에 비해 전기적으로 자극 된 세포에서의 카페인에 대한 응답은, 자극 주파수 별 방식 (도 5D와 E)의 강도가 상당히 높은 진폭을 밝혔다. 한편, 여기서 CMS hPSCbiowires 더욱 전기 자극 (도 6A 및 B)에 의해 강화되었다 HERG 전류 정류 전류 내측 (I의 K1) 밀도를 개선 하였다. I K1의 전류의 이러한 개선은 biowires (도 6C)의 내향 정류 칼륨 채널 유전자 (KCNJ2) 단백질 발현 유도에 따른다. 성숙에 관한 또 다른 중요한 매개 변수는 심근 (심방과 심실) 16 일에 미성숙의 표시이다 자발적으로 이길 수있는 심근의 기능도 자동 성으로 알려져있다. 자동 성이 6 Hz의 처방을 실시 biowires에 필적 하였다 제어 biowires (도 6D)에 비해 EB 유래 심근 세포에서 유의하게 높았다. 갖다N 함께, 이들 결과는 전기 자극과 biowire에서 배양 hPSC의 CM-14의 구조 및 전기 생리 학적 성숙을 촉진 것을 나타낸다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55373/55373fig1.jpg" /> 그림 1 : Biowire 문화 플랫폼. (A) 도식 (왼쪽)과 실제 biowire (오른쪽) PDMS 몰드. 스케일 바 = 2 mm이다. biowire를 설정하기 위해 (B)는, 봉합은 채널 (I)의 중앙에 장착 하였다. 콜라겐 타입 I 겔에서의 hESC-CM 현탁액 채널 (II)의 주위에 봉합 시드 매체 (III)에서 배양 하였다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55373/55373fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55373/55373fig2.jpg" /> 그림 2 :Biowire는 재배의 두 번째 주 동안 전기 자극 상공 회의소에서 배양 하였다. biowire은 탄소 전극에 수직으로 배치 하였다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55373/55373fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55373/55373fig3.jpg" /> 그림 3 : 셀 리모델링 및 젤 Biowire에서 예비 배양 7 일 이후에 봉합 주위에 계약. (A)에 biowire 템플릿 배양액의 표시 일에서의 CM-hESC의 브라이트 이미지. 스케일 바 = ~ 200㎛. 배양 표시된 날 겔 다짐의 (B) 정량 (평균 ± SD). biowire 섹션 (C) Hematoxylin &amp; Eosin 염색 및 메이슨 트리 크롬의 (MT) 염색 (양두 화살표 봉합사 축을 나타낸다). 스케일 바R = 100 μm의. 이 수치는 기준 (14)로부터 변형되었다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55373/55373fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55373/55373fig4.jpg" /> 그림 4 : Biowire 플랫폼에서 심근 세포 배양의 생리학. (A) 비 - 자극 (대조군)의 대표적인 공 초점 이미지 및 심근 정렬 빈번한 Z-디스크를 나타내는 전기적 자극 biowires (3 Hz에서 6 Hz의 섭생) (양두 화살표 봉합사 축을 나타낸다). 녹색, α-티닌; 빨강, 액틴. 스케일 바는 20 μm의 =. biowires의 (B) 심근 증식은 EBS의보다 낮았다. 증식 sarcomeric α-티닌 및 Ki67 (N = 3-4 당 조건, 평균 ± 이중 염색에 의해 평가 하였다; SD). *, **, #, 그리고 &amp;는 EBd34 (학생의 t의 -test)에 비해 유의 한 차이가 통계적으로 나타냅니다. 이 수치는 기준 (14)로부터 변형되었다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55373/55373fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55373/55373fig5.jpg" /> 그림 5 : 칼슘의 전기 자극 승진 개선이 속성을 처리. (AC) 3 Hz의 처방 (B) 및 6 Hz의 처방 (C) 실시 nonstimulated 대조군 세포 (A) 및 셀 카페인에 응답 칼슘 방출의 대표적인 추적. (D) 실험군 간의 최대 형광 강도의 카페인 - 유도 변경 (피크 형광 제가 정규화 후의 평균 ± SEM카페인을 투여하기 전에 ntensity; 3 ㎐, P = 1.1 × 10 대 제어 - 6; 6 ㎐, P = 2.1 × 10 대 제어 - 7; 6 대 3 Hz에서 ㎐, P = 0.003; N = 10 (대조군), N = 6 (3 Hz에서), 및 N = 9 (6 Hz로) (학생의 t -test). (E) 2+ 과도 전 및 6 Hz의 처방을 실시 5mm의 세포 (화살표)에 카페인 투여 후 칼슘의 대표적인 형광 기록. 이 수치는 기준 (14)로부터 변형되었다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55373/55373fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/55373/55373fig6.jpg" /> 그림 6 : 전기 페이싱은 전기 생리 속성 및 자동 성을 향상시킵니다. Electrophysiologbiowires 또는 배아 체 (교환 사채)에서 고립 된 단일 심근에서 iCal의 속성은 패치 클램프로 기록되었다. (A) 꼬리 HERG 전류 밀도. -100 mV의 측정 (B) I K1 전류 밀도. (C) 상향 조절 칼륨의 내측 (KCNJ2)을 채널 유전자 정류. (D) 자율 박동 (자동 성)이나 자율 박동 아니오 (NO 자동 성)를 표시 셀의 비율. AD의 데이터는 실험 집단 간의 차이는 학생의 t의 -test, 카이 제곱 테스트 및 ANOVA (페어 다중 비교, 홀름 - Sidak 방법)에 의해 분석 된 평균 ± SEM을 나타냅니다. 이 수치는 기준 (14)로부터 변형되었다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55373/55373fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-witH-next.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <tbody><tr><td> 프로토콜 단계 # </td><td colspan="5"> 중요한 단계 </td></tr><tr><td> 2.4 </td><td colspan="5"> 2cm 간격 또는 가능한 최소 거리 고 에너지 자극하고 세포 사멸을 피할 수 - 1 탄소봉을 놓는다. </td></tr><tr><td> 2.6 </td><td colspan="5"> 백금 와이어 및 자극 챔버 처음 이루어지면 탄소 사이의 연결을 테스트한다. 전기 자극기로 자극 챔버를 연결하고, 원하는 전압을 설정한다. 두 탄소봉 각각에 볼트 리드를 놓는다. 자극 챔버로부터의 출력 전압은 전압계를 읽고 동일한 전압이어야한다. 잘못된 판독 PDMS와 백금 와이어의 가능한 코팅 또는 시스템의 다른 접속 불량을 나타냅니다. </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td colspan="5"> 단일 세포는 biowire 종자 사용되었다. 해리를 들어, incubatioN 콜라게나 시간은 중요하며, 세포의 연령 및 분화 프로토콜 (단층 대 사채)에 의해 결정되어야한다. 이 프로토콜에서, 2 시간의 배양 시간은 21 일 사채 및 단층을 30 분을 권장한다. 다른 연령대의 세포를 들어, 콜라겐 분해 시간은 세포 생존과 수축 기능 후 소화를 모니터링하여 최적화를해야 할 수도 있습니다. </td></tr><tr><td> 3.3 </td><td colspan="5"> 트립신은 세포를 손상시킬 수 있습니다; 따라서, 5 분 이상 더 이상에 배양 기간을 제한합니다. </td></tr><tr><td> 3.5 </td><td colspan="5"> 바늘 끝에 주사기를 연결하는 주사기의 끝을 잡고 오염 물질을 도입하지 마십시오. 급락의 수는 셀의 큰 덩어리의 유무에 의해 결정된다. 세포 사멸을 방지하기 위해 바늘 중단을 최소화합니다. 거품 형성을 피할 것. 니들 파쇄 표시 덩어리의 경우에는, 증가하는 대신에 절연 부 후속 콜라겐의 배양 시간을 연장트립신 또는 급락의 수가 배양 시간. </td></tr><tr><td> 3.6 </td><td colspan="5"> 겔의 첨가 전에 완전히 상청액을 제거한다. 잔류하는 배지는 세포의 비율로 희석 수 겔 겔 중합에 영향을 미친다. </td></tr><tr><td> 3.7 </td><td colspan="5"> 최대의 크기를 조절하거나 아래로 때 콜라겐 젤 성분의 농도를 유지한다. 재고 농도는 시약의 배치 또는 준비에 따라 달라질 수 있음을 유의하십시오. </td></tr><tr><td> 3.11 </td><td colspan="5"> 즉 마이크로 웰은 배양 접시의 바닥에 남아 PDMS 보장하기 위해 페트리 접시가 건조되었는지 확인하고, PDMS의 마이크로 웰을 밀어 멸균 포셉 한 쌍을 사용합니다. </td></tr><tr><td> 4.2 </td><td colspan="5"> 모든 biowires이 제자리에 있는지 확인합니다. 완전히 전기 자극 챔버 매체와 biowires 커버. 탄소 막대에 수직 모든 biowires를 정렬합니다. </td></tr><tr><td> 4.3 </td> &lt;TD의 열 결합은 = &quot;5&quot;&gt; 부드럽게 뚜껑을 덮음으로써, 백금 와이어에 손상을 피한다. 뚜껑이 완전히 닫히지 않습니다 경우에 접시에 제대로 뚜껑을 확보하기 위해 테이프를 사용합니다. 인큐베이터의 도어를 닫을 때 인큐베이터의 적당한 밀봉을 보장하기 위해 도어 폐쇄 지점에서 전기 자극 중 와이어의 박 육부를 배치했다. </td></tr><tr><td> 4.4 </td><td colspan="5"> 매체의 변화에 ​​대한 전기 자극을 분리. 기존 매체의 상단 부분을 제거하고 신선한 매체를 추가 할 P1000을 사용합니다. biowires 항상 매체에서 침수되어 있는지 확인합니다. </td></tr></tbody></table> 표 1 : 프로토콜의 중요한 단계.

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Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

심장 biowire 플랫폼은 전기 자극 3 차원 세포 배양을 조합하여 인간 배아 및 유도 된 다 능성 줄기 세포 유래 심근 (hPSC-CM)를 숙성에 사용되는 시험 관내 방법. 이 원고는 심장 biowire 플랫폼의 자세한 설정을 제공합니다.

전기 자극을 사용하여 Biowires 인간 줄기 세포 유래 심근 세포의 성숙

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

maturation-human-stem-cell-derived-cardiomyocytes-biowires-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.0K 조회수.  University Health Network.  심장 biowire 플랫폼은 전기 자극 3 차원 세포 배양을 조합하여 인간 배아 및 유도 된 다 능성 줄기 세포 유래 심근 (hPSC-CM)를 숙성에 사용되는 시험 관내 방법. 이 원고는 심장 biowire 플랫폼의 자세한 설정을 제공합니다. 

비디오: Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

연구

발생학

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) are increasingly recognized as having great value for modeling cardiovascular diseases in humans, especially arrhythmia syndromes. They have also demonstrated relevance as in vitro systems for predicting drug responses, which makes them potentially useful for drug-screening and discovery, safety pharmacology and perhaps eventually for personalized medicine. This would be facilitated by deriving hPSC-CMs from patients or susceptible individuals as hiPSCs. For all applications, however, precise measurement and analysis of hPSC-CM electrical properties are essential for identifying changes due to cardiac ion channel mutations and/or drugs that target ion channels and can cause sudden cardiac death. Compared with manual patch-clamp, multi-electrode array (MEA) devices offer the advantage of allowing medium- to high-throughput recordings. This protocol describes how to dissociate 2D cell cultures of hPSC-CMs to small aggregates and single cells and plate them on MEAs to record their spontaneous electrical activity as field potential. Methods for analyzing the recorded data to extract specific parameters, such as the QT and the RR intervals, are also described here. Changes in these parameters would be expected in hPSC-CMs carrying mutations responsible for cardiac arrhythmias and following addition of specific drugs, allowing detection of those that carry a cardiotoxic risk.

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Electrophysiological characterization of cardiomyocytes derived from human Pluripotent Stem Cells (hPSC-CMs) is crucial for cardiac disease modeling and for determining drug responses. This protocol provides the necessary information to dissociate and plate hPSC-CMs on multi-electrode arrays, measure their field potential, and a method for analyzing QT and RR intervals.

다중 전극 배열 (MEAs)을 이용한 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMs)의 전기 생리 학적 분석

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated researchers in the stem cell and bioengineering fields to develop in vitro high-fidelity human myocardium for both basic research and clinical applications. However, the immature phenotype of cardiac cells is a limitation on obtaining tissues that functionally mimic the adult myocardium, which is mainly characterized by mechanical and electrical signals. Thus, the purpose of this protocol is to prepare and mature the target cell population through electromechanical stimulation, recapitulating physiological parameters. Cardiac tissue engineering is evolving toward more biological approaches, and strategies based on biophysical stimuli, thus, are gaining momentum. The device developed for this purpose is unique and allows individual or simultaneous electrical and mechanical stimulation, carefully characterized and validated. In addition, although the methodology has been optimized for this stimulator and a specific cell population, it can easily be adapted to other devices and cell lines. The results here offer evidence of the increased cardiac commitment of the cell population after electromechanical stimulation. Electromechanically stimulated cells show an increased expression of main cardiac markers, including early, structural, and calcium-regulating genes. This cell conditioning could be useful for further regenerative cell therapy, disease modeling, and high-throughput drug screening.

Here we present a protocol for training a cell population using electrical and mechanical stimuli emulating cardiac physiology. This electromechanical stimulation enhances the cardiomyogenic potential of the treated cells and is a promising strategy for further cell therapy, disease modeling, and drug screening.

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

생체공학

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput electrophysiological approaches for hiPSC-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) preparations is much needed for efficient drug testing. Although multielectrode arrays (MEAs) are frequently employed for field potential measurements of excitable cells, a recent publication by Joshi-Mukherjee and colleagues described and validated its application for recurrent action potential (AP) recordings from the same hiPSC-CM preparation over days. The aim here is to provide detailed step-by-step methods for seeding CMs and for measuring AP waveforms via electroporation with high precision and a temporal resolution of 1 &#181;s. This approach addresses the lack of easy-to-use methodology to gain intracellular access for high-throughput AP measurements for reliable electrophysiological investigations. A detailed work flow and methods for plating of hiPSC-CMs on multiwell MEA plates are discussed emphasizing critical steps wherever relevant. In addition, a custom-built MATLAB script for rapid data handling, extraction and analysis is reported for comprehensive investigation of the waveform analysis to quantify subtle differences in morphology for various AP duration parameters implicated in arrhythmia and cardiotoxicity.

This article contains a set of protocols for the development of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) networks cultured on multiwell MEA plates to reversibly electroporate the cell membrane for action potential measurements. High-throughput recordings are obtained from the same cell sites repeatedly over days.

재발 동작 전위 기록을 위한 멀티웰 마이크로 전극 어레이의 인간 iPSC 유래 심근구 네트워크

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

인간 조직형 심장 슬라이스의 이중 전압 및 칼슘 광학 매핑에 의한 전임상 심장 전극생리학 평가

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used in regulatory submissions. Here, we extend their use to cardiac medical device safety or performance assessments. We developed a novel method to evaluate cardiac medical device contractile properties in robustly contracting 2D hiPSC-CMs monolayers plated on a flexible extracellular matrix (ECM)-based hydrogel substrate. This tool enables the quantification of the effects of cardiac electrophysiology device signals on human cardiac function (e.g., contractile properties) with standard laboratory equipment. The 2D hiPSC-CM monolayers were cultured for 2-4 days on a flexible hydrogel substrate in a 48-well format.
The hiPSC-CMs were exposed to standard cardiac contractility modulation (CCM) medical device electrical signals and compared to control (i.e., pacing only) hiPSC-CMs. The baseline contractile properties of the 2D hiPSC-CMs were quantified by video-based detection analysis based on pixel displacement. The CCM-stimulated 2D hiPSC-CMs plated on the flexible hydrogel substrate displayed significantly enhanced contractile properties relative to baseline (i.e., before CCM stimulation), including an increased peak contraction amplitude and accelerated contraction and relaxation kinetics. Furthermore, the utilization of the flexible hydrogel substrate enables the multiplexing of the video-based cardiac-excitation contraction coupling readouts (i.e., electrophysiology, calcium handling, and contraction) in healthy and diseased hiPSC-CMs. The accurate detection and quantification of the effects of cardiac electrophysiological signals on human cardiac contraction is vital for cardiac medical device development, optimization, and de-risking. This method enables the robust visualization and quantification of the contractile properties of the cardiac syncytium, which should be valuable for nonclinical cardiac medical device safety or effectiveness testing. This paper describes, in detail, the methodology to generate 2D hiPSC-CM hydrogel substrate monolayers.

Here, we demonstrate a non-invasive cardiac medical device contractility evaluation method using 2D human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) monolayers, plated on a flexible substrate, coupled with video-based microscopy. This tool will be useful for the in vitro evaluation of the contractile properties of cardiac electrophysiology devices.

2D 인간 줄기 세포 유래 심근 세포에서 심장 수축성 조절 요법의 평가

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical cardiotoxicity testing. In two-dimensional monolayer formats, hiPSC-CMs recapitulate the structure and function of the adult human heart muscle cells when cultured on an optimal extracellular matrix (ECM). A human perinatal stem cell-derived ECM (maturation-inducing extracellular matrix-MECM) matures the hiPSC-CM structure, function, and metabolic state in 7 days after plating. 
Mature hiPSC-CM monolayers also respond as expected to clinically relevant medications, with a known risk of causing arrhythmias and cardiotoxicity. The maturation of hiPSC-CM monolayers was an obstacle to the widespread adoption of these valuable cells for regulatory science and safety screening, until now. This article presents validated methods for the plating, maturation, and high-throughput, functional phenotyping of hiPSC-CM electrophysiological and contractile function. These methods apply to commercially available purified cardiomyocytes, as well as stem cell-derived cardiomyocytes generated in-house using highly efficient, chamber-specific differentiation protocols. 
High-throughput electrophysiological function is measured using either voltage-sensitive dyes (VSDs; emission: 488 nm), calcium-sensitive fluorophores (CSFs), or genetically encoded calcium sensors (GCaMP6). A high-throughput optical mapping device is used for optical recordings of each functional parameter, and custom dedicated software is used for electrophysiological data analysis. MECM protocols are applied for medication screening using a positive inotrope (isoprenaline) and human Ether-a-go-go-related gene (hERG) channel-specific blockers. These resources will enable other investigators to successfully utilize mature hiPSC-CMs for high-throughput, preclinical cardiotoxicity screening, cardiac medication efficacy testing, and cardiovascular research.

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) offer an alternative to using animals for preclinical cardiotoxicity screening. A limitation to the widespread adoption of hiPSC-CMs in preclinical toxicity screening is the immature, fetal-like phenotype of the cells. Presented here are protocols for robust and rapid maturation of hiPSC-CMs.

성숙한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 단층을 사용한 고처리량 심장 독성 스크리닝

Human induced stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are used to replace and reduce the dependence on animals and animal cells for preclinical ...

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

Heart failure remains the leading cause of death worldwide, creating a pressing need for better preclinical models of the human heart. Tissue engineering is crucial for basic science cardiac research; in vitro human cell culture eliminates the interspecies differences of animal models, while a more tissue-like 3D environment (e.g., with extracellular matrix and heterocellular coupling) simulates in vivo conditions to a greater extent than traditional two-dimensional culture on plastic Petri dishes. However, each model system requires specialized equipment, for example, custom-designed bioreactors and functional assessment devices. Additionally, these protocols are often complicated, labor-intensive, and plagued by the failure of the small, delicate tissues.
This paper describes a process for generating a robust human engineered cardiac tissue (hECT) model system using induced pluripotent stem-cell-derived cardiomyocytes for the longitudinal measurement of tissue function. Six hECTs with linear strip geometry are cultured in parallel, with each hECT&#160;suspended from a pair of force-sensing polydimethylsiloxane (PDMS) posts attached to PDMS racks. Each post is capped with a black PDMS stable post tracker (SPoT), a new feature that improves the ease of use, throughput, tissue retention, and data quality. The shape allows for the reliable optical tracking of post deflections, yielding improved twitch force tracings with absolute active and passive tension. The cap geometry eliminates tissue failure due to hECTs slipping off the posts, and as they involve a second step after PDMS rack fabrication, the SPoTs can be added to existing PDMS post-based designs without major changes to the bioreactor fabrication process.
The system is used to demonstrate the importance of measuring hECT function at physiological temperatures and shows stable tissue function during data acquisition. In summary, we describe a state-of-the-art model system that reproduces key physiological conditions to advance the biofidelity, efficiency, and rigor of engineered cardiac tissues for in vitro applications.

Three-dimensional cardiac tissues bioengineered using stem-cell-derived cardiomyocytes have emerged as promising models for studying healthy and diseased human myocardium in vitro while recapitulating key aspects of the native cardiac niche. This manuscript describes a protocol for fabricating and analyzing high-content engineered cardiac tissues generated from human induced pluripotent stem-cell-derived cardiomyocytes.

공학적 심장 조직의 데이터 수집 및 모델 처리량을 개선하기 위한 바이오리액터 설계

Heart failure remains the leading cause of death worldwide, creating a pressing need for better preclinical models of the human heart. Tissue engineering ...

3D Human Myocardial Tissue Generation Using Melt Electrospinning Writing of Polycaprolactone Scaffolds and hiPSC-Derived Cardiac Cells

The development of functional human cardiac tissues holds significant promise for advancing applications in drug screening, disease modeling, and regenerative medicine. This protocol describes the stepwise fabrication of 3D myocardial tissues with advanced mimicry of native cardiac structure by combining melt electrospinning writing (MEW) polycaprolactone (PCL) scaffolds with fibrin hydrogels and human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived cardiac cells. The process involves embedding a mixture of cardiomyocytes (hiPSC-CMs) and cardiac fibroblasts (hiPSC-CFs) within a fibrin matrix to create mini-tissues, with structural support provided by MEW-generated scaffolds. These fibrillar scaffolds are fabricated at the micro- to nanoscale, allowing for precise control over fiber architecture, which plays a key role in organizing cell distribution and alignment. Meanwhile, the fibrin matrix promotes cell viability and mimics the extracellular environment. Characterization of the generated tissues reveals well-organized sarcomeres within hiPSC-CMs, along with stable contractile activity. The tissues demonstrate consistent spontaneous beating as early as two days post-seeding, with sustained functionality over time. The combination of hiPSC-CFs with hiPSC-CMs enhances the structural integrity of the tissues while supporting long-term cell viability. This approach offers a reproducible, adaptable, and scalable method for creating biomimetic cardiac tissue models, providing a versatile platform for preclinical drug testing, mechanistic studies of cardiac disease, and potential regenerative therapies.

A reproducible method is presented to generate 3D myocardial tissues combining melt electrospinning writing (MEW) polycaprolactone (PCL) scaffolds and fibrin hydrogels with hiPSC-derived cardiomyocytes and fibroblasts. This technique offers precise control over scaffold architecture and can be applied in preclinical drug testing and cardiac disease modeling.