팀 데일리와 앤드류 스미스는 초기 일 동안 많은 유용한 계산 토론을 제공; 팀 데일리는 전산 자원이 남부 캘리포니아 대학의 고성능 컴퓨팅 클러스터가 제공 한 프로토콜 5. 필요한 프로그램 rotate_translate_cylindrical을 썼다. 이 작품은 NIH 부여 # 1 GM098536 (MDD)에 의해 지원되었다.

모든 절차와 인원은 동물 관리 및 사용위원회 남부 캘리포니아 대학의 대학 (IACUC), 프로토콜 # 11394에 의해 승인되었다. 1. 음경 골 해부 및 준비 <ol><li> 관련 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 정한 프로토콜에 따라, 과다 노출 이산화탄소를 통해 성적으로 성숙한 수컷 마우스를 안락사. </li><li> 앙와위에서 동물을 배치하고, 엄지 손가락은 포피 개방 측 방향으로 압력을 적용하여 음경을 뻗치다. </li><li> 음경이 길어지면, 가능한 한 포피 통해 조직을 확장한다. </li><li> 가위로, 음경 골이있는 귀두의 음경 몸 인접를 잘라. </li><li> 1.7 ML의 튜브에 해부 성기를 전송하고 200 μL의 수돗물을 추가합니다. 음경이 완전히 액체에 잠긴 않았는지 확인합니다. </li><li> 3~5일 위해 ~ 50 ° C의 물에서의 조직을 인큐베이션. </li><li&gt; 적절한 배양 후, 해부 현미경으로 집게를 사용하여 음경 골에서 주변 조직을 제거합니다. 부드럽게 조직을 밀어 나머지 뼈를 청소하는 70 % 에탄올을 분출. </li><li> 열린 모자와 새로운 microcentrifuge 관에 해부 음경 골을 넣습니다. 열린 O 캡 남기기 / N 뼈를 건조합니다. </li></ol> 2. MicroCT 스캐닝 <ol><li> 꽃집 거품의 실린더를 만드는 꽃집 거품의 벽돌로 microCT 스캔 원통형 홀더를 누르십시오. </li><li> 꽃집 거품의 실린더를 추출하고 2-5cm 두께 ~ 조각을 잘라. </li><li> 스캔하는 동안 간섭을 최소화하기 위해 개별 조각의 주위에, 꽃집 폼에 건조 bacula을 누릅니다. 뼈의 정확한 방향은 프로토콜 4 각 시편의 적절한 식별을 가능하게 주목해야한다. </li><li> 조심스럽게 microCT 홀더에 삽입 된 뼈 조각을 배치합니다. </li><li> microCT 스캔을 획득. 마우스 bacula (14)의 경우, </sup90 KVP, 155 μA, 0.5 mm 알루미늄 필터, 180 (360 범위) 당 750 돌기의 노출 시간 :&gt;, 우리는 다음과 같은 설정 아래에있는 USC 분자 이미징 센터에서 uCT50 스캐너 (Scanco 의료 AG, Bruttisellen, 스위스) 사용 500 밀리, 15.5 mm의 복셀 크기입니다. </li></ol> 3. MicroCT 처리 : 단일가 .xyz 파일에 .DCM 스택 변환 참고 : 각 microCT 스캔이 .DCM의 스택, 또는 &quot;DICOM&quot;개체를 통해 촬영 한 이미지 조각을 나타내는 파일을 생성합니다. x, y 및 각 화소의 Z 좌표와 -5,000 (검은 색)에서 5000의 범위의 화소의 강도 - 모든 다운 스트림 계산 기하학 네 개의 컬럼을 포함하는 텍스트 파일이 단순히 인 평면 .xyz 인 파일이 필요 (화이트). 3,000 위의 픽셀 임계 값은 일반적으로 뼈를 정의하기위한 임계 값으로 잘 작동합니다. <ol><li> 설치 파이썬 (www.python.org)와 파이썬 모듈 명령, DICOM, PYLAB, SYS, 그리고 NumPy와. </li><li> 열기 &quot;01_process_dicom.py &quot;텍스트 편집기와 {Figshare}. 필요에 따라 변수 섹션, 변경 경로, 픽셀 임계 값 및 디렉토리 이름에서. </li><li> &quot;파이썬 01_process_dicom.py&quot;를 실행합니다. 진행 화면이 출력됩니다. 단계 3.2에 지정된 각 디렉토리 내에서 새 파일의 이름은 만든되며, 예 PT3000 화소 임계치를 나타내는 directory_name.PT3000.xyz는 단계 3.2에 나타내었다. </li></ol> 4. MicroCT 처리 : 분단 아웃 개별 표본을 파일가 .xyz <ol><li> 라이브러리 RGL와 R을 (https://www.r-project.org/)를 설치합니다. </li><li> 텍스트 편집기를 사용하여 파일 &#39;02_segment_dicoms.r&#39;{Figshare}을 엽니 다. 변수 섹션에서 위의 프로토콜 3에서 만든 .xyz 인 파일을 가리 키도록 경로 이름을 변경합니다. </li><li> R 내에서 (따옴표없이) 명령 &quot;소스 ( &#39;02_segment_dicoms.r&#39;)를&quot;실행합니다. </li><li> 프로토콜 3에서 만든 .xyz 인 파일의 세 가지 차원 이미지 후에 나타나면 한 접점을 입력전체가 .xyz 파일에서 표본의 연구. 그런 다음 레이블과 스크롤 및 줌 기능을 사용하여 각 시편의 점을 선택합니다. 참고 : 배경에서 분리가 .xyz 파일은 각각의 시료에 대하여 설명한다. 이들은 PT3000 사용 된 픽셀 임계 값을 나타냅니다 예를 들어, XYZ_FILES_PT3000에 대해,라는 이름의 디렉토리에 나타납니다. </li></ol> &quot;정렬&quot;5. 표본은 일반 좌표로 파일이 .xyz. <ol><li> 추가 모듈 mattdean_modules.py {Figshare}뿐만 아니라이 자립 응용 프로그램을 필요로하는 파이썬 스크립트 &quot;03_transform.py&quot;{Figshare}을 열고 &quot;rotate_translate_cylindrical&quot;(https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) 와 &quot;qconvex&quot;(www.qhull.org/html/qconvex.htm)이 스크립트에 의해 사용되는. </li><li> 변수 섹션에서, rotate_path 및 qconvex_dir을 mattdean_modules.py의 전체 경로 이름을 식별합니다. 또한, 개별 xy를 들어있는 디렉토리의 전체 경로를 확인4 단계에서 만든 Z 파일. </li><li> 접미사 .TRANSFORMED.xyz와 시편마다 새 파일을 만들어 실행 03_transform.py. </li></ol> 파일가 .xyz 6. &quot;슬라이스&quot;정렬 된 표본은 세미 랜드 마크를 확인합니다. <ol><li> 열기와 파이썬 스크립트 &quot;04_identify_landmarks.py&quot;를 실행 {Figshare}. 변수 섹션에서 .TRANSFORMED.xyz 파일이있는 디렉토리에 전체 경로 이름을 식별합니다. 이 스크립트는 구조의 크기 및 형상을 정량화하는데 사용될 수있다 (802) 준 최적를 식별한다. </li></ol>

<ol>
	<li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrics+morphometrics.">Geometrics morphometrics.</a> Annu. Rev. Anthropol. 36, 261-281 (2007).</li><li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern morphometrics in physical anthropology. 6, (2005).</li><li>Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Geometric morphometrics for biologists: a primer. , (2004).</li><li>Rohlf, F. J., Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensions+of+the+Procrustes+method+for+the+optimal+superimposition+of+landmarks.">Extensions of the Procrustes method for the optimal superimposition of landmarks.</a> Syst. Zool. 39 (1), 40-59 (1990).</li><li>Gunz, P., Mitteroecker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semilandmarks:+a+method+for+quantifying+curves+and+surfaces.">Semilandmarks: a method for quantifying curves and surfaces.</a> Hystrix. 24 (1), 103-109 (2013).</li><li>Gunz, P., Ramsier, M., Kuhrig, M., Hublin, J. 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Does Morphometrics Need Biology?.</a> Biological Theory. 4 (1), 84-97 (2009).</li><li>Schultz, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+baculum+size+and+shape+variation+in+mice.">The genetic basis of baculum size and shape variation in mice.</a> G3. 6 (5), 1141-1151 (2016).</li><li>Schultz, N. G., Lough-Stevens, M., Abreu, E., Orr, T. J., Dean, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+baculum+was+gained+and+lost+multiple+times+during+mammalian+evolution.">The baculum was gained and lost multiple times during mammalian evolution.</a> Integr Comp Biol. 56 (4), 644-656 (2016).</li><li>Dines, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+selection+targets+cetacean+pelvic+bones.">Sexual selection targets cetacean pelvic bones.</a> Evolution. 68 (11), 3296-3306 (2014).</li><li>Adams, D. C., Ot&#225;rola-Castillo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=geomorph:+an+R+package+for+the+collection+and+analysis+of+geometric+morphometric+shape+data.">geomorph: an R package for the collection and analysis of geometric morphometric shape data.</a> Methods Ecol. Evol. 4 (4), 393-399 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

위의 프로토콜의 중요한 단계는 1) bacula를 해부하고, 2) microCT 이미지를 수집, 3) XYZ의 플랫 파일에 microCT 출력을 변환, 4) 각 시편의 점 구름을 분할 좌표, 5)에 각각의 시료를 변환 표준화 좌표계, 6) 반 랜드를 형성 할 수있다. 이러한 단계는 용이하게 다른 물체를 수용하도록 수정된다. 이러한 방법은 가능성도 곡선 적어도 본질적으로 &quot;막 대형&quot;, 또는 임의의 객체에 적용 할 수있다. 그 뒤로 그 자체에 곡선 개체 (그림 1G)를 슬라이스하는 객체의 다른 부분에서 포인트를 반환하기 때문에 &quot;U 자형&quot;은 현재, 분석 할 수 없습니다 될 수 있습니다. 이러한 객체는 계산 전에 슬라이스에 개체를 교정하여 미래에 수용 될 수있다. 우리의 부족 모양에서 수학적으로 정의 세미 랜드 마크에 대한 일반적인 방법을 제시올 리드 랜드 마크. 이러한 일반적인 방법은 아주 다른 모양이 고래 골반과 갈비뼈 뼈 (16)의 진화를 연구하기 위해 수정되었습니다. 정의 랜드 마크에 대한 우리의 계산 방법은 XYZ 좌표의 시리즈에 적용해야합니다. 우리는 마우스 bacula (14)의 작은 크기 지정, 여기 microCT 스캔을 사용. 이러한 고래 골반 뼈 리브와 같은 큰 뼈를 들어, 뼈 (16)의 표면을 재구성 레이저 스캐너를 이용. 이 시각에있어서의 품질을 확인하기 위해 세미 - 최적의 모든 세트를 검사하는 것이 중요하다. 우리의 계산 방법의 주요 장점은 정확한 크기를 정량화 변형을 형성하고, 대상물의 특정 영역의 대응 관계를 유지한다는 것이다.

morphometrics의 필드 크기 및 생물 형태의 모양, 과학 탐구 1, 2, 3, 4, 5, 6에 기초하는 단계를 정량화하는 방법의 다양성을 포함한다. 전통적으로, 크기 및 형태의 통계적 분석은 생물학적 최적 구조를 식별하고 다변량 분석 워크 수 직선 거리, 각도 및 비율을 측정함으로써 시작된다. 랜드 마크 기반의 기하학적 Morphometrics 분석 및 시각화 (5)를 통해 데이터 수집에서 기하학적 정보를 보존, 랜드 마크의 공간 위치를 유지 접근 방식이다. 일반화 된 프로크루스테스 분석 (GPA)이 있어요 표본 사이의 정렬을 생산하기 위해 위치, 규모 및 랜드 마크의 회전에 변화를 제거하기 위해 적용 할 수 있습니다자신의 제곱의 차이를 inimizes - 무엇을 유지하는 형상 유사성 (7)이다. 어떤 형태 계측 학적 분석의 중요한 개념은 동성, 또는 하나가 안정적으로 표본 또는 구조 사이에 해당하는 생물학적 의미 및 이산 기능을 대표하는 랜드 마크를 식별 할 수있는 생각이다. 예를 들어, 인간의 두개골 형태 계측 학적 분석을 활성화 할 수 있습니다 상동 프로세스, foramina, 봉합 및 덕트가 있습니다. 불행히도, 대응하는 최적의 식별은 평활 표면 또는 곡선 8, 9, 10, 특히 많은 생물학적 구조 걸쳐 어렵다. 우리는 계산 기하학을 사용하여 아래이 문제를 접근. 일반적인 워크 플로는 모든이야 있도록 그 점 구름을 점 구름으로 표현 될 수있는 물체의 3 차원 스캔을 생성 한 다음 회전 변환하는 것입니다pecimens는 공통 좌표계의 방향. 그 다음 우리는 수학적 개체의 특정 지역에서 세미 랜드 마크를 정의합니다. 같은 지역에 배치 이산 세미 랜드 마크 (11) 생물학적으로 임의의 수 있습니다. 임의로 배치 랜드 마크가 생물학적으로 상동하지 않을 수 있기 때문에 GPA 이후의 통계 분석을 실시하는 것은 바람직하지 않은 유물 8, 12을 생성 할 수 있습니다. 따라서 우리는 이러한 반 랜드 마크가 수학적으로 &quot;슬라이드&quot;에 있습니다. 이 절차는 구조물과의 전위차를 최소화한다. 다른 곳에서 논의 된 바와 같이 여기에 사용되는 알고리즘 슬라이딩 부족 유사한 해부학 적 영역을 정량화하는 것이 적절하다 쉽게 최적 3, 6, 8, 10, 11, 12에 대응하는 식별. 이 방법은 리튬이mitations (13),하지만 서로 다른 크기와 모양의 객체에 적용 할 수 있어야합니다. 여기, 우리가이 방법은 마우스 음경 골 (14)의 최근 연구에 적용된 방법을 설명, 얻고 포유 동물의 진화 15시에 여러 개의 독립적 번 손실 된 음경의 뼈. 우리는 절개 특정 뼈의 제조 상기 음경 골 (프로토콜 1) microCT 이미지의 생성 (프로토콜 2) 모든 다운 스트림 계산 기하학을 가능하게하는 형식으로 이러한 이미지 변환 논의 (프로토콜 3, 4). ~ 100K의 XYZ 좌표에 의해 다음 단계 후, 각 시편 표시됩니다. 우리는 다음을 효과적으로 공통의 방향에 모든 검체 (프로토콜 5) 정렬 변환의 시리즈를 통해 도보로, 다음 정렬 표본 세미 랜드 마크 (프로토콜 6)를 정의합니다. 프로토콜 1-4에 관계없이 객체가 분석되는 유사해야합니다. 프로토콜 5 및 의정서 6 SPE 있습니다cifically 음경 골을 위해 설계,하지만이 단계를 자세히 설명하여 연구자가 관심을 자신의 객체에 대한 중요한 것 수정을 상상할 수있는 우리의 희망입니다. 예를 들면, 이러한 방법의 변형은 고래 골반 뼈와 뼈 리브 (16)를 연구하기 위해 적용 하였다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:287px;">VWR</td>
			<td style="width:79px;">470106-338</td>
			<td style="width:167px;">Most sizes should work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved</td>
			<td style="width:287px;">VWR</td>
			<td style="width:79px;">82027-406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:287px;">VWR</td>
			<td style="width:79px;">87003-294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:287px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:79px;">CAS 64-17-5</td>
			<td>To be diluted to 70% for dissections</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:211px;">Floral Foam</td>
			<td style="width:287px;">Wholesale Floral</td>
			<td style="width:79px;">6002-48-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">uCT50 scanner&#160;</td>
			<td colspan="2">Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection, microct scanning and morphometric analyses of the baculum

현대 morphometrics는 크기와 모양 변화를 정량화하는 강력한 방법을 제공합니다. 기본 요구 사항은 랜드 마크를 정의하는 좌표의 목록입니다; 그러나 이러한 좌표는 표본에서 상동 구조를 표현해야합니다. 많은 생물학적 개체 동성의 가정을 만족시키기 쉽게 식별 최적 구성되어 있지만, 많은 그러한 구조물이 없다. 하나의 잠재적 인 솔루션은 표본에서 동일한 형태 학적 영역을 나타내는 개체에서 발생하는 세미 랜드 마크를 수학적으로하는 것입니다. 여기, 우리는 수학적으로 마우스 음경 골 (음경 뼈) 세미 랜드 마크를 정의하기 위해 최근에 개발 된 파이프 라인을 보여줍니다. 우리의 방법은 개체의 넓은 범위에 적용될 수 있어야한다.

프로토콜 (6)에서 생성 된 세미 랜드 마크의 XYZ 좌표는 직접 랜드 마크 기반의 기하학적 morphometrics 분석 (17)로 가져올 수 있습니다. 연산 파이프 라인은 상기 마우스 bacula (14)뿐만 아니라 고래 골반 뼈와 리브 (16)를 연구하기 위해 적용되었다. 세미 랜드 마크의 계산 정의에 대한 자세한 내용은 연구자들이 관심을 자신의 특정 개체를 수용하기 위해 수정 될 수 있습니다 단계를 시각화하기위한 시도로, 여기에 표시됩니다. 음경 골은 특정 변환을 자동화하는 데 악용 된 몇 가지 독특한 기능이 포함되어 있습니다. 예를 들어, 계산 - 근위 말단부 축을 따라 두 개의 절반으로 뼈를 절단 한 후, 우리는 단순히 총 포인트 수 (근위 더 있음)과 비교하여 근위 절반 식별. 한 이와 같은 독특한 기능이 존재하는 한, 우리의 방법은 어떤에 적용 할 수 있어야목적. 또한, 우리는 실험적 같은 우리 음경 골 연구에서 잘 수행 &quot;10 % 기단&quot;특정 임계 값을 결정 강조하지만 확실히 다른 목적을 위해 재평가되어야한다. 프로토콜 5부터 상기 제 1 연산 단계는 멀리 서로 떨어져있는 두 지점을 식별 볼록 선체 (샘플에서 다른 점을 포함 포인트의 최소 세트)를 계산한다. 이 두 점 (빨간 분야, 그림 1C)는 뼈를 통해 근위 - 원위부 실행하는 새로운 z 축 (빨간색 선, 그림 1C)를 정의하기 시작합니다. 음경 골의 경우에, 포인트를 더 포함하는 점 구름의 절반 기단부로 정의된다. 둘째, 전체 포인트 클라우드는 근위 점은 0,0,0의 Z 좌표와 말단 지점 t,는 x, y를 취하도록 변환+ Z는 뼈의 크기에 따라 약간의 양의 값이다 0,0, + Z의 X, Y, Z 좌표에 AKE를. 이 단계의 마지막에, Z 축 뼈의 길이를 통과한다. 이하 절차는 최대 Z 좌표에 최소의 길이 Zlength이라고한다. 셋째, 위의 확인 근위 및 원위 지점의 정확한 위치, 10 % 가장 근위 가장 먼 지점이 별도로 샘플링 10 %와 관련된 변화를 수정하기 위해 (그림 1D)는, 각각의 무게 중심 식별 (빨간색 분야를, 그림 1E) 상기 포인트 클라우드는 근위 중심은 0,0,0, 그리고 선단 중심이 시료의 중앙을 통과 새로운 Z 축으로 0,0, + Z 이도록 변화 (적색 라인,도 1E) . 넷째, 점군 먼저 SLIC을 고려하여 Z 축 중심으로 회전근위 15 15.25 %의 구조 Zlength (파란색 점, 그림 1E)의 포인트 전자. 점의이 조각은 볼록 선체 촬영 (Z 좌표가 단순히 무시됩니다 즉)은 z 차원에서 평평하고, 최소 경계 사각형 계산 (다른 모든 점을 포함하는 가장 작은 사각형). 이 최소 경계 사각형의 두 짧은면의 중간 점을 연결하는 선을 상상해보십시오. 이 두 중간 점은 -x, 0, + Z 및 + X, 0, + z는 각각, 따라서이 줄 새로운 x 축하게 될 때까지 우리는 점 구름을 돌립니다. 변환 후에는 최대 최소 X 값 사이의 거리 Xlength라고 칭한다. 새 파일이 specimen.TRANSFORMED.xyz에 specimen.xyz에서 생성됩니다. 다섯째, 내 가리키는 z 축으로이 중앙 SL에서 확인 (파란색 점, 그림 1 층), 그리고 가장 말단 가장 한 근위 및 단일 지점을 분리하는 Xlength 1 %각각 얼음과 표시 근위. 이러한 식별 처음 두 준 최적이다. 여섯째, 점 (50)은 균등하게 분할, Z 축 (적색 점,도 1G)에 따라서 샘플링된다. 각 슬라이스는 1 % Zlength의 두께이다. 각 조각은 다음 Z 차원에서 평평하고, 7 수직 라인 (레드 라인, 그림 1H)에 의해 동등하게 분할된다. 각 라인의 2 % Xlength 내 포인트 (빨간 점, 그림 1H)를 유지 한 다음 최대로 포인트를 유지 각각의 라인에 투영, 각각 복부와 지느러미를 표시하는 y 좌표 최소. 또한, 라벨 P15_VENTRAL4이 15 일 조각의 4 번째 수직선에서 샘플링 복부 점이다 예를 들어 슬라이스 번호와 행 번호가 포함되어 있습니다. 중요한 것은, 표시된 모든 지점, 예를 들어, P15_VENTRAL4는 corres을 유지, 모든 시료에서 한 번만 발생pondence. 7 라인 (14 준 최적의 전체)의 각각의 복측과 배측 점 이외에, 최대 및 최소 X 값을 가진 점을 샘플링하고, 각각 LEFT 및 RIGHT를 분류한다. 왼쪽 및 오른쪽의 y 및 z 좌표가 음경 골에 대한 R.에서 lowess 기능을 사용하여 매끄럽게, 16 세미 랜드 마크의 총 (그림 1H를 빨간색 분야)을 조각 당 정의; 50 조각 플러스 근위 위에서 정의 된 말단 세미 랜드 마크와, (802) 세미 랜드 마크 표본 당 (녹색 분야, 그림 1I)를 샘플링. 원래 microCT 스캔의 모든 다른 점은 삭제됩니다. 복부 / 지느러미와 근위 / 원위 극성 수학적 결정되었지만, 모든 시료 정렬 육안으로 확인하고, 필요에 따라 수동으로 조정한다는 것에 유의해야한다. 369 bacula의 샘플에서, 약 10 수동으로 조정해야했습니다. 그림 1 : 전산 워크 플로우 (프로토콜 4-6)의 시각적 표현. (A) 각각의 시편에 고유 한 점 구름의 할당을 보여주는 02_segment_dicoms.r 스크립트 (프로토콜 4)에서 스크린 샷. ~ 100K의 XYZ 점의 구름으로 표시 (B) 한 음경 골의 확대보기. 뼈 (레드 라인)을 통해 근위 - 원위부 실행하는 새로운 z 축을 정의하는 데 사용 멀리 떨어져 서로 (빨간 분야)에서 두 점 (C) 확인. (D)에 가장 근접 10 % 샘플링 포인트 (빨간 점)의 가장 말단의 10 %는 Z 축 정확한 위치에 약간의 편차를 조정하는 수단을 제공한다. (E) 근위 가장 10 %와 말초 - 대부분의 10 % (빨간색 분야)의 무게 중심은 새로운 z 축 (레드 라인)을 정의하는 데 사용됩니다. 그런 다음, 점의 조각 1 사이에 떨어지는이 새로운 z 축 (파란색 점)의 5.00-15.25 %는 최소 경계 사각형을 계산하기 위해 취해진 다. 점 구름은 최소 경계 사각형의 긴 변은 새로운 X 축에 평행 할 때까지 회전된다. F) 중간 선 (파란색 점을 따라 실행 점의 조각) 샘플링 및 근위 가장 원위부 가장 포인트는 세미 랜드 마크로서 정의. G) 포인트 50 균등하게 분할은 하나의 슬라이스를 나타내는 H (빨간색 점),) 샘플링. 16 점 (적색 원)의 각각의 조각의 윤곽을 포착하기 위해 정의된다. 모든 슬라이스에 걸쳐 반복되는 경우 I)이 802 준 최적 (녹색 분야의 합계)의 구조를 정의하는 모든 형태 학적 하류 어플리케이션에서 사용된다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55342/55342fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

많은 생물학적 구조 어려운 현대 형태 계측 학적 방법을 적용 할 수있어 쉽게 정의 최적 부족하다. 여기에서 우리는 크기를 정량화하고 변화를 형성하는 데 사용되는 세미 랜드 마크를 정의하는 계산 방법 다음 해부 및 microCT 스캔을 포함하여 마우스 음경 골 (음경의 뼈), 공부하는 방법을 설명한다.

음경 골의 해부, MicroCT 스캔 및 형태 학적 분석

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K 조회수.  University of Southern California (USC).  많은 생물학적 구조 어려운 현대 형태 계측 학적 방법을 적용 할 수있어 쉽게 정의 최적 부족하다. 여기에서 우리는 크기를 정량화하고 변화를 형성하는 데 사용되는 세미 랜드 마크를 정의하는 계산 방법 다음 해부 및 microCT 스캔을 포함하여 마우스 음경 골 (음경의 뼈), 공부하는 방법을 설명한다. 

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Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

나이프 - 에지 스캐닝 현미경에 대한 표본 준비, 이미징 및 분석 프로토콜

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

연구

생체공학

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

비디오 - 속도 검색 공촛점 현미경과 Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Evaluation of Biomaterials for Bladder Augmentation using Cystometric Analyses in Various Rodent Models

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and expels it with a precisely orchestrated contraction. A number of congenital and acquired urological anomalies including posterior urethral valves, benign prostatic hyperplasia, and neurogenic bladder secondary to spina bifida/spinal cord injury can result in pathologic tissue remodeling leading to impaired compliance and reduced capacity1. Functional or anatomical obstruction of the urinary tract is frequently associated with these conditions, and can lead to urinary incontinence and kidney damage from increased storage and voiding pressures2. Surgical implantation of gastrointestinal segments to expand organ capacity and reduce intravesical pressures represents the primary surgical treatment option for these disorders when medical management fails3. However, this approach is hampered by the limitation of available donor tissue, and is associated with significant complications including chronic urinary tract infection, metabolic perturbation, urinary stone formation, and secondary malignancy4,5.
Current research in bladder tissue engineering is heavily focused on identifying biomaterial configurations which can support regeneration of tissues at defect sites. Conventional 3-D scaffolds derived from natural and synthetic polymers such as small intestinal submucosa and poly-glycolic acid have shown some short-term success in supporting urothelial and smooth muscle regeneration as well as facilitating increased organ storage capacity in both animal models and in the clinic6,7. However, deficiencies in scaffold mechanical integrity and biocompatibility often result in deleterious fibrosis8, graft contracture9, and calcification10, thus increasing the risk of implant failure and need for secondary surgical procedures. In addition, restoration of normal voiding characteristics utilizing standard biomaterial constructs for augmentation cystoplasty has yet to be achieved, and therefore research and development of novel matrices which can fulfill this role is needed.
In order to successfully develop and evaluate optimal biomaterials for clinical bladder augmentation, efficacy research must first be performed in standardized animal models using detailed surgical methods and functional outcome assessments. We have previously reported the use of a bladder augmentation model in mice to determine the potential of silk fibroin-based scaffolds to mediate tissue regeneration and functional voiding characteristics.11,12 Cystometric analyses of this model have shown that variations in structural and mechanical implant properties can influence the resulting urodynamic features of the tissue engineered bladders11,12. Positive correlations between the degree of matrix-mediated tissue regeneration determined histologically and functional compliance and capacity evaluated by cystometry were demonstrated in this model11,12. These results therefore suggest that functional evaluations of biomaterial configurations in rodent bladder augmentation systems may be a useful format for assessing scaffold properties and establishing in vivo feasibility prior to large animal studies and clinical deployment. In the current study, we will present various surgical stages of bladder augmentation in both mice and rats using silk scaffolds and demonstrate techniques for awake and anesthetized cystometry.

Surgical stages of bladder augmentation are described using 3-D scaffolds in murine and rat models. To test the efficacy of biomaterial configurations for use in bladder augmentation, techniques for both awake and anesthetized cystometry are presented.

각종 설치류 모델에 Cystometric 분석을 사용하여 방광 증원을위한 Biomaterials 평가

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and ...

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific molecular mechanisms are identified, new therapeutic strategies can be developed to treat abnormalities in specific behaviors caused by degenerative diseases or aging of the nervous system. The marine snail Aplysia californica is well suited for the investigations of cellular and molecular basis of behavior because neural circuitry underlying a specific behavior could be easily determined and the individual components of the circuitry could be easily manipulated. These advantages of Aplysia have led to several fundamental discoveries of neurobiology of learning and memory. Here we describe a preparation of the Aplysia nervous system for the electrophysiological and molecular analyses of individual neurons. Briefly, ganglion dissected from the nervous system is exposed to protease to remove the ganglion sheath such that neurons are exposed but retain neuronal activity as in the intact animal. This preparation is used to carry out electrophysiological measurements of single or multiple neurons. Importantly, following the recording using a simple methodology, the neurons could be isolated directly from the ganglia for gene expression analysis. These protocols were used to carry out simultaneous electrophysiological recordings from L7 and R15 neurons, study their response to acetylcholine and quantitating expression of CREB1 gene in isolated single L7, L11, R15, and R2 neurons of Aplysia.

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Marine snail Aplysia californica has been widely used as a neurobiology model for the studies on cellular and molecular basis of behavior. Here a methodology is described for exploring the nervous system of Aplysia for the electrophysiological and molecular analyses of single neurons of identified neural circuitry.

아피시아 단일 뉴런의 전기 생리 및 분자 분석을 위한 신경리아 준비

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of nanometer-scale features. Historically, a major drawback of scanning probe lithography has been the intrinsically low throughput of single probe systems. This has been tackled by the use of arrays of multiple probes to enable increased nanolithography throughput. In order to implement such parallelized nanolithography, the accurate alignment of probe arrays with the substrate surface is vital, so that all probes make contact with the surface simultaneously when lithographic patterning begins. This protocol describes the utilization of polymer pen lithography to produce nanometer-scale features over centimeter-sized areas, facilitated by the use of an algorithm for the rapid, accurate, and automated alignment of probe arrays. Here, nanolithography of thiols on gold substrates demonstrates the generation of features with high uniformity. These patterns are then functionalized with fibronectin for use in the context of surface-directed cell morphology studies.

Here we present a protocol for wide-area scanning probe nanolithography enabled by the iterative alignment of probe arrays, as well as the utilization of lithographic patterns for cell-surface interaction studies.

큰 지역 스캐닝 프로브 나노리 자동된 맞춤 및 셀 문화 연구에 대 한 기판 제작에의 응용에 의해 촉진

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. Unfortunately, many researchers spend large amounts of time and resources developing and optimizing workflows that are only relevant to their own experiments. In this article, we describe a protocol that can be used by those with access to a widefield high-content analysis system (WHCAS) to image any slide-mounted tissue, with options for customization within pre-built modules found in the associated software. Not originally intended for slide scanning, the steps detailed in this article make it possible to acquire slide scanning images in the WHCAS which can be imported into the associated software. In this example, the automated segmentation of brain tumor slides is demonstrated, but the automated segmentation of any fluorescently-labeled nuclear or cytoplasmic marker is possible. Furthermore, there are a variety of other quantitative software modules including assays for protein localization/translocation, cellular proliferation/viability/apoptosis, and angiogenesis that can be run. This technique will save researchers time and effort and create an automated protocol for slide analysis.

Here we describe a protocol for the automated segmentation of fluorescently labeled tissues on slides using a widefield high-content analysis system (WHCAS). This protocol has wide-ranging applications in any field which involves the quantitation of fluorescent markers in biological tissues including the biological sciences, medical engineering, and health sciences.

자동된 슬라이드 스캔 및 Widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템을 사용 하 여 붙일 표시 된 조직에서 시장 세분화

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big challenge with the state-of-the-art retinal imaging modalities because they would require z-stacking to compile a volumetric dataset. Newer optical coherence tomography (OCT) and OCT angiography (OCTA) systems overcome these restrictions to provide three-dimensional (3D) anatomical and vascular images, but the dye-free nature of OCT cannot visualize leakage indicative of vascular dysfunction. This protocol describes a novel oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO) technique that provides 3D volumetric fluorescence retinal imaging. The setup of the imaging system generates the oblique scanning by a dove tail slider and aligns the final imaging system at an angle to detect fluorescent cross-sectional images. The system uses the laser scanning method, and therefore, allows an easy incorporation of OCT as a complementary volumetric structural imaging modality. In vivo imaging on rat retina is demonstrated here. Fluorescein solution is intravenously injected to produce volumetric fluorescein angiography (vFA).

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy oSLO and Optical Coherence Tomography OCT

Here, we present a protocol to get a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence and OCT retinal image by using a novel imaging multimodal platform. We will introduce the system setup, the method of alignment, and the operational protocols. In vivo imaging will be demonstrated, and representative results will be provided.

복합 체적 망막 이미징 오블리크 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy (오슬로) 및 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...

Morphometric Protocol for the Objective Assessment of Blastocyst Behavior During Vitrification and Warming Steps

This article describes the noninvasive method of blastocyst morphometry based on time-lapse microphotography for the accurate monitoring of a blastocyst&#39;s volume changing during individual phases before and after vitrification. The method can be useful in searching for the most optimal timing of blastocyst exposure to different concentrations of cryoprotectants by observing blastocyst shrinkage and re-expansion in different pre- and post-vitrification phases. With this methodology, the blastocyst vitrification protocol can be optimized. For a better demonstration of the usefulness of this morphometric method, two different blastocyst preparation protocols for vitrification are compared; one with using an artificial blastocoel collapsing and one without this intervention before vitrification. Both blastocysts&#39; volume changes are followed by time-lapse microphotography and measured by photo-editing software tools. The measurements are taken every 20 seconds in previtrification phases and every 5 minutes in the post-warming period. The changes of the blastocyst dimensions per time unit are presented graphically in line diagrams. The results show a long equilibration previtrification phase in which the intact blastocyst first shrinks and then slowly refills the blastocoel, entering vitrification with a fluid-filled blastocoel. The artificially collapsed blastocyst remains in its shrunken stage through the entire equilibration phase. During the vitrification phase, it also does not change its volume. Since the blastocyst morphometry shows a constant volume of the artificially collapsed blastocysts during the previtrification step, it seems that this stage could be shorter. The described protocol provides many additional comparative parameters of blastocyst behavior during and after cryopreservation on the basis of the speed and intensity of the volume changes, the number of partial blastocoel contractions or total blastocyst collapses, and the time to a total blastocoel re-expansion or the time to hatching.

Here we present a time-lapse morphometric protocol to follow the intensity of blastocyst shrinkage and re-expansion during previtrification interventions and post-warming recovery. The application of the protocol is possible in in vitro fertilization laboratories equipped with time-lapse microscopes and is recommended in the development of an optimal blastocyst vitrification method.

Vitrification 온난 단계 동안 Blastocyst 행동의 객관적인 평가 대 한 형태학 프로토콜

This article describes the noninvasive method of blastocyst morphometry based on time-lapse microphotography for the accurate monitoring of a ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

잎 반사 및 엽록소 형광 분석의 동시 측정을 통해 광합성 거동 평가

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

생체 외에서 인간 호중구 떼의 화학 및 분자 분석을 위한 생체 입자 미세어레이

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...