이 작품은 FL에 미국 심장 협회 (American Heart Association) 원정대 상 (16POST29950007), 건강 (NIH T32 HL069765) BLD, MA 살레에 미국 심장 협회 (American Heart Association) 원정대 상 (14POST20420025) 중 국립 연구소에서 훈련 보조금 및 NIH에 의해 지원되었다 K08 상 MSM에 (HL121671). MSM은 길르앗 과학, Inc.의 연구 보조금에 의해 지원됩니다

밴더빌트 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회는 여기에 설명 된 절차를 승인했다. 마우스는 보관 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 마음에 든다고된다 (국립 아카데미를 누릅니다. 개정 2010). 쥐의 대동맥 배수 림프절, 신장 및 대동맥 1. 분리 <ol><li> CO 2 흡입하여 쥐를 안락사. 70 % 에탄올로 가슴 스프레이 조심스럽게 피부와 마음을 노출 가위로 가슴 벽을 엽니 다. </li><li> 혈관을 관류하기 우심방에 작은 절개를 수행하고 꾸준히 21 23 G 바늘을 사용하여 좌심실의 정점에 차가운 PBS (약 1 ㎖ / 초)의 적어도 10 ㎖를 주입. 모든 기관이 희게 될 때까지 관류. 핵심은 첫째 blanches. 간의 창백하면 관류 잘 수행되었음을 나타냅니다. </li><li> 작은 집게와 미세 가위를 사용하여, 부드럽게, 절단 및 창자를 꺼내위장, 비장, 췌장과 간 더 나은 대동맥을 시각화합니다. 참고 :이 단계는 오염을 유도 할 수 위장관 손상으로 매우 정확하게 수행해야합니다. </li><li> 잘라 가위 각각의 폐를 제거합니다. 무 바늘 주사기를 사용하여 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)와 흉강을 씻어. 멸균 거즈를 사용하여 여분의 혈액과 액체를 제거합니다. </li><li> 미세 해부 집게를 사용하여 복부 대동맥 림프절을 제거합니다. 캡슐을 파열하지 않도록합니다. 해부 포셉 각 림프절의 표면에 남아있는 지방을 제거합니다. 미세 가위로 두 개의 신장을 잘라. </li><li> 잘, 곡선 가위로 전체 대동맥 (흉부 및 복부 대동맥)을 해부하다. 마음의 수준에서 시작하고 조심스럽게 식도 및 대동맥에 부착 된 주변 혈관 주위 지방을 유지해야하고 장골 분기의 수준에 이르기까지 척추의 해부. 참고 : 대동맥의 추가 절개는 레모하기주변 구조 현미경 하에서 수행 될 수했습니다. 특히, 동맥 분기 (경동맥, 쇄골 하 동맥, 복강, 장간막, 신장 동맥)과 림프절을 제거합니다. 이 많은 염증 세포가 고혈압의 설정에있는 사이트이기 때문에 각 대동맥 주위 혈관 주위 지방의 일관된 층을 유지 마십시오. 차가운 PBS를 포함하는 별도의 튜브에서 각 조직을 놓습니다. </li></ol> 각 조직에서 단일 세포 현탁액의 2 세대 <ol><li> 신장 주 : 신장 기계적 해리 플러스 소화 효소를 결합하여 단일 세포 현탁액 내로 해리 될 수있다. <ol><li> (5 % 소 태아 혈청 (FBS) 보충) 1640 배지 (2 ㎎ / ㎖) 콜라게나 D를 첨가의 DNase I (100 μg의 / ㎖) RPMI에 의해 신장 분해 용액을 제조 하였다. 신장 샘플 당 10 ml의를 준비합니다. </li><li> 신장 다이제스트 10㎖를 함유하는 분리 튜브에 두 신장 전송 집게를 사용하여이온 용액. </li><li> 제조자의 지시에 따른 반자동 dissociator 장치를 이용하여 기계적 분리를 수행한다. </li><li> 기계적 해리 후에 장치로부터 튜브를 분리하여 효소 소화를 수행한다. 연속 회전에서 37 ºC에서 20 분 동안 샘플을 품어. 즉시 5 % FBS로 보충 차가운 RPMI 1640 배지를 첨가하여 효소 소화를 멈춘다. </li><li> 40 μm의 여과기를 통해 여과 한 후 50 ML 원뿔 튜브에 피펫으로 솔루션을 전송합니다. 1 ML의 주사기의 플런저로 눌러 떨어져 나머지 조직을 애타게. 세포 (500 XG, 8 분, 4 ºC)를 펠렛. </li><li> 36 %의 밀도 구배 원심 분리 배지 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 15 ML 원뿔 관에 정지를 전송합니다. 조심스럽게 중단없이 3 ml의 36 % 세포 현탁액을 72 % 아래 밀도 구배 원심 분리 배지 3 ㎖을 추가한다. 원심 분리기 (브레이크없이 1,000 XG, 20 분, 4 ° C). &lt;/ 리&gt; <li> 면역 세포는 인터페이스에 위치한다. 세포 파편을 포함하는 최상위 황색 층을 제거하고 차가운 PBS를 사용하여 15 ml의 볼륨을 불러옵니다. 고장 잘 구배를 흔들어. 셀 (300 XG, 8 분, 39 ° C)를 스핀 5 % FBS와 RPMI 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 트립 판 블루 배타를 이용하여 혈구의 생균 수를 계산. </li></ol></li><li> 대동맥 <ol><li> 콜라게나 제 A (1 ㎎ / ㎖), 콜라게나 제 B (1 mg / ㎖)을 첨가하여 대동맥 소화 용액을 조제하고,의 DNase I (100 μg의 / ㎖) RPMI로 (5 % FBS로 보충) 1640. </li><li> 미세 핀셋을 이용하여 대동맥 소화 용액 1 ㎖를 함유하는 2 ml의 튜브로 대동맥을 전송. 1 ml의 소화 용액 미세 가위로 아주 작은 조각으로 전체 대동맥을 말하다. 얼음에 보관하십시오. 연속 회전에서 37 ° C에서 30 분 동안 샘플을 품어. </li><li> 조직 배양 접시에 용액을 옮기고 enzyma 정지5 % FBS와 차가운 RPMI의 5 배 부피를 첨가하여 TIC 소화. </li><li> 40 μm의 여과기를 통해 여과 한 후 50 ML 원뿔 튜브에 피펫으로 솔루션을 전송합니다. 1 mL의 주사기 플런저로 눌러 단일 세포 현탁액으로 이격 나머지 조직 애타게. 여과기를 세척하고 세포 (300 XG, 8 분, 4 ºC)를 펠렛. </li><li> 5 % FBS RPMI에 10 ㎖를 첨가하여 침전물을 세척 하였다. 셀 (300 XG, 8 분, 39 ° C)를 스핀 5 % FBS와 RPMI 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 트립 판 블루 배타를 이용하여 혈구의 생균 수를 계산. </li></ol></li><li> 대동맥 림프절 <ol><li> 조직 배양 접시 (60mm X 15mm)에 40 μm의 여과기를 놓습니다. 스트레이너의 림프절을 놓고 1 ML의 주사기의 플런저로 눌러 단일 세포 현탁액에 떨어져 그들을 애타게. 5 % FBS와 RPMI 2 ㎖와 스트레이너를 플래시합니다. 접시에 세포를 수집합니다. </li><li> 이전15 ㎖의 팔콘 튜브에 세포 펠렛 세포 (300 XG, 8 분, 4 ° C). 5 % FBS와 RPMI 500 μL에 펠렛을 재현 탁. 트립 판 블루 배타를 이용하여 혈구의 생균 수를 계산. </li></ol></li></ol> 유동 세포 계측법에 의한 사이토 카인 탐지 3. 예 생체 자극 <ol><li> 5 % FBS, 비 필수 아미노산는 0.1mm, 50 μM의 β 머 캅토 에탄올 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 RPMI : 세포 배양액을 준비한다. </li><li> 원심 분리기 신장, 대동맥 림프절에서 얻은 각각의 세포 현탁액 (300 XG, 8 분, 4 ° C). 용액에 1 × 106 세포의 농도로 세포 배양 배지와 각 펠렛을 재현 탁. </li><li> 세포 배양의 각 1 ml를 위해 (포르 볼 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA), 칼슘 이온 운반체에 이오 노마 이신을 함유하고, 골지체 억제제 Brefeldin A) 세포 활성화 칵테일 2 μl를 첨가하여 세포를 자극한다. 참고 : 최종 농도PMA의 81 nm의, PMA와 Brefeldin A. 치료 이오 노마 이신의 1.33 μM, 5 ㎍ / ㎖의 이오 노마 이신은 사이토 카인을 생산하는 세포를 활성화 : 각 구성 요소들입니다. 사이토킨 검출 할 수있는 세포에 포획해야 단백질이 분비된다. Brefeldin A는 소포체와 골지체 장치에서 정상적으로 분비되는 단백질의 축적을 야기한다. 따라서, 여기에 설명 된 기술은 유동 세포 계측법에 의한 사이토 카인의 생산 림프구의 검출 가능성을 향상시킨다. </li><li> 12 잘 2 백만 세포 (대동맥 또는 신장) 또는 24 웰 (림프절) 낮은 부착 판에 판 1. 3 시간 동안 37 ° C 가습 CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다. 주 : 도금 된 세포의 수는 대조군 마우스로부터의 림프절에서 낮아질 수있다. 또한, 자극 시간은 경험적 연구 각 세포 집단 및 사이토킨에 대해 결정되어야한다. 대동맥, 신장, 림프절로부터 분리 된 T 세포의 경우는 3 내지 4 시간 동안 자극하는 것을 권장합니다. 더 긴 자극 w병 사이토 카인 분비를 증가시키고, CD3, CD4 및 CD8과 같은 여러 가지 T 세포 표면 마커의 추가의 하향 조절을 유도하지 않습니다. (심지어 3 ~ 4 시간 자극이 마커의 일부 하향 조절을 유도 않습니다.) </li></ol> 4. 표면 얼룩 <ol><li> 폴리스티렌 FACS 튜브와 원심 분리기 (300 XG에, 8 분, 4 ° C)에 세포를 전송합니다. (FACS 완충액으로 두번 (칼슘 및 마그네슘 +없는 PBS 4 % FBS 및 2mM의 EDTA를 함유) 세포를 세척하고, 원하는 항체 패널의 개수 및 필요한 제어 튜브의 수에 따라 서로 다른 FACS 튜브에 동등 세포 현탁액을 나누어 아래 참조). </li><li> 각 패널에 대한 보상을 수행하려면 각 조직 유형 및 항체 패널 흠 제어 튜브와 하나의 스테인드 튜브를 준비합니다. 또한, 모든 그러나 하나의 항체를 첨가하여 각각의 항체 패널 용 형광 마이너스 온 (FMO) 제어 튜브를 준비한다. </li><li> FACS 2 ml의 각 튜브의 볼륨을 조절완충기. 원심 분리기는 세포 현탁액 (300 XG, 8 분, 4 ° C), 얼음에 10 분 동안 만 셀 당 항 CD16 / CD32 항체 0.5 μg의와 세포를 배양하여 상층 액과 블록 된 Fc 수용체를 제거합니다. 참고 : CD16는 선호도가 낮은 IgG의 Fc 수용체 III FCR (III)이며, CD32는 FcRγ 쇄 II입니다. CD16 / CD32는 과립구, 비만 세포, 단핵구 / 대 식세포, 자연 살해 세포, B 세포, 수지상 세포 및 일부 활성화 성숙한 T 세포 상에 발현된다. </li><li> 생존 염색을 수행 1X PBS의 1,000 μL에 1X PBS, 원심 분리기 (300 XG에, 8 분, 4 ° C) 및에 resuspend로 세포를 씻으십시오. 셀 - impermeant 아민 반응성 염료 (생존 얼룩) 1 μl를 추가합니다. 빛으로부터 보호 4 ° C에서 15 분 동안 품어. </li><li> 배양하는 동안, FACS 버퍼의 적절한 볼륨 (표면 염색) 항체의 칵테일을 준비합니다. FACS 버퍼의 1-2 ㎖로 두 번 세포를 씻으, 원심 분리기 (300 XG에, 8 분, 4 ° C) 100 ㎕를 각 펠렛을 재현 탁항체 혼합물. 빛으로부터 보호 4 ° C에서 30 분 동안 품어. 주 : 각 항체 유동 세포 계측법,이 도즈 적정 곡선을 수행함으로써 필요한 항체의 최적 량을 결정하는데 유용하다. </li><li> 세포 (300 XG, 8 분, 4 ° C)를 FACS 버퍼 2 ㎖로 두 번 세포를 씻어 펠렛. </li></ol> 5. 고정, Permeabilization 및 세포 내 염색 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 적절한 버퍼를 포함하는 고정 및 permeabilization 키트와 함께 세포 염색을 수행합니다. 수정 및 적절한 버퍼에이를 재현 탁하여 세포 Permeabilize 하시려면. 빛으로부터 보호 4 ° C에서 40 분 동안 샘플을 품어. </li><li> 1 배의 permeabilization 1 ㎖를 추가하고 고정 투과성이 세포에 직접 버퍼 씻는다. 원심 분리기 (500 XG, 8 분, 4 ° C)과 뜨는을 제거합니다. 1X 세척 버퍼의 2 ㎖로 펠렛을 재현 탁. </li><li> antib의 혼합물을 준비1X 세척 버퍼 (튜브 당 보통 100 μL)의 적절한 볼륨 (세포 내 염색만을위한) odies. 주의 : 전술 한 바와 같이, 최적의 항체 농도는 패널의 각 항체에 대해 결정해야한다. 예를 들어, IL-17A 또는 IL-17F에 대한 항체, 우리 1:30의 희석 배수를 사용하지만, IFNγ와 T-내기에 대한 항체, 우리는 하나의 희석 배수 사용 : 100. </li><li> 원심 분리기 세포 (500 XG, 8 분, 4 ° C) 및 항체 혼합물 100 ㎕ 각 펠렛을 재현 탁. 빛으로부터 보호 4 ° C에서 40 분 동안 품어. </li><li> 세포 (500 XG, 8 분, 4 ° C)를 1 배 세척 버퍼 2 ㎖로 두 번 세포를 씻어 펠렛. 1X 세척 완충액 300 μL에 펠렛을 재현 탁하고 적절한 필터를 유세포 분석. </li><li> 조직 샘플 당 세포의 총 수 정량을 위해 카운트 비드를 사용한다. 인수 이전에, 각각의 튜브에 구슬을 계산의 권장 볼륨 / 번호를 추가 할 수 있습니다. </li></ol> 6. 보상, 게이팅, 정규화, 및 팁 <ol><li> 보상 및 게이팅 <ol><li> 보상을위한 실행 흠 단일 스테인드 제어 튜브 스펙트럼 중복에 대한 조정합니다. 주 : 보상 비드보다는 세포 보상 제어의 사용은 샘플에 대한 관심 또는 세포 집단의 항원 그 보상 어렵다 세포를 사용하여 낮은 수준으로 존재하는 경우에 필요하다. 탠덤 염료를 사용하는 경우 또한 노트의, 탠덤 염료가 많이-많은-과 매일 함께 다양하기 때문에 각 실험에 대한 보상을 준비하는 것이 좋습니다. </li><li> 새로운 여러 가지 빛깔의 실험을 시작할 때 형광을 뺀 패널의 모든 형광 하나의 컨트롤 (FMOs)를 실행합니다. 참고 : FMO 컨트롤 하나를 제외한 패널의 모든 항체를 포함하는 샘플입니다. 이러한 컨트롤에 제대로 adjus 생략 된 항체에 대한 부정적인 신호 대 양의 정확한 차별을 허용게이트에서 t. 이러한 제어는 발현이 표적 집단의 분리가 불량 할 때 또는 (예를 들면, 대상이 사이토 카인 또는 전사 인자이다) 낮을 때 특히 중요하다. 그들은 항원 특이성이없는 항체 이소 타입 및 형광 복합체에 대한 적절한 보상을 제공하기 때문에 FMO 컨트롤 항상 필요하지 않지만, 어떤 경우에는, 아이소 타입 컨트롤 곳에서 바람직 할 수있다. </li><li> 기본 게이트를 설정 : 백혈구 인구를 검출하기 위해 앞으로 분산 형 지역 (FSC-A) 및 사이드 분산 형 지역 (SSC-A) 전압을 조정합니다. </li><li> 죽은 세포를 제외합니다. 참고 : 생존의 얼룩은 표면과 세포의 내부 모두에 존재하는 무료 아민과 반응. 세포를 살아 달리 (손상된 멤브레인) 사균 단백질 표지의 양을 증가 염료 세포질에 입력 할 수있다. 따라서, 죽은 세포는 쉽게 차별을 허용하는 살아있는 세포보다 밝은 것입니다. 라이브에 게이트세포. 주 : 대동맥 및 신장에서 세포 현탁액의 생존 인해 추가 소화 단계 림프절로부터 세포 현탁액의 생존율보다 낮을 수있다. </li><li> 플롯 앞으로 분산 형 지역 (FSC-A) [y 축] 및 전달 살포 높이 (FSC-H) x 축]. 단봉이 점 플롯에 대각선으로 나타납니다. 이 대각선에 게이트 이중선을 제외합니다. 이어서 SSC-A [Y 축] 및 CD45 [X 축] 플롯. </li><li> 백혈구 CD45 + 집단은 쉽게 식별 될 수있다. 이 인구에 문입니다. 후속 집단은이 집단으로부터 식별 될 수있다. </li></ol></li><li> 세포 수의 정규화 <ol><li> 계산 구슬 낮은 FSC 높은 SSC 발생 특성을 가지고있다. 50,000 비드 단일 세포 현탁액 300 ㎕를 첨가하는 경우에 다음과 같이 튜브는 당, 예를 들어, 어느 하나의 절대 수의 계산을위한 방정식은 세포 유형을 제공 : 세포의 수 페이지어 관 = (흐름 cytometer에 의해 계산 구슬 50,000 / 수) 계산 세포의 X 번호. 이 계산을 이용하여, 튜브 당 특정 세포 유형의 절대 값이 결정될 수있다. 각 장기로부터 발생 얼마나 많은 튜브 기준 장기 당 세포의 수를 산출 할 수있다. 참고 : 프로토콜 동안 4 ° C에서 모든 세포 및 시약 보관하십시오. 이 세포를 손상시킬 수 있기 때문에 활발한 텍싱을 피하십시오. 세포 펠렛 최소한의 힘을 사용합니다. 이 세포 사멸을 침전 수 있으므로 FACS 튜브에 거품을 피한다. 펠릿 언제든지 건조하게하지 마십시오. </li></ol></li></ol>

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The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue9. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similarly, an incomplete digestion can affect the results leading to a lower number of positive cells. Furthermore, the time of ex vivo stimulation needs to be carefully adjusted for each cell type/cytokine to allow for optimal stimulation with minimal cell toxicity. 
Although intracellular staining coupled with flow cytometry analysis is one of the most powerful methods to analyze immune processes at a cellular level in blood and tissues, this technique has its limitations. These limitations include the relatively low number of immune cells in cardiovascular and renal tissues. Thus, depending on the cell type examined, it may be necessary to pool organs from several mice to obtain one sample. Furthermore, the instability of markers is another limitation as the expression of markers can be affected by several steps during the process. For this reason, it is advisable to perform histology in parallel to confirm the results obtained by flow cytometry. There are also special considerations regarding the use of the flow cytometer and the interpretation of the results. The flow cytometer is a sophisticated instrument and requires highly trained operators. Importantly, despite the use of compensation controls, there is still an issue of spectral overlap that limits experiments to 8-12 markers (usually 8) per sample. 
Moreover, this technique is very sensitive and subject to several experimental manipulations which can lead to slight day-to-day variation in the quantification of results. Thus, if performing this technique across multiple days for a given study, it is important to include control and experimental groups each day to determine relative changes. Finally, another limitation/source of variation is the choice of the markers used to identify a population10. Each study tends to use different combinations of markers and fluorochromes to define a population, which can lead to slight differences in quantification.
Despite these limitations, this is a powerful experimental technique that allows the identification and quantification of T cell subsets in solid organs. In fact, while other techniques measure either the expression of surface markers, cytokines or transcription factors separately, this method permits the measurement of several markers simultaneously at the single cell level. Furthermore, once the cells are identified, several other parameters can then be determined11,12,13,14. For example, one can evaluate for markers of apoptosis, protein phosphorylation or the proliferation of a specific T cell subset15. In addition, there are newer proprietary methods to detect mRNAs in cells using flow cytometry16,17.
In conclusion, we have outlined a detailed and reproducible protocol to identify T cell subsets using surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. This protocol can be applied to other tissues (with slight modification) and to other models of disease.

최근의 증거는 적응성 면역계, 특히 T 림프구가 여러 1,2,3,4,5 심혈관 질환의 발달에서 중요한 역할을한다는 것을 보여준다. 예를 들어, 안지오텐신 II 고혈압의 모델에서는, 용기 및 마우스의 신장에서 T 세포의 축적이 6을 설명 하였다. 혈관 축적은 외막과 혈관 주위 지방에 주로있다. 신장에서, T 세포는 골수 및 신장 피질 모두에서 축적된다. 관련되는 서브 세트에 따라 이러한 T 세포는 혈관 및 신장 기능에 영향을 병리 현상을 초래할 수있는 다른 사이토킨을 야기 (맥 매스터 등. (6)에 의해 검토). CD4 + T 헬퍼 림프구 여러 서브 세트들로 분할 될 수있다 : 그 기능 및 서명 사이토에 기초하여 T 헬퍼 1 (받은 Th1), TH2, TH9, Th17, Th22, T 조절 (TREG) 세포 및 T 모낭 헬퍼 (TFH) 세포kines 7. 마찬가지로, CD8 + 세포 독성 T 세포는 T에서, TC2, TC9 Tc17 또는 8로 분류 될 수있다. 합니다 (CD4 또는 CD8 T 세포 마커를 발현하지 않는, 즉 세포) 더블 부정적인 T 세포도 있습니다. 이들 세포의 서브 세트는 다른 감마 델타 T 세포 수용체 (대신 고전 알파 및 베타 수용체)를 갖고, 따라서 감마 델타 T 세포라고 칭한다. 표면 마커, 사이토 카인 및 전사 인자의 유동 세포 계측법에 의한 다 변수 분석은 이들 세포를 식별하기 위해 가장 좋은 방법을 구성한다. 이 방법은 광범위 면역학 분야에서 사용되지만, 그것은 덜 단단한 장기 및 심혈 관계 질환의 설정에 대하여 설명한다. 역사적으로, 조직에 임파구의 식별은 면역 또는 RT-PCR에 방법에 한정되었다. 면역 조직 화학 및 면역 형광은 INT의 항원의 조직 분포를 결정하는 강력한 방법이 있지만erest, 그들은 표현형과 관련된 부분 집합을 식별하는 데 불충분하다. RT-PCR 분석은 항원, 사이토 카인 또는 전사 인자의 mRNA의 발현을 검출하는 데 유용하면서 또한, 그것은 동시에 각각의 세포의 레벨에 여러 단백질의 검출을 허용하지 않는다. 사이토 카인 및 전사 인자를 검출하는 세포 염색 결합 특히 유동 세포의 출현은, 고형 장기 면역 세포 서브 세트의 단일 세포 수준에서의 식별 및 정량화 할 수있는 강력한 방법으로 연구자를 제공한다. 우리는 안지오텐신 II 유발 고혈압 모델 쥐의 신장, 대동맥 및 대동맥 림프절 내에 존재하는 주요 T 세포 하위 집합 유동 세포 계측법에 의해 식별하는 세포 내 염색 분석을 최적화했다. 높은 다시 A의 조직 소화, 생체 활성화, permeabilization, 표면 및 세포 내 염색 결과 : 각 단계의 최적화심혈관 및 신장 질환 모델에 적용 할 수있는 제조 가능한 분석.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1074">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:257px;">ROCHE</td>
			<td style="width:177px;">11088882001</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase A</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td>10103586001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase B</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td>11088815001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnase</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Red blood cell lysis buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI Medium 1614 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5445-02</td>
			<td>For density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS &#8482; C tube&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMACS dissociator device</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Use the program SPLEEN_04</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell activation cocktail (with Brefeldin A)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD16/32</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0161-81</td>
			<td>dilute 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transcription factor buffer set</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>562725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OneComp eBeads&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-1111-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">123 count eBeads</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45 AmCyan (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>506910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL-17F APC (clone 9D3.1C8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>517004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD8 APC (clone 53-67)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0081-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-bet PE-Cy7 (clone 4B10)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>644823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IFN&#947; FITC (clone XMG1.2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557724</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracellular staining and flow cytometry to identify lymphocyte subsets within murine aorta, kidney and lymph nodes in a model of hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

이 프로토콜은 허용에게 안지오텐신 II 유발 고혈압 모델 쥐의 신장, 대동맥 및 대동맥 림프절에서 분리 된 T 세포 표면과 세포 마커의 식별을 설명했다. 대표 결과는 다음과 같다. 도 1은 고혈압을 유도하는 안지오텐신 II로 넘치는 WT 마우스의 대동맥으로부터 제조 한 세포 현탁액 중의 T 세포 집단을 식별하는 데 사용되는 게이팅 전략을 보여준다. 유사한 전략은 신장, 림프절에 사용됩니다. 순방향 분산 영역 (FSC-A) 및 측면 스 캐터 지역 (SSC-A)의 전압은 백혈구 집단 (G1)를 검출하고, 이물질을 제외하도록 조정 하였다. 라이브 세포 (G2)는 태평양 파란색과 결합 된 생존 마커 음. 라이브 세포를 만에 게이트에 전달 살포 높이 (FSC-H) 및 전달 살포 지역 (FSC-A)에 문이 있었다단일 인구 (G3). 백혈구는 다음 SSC-A 및 CD45 (G4)에 게이팅에 의해 선정되었다. CD45는이 예에서 AmCyan와 결합된다. 마지막으로, T 세포는 CD45 + CD3 + 인구 (G5)으로 문이 있습니다. CD3이 예에서는를 PerCP-Cy5.5와 결합된다. IL-17A 및이 모델 쥐 신장 동맥 내 T 세포를 생산하는 IL-17F의 존재를 결정하기 위해, 단일 세포 현탁액은 IL-17A 및 IL-17F에 대해 염색 하였다. 그림 2는 형광 마이너스 IL-17A와 신장 샘플에서 IL-17F 염색에 대해 하나의 컨트롤 (FMOs) (각각 FITC와 APC와 결합)을 보여줍니다. FMO 컨트롤은 하나를 제외하고 패널의 모든 항체를 포함하는 샘플입니다. 예상대로, 거의 세포는 FMO 컨트롤에서 IL-17A (그림 2A) 또는 IL-17F (그림 2B)에 긍정적이다. 제대로 ADJ에 이러한 컨트롤은 긍정적 대 부정적인 신호의 정확한 차별을 허용UST는 게이트 실험 시료에서 IL-17A 또는 IL-17F 양성 세포를 식별. 그림 3은 T 신장 (그림 3A)에서 분리 된 세포와 차량 (가짜) 또는 안지오텐신 II (중앙 II) 주입 WT 쥐의 대동맥 (그림 3B)의 세포 내 염색의 예를 제공합니다. 사실, IL-17A 또는 IL-17F를 발현 T 세포의 서브 세트는이 모델에서 두 조직에서 검출 될 수있다. 도 4는이 모델 (도 4a)에서 대동맥 림프절 내 T 세포의 세포 염색을 나타낸다. CD8 + T 세포는 제 (도 4B) 게이팅 하였다. 그런 다음, 두에 T 마커의 발현, 사이토 카인 IFNγ 또는 전사 인자 T 베팅은 CD8 + T 세포 하위 집합에서 정량화 하였다. 도 4c는 IFN 대한 FMOs를 도시47; 및 림프절 샘플에서 T-내기 염색 (각각 FITC와 PE-Cy7와 결합). 도 4d는 WT 마우스의 대동맥 림프절은 안지오텐신 II 주입에서 CD8 + IFNγ + 및 CD8 + T 베팅 + 세포 집단이 식별 될 수 있음을 보여준다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55266/55266fig1.jpg" /> 도 1 : T 세포를 식별하기 위해 게이팅 전략 유동 세포 계측법. 백혈구는 먼저 앞으로 분산 / 측면 산란 (FSC-A / SSC-A) 도트 플롯 (G1), 라이브 셀 선택 (G2)에 문이있다. 세포 후 단봉 (FSC-A / FSC-H) (G3)에 게이트된다. G3의 세포는 또한 CD45 (G4)의 발현을 특징으로한다. 마지막으로, T 세포는 CD45 + CD3 + 더블 양성 세포 (G5)에 문이있다. 이 단일 세포 현탁액을 야생형 분리 전체 대동맥으로부터 제조 하였다 (WT) 마우스 angiot 주입<html> ensin II는 고혈압을 유발합니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55266/55266fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55266/55266fig2.jpg" /> 그림 2 : 형광을 뺀 컨트롤 IL-17A와 IL-17F 용 (FMO). (A) 안지오텐신 II 처리 한 쥐 신장 샘플에서 분리 된 단일 세포 현탁액 정착 생존 마커 (태평양 블루), CD45 (AmCyan), CD3 (를 PerCP-Cy5.5) 및 IL-17F (APC)를 사용하여 염색 하였다. IL-17A에 대한 항체가 IL-17A의 적절한 게이팅을 결정 생략 하였다. (B) 안지오텐신 II 처리 한 쥐 신장 샘플에서 분리 된 단일 세포 현탁액을 고칠 생존 마커 (태평양 블루), CD45 (AmCyan), CD3 (를 PerCP-Cy5.5) 및 IL-17A (FITC)을 사용하여 염색 하였다. 이때, IL-17F에 대한 항체는 생략 하였다.urce.jove.com/files/ftp_upload/55266/55266fig2large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55266/55266fig3.jpg" /> 도 3 : IL-17A 및 IL-17F에 대한 쥐 신장 및 대동맥으로부터 분리 T 세포의 세포 내 염색. 유동 세포 계측법 + II (중앙 II) 이전은 CD45 + CD3에 문 WT 차량 (위장) 주입 마우스 또는 안지오텐신에서 신장 (A) 및 대동맥 (B)에서 T 세포에서 IL-17A와 IL-17F 식을 보여주는 플롯을 점 세포. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55266/55266fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55266/55266fig4.jpg" /> 그림 4 : T 세포의 세포 내 염색<html> 쥐의 대동맥 림프절에서 격리 s의. WT에 마우스를 두 척추 대동맥 림프절의 (A) 외관 육안. (B)는 WT 마우스로부터 단리 네 대동맥 림프절로부터 분리 된 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 도트 플롯 안지오텐신 II 주입 이전 및 CD45 + CD3 + 세포 상에 게이팅 주제 유동 세포 계측법. (C)는 림프절로부터 분리 된 단일 세포 현탁액은 생존 마커 (퍼시픽 블루)을 사용하여 염색하고, CD3 (를 PerCP-Cy5.5), CD4 (APC-Cy7) 및 CD8 (APC). FMO 컨트롤하는 IFNγ (FITC) 또는 T-내기 (PE-Cy7)에 대한 항체가 적절한 게이팅을 결정하기 위해 생략 표시됩니다. (D)는 세포 계측법 FMO 컨트롤에 의해 결정되는 게이트를 사용하여 CD8 + 림프절의 T 세포 내에서 긍정적 인 IFNγ와 T-내기 식을 보여주는 플롯을 점 흐른다.g &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

이 문서에서는 식별하고 세포 내 염색에 의해 쥐의 신장, 대동맥 림프절 내에 존재하는 기능 T 림프구의 하위 집합을 정량화 및 유동 세포 계측법하는 자세한 방법을 제공합니다. 안지오텐신 II 유발 된 고혈압의 모델은 설명 단계별, 절차 및 유동 세포 계측법의 기본 원리 및 세포 내 염색하기 위해 선택되었다.

세포 내 염색 및 유동 세포 계측법은 고혈압의 모델에 쥐 대동맥, 신장 및 림프절에서 림프구 하위 집합을 식별하는

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

intracellular-staining-flow-cytometry-to-identify-lymphocyte-subsets

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.1K 조회수.  Vanderbilt University Medical Center.  이 문서에서는 식별하고 세포 내 염색에 의해 쥐의 신장, 대동맥 림프절 내에 존재하는 기능 T 림프구의 하위 집합을 정량화 및 유동 세포 계측법하는 자세한 방법을 제공합니다. 안지오텐신 II 유발 된 고혈압의 모델은 설명 단계별, 절차 및 유동 세포 계측법의 기본 원리 및 세포 내 염색하기 위해 선택되었다. 

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Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

유동세포계측법에 의해 폐, 폐 배수 림프절의 분석과 마우스의 비 수술 Intratracheal 떨어뜨림

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

연구

면역학 및 감염병학

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

이미지 기반 유동 세포 계측법 기술은 과립구 기능의 변화를 평가하기<em&gt; 체외</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 대 식세포의 표현형 특성

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

와 감염시 배수 림프절에 쥐 피부 수지상 세포의 마이그레이션을 연구하는 CFSE 기반 분석<em&gt; 소 결핵균</em&gt; Bacille 칼 메트 - GUERIN

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

검출<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em자기 활성 셀 정렬 및 유동 세포 계측법에 의해&gt; 변형 표면 당 단백질 전환

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most biological materials do not contain dense elements capable of scattering electrons to create an image; therefore, a negative stain, which places dense heavy metal salts around the sample, is required. In order to visualize viruses in suspension under the TEM they must be applied to small grids coated with a transparent surface only nanometers thick. Due to their small size and fragility, these grids are difficult to handle and easily moved by air currents. The thin surface is easily damaged, leaving the sample difficult or impossible to image. Infectious viruses must be handled in a biosafety cabinet (BSC) and some require a biocontainment laboratory environment. Staining viruses in biosafety levels (BSL)-3 and -4 is especially challenging because these environments are more turbulent and technicians are required to wear personal protective equipment (PPE), which decreases dexterity. 
In this study, we evaluated a new device to assist in negative staining viruses in biocontainment. The device is a capsule that works as a specialized pipette tip. Once grids are loaded into the capsule, the user simply aspirates reagents into the capsule to deliver the virus and stains to the encapsulated grid, thus eliminating user handling of grids. Although this technique was designed specifically for use in BSL-3 or -4 biocontainment, it can ease sample preparation in any lab environment by enabling easy negative staining of virus. This same method can also be applied to prepare negative stained TEM specimens of nanoparticles, macromolecules and similar specimens.

This protocol provides instruction for negative staining virus samples which can easily be used in BSL-2, -3, or -4 laboratories. It includes the use of an innovative processing capsule, which protects the transmission electron microscopy grid and provides the user easier handling in the more turbulent environments within biocontainment.

Biocontainment 내 바이러스 샘플의 음성 염색을위한 캡슐의 활용

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...