패티 Lederman RPE 세포 준비에 대 한 수술과 수잔 보든에 그녀의 지원에 대 한 감사 하 길. 우리는 또한이 프로젝트에 대 한 자금에 대 한 NYSTEM C028504를 인정 합니다. 저스틴 디 밀러 NIH에서 지원 되는 F32EY025931를 부여 합니다.

동물 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 뉴욕 주립 대학의 알바 니에 의해 승인 되었습니다.
1. 사전 사출 준비
<ol><li>
HRPESC-RPE 세포 현 탁 액의 준비 참고: 모든 다음 단계 살 균 조직 문화 후드에서 수행 됩니다 및 기본적인 살 균 기술 가진 친밀 필요 합니다.<ol>
<li>기본 hRPE 세포 격리 인간 기증자에서 눈 세 50-90 년과 24-잘 접시12문화 셀. 통로 1에 셀 cryopreserve, 필요에 따라 해 동 및 문화 통로 2 (P2) 세포 주입에 대 한 4-5 주 (그림 1A).</li>
		<li>12 문화 매체 제거 하 고 부드럽게 린스 우물 500 µ L로 두 번 미리 Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 칼슘 및 마그네슘 없이 X 1을 예 열 (1 DPBS CMF x) 1을 추가 하 여 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 고 진공을 사용 하 여 그것을 제거 하는 것은 우물에 X DPBS CMF.</li>
		<li>각 우물에 300 µ L 트립 신/DNAse를 추가 합니다. 트립 신/DNAse (4 구 0.25 %trypsin-EDTA의 1 mL 당 DNase) 셀 해리를 37 ° C에서 4 분에 hRPESC-RPE 세포를 품 어.</li>
		<li>그들은 반올림 있는지 현미경 셀을 확인 합니다. 계속 그들은 아직 둥근 하지 경우 트립 신/DNase를 추가 2 분 동안에 세포를 품 어.</li>
		<li>셀 반올림 됩니다, 일단 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 triturate 우물에서 분리 된 세포를 트립 신/DNase 비활성화를 미리 데워 진된 문화 매체의 동일한 볼륨 15 mL 원뿔 튜브로 분리 된 셀을 포함 하는 트립 신/DNase 전송.</li>
		<li>미리 데워 진 1 우물 린스 부드럽게 위아래로 잘;의 가장자리의 주위에 특히 pipetting으로 X DPBS CMF 그런 다음 이전 원뿔 관에 이러한 셀을 추가 합니다.</li>
		<li>286 x g 작은 셀을 4 ° C에서 5 분에 원뿔 튜브 원심</li>
		<li>제거는 상쾌한 고 1 mL 문화 매체와 셀 resuspend.</li>
		<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
		<li>작은 셀을 4 ° C에서 5 분에 대 한 286 x g에서 원심.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 셀에 살 균 균형 소금 솔루션 (BSS) 50, 000 셀 / µ L에서 (subretinal 주입 중 1 µ L 볼륨에 50, 000 셀을 제공)을 resuspend.</li>
		<li>1.7 mL microcentrifuge 튜브와 얼음 물 혼합물에 주입 사용까지 최종 세포 현 탁 액 (CS)를 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀 인젝터의 준비
	<ol>
<li>주입 주사기와 인젝터를 밀접 하 게 나사에 메 마른 33-게이지 경사진된 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>5-6 번 100% 에탄올과 인젝터를 플러시.</li>
		<li>5-6 번 70% 에탄올과 인젝터를 플러시.</li>
		<li>플러시 BSS와 인젝터 5-6 시간.</li>
		<li>인젝터 바늘 메 마른 검은 마커 펜 (그림 1B) 해 현미경 바늘의 팁에서 600 µ m의 위치에 표시 합니다.</li>
		<li>인젝터 주입 micromanipulator 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. subretinal 주입
<ol><li>
외과 영역 및 동물 준비
	<ol>
<li>그리고 4-5 주 오래 된 RCS 쥐 (60-100 g)를 무게 isoflurane 증기 전달 시스템을 사용 하 여 anesthetize. 참고: 유도 마 취 5%에서 isoflurane 유량을 유지 합니다. 발을 눌러 마 취의 깊이 확인 하 고 수술 시 마 취 유지 보수에 대 한 2-3% 유량을 줄일 수 있습니다.</li>
		<li>메 마른 외과 영역을 설정 해 현미경의 스테이지 밑,가 열 패드와 멸 균 수술 드 레이프를 놓습니다.</li>
		<li>외과 영역에 쥐를 전송 및 마 취 유지 isoflurane 시스템에 연결 된 코 콘 쥐 장소.</li>
		<li>거 즈와 쥐의 시체를 커버. 전체 마 취를 확인 하는 쥐의 발가락을 꼬집어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
트랜스 scleral subretinal 주사 현미경
	<ol>
<li>쥐의 unoperated 눈에 한 방울 눈 윤 활 유를 적용 합니다.</li>
		<li>주입, 외과 의사의 오른손 쪽으로 그것의 머리 및 외과 의사를 향해 다시 천장에 직면 하는 왼쪽된 눈과 쥐의 오른쪽 면에 위치.</li>
		<li>작은 위로 눈을 커버 하는 어떤 수염을 잘라 주세요.</li>
		<li>왼쪽된 눈의 시간적 측면에서 눈 세척의 작은 금액을 똑 똑 하 고 눈을 씻어 하 면 주걱으로 비 강 측에 초과 수집 합니다.</li>
		<li>각각의 한 방울을 적용 하 여 주입 후 10 월 시험에 대 한 1 %tropicamide 및 2.5 %phenylephrine (갓 수술 당일 무 균 0.9% 식 염 수에 희석 하 여 10 %phenylephrine 만든)와 학생 같은데요.</li>
		<li>4-6 시간 눈 주위의 피부를 살짝 당겨 눈은 약간 proptosed 지역에서 limbus 후부에 쉽게 액세스할 수 있도록 눈 꺼 풀을 열고.</li>
		<li>눈 세척의 방울을 적용 하 고 눈을 촉촉한 유지.</li>
		<li>부드럽게 (준비 단계 1.1.12) CS를 triturate 하 고 1.2 µ L CS와 인젝터를 로드 합니다. 여분의 0.2 µ L 주입 역류에 대 한 보상 하는 데 사용 됩니다. 참고: 에 대 한 우리의 측정에 따라 5000-8000 셀 50, 000 셀 / µ L 셀 손실의 약 10-16%에 그의 주사와 역류에 손실 됩니다 및 0.2 µ L CS의 추가이 셀 손실 보상을 주입 했다.</li>
		<li>인젝터는 micromanipulator에 CS로 가득 놓습니다 (또는 그것을 잡고 보조) 세로로 RPE 세포에에서 쉽게 침 몰 경향이.</li>
		<li>눈에 방울 0.5 %proparacaine (지역 국 소 마 취 제)를 적용 하 고 초과 면 주걱으로 제거. 참고: 이 단계는 각 막 반사를 억제 하 고 깜박이 후속 단계에서 눈을 방지 해야 합니다.</li>
		<li>집게를 사용 하 여를 후부는 limbus 결 막, 눈 nasally, 회전 리프트 "텐트"를 만들려고 결.</li>
		<li>가 위를 사용 하 여 결 막에 작은 개통을 확인 하 고 기본 sclera를 노출 하는 "천막"의 상단을 잘라.</li>
		<li>집게를 사용 하 여 나머지 결 한계는 limbus 옆의 가장자리 회전 눈 nasally 동 공 축 테이블 위쪽 (그림 1C)을 기준으로 약 30도의 각도에서를. 결 막의 지속적인 창과 바늘 삽입 하는 동안 카운터 힘을 제공 하 고 최적의 각도에서 눈을 유지 하기 위해 필요 합니다.</li>
		<li>세포 주입 안내 하는 구멍을 향하도록 팁의 개막과 함께 limbus를 후부 1200-1500 µ m에서 메 마른 경사진된 31 게이지 인슐린 바늘의 끝을 놓습니다.</li>
		<li>그것은 10-15도 sclera (의도 된 주사 사이트에서 가상 평면에 접선) 위에 인슐린 바늘의 각도 조정 합니다. 천천히 sclera 맥락 막 복잡 한 약 500 µ m의 바늘 깊이 침투. 색칠 한 쥐에서 바늘 끝 사라질 것 이다 '' 안료 맥락 막 아래. 여기에서 사용 하는 인슐린 바늘의 브랜드에 대 한 경사에 바늘 끝에서 거리 500 µ m입니다.</li>
		<li>신중 하 게 철수 인슐린 바늘 (혈액의 아주 작은 유출을 볼 수 있습니다).</li>
		<li>과도 한 출혈, 지적 필요한 경우 눈 창 구멍, 취소를 적용할 수 있습니다. 지속적인 출혈 후 창 응용 프로그램 나타냅니다 선박 수 있습니다 손상 되었을.</li>
		<li>오프닝, 그리고는 공 막의 지역 표면에 상대적으로 약 10-15도 각도 직면 하 고 안내 하는 구멍으로 RPE 세포 로드 인젝터 바늘을 안내.</li>
		<li>부드럽게 subretinal 공간에 액세스를 약 500 µ m의 깊이를 안내 하는 구멍에 인젝터 바늘을 삽입 합니다. 검은 펜 마크의 가장자리와 바늘 (그림 1C 및 1d) 안료 맥락 막에 의해 덮여 있다 지점 사이의 100 µ m 여백에 대 한 이어야 한다.</li>
		<li>부드럽게 셀 (약 1.2 µ L)의 적절 한 볼륨을 주입 하는 인젝터 주사기의 플런저를 우울 하 게 보조를 요구 하십시오. 플런저 프레스는 조수로 일부 카운터 힘을 제공 하기 위해 준비가 되어있습니다. 참고: 도우미와 사전 모의 연습 의사와이 단계는 필요한 경험을 가진 보조를 제공할 수 있습니다.</li>
		<li>시각적으로 펜에 집중 하는 동안 가장자리를 표시, 인젝터 25-30에 대 한 장소에서를 누른 다음 천천히 인젝터를 철회 합니다. 역류의 작은 금액은 일반적으로 관찰 된다. 참고: 없는 혈 류 관찰 되는 경우 수 있었다 intravitreal 주사. 인감 또는 공 막 엔 아래 작성 하는 셀을 통해 역류 하십시오 경우 주사 너무 얕은 했다.</li>
		<li>3 번에 메 마른 눈 세척과 사출 사이트에서 셀 경과 헹 구 고 면 주걱으로 초과 수집 합니다.</li>
		<li>운영된 눈에 한 방울 눈 윤 활 유를 적용 하 고 10 월 역 이식된 세포의 위치와 subretinal bleb의 크기를 검사 하는 쥐를 전송.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 포스트 주입 치료
<ol><li>
항 염증 및 통증 진통제 치료
	<ol>
<li>고통을 감소를 피하 염 분에 0.1 mg/kg 몸 무게에서 buprenorphine 주사.</li>
		<li>염 분에 1.6 mg/kg 몸 무게에서 dexamethasone 염증 제어용 복 주사 (I.P.) 주사.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
동물 복구
	<ol>
<li>체온을 유지 하기 위해 열 램프 아래 복구 케이지를 쥐를 반환 합니다.</li>
		<li>출혈의 징후에 대 한 운영된 눈을 관찰 합니다.</li>
		<li>마 취 나올 수 있도록 쥐를 관찰 합니다.</li>
		<li>신선한 케이지를 복구 된 동물을 반환 하 고 수술 카드 케이지를 플래그 조 난, 안구 출혈, 또는 각 막 불투명도의 어떤 표시 든 지를 위한 매일 모니터링. 문제가 있다면 수 의사를 즉시 통보.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>De Jong, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration.">Age-related macular degeneration.</a> N Engl J Med. 355, 1474-1485 (2006).</li><li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).</li><li>Ambati, J., Fowler, B. 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저자는 공개 없다.

이 기사에서 묘사 된 subretinal 주입 기술은 트랜스 scleral 통로, 인젝터 바늘 신경 망막 손상 또는 유리 구멍을 방해 하지 않고 눈 벽의 바깥 레이어 (sclera-맥락 막-RPE 복잡 한)를 침투를 통해 이다. 대체 트랜스-vitreal 접근 설치류 렌즈 유리 구멍의 대부분을 차지 하는 때문에, 백 내장, 이어지는 렌즈 손상의 잠재적인 위험이 있다. 이 방법에 비해, 우리의 기술 덜 위험 하 고 인젝터 바늘 subretinal 공간을 도달 하는 전체 유리 캐비티를 통해 갈 필요가 없습니다으로 최소한의 외상의 원인. 사실, 우리의 연구에서 10 월 시험 행사, 매우 드문 망막 침투 것 고, 동물에 따라 시험에는 없는 영구적인 망막 분리. 또한, 사출 사이트는 매우 작은 (< 200 µ m 직경에서) 때 33-게이지 인젝터를 사용 하 여 바늘 sclera 맥락 막 RPE 복잡 한 구조적 장애는 매우 제한 된 그래서. 바늘 철회 후 주입 구멍 자체 자동으로 그렇게 스티치 물개 또는 조직 접착제 필요 하다.
사출 주변 또는 내에서 과도 한 출혈 수술 합병증 포함 안내 하는 구멍. 집게를 사용 하 여 그립에 limbus 결 여백만 부드러운 힘 필요 혈관을 곤란 하 게 하지 않도록 하 고 가능한 출혈 감소 합니다. 안내 하는 구멍을 만들기 전에 표면 혈관의 침투를 피하기 위해 원하는 주사 사이트를 검사 합니다. 스피어를 사용 하 여 셀 주사 바늘의 삽입 하기 전에 혈액의 안내 하는 구멍을 지울 수 있습니다. 안내 하는 구멍에서 출혈이 지속 되 면 스피어의 몇 가지 애플 리 케이 션 후, 그릇 되었을 수도 있습니다 고장. 우리가 관찰 하는 또 다른 합병증 post-operatively 각 막 불투명도 개발 하는 RCS 쥐의 작은 백분율 이다. 어떤 경우에는 불투명도 만성 되었고 다른 과도 했다. 영구 불투명도와 동물 연구 그룹에서 제거 되었습니다. 각 막 불투명도 눈 건조, 물리적 손상, 염증, 약물 또는 화학 자극21개발할 수 있습니다. 그들의 형성을 줄이기 위해 눈 지켜져야 한다 촉촉한 눈을 충분 한 윤 활을 유지 하 여 고 작업 중 각 막 면 주걱 또는 다른 도구를 만지지 마십시오.
주입 프로토콜 사용 하 여 정의 된 접근 각도 눈 랜드마크, 상대적인 바늘 깊이 우리의 설정에 수술 테이블에 상대적으로 눈 각도 여기 설명. 포스트 주입 10 월 검사를 사용 하 여 높은 정확도 RPE 세포 이식 쥐의 subretinal 공간으로 재현할 수 제어를 제공 하려면 이러한 주입 매개 변수 정제에 중요 했다. 일단 반복된 연습에 의해 지배, 방법은 간단 하 게 수행입니다. 그것은 권장, 훈련에서 특히 수술 후 눈 시험 결과 확인 하기 위해 수행 됩니다. 각도 깊이 주입 바늘 지 가능성이 필요 조정의 따라 수술 설정에 따라이 의견을, 나이, 동물의 다른 동물 종에 사용 하는 경우 및/또는 (예를 들어, 마우스).
사출 품질을 평가 하 고 포함 또는 연구에서 제외 결정, 10 월 관측에서 출혈이 subretinal의 존재가 중요 합니다. 어디 OCT를 사용할 수 없는 실험실에서 아래에서 설명 하는 조건을 사용할 수 있습니다 빠른 심사 외과 의사에 의해 의심된 주입 실패를 제외 하: (1) 이전 주입에: (a) 조종사 구멍 너무 깊은 이루어집니다 (즉, 상당한 깊이 > 500 µ m; 대 한는 여기, 빗면의 중간에 바늘 끝에서 거리를 사용 하는 인슐린 바늘의 브랜드는 500 µ m). (b) 안내 하는 구멍 지나치게 유혈 (즉, 출혈 멈출 수 없습니다 눈 스피어스와 구멍에 힘을 적용). (c) 주입 바늘이 너무 깊이 (즉, 상당한 깊이 > 500 µ m 또는 주사 바늘에 표식 sclera/맥락 막/RPE 복잡 한 조직으로 간다). (2) 동안 주입: 주입 중 안내 하는 구멍에 주사 바늘을 유지 하기 위해 (a) 수 없습니다. (b) 주입 시 주입 바늘 주위 즉시 누설. (c) 주입 바늘 너무 깊이 전달 됩니다 (즉, 주사 바늘에 마커 sclera/맥락 막/RPE 복잡 한 조직으로 간다) 주입 동안에 외과 의사에 의해 발견. (d) 위치에서 주입 바늘 주입 후 5 초 이상 유지 수 없습니다. (e) 과도 한 혈액 주사 바늘을 제거 하는 경우. (f) 역류/경과 후 2 단계와 결합 될 때 주사 바늘의 철회.
바늘 위치, 각도, 깊이의 주의 깊은 관리와 함께, 촬영 트랜스 scleral subretinal 주입 기술은 매우 안정적이 고 정확, 이며 최소한의 수술 외상을 수행할 수 있습니다. 이러한 모든 혜택과 함께, RPE 세포의 전달 뿐만 아니라 다른 세포 유형, 화합물 또는 유전자 치료에 대 한이 기술을 사용할 수 있습니다.

인간의 망막 눈 기능 뒤 가벼운 감각 조직으로 있으며 비전 인식에 중요 한 역할을 한다. 망막 세포 역 기능 또는 세포 죽음 따라서 시력 문제 또는 영구적인 실명을 발생합니다. 변성 또는 망막의 다른 층에 있는 세포의 기능 장애와 관련 된 장애 퇴행 성 망막 질환, 중 AMD는 가장 일반적인 유형 및 선진국 노인에 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인으로 알려져 있습니다. 1,2. AMD의 병 적인 과정은 관련 RPE 레이어와 차례로 손상의 포토 리셉터 생리학, 신경 망막 위축 및 비전 손실3, RPE 지원 기본 Bruch 막 사이 "드루" 축적 된 4,5. 지금까지, 치료법은 고급 건조 (비 신생) AMD. 재생 의학의 새로운 패러다임으로 줄기 세포 치료의 출현 줄기 세포 유래 건강 한 세포 기능 장애 또는 죽은 RPE 세포 교체의 희망을 제공 합니다. 실제로, 이식의 광범위 한 전 임상 연구 줄기 세포 (예를들면, 인간 배아 줄기 세포)-RPE 퇴행 성 동물 모델에 파생 된 RPE 세포 수행된6,7, 일부는에 진행 되었습니다 임상 시험8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). 최근, 줄기 세포 인간의 RPE 레이어, 인간의 RPE 줄기 세포 (hRPESCs)에서의 대안 소스 우리의 실험실에 의해 확인 되었다와 amd hRPESC 파생 된 RPE 세포 (hRPESC-RPE) 이식 치료의 임상 연구에서 현재 사용 되 고 10 , 11 , 12 , 13.
Subretinal 주입 기술은 우리의 그룹을 포함 하 여 여러 그룹에 의해 위에서 언급 한 전 임상 연구에 적용 됩니다. 동물에서 subretinal 주입을 위한 일반적인 방법은 두 가지: 트랜스 vitreal 및 트랜스 scleral. 트랜스-vitreal 접근 앞쪽 눈 침투, 십자가 전체 vitreal 구멍 렌즈에 인접 하 고 침투는 subretinal 도달 하 눈 뒤에 망막 바늘 끝을 직접 관찰할 수 있는 외과 의사의 이점이 있다 공간14,,1516. 그러나, 그것은 렌즈, 손상의 위험 전달 하 고 바늘을 철회 하는 때 유리 체로 셀의 역류에서 발생할 수 있습니다 (앞쪽에 및 사후), 두 개의 위치에 망막을 방해를 요구 한다. 반면, 트랜스 sclera 접근의 원칙, 망막 및 유리 체의 관련을 방지 하 고 역류 눈을 종료 합니다. 안료 설치류에서 외과 의사 처음 sclera의 침투를 관찰할 수 있다 하지만 안료 맥락 막에 통로, 후 바늘 끝은 더 이상 표시. 직접 관찰 없이 망막 위배 일반적 이며 망막 해 부 및 세포 혈액의 유리 체에 배달 될 수 있습니다. 또한, 눈 표면 곡선 때문에 그것은 매우 어떤 바늘 각도 깊이 트랜스 scleral 주사에 대 한 가장 효과적인 알고 어렵다.
이 시각화 된 문서에서 정보를 가진 광학 일관성 단층 촬영 (OCT), 사출 사이트의 상세한 검사를 수 있는 수술 후 평가의 사용에 의해 트랜스 scleral subretinal 주입 방법을 소개 합니다. 우리의 트랜스 scleral 주입 기술 정의 위치, 각도, 그리고 매우 낮은 수술 외상 및 높은 신뢰성을 주사 바늘에 대 한 깊이 사용 합니다. 여기, 우리가 구체적으로 RCS 쥐, 인간의 AMD의 전 임상 모델의 subretinal 공간으로 hRPESC-RPE 세포의 주입을 보여 줍니다. 이 주입 방법으로 우리가 성공적으로 일관 되 게 배달 hRPESC-RPE 세포 RCS 쥐 눈 매우 높은 성공률의 subretinal 공간으로. 세포의 주입 이전13주입 후 최소 2 개월 RCS 대뇌의 보존을 발견 했다. 이 절차는 해 현미경 아래 수행 되 고 배우기 쉽습니다. 그것은 두 사람 (한 의사와 보조) 주사를 수행 요구 하 고 각 동물에 대 한 주입의 평균 시간은 5 분 미만 이다. 정의 된 각도 깊이 주사 바늘에 대 한 실험실, 10 월은 성공적인 subretinal 주입을 달성 하기 위해 사용할 수 없습니다에 대 한 가능 하 게. 그것은 높은 재현성 subretinal 액세스를 허용 하 고 세포 이식, 뿐만 아니라 약물 전달 및 유전자 치료에 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td style="width:256px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-072</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DNAse I</td>
			<td style="width:256px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">DN-25</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">1xDulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline without Calcium &#38; Magnesium (1xDPBS-CMF)</td>
			<td style="width:256px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">431219</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sterile Balanced Salt Solution (BSS)</td>
			<td style="width:256px;">Alcon</td>
			<td style="width:119px;">00065079550</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sterile eye wash</td>
			<td style="width:256px;">Moore Medical</td>
			<td style="width:119px;">75519</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sterile 0.9% saline</td>
			<td style="width:256px;">Hospira</td>
			<td style="width:119px;">488810</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%)</td>
			<td style="width:256px;">Akorn</td>
			<td style="width:119px;">17478026312</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%)</td>
			<td style="width:256px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:119px;">24208058559</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock</td>
			<td style="width:256px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:119px;">42702010305</td>
			<td style="width:231px;">This is used to make 2.5% Phenylepherine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Buprenex</td>
			<td style="width:256px;">Patterson</td>
			<td style="width:119px;">433502</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:256px;">APP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">63323051610</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">615090040</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:256px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:119px;">2546.70-5</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:259px;">Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel</td>
			<td style="width:256px;">Novartis</td>
			<td style="width:119px;">78042947</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops</td>
			<td style="width:256px;">Alcon</td>
			<td style="width:119px;">00065143105</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:259px;">hRPESC-RPE cells</td>
			<td style="width:256px;">Not available commercially</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;">Please refer to &#34;Reference #12&#34; for cell isolation and mainteinance.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">24-well plates</td>
			<td style="width:256px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3526</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Conical tubes (15 ml)</td>
			<td style="width:256px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62554002</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Microcentrifuge cap with o-ring</td>
			<td style="width:256px;">LPS inc</td>
			<td style="width:119px;">L233126</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml)</td>
			<td style="width:256px;">LPS inc</td>
			<td style="width:119px;">L233041</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:256px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5804R</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sterile alcohol wipe</td>
			<td style="width:256px;">McKesson</td>
			<td style="width:119px;">58-204</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sterile cotton tip applicators</td>
			<td style="width:256px;">McKesson</td>
			<td style="width:119px;">24-106-2S</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sterile Weck-Cel spears</td>
			<td style="width:256px;">Beaver-Visitec International&#160;</td>
			<td style="width:119px;">0008680</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sterile surgical drapes&#160;</td>
			<td style="width:256px;">McKesson</td>
			<td style="width:119px;">25-515</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Gauze</td>
			<td style="width:256px;">McKesson</td>
			<td style="width:119px;">16-4242</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Nanofil syringe (10 ul)</td>
			<td style="width:256px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">Nanofil</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Nanofil beveled 33-gauge needle</td>
			<td style="width:256px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">NF33BV-2</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Insulin syringe needles 31-gauge</td>
			<td style="width:256px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">328418</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Rat toothed forceps</td>
			<td style="width:256px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">555041FT</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:259px;">Vannas Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td style="width:256px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-5602</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Circulating water T pump&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Stryker</td>
			<td style="width:119px;">TP700</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Heating pad</td>
			<td style="width:256px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:119px;">TPZ-814</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Animal anesthesia system</td>
			<td style="width:256px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">EZ-7000</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Balance</td>
			<td style="width:256px;">Ohaus</td>
			<td style="width:119px;">PA1502</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:256px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Stemi 2000</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Microscope light source</td>
			<td style="width:256px;">Schott</td>
			<td style="width:119px;">ACE series</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:259px;">Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System</td>
			<td style="width:256px;">Bioptigen</td>
			<td style="width:119px;">R2210</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sterile black marker pen</td>
			<td style="width:256px;">Viscot Industries</td>
			<td style="width:119px;">1416S-100</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Miniature measuring scale</td>
			<td style="width:256px;">Ted Pella Inc</td>
			<td style="width:119px;">13623</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">Infrared Basking Spot Lamp&#160;</td>
			<td style="width:256px;">EXO-TERRA</td>
			<td style="width:119px;">PT2144</td>
			<td style="width:231px;">This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery&#160; phase</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a refined protocol for trans-scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes

연령 관련 황 반 변성 (AMD) 등 퇴행 성 망막 질환 전세계 돌이킬 수 없는 시력 상실의 주요 원인입니다. AMD는 기능적으로 지원 하 고 해부학 신경 망막 주위 세포의 단층 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 변성에 의해 특징입니다. 비 신생 AMD (건식 AMD)에 대 한 현재 약물 치료는 질병의 진행을 느리게만 겨냥 한 새로운 치료 전략을 식별 하는 연구를 필요로 하는 비전을 복원할 수 없습니다. 건식 AMD를 미래에 치료 건강 한 세포 파악 약속 퇴행 성 RPE 세포를 교체. AMD에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 광범위 한 전 임상 연구 참여 subretinal 사출 기술을 적용 동물 모델의 subretinal 공간으로 줄기 세포 유래 RPE 세포의 이식. 이러한 전 임상 동물 연구에서 가장 자주 사용 하는 접근 어려운 바늘 끝의 직접적인 시각화의 부족에 의해 만들어지고 종종 망막 손상 될 수 있습니다 트랜스 scleral 경로입니다. 유리 체를 통해 다른 접근 바늘 끝 위치의 직접 관찰에 대 한 수 있지만 더 많은 눈 조직 방해로 수술 외상의 높은 위험을 운반. 덜 위험 하 고 재현할 수 수정된 트랜스 scleral 주입 방법 정의 바늘 각도 깊이 사용 하 여 성공적으로 하 고 일관 되 게 쥐 subretinal 공간으로 RPE 세포를 제공 하 고 과도 한 망막 손상을 방지를 개발 했습니다. 이 방식으로 전달 하는 세포는 2 개월 이상에 대 한 외과 의사의 왕 대학 (RCS) 쥐에 효능 되도록 이전 입증 되었습니다. 이 기술은 세포 이식 뿐만 아니라 작은 분자 또는 유전자 요법의 배달을 위해 사용할 수 있습니다.

이 문서에서 설명 하는 기술을 사용 하 여, 우리가 일관 되 게 배달 hRPESC-RPE 세포 RCS 쥐의 subretinal 공간으로 정확 하 게 위치, 각도, 그리고 조직 (그림 1B-D에 인젝터 바늘 삽입의 깊이 조절 하 여 ). 즉시 다음 이식, 10 월 시험 사출 사이트와 이식된 세포에 의해 만들어진 subretinal bleb을 수행 했다. 수술 후 10 월 평가 주사 및 망막 손상이 나 출혈에 대 한 모니터링의 품질을 평가 하기 위한 검사 도구 역할을 합니다. 모두 subretinal bleb (그림 2A, C 및 D)과 사출 사이트 (그림 2A , B) 스캔 하는 10 월에서 명확 하 게 볼 수 있었다. Subretinal bleb는 보통 주입 후 24 시간 이내에 해결합니다. Blebs의 크기의 측정은 어려운 OCT를 사용 하 여, 우리 세포 이식으로 포토 리셉터 보존 지역이 가정 bleb 영역을 추정할 수 있다. 우리는 이전 50000 세포의 1 µ L 주사 약 6 ~ 7% 절약 될 수 있습니다 증명 사출 사이트13주위 RCS 망막의 지역. 피는 bleb에서 검색 되었습니다 같이 그림 2A, C 와 D는 망막에 레이어 했다 주사 사이트에서 그대로, 그리고 셀 주입으로 인 한 최소한의 외상을 보여주는 유리 체에서 관찰 되었다. 또한, 실패 한 주사의 대표 10 월 이미지 참조 (그림 2E 및 F) 포함 했다.
10 월 피드백 도구를 사용 하 여, 우리 조직에 인젝터 바늘 삽입의 깊이 각도 최적화. 일단 최적화, 300 이상 이전 subretinal 주사 우리의 다른 연구13 (표 1) 수행의 결과에 따라 subretinal 접근 수술만 5.7%와 90.8%의 성공률을 달성 하기 위해 우리가이 메서드가 실패 합니다. 나머지 3.5%에는 OCTs isoflurane 마 취 관련 눈 압 연17는 적절 한 위치에 눈을 포함 한 여러 가지 이유로 하지 수행 했다.
이식 후 7 일, 고정 및 immunohistological 분석 sectioned 운영된 쥐 눈 enucleated 했다. 인간의 세포 핵 마커 (Hunu)18 과 RPE 세포 마커 (OTX2)19 이식된 세포를 검출 하기 위하여 사용 되었다. 그림 3 id 및 이식의 성공적인 납품 확인, 주입 후 1 주일은 긍정적으로 두 마커 스테인드 subretinal 공간에 이식된 RPE 세포의 두꺼운 층을 보여주었다. 주입 후 1 주일에 셀의 다 수 그림 3C와 같이 수 있습니다 빠르게 감소 immunosuppressed RCS 쥐20에서도 호스트 면역 반응으로 인해 나중에 작은 숫자에. 그럼에도 불구 하 고, 위에서 설명 했 듯이, RCS 쥐 눈의 퇴 화 포토 리셉터 레이어 hRPESC RPE13이식 후 2 개월 이상 구조를 찾을 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55220/55220fig1.jpg"> 그림 1 : 4 주 오래 된 P2 hRPESC RPE 세포의 각도 인젝터 바늘 주사 하는 동안 사용 하는 깊이의 데모 이미지. (4 주 오래 된 P2 hRPESC RPE 세포의 단계 대조 이미지 A)를 주입에 대 한 사용. 눈금 막대 = 100 µ m. (B) 600 µ m 거리 사이 표시자의 가장자리와 인젝터 바늘의 끝을 보여주는 회로도 눈금으로 측정. 미의 최소 눈금은 100 µ m. (C) A 만화 쥐 눈의 해 부 구조와 각도 눈 벽에 인젝터 바늘을 삽입 하는 깊이의 측면 보기의 단면을 보여주는. 쥐 눈의 동 공 축 테이블 위쪽을 기준으로 30도 이며 인젝터 바늘이 안구의 로컬 표면 기준으로 15도. (D) 인젝터 바늘에 인젝터 바늘의 500 µ m 조직과 100 µ m의 공간에 삽입 되는 사출 사이트의 상위 뷰 마커의 시작점을 보여주는 만화는 마르크의 가장자리와 주입 구멍의 개통 사이 왼쪽 r. 구멍의 위치는 limbus를 후부 1200-1500 µ m 이다. 바늘 팁의 측면에 표시 됩니다 하지만 얼굴 다운 해야 주사 동안. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55220/55220fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55220/55220fig2.jpg"> 그림 2 : 주입 후 즉시 운영된 쥐 눈의 10 월 이미지. (A) 한 subretinal bleb 및 사출 사이트, intravitreal 출혈 없이 보여주는 운영된 눈의 10 월 B-스캔 이미지. (B)는 10 월 볼륨 강도 투영 (VIP)의 이미지 삽입 된 영역의 enface 저 이미지를 나타내는 B-스캔 시리즈. 작은 사출 사이트 최소한의 외상을 보여주는 VIP 이미지에 표시 됩니다. (C) (A) 모든 망막 레이어와 subretinal 공간에서 이식된 세포를 보여주는 확대 10 월 이미지 표시. 이 이미지는 이식된 세포 subretinal 공간에 위치 하 고 있었다 설명 했다. (D)는 평균 크기 subretinal bleb을 보여주는 10 월 B-스캔 이미지. (E) 10 월 B-스캔 이미지 intravitreal 공간에 있는 CS와 실패 한 subretinal 주입을 보여주는. (F) 10 월 B-스캔 이미지 보여주는 주사 사이트에서 통해 전체 망막 파고와 실패 한 subretinal 주입. 바 규모 = 100 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55220/55220fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55220/55220fig3.jpg"> 그림 3 : Immunohistological hRPESC-RPE 세포의 이식 후 섹션을 고정 하는 망막의 얼룩. (A) 인간의 세포 핵 마커 (Hunu) 이식된 인간 RPE 세포의 검출을 나타내는 얼룩입니다. (B, E) 세포 핵 카운터 얼룩 (4', 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) 망막 층, 이식, RPE 레이어를 보여주는. (C) A Hunu와 DAPI 이식된 hRPE 셀 subretinal 공간에 있습니다 나타내는 병합 된 이미지. 이식 및 RPE 레이어 사이의 분리는 냉동된 섹션에 대 한 RCS 눈 cryo 보호와 관련 된 처리 아티팩트입니다. (D) RPE 세포 마커 (OTX2) 이식된 인간 RPE 세포의 얼룩. (OTX2와 DAPI F)는 병합 된 이미지. 눈금 막대 = 20µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55220/55220fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>총 주입된 RCS 쥐 눈</td>
			<td>10 월에서 좋은 subretinal blebs</td>
			<td>10 월에서 작은 subretinal blebs</td>
			<td>10 월에서 총 비 복잡 한 subretinal blebs</td>
			<td>10 월 (즉, 기포 또는 망막 출혈)에서 Complicatd subretinal blebs</td>
			<td>아니 10 월 수행</td>
			<td>수술 실패 (10 월에서 아니 subretinal bleb)</td>
		</tr>
<tr>
<td>개수</td>
			<td>314</td>
			<td>260</td>
			<td>25</td>
			<td>285</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>전체 주입 된 눈의 %</td>
			<td>------</td>
			<td>82.80%</td>
			<td>7.96%</td>
			<td>90.76%</td>
			<td>1.59%</td>
			<td>1.91%</td>
			<td>5.73%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">(이 데이터는 RCS 쥐 subretinal 주사 10 동료에서) 요약</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 10 실험 동료 RCS 쥐에서에서 subretinal 주사의 요약.

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Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Subretinal 주입은 나이 관련 황 반 변성에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 전 임상 연구에 널리 적용 되었다. 이 시각화 된 문서에서는, 우리 쥐 눈 세포를 제공 하는 트랜스 scleral 접근을 통해 덜 위험 하 고, 재현 고 정확 하 게 수정 subretinal 주입 기술을 설명 합니다.

쥐의 눈으로 인간 망막 안료 상피 세포의 트랜스 scleral Subretinal 이식에 대 한 세련 된 프로토콜의 개발

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

development-refined-protocol-for-trans-scleral-subretinal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K 조회수.  Neural Stem Cell Institute. Subretinal 주입은 나이 관련 황 반 변성에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 전 임상 연구에 널리 적용 되었다. 이 시각화 된 문서에서는, 우리 쥐 눈 세포를 제공 하는 트랜스 scleral 접근을 통해 덜 위험 하 고, 재현 고 정확 하 게 수정 subretinal 주입 기술을 설명 합니다.

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Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

망막 안료 상피 생리학과 Pathophysiology 연구를위한 실험 모델

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

연구

신경과학

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

쥐 배아 신경 세포의 분리 및 문화 : 빠른 프로토콜

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

마우스 망막 색소 상피의 유전자 치료에 대한 바이러스 벡터의 윤부 접근 - 망막 주입

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of the center&#160;of the retina, called the macula, resulting in the loss of central vision. Early AMD is characterised by the presence of small, yellowish lesions called soft drusen that can progress onto late AMD such as geographic atrophy (dry AMD) or neovascularisation (wet AMD). Although the clinical changes are well described, and the understanding of genetic influences on conferring AMD risk are getting ever more detailed, one area lacking major progress is an understanding of the biochemical consequences of genetic risk. This is partly due to difficulties in understanding the biochemistry of Bruch&#8217;s membrane, a very thin extracellular matrix that acts as a biological filter of material from the blood supply and a scaffold on which the retinal pigment epithelial (RPE) cell monolayer resides. Drusen form within Bruch&#8217;s membrane and their presence disrupts nutrient flow to the RPE cells. Only by investigating the protein composition of Bruch&#8217;s membrane, and indeed how other proteins interact with it, can researchers hope to unravel the biochemical mechanisms underpinning drusen formation, development of AMD and subsequent vision loss. This paper details methodologies for enriching either whole Bruch&#8217;s membrane, or just from the macula region, so that it can be used for downstream biochemical analysis, and provide examples of how this is already changing the understanding of Bruch&#8217;s membrane biochemistry.

Identifying proteins specifically associated with Bruch&#8217;s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

인간의 기증자 눈에서 브루흐의 멤브레인의 농축

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

이른 출생 후 마우스 두뇌로 Interneuron 선구자의 Homochronic 이식

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

화학유전학적으로 조작된 피질 인터뉴런 선조를 출생 후 마우스 뇌로 이식

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Sciatic 신경 호감 상해의 쥐 모형에 있는 기능 평가를 위한 3D 운동학 분석

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and Leber Congenital Amaurosis (LCA) cause progressive and debilitating vision loss. There is an unmet need for therapies that can restore vision once photoreceptors have been lost. Transplantation of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue (organoids) into the subretinal space of an eye with advanced RD brings retinal tissue sheets with thousands of healthy mutation-free photoreceptors and has a potential to treat most/all blinding diseases associated with photoreceptor degeneration with one approved protocol. Transplantation of fetal retinal tissue into the subretinal space of animal models and people with advanced RD has been developed successfully but cannot be used as a routine therapy due to ethical concerns and limited tissue supply. Large eye inherited retinal degeneration (IRD) animal models are valuable for developing vision restoration therapies utilizing advanced surgical approaches to transplant retinal cells/tissue into the subretinal space. The similarities in globe size, and photoreceptor distribution (e.g., presence of macula-like region area centralis) and availability of IRD models closely recapitulating human IRD would facilitate rapid translation of a promising therapy to the clinic. Presented here is a surgical technique of transplanting hPSC-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model allowing assessment of this promising approach in animal models.

Presented here is a surgical technique for transplanting human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model.

고양이과 거대 동물 모델에서 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 조직의 망막하 이식

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...