본 연구는 국립 항공 우주국 통해 아칸소 공간 그랜트 협회와 국립 우주 바이오 메디컬 연구소에 의해 지원되었다, 부여 NNX15AK32A (RP) 및 RE03701 (MH-J), 및 P20의 GM109005 (MH-J), 미국 재향 군인의 관리 ( MH-J). 우리는 원고의 준비 편집 지원 크리스토퍼 Fettes, 의료 과학 아칸소 대학의 환경 및 산업 보건학과에 대한 프로그램 코디네이터, 감사합니다.

모든 동물 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 엄격히 준수하여 수행 하였다. 동물 프로토콜은 의료 과학에 대한 아칸소 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 신선한 공기와 표준 설치류 음식과 물을 무료로 이용할 수의 15 시간당 사이클 - 모든 동물은 10 20 ± 2 ℃에서 표준 에어컨 동물 시설에서 보관 하였다. 도착 후, 마우스 1 주일 동안 격리에서 개최하고 인증 설치류 식사를 제공했다. 1.Radiation 노출 및 중기 세포의 생체 체포에 <ol><li> 노출 조사 챔버에서 2 Gy의 전신 방사선에 마우스를 해제는-마취. 조사 기간 동안, 통풍이 잘 유지 챔버의 장소 마우스는 자유롭게 이동하고 균일 한 용량을받지 못한 확인합니다. </li><li> 0.05 % 콜히친 용액 100 μL를 주입 (c칼슘 및 마그네슘없는 PBS에 용해 olchicine 분말) 복강 내 1 ㎖의 일회용 주사기에 부착 된 25 G 바늘을 사용. 어떤 기관에 직접 분사하지 마십시오. </li><li> 골수 세포 수확하기 전에 2 시간 동안 케이지에 동물을 둡니다. 통증이나 고통의 흔적에 대한 동물을 관찰한다. </li></ol> 2. 골수 세포 수확 및 밀도 구배 원심 분리하여 골수 단핵 세포의 분리 <ol><li> CO 2 질식하여 마우스를 안락사. </li><li> 지느러미와 복부 측면에 70 % 에탄올 스프레이. </li><li> 날카로운 가위로 복부 피부에 2cm의 절개를합니다. 무딘 핀셋 절개의 양쪽 피부를 잡고 조심스럽게 복부 근육을 잡아 당깁니다. </li><li> 가위로 양쪽 뒷다리를 잘라 즉시 4 % FBS 사전 냉장 PBS에 배치합니다. </li><li> 조심스럽게 날카로운 면도칼과면 거즈 붕대로 뒷다리에 연결된 모든 근육을 청소합니다. </li><li> 대퇴골의 경골을 분리합니다. 면도칼 각 뼈의 양쪽 끝을 낸다. </li><li> 3 mL의 주사기에 부착 된 23 G 바늘을 사용하여 (4 % FBS)와 3 mL의 PBS와 함께 골수의 컨텐츠를 플러싱하고, 15 mL의 원심 분리 튜브 내의 컨텐츠를 수집한다. 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 바늘을 통해 세포 현탁액을 10 배 이상을 합격. </li><li> 조심스럽게 세포 현탁액 및 림프구 분리 매질 간의 인터페이스를 방해하지 않고 림프구 분리 매질 (3 mL)을 동일 부피의 세포 현탁액을 오버레이. 실온에서 30 분 동안 400 × g으로 원심 분리기. </li><li> 새로운 15 mL의 원심 분리 튜브 내의 다른 계층과 전송을 방해하지 않고 조심스럽게 버피 코트를 수집한다. </li></ol> 중기 세포 스프레드 3. 준비 <ol><li> 버피 코트를 포함하는 튜브에 10 mL의 PBS를 추가합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 그런 t을 휴식그는 부드러운 도청과 펠렛 셀, ​​10 mL의 PBS를 추가합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리기. </li><li> , 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거 펠렛을 중단하고 미리 예열 저장성 0.075 M 염화칼륨 용액 4 mL를 넣고. 부드러운 일정한 흔들림과 강하에 의한 저장성 용액 방울을 추가합니다. </li><li> 수욕에서 37 ℃에서 20 분 동안 세포를 인큐베이션. </li><li> (: 빙초산 3 : 메탄올 1 v / v)의 저장성 처리 후, 고정액 동량 (4 ml)에 추가 15ml의 튜브와 상기 튜브를 반전시켜 부드럽게 혼합한다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리하고 상층 액을 제거한다. </li><li> 몇 초 동안 부드러운 소용돌이 다음 탭핑과 세포 펠렛을 휴식과 일정한 흔들림와 드롭으로 정착 솔루션 드롭 3 mL를 넣고. </li><li> 실온에서 30 분 동안 배양 한 다음 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리기. </li><li> , 상층 액을 제거 신사와 세포 펠렛을 휴식제작 : 도청, 3 mL의 신선한 정착액을 추가합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리하고 상층 액을 제거한다. 부드러운 도청과 세포 펠렛을 휴식, 신선한 3 ML의 정착액을 추가합니다. </li><li> 단계를 반복 3.12 배 더. </li><li> 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리하고 세포 펠렛을 교란시키지 않고 상층 액을 제거한다. 그 후 600 μL의 정착에 400를 추가하고 피펫으로 잘 혼합한다. </li><li> 45 ° 각도로 기울어 미리 청소하고 젖은 슬라이드에 30 μL에게 고정 된 세포를 삭제하고 완전히 밤새 공기 건조에 슬라이드를 할 수 있습니다. </li></ol> mFISH 4. 마우스 염색체 페인팅 <ol><li> 염색체 변성 <ol><li> 실온에서 2 분 동안 2 × SSC에서 중기 세포의 퍼짐을 포함하는 슬라이드를 놓는다. </li><li> 70 %에서 2 분 각각 80 %, 100 %를 직렬 에탄올 세척하여 슬라이드를 탈수. 65 ° C에서 60 분 동안 품어. </li><li> 데우고 40 ㎖의 변성 용액 (70 % 포름 아미드 / 2 × SS기음; 30 분 동안 유리 코 플린 항아리에 70 ° C (± 2 ° C)로 pH를 7.0). 1.5 분 - 1 예열 변성 용액 슬라이드를 배양하여 염색체 변성. </li><li> 2 분 변성 과정을 중단뿐만 아니라, 재 어닐링에서 염색체 변성을 방지하기위한 빙냉 70 % 에탄올 중에 슬라이드를 즉시 급냉. 그 다음 2 분 동안 80 % 에탄올로 세척하여 탈수. 2 분 동안 100 %의 에탄올과 에탄올 세척을 반복합니다. 완전히 실온에서 슬라이드를 건조. </li></ol></li><li> 변성 및 프로브 혼합물의 하이브리드 <ol><li> 간단히 제조자에 의해 공급되는 프로브 혼합물을 원심 분리하여, 7 분 동안 수욕에서 80 ℃ (± 2 ℃)에서 배양 캡 원심 분리 튜브 스냅 500 μL로 프로브 액 10 μL를 전송하고, 변성. </li><li> 10 분 동안 37 ℃에서 수욕 프로브 혼합물 원심 튜브를 놓는다. </li><li> 변성 chromoso와 슬라이드에 변성 프로브 혼합물을 적용MES. </li><li> 조심스럽게 18mm X 18mm 유리 커버 슬립으로 영역을 커버하고 매우 부드럽게 밀어 커버 슬립을 눌러 눈에 보이는 기포를 제거한다. 고무 시멘트와 커버 슬립의 네면을 밀봉 및 하이브리드에 대한 가습 챔버에서 37 ° C에서 어둠 속에서 16 시간에 12 시간 동안 배양. </li></ol></li><li> 포스트 하이브리드 세척 및 검출 <ol><li> 조심스럽게 고무 시멘트와 커버 슬립을 제거합니다. </li><li> 5 분 동안 74 ° C (± 2 ° C)에서 미리 예열 0.4 배의 SSC의 장소 슬라이드. </li><li> 2 분 동안 세척 용액 II (4 배 SSC / 0.1 % 트윈 20)에서 세척 슬라이드. </li><li> DAPI의 Counterstain과 (1.5 μg의 / mL)로 안티 - 페이드 장착 매체의 20 μL를 놓고 유리 커버 슬립으로 다룹니다. 부드럽게 실험실 조직과 coverslip에 눌러 공기 거품과 초과 장착 솔루션을 제거합니다. 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. </li><li> 적절한 필터가 장착 된 형광 현미경을 사용하여 볼 슬라이드. </li></ol></l난&gt; </ol> 5. 스펙트럼 핵형 마우스 염색체의 (SKY) <ol><li> 염색체와 프로브 변성 <ol><li> 흔들림없이, 2 분 동안 실온에서 2 × SSC에서 슬라이드 평형. </li><li> 실온에서 2 분마다 에탄올 시리즈 슬라이드 (70 %, 80 %, 100 % 에탄올)을 탈수. 완전히 에탄올을 제거 할 수있는 슬라이드를 공기 - 건조. </li><li> 따뜻한 40 ML의 변성 용액 (70 % 포름 아미드 / 2 × SSC, 산도 7.0) 30 분 동안 유리 코 플린 항아리입니다. </li><li> 1 ~ 1.5 분 동안 예열 변성 솔루션에 슬라이드를 품어. </li><li> 2 분 변성 과정을 중단뿐만 아니라, 재 어닐링에서 염색체 변성을 방지하기 위해 즉시 빙냉 70 % 에탄올로 슬라이드 젖어. </li><li> 실온에서 2 분 동안 100 % 에탄올로 2 분 후, 80 % 에탄올로 배치 의해 슬라이드 탈수. </li><li> 80 ° C (± 2 ° C)로 설정 수욕에서 SKY 프로브 (제조사에서 제공 한 유리 병 # 1) 변성7 분 후 즉시 10 분간 37 ° C로 설정 다른 수조에 놓는다. </li></ol></li><li> 프로브 하이브리드 <ol><li> 변성 염색체에 변성 SKY 프로브의 10 μL를 추가합니다. </li><li> 기포가 커버 슬립 아래에 갇혀되지 않도록 조심스럽게 SKY 프로브 상에 18mm X 18mm 유리 coverslip에 배치합니다. </li><li> 고무 시멘트와 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. </li><li> 가습 차광판 챔버에 슬라이드를 넣고 36 시간 ~ 24 시간 동안 37 ℃에서 어둠 속에서 배양한다. </li></ol></li><li> 포스트 하이브리드 세척 및 형광 검출 <ol><li> 커버 슬립을 방해하지 않고 매우 신중 고무 시멘트를 제거합니다. </li><li> 일정한 흔들림 5 분 동안 72 ° C (± 2 ° C)에서 미리 예열 빠른 세척 용액 (0.4 배의 SSC)에 슬라이드를 놓습니다. 세척 용액 III (4 배 SSC / 0.1 % 트윈 20)에 슬라이드를 담그고 흔들어 섞으면 서 1 분 동안 품어. </li><li> 옵션 : 차단 시약 80 μL를 추가하이브리드의 영역 상 (제조사에서 제공 한 유리 병 # 2)와, 24mm X 60mm 플라스틱 커버 슬립을 배치하고, 가습 실에서 30 분 동안 37 ° C에서 어둠 속에 품어. </li><li> 조심스럽게 플라스틱 커버 슬립을 제거하고 5 분간 예열 (45 ° C) 세척 용액 III와 슬라이드를 씻는다. </li><li> 80 μL Cy5에 염색 시약 (제조사에서 제공 한 유리 병 # 3)를 적용하는 24mm X 60mm 플라스틱 커버 슬립을 배치하고, 가습 실에서 40 분 동안 어둠 속에서 37 ° C에서 품어. </li><li> 함유하는 유리 코 플린 항아리에 슬라이드를 담근 예열 (45 ºC) 세정액 III (4X SSC / 0.1 % 트윈 20)와 진탕하면서 2 분 동안 수욕에서 45 ℃에서 배양한다. 이 세척 단계를 3 번 ​​반복합니다. </li><li> 80 μL Cy5.5의 염색 시약 (제조사에서 제공 한 유리 병 # 4)를 적용하는 24mm X 60mm 플라스틱 커버 슬립을 배치하고, 가습 실에서 40 분 동안 어둠 속에서 37 ° C에서 품어. </li><li> (미리 예열과 슬라이드 3 회 반복한다45 ºC) 세정액 III. </li><li> 초과 액체를 배출하기 위해 종이 타월에 대하여 기울어 진 위치에 슬라이드를 잡습니다. 20 μL 안티 페이드 DAPI 시약 (제조업체에서 제공 유리 병 # 5)를 추가하고 조심스럽게 기포를 도입하지 않고 24mm X 60mm 유리 coverslip에 배치합니다. 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉 SKY 이미지를 캡처 장착 된 표면 형광 현미경으로 관찰한다. </li></ol></li></ol>

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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+translocation+frequency+analysis+in+humans+decades+after+exposure+to+ionizing+radiation.">Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation.</a> Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).</li><li>Braselmann, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKY+and+FISH+analysis+of+radiation-induced+chromosome+aberrations:+a+comparison+of+whole+and+partial+genome+analysis.">SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis.</a> Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).</li><li>Sokolova, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+multitarget,+multicolor+fluorescence+in+situ+hybridization+assay+for+the+detection+of+urothelial+carcinoma+in+urine.">The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine.</a> J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).</li><li>Lindholm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodosimetry+after+accidental+radiation+exposure+by+conventional+chromosome+analysis+and+FISH.">Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH.</a> Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

몇 가지 중요한 단계는 mFISH과 SKY의 성공을 결정합니다. 첫번째 가장 중요한 단계는 골수 단핵 세포의 생체 유사 분열 정지를위한 콜히친 처리를 최적화한다. 콜히친 농도와 처리 시간을 개별적으로 또는 콘서트에 효과적인 염색체 그림의 유사 분열 지수뿐만 아니라 염색체 응축 - 두 가지 중요한 전제 조건을 결정한다. 높은 콜히친 농도 이상 처리 시간은 적절한 변성과 하이브리드에 대한 호환되지 않는 매우 응축 된 염색체로 연결됩니다. 또한, 응축 된 염색체와 확산 중기 세포의 복잡한 재 배열의 정확한 식별은 달성하기 쉬운 일이 아니다. 22, 26g 사이의 체중을 가진 마우스에서 2 시간 동안 100 μL 0.05 % 콜히친의 복강 내 투여는 중기 세포의 충분한 수가 약간 좁은 염색체 확산 생성한다. 두번째 중요한 단계는 저장성 처리이다.볼륨, 처리 시간, 및 저장성 용액 영향 염색체 형태학의 온도와 유리 슬라이드 상 염색체 확산. 짧은 시간 또는 서브 - 최적의 온도에서 저장 액 처리 중첩 염색체 확산 중기 세포에서 생성 된, 적절한 염색체 확산을 방지 할 수있다. 염색체 중복은 현장 하이브리드 공정, 형광 신호의 특이도, 재 배열의 적절한 식별의 하류 방해합니다. 셋째, 후 저장성 고정 세포 덩어리 형성을 방지하는 중요한 단계입니다. 정착 제는 부드럽고 일정한 단일 세포 현탁액을 얻었다 진탕 원심 튜브의 측면 아래로 서서히 첨가한다. 그렇지 않으면, 중기 세포 스프레드는 대단히 짧은 시간에 갇혀 될 것입니다 및 염색체 손상됩니다 확산. 그러나, 또한 확산 염색체는 t의 세포 유형, 온도 및 습도에 따라유리 슬라이드 상에 세포 현탁액을 적하 IME. Spurbeck 의한 이전의 연구는보고 된 림프구를 들어, 상대 습도 60 % 이상 중기 영역 (18)에서 20 ° C의 온도 결과. 또한, 건조 기간은 최적의 염색체 확산을위한 중요한 공정이다. 중기 세포가 파괴 중기 매우 느린 건조 결과 18 번 염색체 동안 건조 너무 빨리, 많은 중복 염색체와 타이트한 스프레드를 생산하는 것을 펼쳐집니다. 그러나 덩 샤오핑은 주로 확산 염색체가 배양 된 세포 (19)의 다양한 상대 습도에 따라 달라집니다 것으로 나타났다. 네 번째 중요한 단계는 염색체 변성 시간을 최적화하는 것이다. 더 긴 짧은 변성 시간에 악영향 프로브 하이브리드에 영향을 미칩니다. 짧은 변성이 염색체에 프로브의 상호 작용을 방해 동안 긴 변성은 &quot;푹신한&quot;염색체가 발생합니다. 염색체 &quot;붓기&quot;를 감소시키는 또 다른 방법은 실온에서 하룻밤 연령 슬라이드하다전단 변성 단계. 염색체 유화에 사용되지 프레젠테이션 즉시 -20 ºC에서 데시 케이 터 내에서 무한히 저장 될 수있다. 염색체 변성 시간 슬라이드 연령, 중기 세포 퍼짐 주변 세포질의 양이 세포가 슬라이드 상에 적하 하였다되는 습도 표준화되어야한다. 프로브 변성과 하이브리드는 성공적인 염색체 페인팅 중요하다. 그 형광 신호가 신호 강도를 잃지 않도록 밝은 빛에 프로브의 직접 노출은 피해야한다. mFISH과 SKY가 간 염색체 안정 수차를 검출하기위한 강력한 기술이라는 것을 잘 확립되어있다. 임의의 재구성뿐만 아니라 손실 그린 염색체 이득 용이 이러한 두 가지 방법에 의해 식별 될 수있다. 그러나, 내 팔과 간 암 염색체 교환의 검출은 이러한 기술에 의해 할 수 없습니다. 내 팔과 간 암 염색체 교환의 식별이 가능해 BECA되고있다각각 염색체 팔 고유의 여러 가지 빛깔의 물고기 프로브 및 mBAND 생선 프로브의 개발의 사용. 전 핵 노동자에 대한 이전 연구는 mBAND 분석 방사선 손상 (20)의 독특한 서명을 식별 할 수있는 강력한 도구입니다 것으로 나타났습니다. 또한, 자매 염색 분체 교환의 식별, 방사선 손상 (21)의 특징은,이 기술에 의해 수 없습니다. 또한, mFISH과 SKY 모두 전위로 dicentric 염색체의 잘못된 점수가 발생할 수 있습니다 염색체의 센트로 미어 영역을 페인트 할 수있는 능력을 제한하고있다. 기술은 또한 전위의 정확한 위치 파악 중단을 식별하기에 적합하지 않다. 또한 형광 신호가 영구히 유지 될 수없고, 신호 강도는 시간에 따라 감소하고, 형광 염색체 회화는 자동화 된 시스템에 의한 분석에 적합하지 않다. 그러나, 형광 신호 강도 미끄러 저장함으로써 장기간 보존 할 수있다냉장고에서 말이지. 염색체 페인팅 두 개선 된 방법 및 mFISH SKY의 한계를 극복하기 위해 개발되었다 : 각각 비 형광 염색체 그림 (22)과 분광 컬러 (SCAN) 23 밴딩. FISH 페인팅 통해 퍼 옥시 다제 / 디아 미노 벤지딘 (DAB)를 이용하여 비 형광 염색체 회화의 장점은 정확한 센트로 영역의 식별 명 시야 현미경으로 염색체 재 배열을 식별하고, 그 영구 보존 비 형광 신호 및 이미지 분석 할 수 포함 자동화 될 수있다. SCAN 프로브는 특정 염색체에 대한 밴드 별 게놈 DNA 서열로부터 제조되고, 따라서 정확한 염색체 밴드의 출처를 확인할 수 있기 때문에, 한편, SCAN은 하늘에 유리하다. SCAN은 내 염색체 교환의 식별을 용이하게한다. 개선 된 방법의 이점을 고려하면,이 루틴은 사용 전 고려되어야n은 임상 세포 유전 학적 검사. 그러나, 각 염색체 쌍의 주파수 대역 별 게놈 DNA 서열로부터 탐침의 제조가 기술적 도전 분자 유전학에서의 사용을 제한한다. 처리 군 간의 차이는 통계적으로 유의인지 여부를 판정하는 분자 유전학의 또 다른 중요한 측면이다. 이러한 중기 세포의 수와 같은 채점 기준은 처리 군, 분석 중에 확산 중기 세포 당 염색체 카운트 당 사용 된 동물의 수는, 명칭 등 염색체 유화 후에 관찰 수차 분류 통계적 불확실성을 결정하는데 중요한 역할을하는 데, 카운트 스프레드 치료 그룹 사이. 다양한 실험실 독점 채점 기준, 셀은 적어도 3-5 마우스에서 40 잘 구분 염색체와 확산 (100) 중기 300에 20의 점수를 가지고 있지만 일반적으로 mFISH과 SKY 항문에서 통계적 유의성을 결정하는 것이 좋습니다이 Analysis, 각각 24, 25. 또한, 그린 염색체 수차를 분류하는 데 사용되는 용어의 선택은 통계적 불확실성을 평가하기위한 중요한 파라미터이다. 전체 염색체 페인팅 프로브에 의해 검출 수차를 설명하기 위해 사용이 인기 명명법 시스템이있다 : (1) S &amp; S 터커 등으로 야만인와 심슨 (26), 27 (2) PAINT 명명법에 의한 분류 방법. 28. 각 시스템은 구조적 염색체 이상 분류에 대해 서로 다른 전제 조건에 의존하고 자신의 장점과 단점이 있습니다. PAINT 비정상 페인팅 패턴에 대한 설명을 제공하는 반면 S &amp; S 시스템 수차 기원 역학적 해석에 주로 적합하다. Knehr 등의 알에 의해 연구. FISH 그린 염색체 방사선 유발 염색체 이상에 PAINT 방법에서, S &amp; S 시스템과 같은, 일부 modificati 수차와 원점을 결정하는 데 사용될 수 있다는 지시및 채점 기준에서의 실용적인 응용 프로그램 (29)에 가장 유용 할 것이다. 두 mFISH과 SKY 방법은 자신의 한계를 가지고있다. 예를 들어, mFISH하지만,이 수차의 주파수를 측정하기 위해 모든 염색체를 선별하지 않고, 적은 훈련으로 빠른 득점을 허용 및 연구에 사용 된 그린 염색체의 수에 따라 부분적 수차 주파수를 보여준다. 그러나, 전체 염색체 페인팅 관찰 총 교환의 일부분은 원래 루카스 동부 등에 의해 가정 식으로 추정 할 수있다. 30 추가 Braselmann 등의 알에 의해 수정. 31. 이 수학 공식 페인트 염색체 중 그린과 대조 염색체 사이의 교환을 고려한다. 예를 들어, F (P)가 그린 염색체에 의해 덮여 게놈의 부분 합을 나타낼 수 있도록 한 (F 1), 2 (F 2), 3 (F 3) 갔지1 = 0.0696, 2 F = 0.0649, 및 F F 3 = 0.0570 재, 값이 암컷 마우스에서 개별 염색체의 게놈 내용을 나타냅니다. (- F P는 1) = 0.808 따라서, f를 P = (F 1 + F 2 + F 3) = 0.192과 대조 부분이된다. 페인트와 대조 염색체 (F P)를 포함하는 교류의 주파수는 쉽게 이항 팽창 외적 (p의 +의 Q)에 의해 계산 될 수있다 (2) P = 2 + 2pq + Q 2, p = F p와 q = (1 - F 쪽). 따라서, F P = 2pq = 2 층 P (1 - F 피) = 0.310, 의미 염색체 교환의 31 %는 마우스 염색체-1, -2 페인팅 후 관찰하고, -3입니다. 따라서, 1 / 0.31 = 3.23 셀 한 줄무늬 중기 세포 또는 하나의 전체 게놈 당량 동일하게 획득 될 필요가있다. 또한, mFISH과 SKY 둘과 특이 능력을 제한ically 수차 형성에 관여하고, 또한 작은 중복, 역전 및 삭제를 검출하는 유전자와 중단 식별한다. mFISH과 SKY 분석의 응용 프로그램은 기초 ​​연구에 한정되는 것은 아니다. 모두 정기적으로 임상 연구에서 이용되고있다. 이러한 기술들은 산전 산후 진단, 위험 평가 및 암의 다양한 유형의 식별에 적용되어왔다. 또한, 양쪽 기술은 계면 염색체 도장 할 수있다. 소코 로바는 처음으로 32 상간 염색체를 페인트 mFISH을 사용했다. 이러한 기술은 방사선 (11), (33)을 이온화에 실수로 또는 의도적으로 노출 된 후 인간의 사후 조사 선량 추정 및 위험 평가에 사용됩니다. 따라서, mFISH 또는 SKY에 의해 일부 또는 전체 게놈 분석은 각각 다양한 연구에 대한 간 염색체 안정 수차를 감지하는 유용한 도구입니다.

The two most reliable methods of identifying radiation-induced inter-chromosomal stable aberrations are multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH), which allows the painting of two or more chromosomes simultaneously, and spectral karyotyping (SKY), which imparts a distinct color to each homologous chromosome pair in the genome. Unlike unstable aberrations, stable aberrations are persistent in nature and may be propagated for several generations in irradiated populations1, and are regarded as critical molecular "signatures" of radiation-induced cytogenetic lesions2. Studies by various groups have shown that stable aberrations are associated with the pathogenesis and development of a number of diseases, including cancer3. Before the era of chromosome painting (also referred as molecular cytogenetics), the conventional G-banding technique was the only method for detecting stable chromosomal aberrations. However, chromosome banding is a challenge to cytogeneticists because the resolution is limited, reproducibility is uncertain, it is a labor-intensive procedure, and it requires highly skilled and experienced cytogeneticists for reliable data interpretation4. Moreover, the classic banding technique does not allow detection of complex chromosomal rearrangements, which involve the interaction of three or more breaks distributed among two or more chromosomes, a common outcome of radiation damage. Complex aberrations may persist in individuals many years after radiation exposure, making them useful for retrospective biodosimetry5. Therefore, an alternate approach was required to overcome the limitations of conventional banding techniques to detect stable chromosomal rearrangements. 
In the late 1960s, the pioneering work of Gall and Pardue (1969) on molecular hybridization using nucleic acid probes labeled with radioactive material commenced a new era in the field of cytogenetics, which allowed detection of a specific DNA sequence on chromosomes6. However, the use of radioactive probes for molecular hybridization had several drawbacks: radioactive probes are relatively unstable, probe activity depends on radioactive decay of the isotope used, hybridization takes a longer time, the resolution is limited, the probes are relatively costly, and the radioactive materials are a health hazardous. Thus, it became necessary to develop and design non-radioactive probes. The introduction of fluorescent tagged nucleic acid probes in the 1980s and 1990s overcame the limitations of radioactive probes and greatly enhanced the safety, sensitivity, and specificity of the hybridization technique7-10. Fluorescent probes give rise to extremely bright signals when observed under fluorescence microscopes equipped with the appropriate excitation and emission filters. Any loss, gain, or rearrangement of fluorescent labeled chromosome/s or a part of the chromosome is easily identifiable with this FISH technique.
Analysis of chromosomal aberrations by FISH painting has led to marked progress in cytogenetic research over the years. Designing fluorescent labeled probes for specific applications ranging from locus-specific probes to whole-chromosome painting probes has advanced the field significantly; this has also facilitated the detection of submicroscopic ("cryptic") rearrangement, which was not possible by conventional chromosome banding. Chromosome painting by mFISH and SKY have proven to be valuable tools for the identification of simple and complex inter-chromosomal rearrangements. The basic principles for both techniques are similar, but the method of detection and discrimination of fluorescent signal after in situ hybridization and the process of image acquisition are different. In mFISH, separate images of each of the four fluorochromes are captured by using narrow bandpass microscope filters; dedicated software is then used to combine the images. While in SKY, image acquirement is based on a combination of epifluorescence microscopy, charge-coupled device imaging, and Fourier spectroscopy, which allows the measurement of the entire emission spectrum with a single exposure at all image points. In both mFISH and SKY, monochrome images are captured independently, then merged, and finally, unique pseudo-colors are assigned to the chromosomes in monochromatic images based on the specific dye attached to each fluorochrome probe.
The contribution of mFISH and SKY analysis in the radiation biology field is remarkable, particularly for retrospective dose estimation of human exposure to IR (radiation biodosimetry)11-14, radiation carcinogenesis risk assessment15, as well as detection and risk estimation of radiotherapy-related secondary cancer16. A recent study on mice has shown that a FISH-based chromosome painting technique is also an important tool for evaluating the efficacy of radiation countermeasure17. In the present study, the effect of total body radiation exposure on the induction of stable chromosomal aberrations in the bone marrow cells of mice has been demonstrated using mFISH and SKY techniques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="889">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:451px;">Formamide</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:108px;">221198-100ML</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SSC Buffer 20&#215; Concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6639-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SKY Laboratory Reagent for Mouse</td>
			<td>Applied Spectral Imaging</td>
			<td>FPRPR0030/M40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CAD - Concentrated Antibody Detection Kit</td>
			<td>Applied Spectral Imaging</td>
			<td>FPRPR0033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua</td>
			<td>Applied Spectral Imaging</td>
			<td>FPRPR0182/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC45055-0025&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisherbrand Glass Staining Dishes&#160; with Screw Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KaryoMAX Potassium Chloride Solution&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10575-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Colcemid powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-464-757&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Histopaque-1083&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator</td>
			<td>J. L. Shepherd &#38; Associates</td>
			<td>Model 484B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1 ml</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>647911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethyl Alcohol, 200 Proof</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MEX02761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS, (1X PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1860454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-437-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC295320010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AXIO Imager.Z2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of inter-chromosomal stable aberrations by multiple fluorescence in situ hybridization (mfish) and spectral karyotyping (sky) in irradiated mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

전신 방사선 조사 된 마우스의 골수 세포에서 다수의 염색체 수차를 유도한다. 현재 프로토콜은 방사선 조사 후 골수 세포의 생체 유사 분열 정지를 위해 최적화되고, 밀도 구배 원심 분리, 중기 세포 퍼짐의 제조 및 후속 의해 조사 생쥐 골수 단핵 세포의 분리의 뒷다리 골수 세포의 수확 mFISH과 SKY 기술에 의해 방사선 유발 안정적인 염색체 이상 검출. 염색체 이들 기술은 검색 및 다양한 병태 생리 학적 증상의 위험을 평가하는 데 이용 될 수 그림. 도 1은 대표적인 중기 세포는 정상 및 비정상 마우스 염색체 쌍-1, -2, -3에 확산 나타낸다. 그림 2는 정상 및 비정상 마우스 중기 염색체의 스펙트럼 핵형을 보여줍니다.이러한 결과는 전리 방사선 것은 주로 다양한 세포 유형으로자가 재생과 분화에 대한 책임 줄기 및 전구 세포로 구성된 상기 확산 뮤린 골수 세포에서 염색체 간 안정적 수차를 유도하는 것으로 나타났다. 줄기 및 전구 세포에서 세포 유전 학적 변화는 암을 포함한 다양한 임상 질환과 연관 표시되었습니다, 질병 심각도 및 전반적인 생존을위한 가장 강력한 예측 인자로 간주됩니다. 따라서, 방사선 - 유도 된 안정한 염색체 간 수차를 이온화하여 암 발생의 위험이 발생할 수 있음을 추론 논리이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55162/55162fig1.jpg" /> 그림 1 : mFISH에 의해 감지로 조사 된 마우스의 골수 세포에 방사선의 효과. A 및 B는 CH 정상적인 쌍 마우스 중기 세포의 확산을 보여준다romosome-1 (적색), 염색체 2 (녹색), 및 염색체 -3- (아쿠아). 다른 모든 염색체는 DAPI (파란색)으로 대조된다. C는 다른 부분은 acentric 단편을 형성 반면 염색체 1, 염색체 1의 일부가 아닌 그린 (DAPI) 염색체에 통합되어 수반 안정 수차를 나타낸다. D는 염색체 2의 부분의 일부가 아닌 그린 염색체에 통합 된 나타낸다. E는 염색체-3를 포함하는 안정적인 수차를 나타냅니다. F는 세 가지 그린 염색체를 포함하는 안정적인 수차를 보여줍니다. 브레이크 포인트 컬러 접합은 화살표로 표시됩니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55162/55162fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55162/55162fig2.jpg" /> 그림 2 : 뼈 마르에 방사선의 효과SKY에 의해 감지으로 조사 된 마우스의 흐름 세포. 상단 패널은 C57BL / 6 암컷 마우스의 정상적인 스펙트럼 핵형 (SKY)를 보여줍니다. 중간 패널은 염색체-4 및 염색체-12을 포함하는 안정적인 수차를 보여줍니다. 하단 패널은 염색체 7 염색체-10을 포함하는 안정적인 염색체 이상을 가진 마우스 스펙트럼 핵형을 보여줍니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55162/55162fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

여러 형광에 의한 간 염색체 안정 수차의 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (mFISH) 및 방사선 조사 마우스의 스펙트럼 핵형 분석 (SKY)

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

detection-inter-chromosomal-stable-aberrations-multiple-fluorescence

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

9.8K 조회수.  University of Arkansas for Medical Sciences. The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. 

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In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

에듀 염색에 의한 초파리 성인 난소에서 미토콘드리아 DNA 복제의 제자리 라벨에

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

연구

유전학

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. To assess the impact of PM on nuclear genetic integrity, structural chromosomal aberrations are scored in the metaphase spreads of mouse RAW264.7 macrophage cells. PM is collected from ambient air with a high volume total suspended particles sampler. The collected material is solubilized and filtered to retain the water-soluble, fine portion. The particles are characterized for chemical composition by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Different concentrations of particle suspension are added onto an in vitro culture of RAW264.7 mouse macrophages for a total exposure time of 72 hr, along with untreated control cells. At the end of exposure, the culture is treated with colcemid to arrest cells in metaphase. Cells are then harvested, treated with hypotonic solution, fixed in acetomethanol, dropped onto glass slides and finally stained with Giemsa solution. Slides are examined to assess the structural chromosomal aberrations (CAs) in metaphase spreads at 1,000X magnification using a bright-field microscope. 50 to 100 metaphase spread are scored for each treatment group. This technique is adapted for the detection of structural chromosomal aberrations (CAs), such as chromatid-type breaks, chromatid-type exchanges, acentric fragments, dicentric and ring chromosomes, double minutes, endoreduplication, and Robertsonian translocations in vitro after exposure to PM. It is a powerful method to associate a well-established cytogenetic endpoint to epigenetic alterations.

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

This protocol describes techniques for the quantification and characterization of chromosomal aberrations in vitro in RAW264.7 mouse macrophages after treatment with ambient air particulate matter.

를 사용하여 주변 입자상 물질에 의한 염색체 수차 분석<em&gt; 체외</em&gt; 시스템

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 Microbiota의 시각화

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.