이 프로토콜은 원래 린다 벅의 연구실에서 Xiaolan 예와 마이클 Petrascheck에 의해 시애틀에서 프레드 허치슨 암 연구 센터에서 개발되었습니다. 위의 자세한 버전은보다 넓은 지역 사회에 사용할 수있는 모든 절차를 준비하고 있습니다. 우리는 비판적 프로토콜을 읽기위한 캐롤 테일러, 사라 르뵈프와 앤디 Tomacelli 감사드립니다. 이것은 스크립스 연구소에서 원고 # 2866입니다. Petrascheck 연구소는 노바티스 ADI 프로그램에 의해 자금입니다.

개요 : 프로토콜은 네 부분으로 나뉩니다. 파트 1은 먹이 박테리아를 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 파트 2 웜 문화를 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 3 부에서는 수명을 점수하는 방법에 대해 설명합니다. 4 부에서는 몇 가지 대표적인 결과를 보여줍니다, 그리고 제 5 부에 필요한 솔루션을 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 수명 실험을 완료하는 데 몇 주가 걸릴. 프로토콜 주간의 각 단계에 대한, 일, 그리고 하루의 시간 계획을 용이하게하기 위해 포함됩니다. L4 단계 (데이 0) 전체 프로토콜에 대한 참조 포인트로 사용됩니다. 1. 수유 박테리아의 준비 이 섹션은 먹이 박테리아의 준비에 대해 설명합니다. 특정 E. 대장균은 OP50라고 C.elegans를 공급하는 데 사용되는 변형. 다른 박테리아와 웜 문화의 교차 오염을 방지하기 위해이 프로토콜을하기 전에, OP50 변형이 Carbenicillin / 암피실린 저항 21하였습니다. 사전에 OP50 4~5일를 준비합니다. OP50과 연락 오는 모든 자료는 멸균해야합니다. 일 -7 : 목요일 (주 1) : 접종 37 박 이상의 단일 OP50 식민지와 부화 ° 세균 통에 C 100 μg / ML 암피실린 및 0.1 μg / ML Amphotericin B를 포함하는 TB 5 ML. 일 -6 : 금요일 (주 1). 아침 8시 반. 문화 충분한 시간이 포화에 도달하도록 초기 접종 <ol><li> 50 μg / ML 암피실린을 포함한 300 ML의 TB에서 OP50 1:2000의 야간 문화를 희석. 채도에 도달할 때까지 37 8~12시간에 대한 세균 쉐이크 ° C의 문화를 품다. 문화 14 시간 이상 성장을 허용하지 않습니다. </li><li> 멸균, 사전에 가중치 원심 분리 관에 OP50을 전송합니다. 펠렛 테이블 톱 원심 분리기에서 3,500 RPM (2,200 XG) 10 분 원심 분리하여 OP50. </li><li> 뜨는을 취소하고 멸균 물 속에 다시 중지 OP50 펠렛하고 다시 원심 분리하여 펠렛. 두번 세척을 반복합니다. </li><li> 두 번째 세척 후, 모든 남아있는 물을 조심스럽게 제거합니다. 물도은 튜브에 남아되지 않을 것입니다. 펠렛을 포함하고있는 원심 분리 튜브를 저울질하고 펠렛의 무게를 결정하기 위해 비어있는 원심 분리 관의 무게를 뺍니다. </li><li> 철저히 100 MG / ML의 농도 S - 완료의 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 아무도 대단히 짧은 시간을 둘 수 없습니다. </li><li> 100 MG / ML OP50의 농도는 2 X10 10 세균 / ML에 해당한다. ML 당 박테리아의 광학 밀도와 숫자 사이의 관계가 알려져있다면 ML 당 박테리아의 수를 결정하는 사​​진 분광계를 사용하십시오. 필요한 경우, 2 X10 10 세균 / ML에 OP50 먹이 솔루션의 농도를 조정합니다. </li><li> 4 OP50solution를 저장 °가 웜 문화에 사용되는 C까지. </li></ol> 2. 동기 웜 문화의 준비 이 섹션은 웜 문화의 준비에 대해 설명합니다. 그 목표는 벌레의 시대 - 동기 인구를 생성하는 것입니다. 5 단계에서 표백제 치료 후 C.elegans와 연락 오는 모든 자료는 멸균해야합니다. 플레이트는 별도로 표시 ° C 않는 20 보관됩니다. 일 -6 : 금요일 (주 1), 오후 4 오후 : 새로운 접시에 동물을 전송 <ol><li> 웜 인구의 대다수가 굶어 죽었을 L1의 애벌레로 구성되어있는 5-10일 오래된 NGM 판을 가져가라. </li><li> 곧 알콜 램프를 통해 그것을 가열하여 금속 주걱을 소독. 그것은 식지. 굶주린 벌레가 들어있는 접시에서 한천 덩어리를 잘라 냉각 주걱을 사용합니다. OP50와 신선한 10cm NGM 판에 씨앗이 덩어리 몇 가지를 전송합니다. 약 품어. 웜 인구의 대부분 gravid 성인 구성되어 ° C까지 20 65시간. 그것이 gravid 성인으로 성장하기 위해 굶어 L1 동물을위한 소요 시간은 변형의 변형에 따라 다를 수 있습니다. </li></ol> 주 -3 : 월요일 (주 2) 오전 10:00 : 동기 인구를 설정 <ol start="3"><li> 50-10 ML 멸균 물을 접시 그들을 세척하여 10cm 접시에서 벌레를 수집합니다. 15 ML 원뿔 관에 웜 / 물 솔루션을 전송합니다. </li><li> 1,200 RPM (280 XG)에서 탁상 원심 분리기 2 분 centrifuging하여 벌레를 씻으십시오. 뜨는을 취소하고 10 ML 물을 추가합니다. 반복합니다. </li><li> 뜨는 제거하고 신선한 표백 / NaOH 용액 (2.5 ML 가정용 표백제, 1 ML 10N NaOH, 6.5 ML H 2 O) 5 ML를 추가합니다. 벌레가 열려 휴식까지 RT에서 5 분 동안 품어. 부드럽게 와동 모든 분하시기 바랍니다. 해부 현미경 반응의 진행 상황을 모니터링합니다. </li><li> 즉시 모든 어른 디졸브로 반응을 무력화 M9 버퍼의 5 ML를 추가합니다. </li><li> (2,500 RPM에서 2 분 centrifuging 10 ML M9 버퍼와 달걀 세 번 씻어1,100 XG). </li><li> 한번와 계란을 씻어 10 ML 2,500 RPM (1,100 XG) 2 분 centrifuging하여 S - 완료되었습니다. </li><li> 뜨는 제거를 추가, 10 ML S는 - 완전하고 신선한 50 ML 원뿔 관에 대한 해결책을 전송합니다. 40 ML의 최종 볼륨 S - 완성 30 ML을 추가합니다. 부드럽게 nutator 또는 이와 유사한 장치에 실온에서 하룻밤 튜브를 흔들. </li></ol> 일 -2 : 화요일 (주 2) 12:00 : 접시에 종자 동물 <ol start="10"><li> 해부 현미경, 벌레가 밤 동안 부화 여부를 확인하십시오. 해부 범위를 사용하여 10 μL 방울의 벌레의 수를 계산하여 S - 완벽한 솔루션에 벌레의 농도를 결정합니다. 각 샘플에 대해 적어도 10 방울을 계산합니다. </li><li> 80-100 웜 / S 완성에 ML의 농도에있는 벌레를 다시 일시 중지합니다. 0.1 μg / ML의 최종 농도 50 μg / ML과 Amphotericin B (재고 250 μg / ML)의 최종 농도 Carbenicillin을 (재고 100 MG / ML) 추가합니다. nutator 악수. 벌레의 큰 수량을 준비하면, 필터 캡과 함께 600 ML의 nunclon 플라스크를 사용합니다. </li><li> 오후 2시 반 6 MG / ML (= 1.2 X10 9 세균 / ML)의 최종 농도 1 부에서 준비한 OP50를 추가합니다. OP50 4 ° C.로 돌아가기 </li><li> 96 잘 접시의 각 우물에 worm/OP50 솔루션을 120 μL을 전송합니다. 투명한 바닥과 96 잘 접시를 사용합니다. pipetting 동안 정지에있는 벌레를 유지 있는지 확인하십시오. </li><li> 오염 및 증발을 방지하기 위해 테이프 실러를 사용하여 번호판을 밀봉합니다. 2 분 microtiter 접시 쉐이크에 접시를 흔들 동물 L4 단계에 도달할 때까지 20 이일 ° C에 대해 숙고하다. </li></ol> 일 0 : 목요일 (주 2) 정오가 : Fluorodeoxyuridine을 추가하여 동물을 소독 (FUDR) <ol start="15"><li> 동물이 각각 잘 수있는 0.6 MM의 FUDR 주식 솔루션 30 μL를 추가 소독합니다. 이 단계는 150 μL 각 우물에 최종 볼륨을 제공 5 MG / ML (1x10 9 세균 / ML)에 6mg / ML에서 OP50의 최종 농도를 감소시킵니다. 테이프 실러스를 사용하여 번호판을 봉인하고 microtiter 접시 쉐이크에서 2-3 분 흔들어. OP50이 일 -2에서 2시 30 분에 추가되었습니다면, 그것은 FUDR은 정오 전에 추가하는 것이 중요합니다. 20 ° C 배양기에 플레이트로 돌아가기 </li></ol> 1 일 : 금요일 (주 2) : 문화에 약물을 추가 <ol start="16"><li> 오전 9함으로써 동물의 대부분 gravid 여러 계란 각을 포함해야합니다. 누구의 영향 수명에 원하는 농도에서 테스트하는 약물을 추가합니다. DMSO에 마약을 분해하는 경우 DMSO의 최종 농도는 0.6 %가 C.elegans 수명을 단축보다 DMSO의 농도 높은 같은 0.6 %를 초과해서는 안됩니다. 약물 이외 후, 테이프 실러와 접시를 봉인하고 microtiter 접시 쉐이크에서 2-3 분 흔들어. 20 ° C 배양기에 플레이트로 돌아가기 </li><li> 마약를 추가하면 때때로, 특히 물보다 용매의 다른을 사용하는 경우, 접시 당 몇몇 동물을 죽일 수 있습니다. 죽은 동물을 확인하는 거꾸로 현미경을 사용합니다. 일반적으로, 96 잘 접시 당 미만 10 죽은 동물이 있어야합니다. 20 ° C 배양기로 번호판을 반환합니다. </li></ol> 일 4 : 월요일 (주 3) : 변경 실러스 <ol start="18"><li> 실러를 제거 문화를 입력 신선한 산소를 허용하려면, 일분 후에 접시를 봉인. microtiter 접시 쉐이크에 2-3분에 대한 번호판을 흔들어. 매주 한 번 반복합니다. </li></ol> 제 5 일 : 화요일 (주 3) : 기아를 방지하기 위해 새로운 OP50 추가 <ol start="19"><li> 기아를 방지하기 위해 96 우물의 각 부분 1 준비했습니다 100 MG / ML OP50 솔루션의 5 μL를 추가합니다. </li></ol> 3. 수명의 점수. 이 섹션은 동물들이 죽을때까지 제 2의 동기 웜 인구의 생존을 감시하는 방법을 설명합니다. 96 잘 접시에있는 동물을 관찰하려면, 2X 또는 2.5x 목적으로 거꾸로 현미경을 사용합니다. 기록 생존 데이터를 일주일에 세 번, 월요일, 수요일, 금요일. 동물이 살아 있거나 죽어있는지를 확인하기 위해 움직임을 사용합니다. 강한 빛, 특히 푸른 불빛이 이동하는 동물을 유도. 분석에서 죽은 동물을 제거하지 마십시오. 때로는 움직이지 않았고 앞의 수가 죽은 결정 동물은 나중에 이동 할 수도 있습니다. <ol><li> 일 0에, 실험의 시작 부분에 각 우물에 벌레의 총 수를 계산합니다. 이 우물의 동물로 분석에서 이상의 18 동물을 포함 우물을 검열 충분 OP50이되지 않으며식이 제한의 효과를 보여줍니다. </li><li> 동물 2 분 microtiter 접시 쉐이크에 96 접시를 잘 흔들어 이동하는 기회를 증가하기 위하여. 전에 계산. </li><li> 각 계수 세션 기록 날짜 및 동물의 수가 어느살아있는 동물로 이동합니다. 액체의 운동은 단단한 미디어에보다 쉽게​​하고 강한 조명에 의해 유도된 수 있습니다. 높은 배율의 사용은 인두의 끝을 분들처럼 매우 미묘한 움직임을 탐지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 미묘한 움직임은 종종 아주 오래된 동물 관찰 유일한 운동입니다. </li><li> 20 ° C 배양기에 플레이트로 돌아가기 </li><li> 모든 동물이 죽을 때까지 2~3일마다 2-4 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 대표 결과. 이 섹션에서는이 분석과 몇 가지 대표적인 결과에 의해 생성되는 수명 데이터의 기록을 유지하는 방법에 대한 예제를 보여줍니다. 그림 1A는이 분석하는 동안 수명 데이터를 기록하는 방법에 대한 예제를 보여줍니다. 엑셀 시트는 생존 각 우물에 인구를 추적하는 데 사용됩니다. 각 잘 들어 그것이 몇달이 좌표의, 스트레인, 마약, 약물의 농도와 일 0에 살아있는 동물의 총 개수는 (X0) 실험의 시작 부분에 기록됩니다. 기록 날짜뿐만 아니라 생활과 죽은 동물의 수를 세 번 각각 잘의 다양한 인구의 생존을 수행하기 위해 주. 그래프 결과를 위해, 매일 매일 살아있는 동물의 분율을 계산하고 일 시간의 함수로 플롯. P - 값은 스타타 또는 이와 유사한 소프트웨어와 같은 통계 패키지를 사용하여 계산해야합니다. C.elegans의 매체 수명은 온도에 따라 달라집니다. 그림 1B는 수명의 온도 종속 변경 사항이 정확하게 수명 분석 22 기반 microtiter에 의해 복제되는 보여줍니다. 마찬가지로, microtiter 플레이트 분석 야생 타입 N2 동물 23-24 25 (그림 1C)에서 다를 lifespans을보고 돌연변이에서 수명의 변화를 재현한. 분석은 또한 더 많은 양적 진술을하기 위해 사용할 수 있습니다. Fig1D의 의미에서 수명이 Mirtazepine 농도 7 기능으로 꾸몄다 있습니다. 각 데이터 포인트는 7-12 인구의 평균 수명, 잘 다른 각 생활을 나타냅니다. 잘마다 동물의 숫자 (5-15 동물) 비교적 낮은 경우에도 오차 막대에서 볼 수 있듯이 잘 - 투 - 잘 편차는 상대적으로 작다. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 수명 분석을 기반으로 microtiter 플레이트 정확하게 수명의 변화에 문헌에 보고된를 재현한. (A) 샘플 데이터는 Excel 스프레드 시트에서 수집했습니다. 각 계수 세션 날짜 동안 잘의 좌표와 살고 죽은 동물의 숫자를 기록했다. 실험의 시작 부분에서, 각 우물에 동물의 총 개수가 결정되었습니다. (B) 야생 유형의 생존 곡선 (N2) 동물 20 성장 ° C와 25 ° C. 수명에 영향을 변이를 들고 종자의 (C) 서바이벌 곡선. 네개의 변종은 20 ° C.에 병렬로 assayed되었습니다 Mirtazepine 취급 N2 동물 (D) 선량 반응 곡선. 평균 수명은 Mirtazepine 농도의 함수로 꾸몄다 있습니다. 오류 막대는 조건 1 일 8 웰스의 SEM을 나타냅니다. 5. 자료. M9 버퍼, 1000 ML <ul><li> 6g 나 2 HPO 4 </li><li> 3g KH 2 PO 4 </li><li> 5g NaCl </li><li> 0.25 g MgSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> 1000 ML에 탈이온수 추가 </li><li> 압력솥 </li></ul> Potassiumphosphate 버퍼 산도 6.0 1000 ML <ul><li> 136g KH 2 PO 4 </li><li> 900 ML에 탈이온수 추가 </li><li> 5M 코와 6.0 산도를 조정 </li><li> 1000 ML에 탈이온수 추가 </li><li> 압력솥 </li></ul> 추적 금속 솔루션 <ul><li> 1.86 g 나이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </li><li> 0.69 g FeSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> 0.20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0.29 g ZnSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> 0.016 g CuSO 4 </li><li> 1000 ML 물을 deionized </li><li> 압력솥과 어둠 속에 저장합니다. </li></ul> S - 기초 중간, 1000 ML <ul><li> 5.9 g NaCl </li><li> 1M 칼륨 나트륨, 산도 6.0의 50 ML </li><li> 1000 ML 물을 deionized </li><li> 압력솥 </li><li> 5mg / ML 콜레스테롤 (잇 - OH에 용해) 1 ML을 추가합니다 다음 솔루션은 식지합니다. </li></ul> 칼륨 구연 산염의 1M 1000 ML <ul><li> 268.8 g의 tripotassium의 구연 산염 </li><li> 26.3 구연산 산성 일수화물 </li><li> 900 ML 탈이온수 추가 </li><li> 5M 코와 6.0 산도를 조정 </li><li> 1000 ML에 탈이온수 추가 </li><li> 압력솥 </li></ul> S - 완료 중간, 1000 ML <ul><li> 977 ML S - 기저 </li><li> 10 ML 1M 칼륨의 구연 산염의 산도 6 (살균) </li><li> 10 ML 트레이스 금속 용액 (살균) </li><li> 3 ML 1M CaCl 2 (살균) </li><li> 3 ML 1M MgSO 4 (살균) </li></ul> NGM의 한천 <ul><li> 3.0g NaCl </li><li> 2.5G Pepton(카제인에서 췌장 소화) </li><li> 17g 아가르 </li><li> 탈이온수 975 ML과 감동 바 추가 </li><li> 압력솥 </li><li> 55 식다 autoclaving 후에 ° C 다음과 같은 구성 요소를 추가합니다 : <ul><li> 1M CaCl 2 (멸균)의 0.5 ML </li><li> 에탄올의 5mg / ML 콜레스테롤 1 ML </li><li> 1M MgSO 4 (멸균) 1 ML </li><li> 25 ML의 Potassiumphosphate 버퍼, 산도 6.0 (멸균) </li></ul></li></ul> TB 1000 ML <ul><li> 12g Bacto Tryptone </li><li> 24g의 효모 추출 </li><li> 4 ML의 글리세롤 </li><li> 900 ML 탈이온수 추가 </li><li> 압력솥 </li><li> 55 식다 autoclaving 후에 ° C 다음과 같은 구성 요소를 추가합니다 : <ul><li> 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 100 ML을 추가 </li></ul></li></ul> 0.6 MM Fluorodeoxyuridine (FUDR, 시그마 고양이 # F0503), 1000 ML <ul><li> 100 MG FUDR </li><li> S - 완전 무균 670 ML에 용해, 10 ML 45 ML aliquots합니다. </li><li> -20 ° C.에 저장 </li></ul> 100 MG / ML Carbenicillin, 10 ML <ul><li> 1g Carbenicillin </li><li> 10 ML 무균 탈이온수 </li><li> 무균 여과액 및 나누어지는 </li><li> -20 ° C.에 저장 </li><li> 50 μg / ML의 최종 농도에서 사용 </li></ul> 250ug / ML Amphotericin B, 4 ML <ul><li> 1mg Amphotericin B </li><li> 4 ML 잇 - OH </li><li> -20 ° C에서 보관 </li><li> 0.1 μg / ML의 최종 농도에서 사용 </li></ul>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist.">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li><li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model.">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).</li><li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+function+in+novel+targets:+C.+elegans+as+a+model+organism.">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution.">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span.">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li><li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li><li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes.">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

제시 프로토콜 96 잘 microtiter 접시에 C.elegans 수명의 측정을하실 수 있습니다. 으로 대표 결과에 표시된 섹션은 안정적으로 이전 결과를 복제 및 양적 정보를 제공합니다. 이 분석을 사용 우리는 성공적으로 C.elegans 수명에 대한 그들의 영향에 대한 89,000 분자 이상 검사를했습니다. 약물 검사의 목적을 위해, 96 잘 microtiter 플레이트 형식의 수명을 측정하는 것은 전통적인 고체 미디어 분석을 통해 몇 가지 장점이 있습니다. 그것은 미디어 준비, 보육 공간, 그리고 필요한 약물의 양을에 필요한 노동을 줄일 수 있습니다. 96 - 웰 형식과 현미경 설정은 높은 처리량 검사에 대한 전체 분석의 자동화를 허용합니다. 분석의 개발 기간 동안 각 변수와 조합에 대해 여러 개의 값이 그에 C.elegans 수명에 미치는 영향에 대해 테스트되었습니다. 이 테스트는 3에서 10에 이르기까지 다양한 OP50 농도를 포함 MG / ML (3, 4, 6, 8, 10 MG / ML), 7에서 45 (7, 10, 15, 22, 45에 이르기까지 잘 따라 웜의 다른 번호 웜 / 음), 40에서 150 잘마다 μL (40, 60, 80, 100, 120, 150 μL), 그리고 버퍼 구성의 변화에​​ 이르기까지 다양한 문화 볼륨. 먹은 경우 Carbenicillin 방지 OP50와 농도에 Carbenicillin이나 Amphotericin B도가 표시가 C.elegans 수명에 영향을 찾았습니다. 접시의 지속적인 완만한 떨고, 자주 C.elegans 액체 문화에 추천합니다,이 분석에 사용되는 작은 볼륨 소모품 발견되었습니다. 큰 우물과 microtiter 접시가 사용할 수있다면 부드러운 흔들림는하지만 필요합니다. 값은이 프로토콜에 신중하게 테스트를 다양한 조건의 통계 비교에 따라 선택되어 지적했다. 이 분석의 가장 놀라운 특징은 아마 C.elegans은 테이프로 봉인된 96 잘 접시에 보관 수있다는 사실이다. 나란히 비교는 비닐 실러와 함께 밀폐 접시, 또는 공기의 교환을 허용 실러스와 밀폐 접시에 unsealed 접시에 교양 동물의 수명에 차이를 공개하지 않았다. 세 조건에서 동물 L1에서 65시간 이내 gravid 어른 매우 homogenously 개발하고 매우 유사한 lifespans을 보여주었다. NGM에 병렬로 성장 동물이 약간 더 빠른 개발,하지만이 차이는 실러의 부재 또는 존재 독립했다. 제시 프로토콜은 라이브 세균을 기반으로하지만, 죽은 박테리아에 대한 적응하실 수 있습니다. 그러나, 액체 분석에서 하나의 생존 박테리아는 빠르게 증식하고 문화를 다시 채웁니다. 우리 손에, 그들은 액체 문화 사용할 수있는 범위 내에서 세균을 죽일 수있는 유일한 안정적인 방법은 감마 방사선으로 박테리아의 연장 치료를하는 것입니다. 수명 실험의 계획에 고려해야 할 한 가지 중요한 포인트는 감지의 능력이 있습니다. 효과의 크기에 따라, 관심있는 약물의 영향은 여러 우물에서 테스트해야합니다. 전형적인 분석 4 약물 치료 4 제어 우물, 해당 대략하기 40-50 각 동물에서 실험 이상의 95%의 수명에서 3​​0 % 증가를 감지하기 위해 충분해야합니다. 14 % 증가는 사건의 60 %에 감지하고 따라서 더 많은 복제 우물을 필요로하고 있습니다. 이 분석에 의해 생성된 수명 데이터의 풍부한는 실험을 개발하거나 특정 parametrical Gompertz 모델 1 변형하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 Gompertz 모델은 검색의 힘을 확인하고 대규모 스크린에 대한 잘못된 반응과 네거티브 필름의 수를 추정하는 데 유용합니다. 우리는 장님이 실험에서 이러한 모델의 예측을 검증하고 대형 스크린에서 거짓 네거티브 필름의 숫자 (게시되지 않은 결과를) 측정에 사용. 요약, 우리는 제시 분석은 C.elegans의 수명을 연장하고 기본 메커니즘을 연구하는 작은 분자를 식별하는 큰 도움이 될 것으로 예상.

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Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>Calbiochem</td><td>cat# 171375</td><td>Also called Fungizone</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat# F0503</td><td>FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water</td></tr><tr><td>Mianserin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2525-250MG</td><td>Use as positive control at 50&amp;#x03BC;M final concentration</td></tr><tr><td>Cyproheptadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat#C6022-MG</td><td>Alternative positive control at 10 &amp;#x03BC;M final concentration</td></tr><tr><td>Sealing Tape</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 236370</td><td>Polyester, non-sterile</td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Falcon BD</td><td>cat# 351172</td><td>Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene</td></tr><tr><td>Nunclon flask</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 178883</td><td>used for large volumes</td></tr></tbody></table>

measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates

수명은 몇 가지 유전자 경로에 의해 규제 생물 학적 과정이다. 노화의 생물을 조사하는 한 가지 전략은 동물을 연구하는 것입니다 나이 규제 경로의 구성 요소에 항구 변이. 이러한 변이를 교란 연령 규제 통로의 기능을하기 때문에 전체 유기체의 수명을 변경하는 경우, 그들은 중요한 기계론의 통찰력은 1-3 제공합니다. 수명의 규정을 조사하기 위해 또 다른 전략은 교란 연령 규제 경로에 작은 분자를 사용하는 것입니다. 지금까지 분자의 숫자는 다양한 모델 생물의 수명을 연장하는 것으로 알려져 있으며, 노화 4-16의 생물학을 연구하는 도구로 사용됩니다. 식별 분자의 수는 지금까지 노화의 생물학을 연구에 사용할 수있는 유전자 &quot;도구 모음&quot;에 비해 작습니다. Caenorhabditis 엘레간스 때문에 우수한 유전 3 주동안 짧은 수명의 노화 연구에 사용되는 주요 모델 중 하나입니다. 최근 C.elegans 때문에 작은 크기와 microtiter 플레이트 성장하는 기능 표현형 기반 약물 화면 5,7,16-20를위한 모델 생물로 등장했다. 여기 우리는 96 잘 microtiter 접시에 C.elegans 수명을 측정하는 분석을 제시한다. 분석은 개발하고 성공적으로 C.elegans 수명 7 연장 분자 대형 라이브러리를 화면으로 사용되었습니다. 분석의 신뢰성은 여러 시험에서 평가되었다 : 첫째, 서로 다른 온도에서 성장 야생 유형 동물의 수명을 측정하여, 두 번째 변경 lifespans과 돌연변이의 수명을 측정하여, 셋째, 서로 다른 농도에 대한 응답으로 수명의 변화를 측정하여 약은 Mirtazepine니다. Mirtazepine 이전 C.elegans 7 수명을 연장하기 위해 표시되었습니다. 이 테스트의 결과는 분석이 다른 assays에서 이전 결과를 복제 할 수 있으며, 양적는 것을 보여줍니다. microtiter 형식은 자동 액체 처리 시스템이 수명 분석 호환 차종과 자동 플랫폼에 통합이 가능합니다.

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

이 프로토콜에서 우리는 측정하는 방법을 제시<em&gt; Caenorhabditis 엘레간스</em96 잘 microtiter 접시에&gt; 수명.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em96 웰 플레이트에 Microtiter> 수명

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

36.4K 조회수.  The Scripps Research Institute. 이 프로토콜에서 우리는 측정하는 방법을 제시 Caenorhabditis 엘레간스 수명.

비디오: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on animal physiology and behavior. Recently, we showed that modulation of longevity in the nematode Caenorhabditis elegans by food abundance is more complex than previously recognized. The responsiveness of the lifespan to changes in food level is determined by specific genes that act by controlling information processing within a neural circuit. Our framework combines genetic analysis, high-throughput quantitative imaging and information theory. Here, we describe how these techniques can be used to characterize any gene that has a physiological relevance to broad-range dietary restriction. Specifically, this workflow is designed to reveal how a gene of interest regulates lifespan under broad-range dietary restriction; then to establish how the expression of the gene varies with food level; and finally, to provide an unbiased quantification of the amount of information conveyed by gene expression about food abundance in the environment. When several genes are examined simultaneously under the context of a neural circuit, this workflow can uncover the coding strategy employed by the circuit.

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Here, we present a framework to relate broad-range dietary restriction to gene expression and lifespan. We describe protocols for broad-range dietary restriction and for quantitative imaging of gene expression under this paradigm. We further outline computational analyses to reveal underlying information processing features of the genetic circuits involved in food-sensing.

C. 선 충 에서 광범위 한 범위 식이 제한 유전자 식 수준 동안 수명 변조에서 인코딩된 정보의 정량화

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

연구

유전학

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

생화학

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em솔리드 미디어> 수명

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

생물학

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)의 식품 섭취량과 수명을 측정하기 위한 고처리량 분석

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of Caenorhabditis elegans&#160;(C. elegans), an important parameter when studying the genetics of aging or metabolism. In most species, feeding is determined by measuring the difference between the amount of food provided and the amount left after a given time interval. The method presented here uses the same strategy to determine the feeding of C. elegans. It measures the amount of bacteria, the food source of C. elegans, cleared within 72 h. This method uses 96-well microtiter plates and has allowed the screening of hundreds of drugs for their ability to modulate food intake at a speed and depth not possible in other animal models. The strength of this assay is that it allows to measure feeding and lifespan simultaneously and directly measures the disappearance of food and, thus, is based on the same principles used for other organisms, facilitating species-to-species comparison.

저자 스포트라이트: 지독성과 HFpEF의 관계 탐구 

This protocol describes an assay to quantify Caenorhabditis elegans feeding rate based on measuring the clearance of bacteria in liquid culture.

예쁜꼬마선충( Caenorhabditis elegans )의 음식 섭취량을 세균 청소율 측정으로 정량화

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

행동분석학

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A non-mammalian soil round worm, Caenorhabditis elegans, is a valuable model organism for toxicology studies due to its convenience and lack of animal ethics issues compared with mammalian animal systems. In this protocol, a detailed procedure of toxicological evaluation of chemicals in C. elegans is described. A clinical anticancer drug, etoposide, which targets human topoisomerase II and inhibits DNA replication of human cancer cells, was selected as a model testing chemical. Age-synchronized C. elegans eggs were exposed to either dimethyl sulfoxide (DMSO) or etoposide, and then the growth of C. elegans was monitored every day for 4 days by the stereo microscope observation. The total number of eggs laid from C. elegans treated with DMSO or etoposide was also counted by using the stereo microscope. Etoposide treatment significantly affected the growth and reproduction of C. elegans. By comparison of the total number of eggs laid from worms with different treatment periods of chemicals, it can be decided that the reproductive toxicity of chemicals on C. elegans reproduction is reversible or irreversible. These protocols may be helpful for both the development of various drugs and risk assessment of environmental toxicants.

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

A basic protocol to evaluate the toxicity of chemicals in a model animal, Caenorhabditis elegans, is described. The method is convenient and useful for the development of pharmaceuticals as well as for the risk assessment of various environmental pollutants.

성장과 재생산 꼬마 선 충 의 화학 물질의 효과 측정

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

의학

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

의 산화 스트레스 저항을 측정<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 96 웰 마이크로 타이 터 플레이트에

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

측정 Caenorhabditis 엘레간스 수명

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C. 선 충 에서 광범위 한 범위 식이 제한 유전자 식 수준 동안 수명 변조에서 인코딩된 정보의 정량화

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량