우리는 오디오 장비에 대한 중요한 읽기 / 볼 MATYAS Fendrych와 스테판 Stadlbauer 감사합니다. OpenSPIM에 기여하기위한 IST 오스트리아에서 MIBA 기계 공장에 감사합니다. 이러한 결과로 이어지는 연구는 REA 보조금 협정 N ° [291734]와 유럽 연구위원회 (프로젝트 ERC 2011에서 유럽 연합 (EU)의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 / 2,007에서 2,013 사이)의 인민 계획 (마리 퀴리 작업)에서 자금을받은 -StG-20101109-PSDP).

이미징 1. 애기 배양 이전 <ol><li> 2.15 g MS-매체, 10g의 설탕, 0.97 g의 MES (2- (N의 -morpholino) 에탄 술폰산) 1 L의 DDH 2 O (더블 증류수를 추가하여 ½ MS 배지 (반 강도 무라 시게 및 스쿡 매체) 준비 ) 1 L 병에. KOH를 사용하여 5.8으로 산도를 조정합니다. </li><li> ½ MS 배지에 15g / L의의 젤란 검 추가, 121 ° C에서 20 분 정도 압력솥. </li><li> 약 2mm의 두께를 갖는 겔의 층을 만들 정사각형 페트리 접시 (245 X 245 × 25 ㎜)로 뜨거운 배지 30 ㎖를 붓는다. 요리는 매체가 응고 할 수 있도록 실내 온도까지 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 1 mL의 멸균 H 2 O가 유리 피펫 또는 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 씨앗을 들고 겔의 표면에 그들을 뿌리 포함하는 1.5 ML의 반응 관에 멸균 애기 씨앗을 넣습니다. 씨앗을 따로 따로 약 10mm를 놓습니다. 테이프로 플레이트를 밀봉합니다. </li><li> 4에서 24 시간 동안 플레이트를 인큐베이션° C (계층화). </li><li> 육일에 대한 빛의 120-140 μmol / 평방 미터 / s의 금액과 16/8 시간 일 / 밤주기에서 22 ° C에서 예 성장 인큐베이터에서 접시를 육성. 최대 10 일 이전 식물을 사용할 수있다. </li></ol> 2. 식물 시료 제조 방법 주 : 샘플 홀더 3D 인쇄되거나 손으로도 2c에 도시 된 기준을 사용하여 기계 공장에서 제조 될 수 있습니다. 3D 모델 파일은 보조 재료 (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl)에 제공된다. 재료 목록에서 3D 인쇄 주문에 대한 링크를 참조하십시오. <ol><li> 5g을 50ml의 ½ MS 배지를 함유하는 50 ㎖ 병으로 저 용융 아가, 121 ℃에서 20 분 동안 오토 클레이브를 추가한다. </li><li> 1.5 mL의 반응 튜브의 1 % 낮은 용융 아가로 오스 솔루션을 나누어지는. 4 ℃에서 저장은 (적어도 두 달 동안 사용될 수있다). </li><li> 80 ° C에서 1 %% 낮은 용융 아가로 오스의 나누어지는 용융하고 아래로 냉각 할 수33 ° C. </li><li> 초음파 장치의 샘플 홀더를 청소합니다. 70 % 에탄올로 샘플 홀더를 소독 및 멸균 물에 씻는다. </li><li> 메스를 사용하여 공장 주위에 젤을 잘라. </li><li> 평평한 주걱 블록을 들어 올리고 두 번째 주걱을 사용하여 샘플 홀더에 조심스럽게 밀어 넣습니다. </li><li> 100 μL 피펫을 사용하여 (33 ° C에서) 1 % 아가로 오스와 샘플 홀더에 젤을 접착제. </li><li> 10 μL 피펫을 사용하여 1 % 아가로 오스와 겔에 공장을 접착제. 잎이 젤이 적용되지 않습니다 있는지 확인 스테레오 현미경을 사용합니다. 관심 영역에 직접 젤을 배치하지 마십시오. </li><li> 건조에서 식물을 방지하기 위해 중단없이 작동합니다. 가능하면 1,000 μL 피펫 팁에 샘플 홀더를 삽입합니다. 캡으로 피펫 팁을 사용하여 공장이 위치한 샘플 홀더의 한쪽 끝을 통해 조심스럽게 밀어 넣습니다. </li><li> 피펫 팁 상자의 샘플 홀더를 넣고 필요하면 더 많은 식물을 준비합니다. 식물은 direc 될 수 있습니다TLY 군데 나 성장 인큐베이터에 다시 넣어. </li></ol> 3. 현미경을 설정 참고 : LED 조명 시스템은 맞춤형 램프입니다. LED가 링을 구축하는 데 필요한 기술적 인 세부 사항은 그림 3과 재료 목록에서 찾을 수 있습니다. 보드 설계를위한 보충 자료 파일 (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd)를 참조하십시오. <ol><li> 나사 또는 접착제 (예를 들면 양면 테이프)를 OpenSPIM X / Y / Z / θ 스테이지 아암의 하부 측의 LED 링. </li><li> 조정 가능한 전원 공급 장치 (0-30 V, 최대 2 A)와 LED 링을 연결합니다. </li><li> 원하는 빛의 강도에 전압을 조정합니다 (애기 장대, 120-140 μmol / m 2 / s의 그림 3D)입니다. </li><li> 70 % 에탄올로 샘플 챔버를 소독 및 멸균 물에 씻는다. </li><li> 벤젠 및 렌즈 청소 조직과 대물 렌즈를 청소합니다. 70 % 에탄올로 소독 대물 렌즈. </li><li> perfusi 연결일방향으로 배치 된 샘플 챔버 튜브. 옆에 연동 관류 펌프에 신선한 ½ MS 매체와 다른 빈 병이 포함 된 1 L 병을 넣습니다. 관류 한 튜브를 이용하여 시료 챔버의 하부 흡입구 배지 병을 연결한다. 다른 관류 튜브를 사용하여 사용되는 매체를 휴지통 빈 병 샘플 챔버의 상부 배출구를 연결합니다. </li><li> 1 mL / 분에 흐름의 속도를 설정합니다. 참고 : 샘플 챔버를 넘쳐하지 않으려면,이 유입보다 유출하는 것이 중요합니다. 어느 펌핑 속도를 증가 또는 유출에 대한보다 큰 내경을 가진 관을 사용한다. </li><li> 70 % 에탄올로 씻어 물 표면에 샘플 챔버에 배치하기 전에 그들을 건조시켜, 3mm 작은 사각형에 검은 색 플라스틱 호일을 잘라. </li><li> 샘플 홀더에서 피펫 팁을 제거하고 샘플 챔버에서 샘플 홀더를 삽입합니다. 새로 제조 된 샘플 홀더 무대 암에 맞지 않을 경우, 미세한 모래를 사용종이는 얇게 만들거나 너무 얇은 경우에 O 링 (∅ 6mm)를 사용한다. </li><li> 뚜껑을 만들려면 두 개의 50 × 25 밀리 조각으로 검은 색 알루미늄 호일을 잘라. 각 부분의 일 측면의 중간에 잘라 5mm합니다. 삼각형 들여 쓰기 (그림 1D)을 만들 접습니다. 샘플 홀더에 대향하는 삼각형 만입 시료 챔버의 상부에 뚜껑을 넣어 두 뚜껑 샘플 챔버를 닫는다. 식물의 잎은 뚜껑의 그늘에없는 것을 확인하고 조명 시스템으로부터의 광을받을 수 있습니다. </li><li> 보기의 분야에서 신흥 측면 루트를 배치하기 위해 X / Y / Z 회전 무대를 사용하여 관심 영역을 찾습니다. </li><li> 기록 전에 시스템은 적어도 15 분 동안 평형을 허용한다. </li><li> 설치 이미지를 획득. <ol><li> 3 μm의 Z-간격 (650 μm의)과 (217) 이미지의 스택을 설정하고 17 시간의 총 기간 동안 15 분 촬영 간격과 시간 경과를 설정합니다. 참고 :에 대한 자세한 설명서OpenSPIM 소프트웨어에 발견 할 수있는 방법을 운영하는 (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack). </li></ol></li><li> 기록 시작합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

광 시트 형광 현미경 낮은 광독성 및 생리 상태에서 시료를 유지하면서, 높은 시공간 해상도의 대용량을 캡처하는 데 사용할 수있는 초고속 수집 속도를 결합하는 큰 장점을 갖는다. 밝은 장 현미경의 분해능은 공 초점 현미경 (9)의 것과 비교할 수있다. 그러나, 빛의 산란 및 흡수 개별적으로 여기 및 방출 경로를 따라 발생하여 전체 이미지 품질은 표면에 비해 불투명 조직 내부 상당히 낮을 수있다. 이러한 복잡화를 회피 한 세로축 샘플을 회전시키고 다른 방향에서 같은 부피를 관찰 할 가능성을 사용할 수있다. 그러나 이것은 예를 들어, 측면 뿌리는 더 많은 정보를 얻고없이 낮은 화질 결과 뒤에서 루트 및 이미지의 한면에 등장, 항상 유리하지 않다. 그러나, 회전은 주로 SAMP를 정확히 위치 시키는데 사용될 수있다가장 좋은 방법으로 제작. 대물 렌즈의 고전적인 수평 배열은 샘플 장착의 새로운 방법을 수 있습니다. 식물은 수직 위치에서 혜택을 누릴 수 있습니다. 장착 방법은 &quot;겔의 표면 상에&quot;, 여기서 제시하는 등의 겔 (24, 25) 내부에 루트를 내장 등의 다른 실장 방법에 비해 여러 가지 장점을 갖는다. 1) 루트 시스템은 액체 매체와 직접 접촉한다. 샘플 챔버 연속적으로 새로운 배지를 제공하는 관류 시스템에 연결된다. 또한 신속하게 다른 미디어 또는 약물을 적용하는 샘플 챔버의 전체 부피를 교환 할 수있다. 그들은 실험실에서 성장하는 데 사용되므로 2) 이전에 준비 식물 성장 샘플링합니다. 식물은 형광 현미경으로 선택할 수 있으며, 단지 원하는 식물을 제조 할 필요가있다. 3) 식물이 접촉되지 않고 시료 홀더 페트리 접시에서 전송된다. 이에 따라 식물은 또한 그것이 성장에 incubato에서 성장 된 동일한 겔 개발할 수R 및 기계적 응력은 최소로 감소된다. 4) 검체의 도면 탁하고 시료와 검출 목적의 간격만으로 중간 굴절율과 서로 다른 다른 물질로 채워져 있기 때문에 광학 수차를 최소화된다. 장기간의 촬상을 수행하기 위해, 식물 조명 시스템은 식물의 광합성 활성을 보장하기 위해 필요하다. 대부분의 실험실에서 식물은 투명한 겔상에서 성장 뿌리가 빛에 노출되는, 즉. 이것은 그들의 환경에 서로 다른 반응을 일으킬 및 생화학 및 개발 (26, 27)의 변화를 유도 할 수있다. 루트 시스템에서 빛의 양을 줄이기 위해, 흑색 플라스틱 호는 물 표면과 블랙 알루미늄 박으로 이루어지는 뚜껑 샘플 챔버를 포함을 커버하는데 사용되었다. 식물에 도달 할 수 빛 뚜껑의 중앙 구멍을 통해 나뭇잎. 이 설정에서 배경 빛의 증가는 suggestin를 관찰되지 않았다적색 및 청색 LED로부터의 미광의 양이 크게 GFP 필터 및 차광 방식으로 감소 하였다 g. 그러면 카메라 배경 노이즈를 증가시키지 않고, 화상 취득 동안에 온 광을 유지시켰다. 샘플 홀더는 3D 프린팅을 위해 설계되었습니다. 시험 하였다 여러 플라스틱 샘플의 드리프트 결과 100 % 안정하지만, 소재의 선택이 매우 중요하다. 따라서, 수지를 사용하는 대신 또는 폴리에틸렌 (PEP)로드를 분쇄하여 샘플 홀더를 구축 할 것을 권장한다. 양면 조명계와 광 시트 현미경 설정을 사용하는 경우 샘플 홀더는 상기 회전 각도에 따라 광 시트 중 하나를 방해 할. 플레이트에서 공장을 떠서 동안 기계적 스트레스를 줄이기 위해 주걱의 평평한 각도를 사용합니다. 이 공장은 빠르게 건조하고 아주 처음 경험 공기 흐름 수 있습니다. 우와, 어떤 공기 초안 (빠른 동작, 에어컨 흐름을)하지 않도록하십시오가능하면 RK는 중단없이하고 1,000 μL 피펫 팁에 샘플 홀더를 밀어 넣습니다. 현미경 내부는 액체의 전체 공장을 찍어 마른 잎을 유지하지하기 위해 매우 중요합니다. 이 기술은 측면 루트 형성의 초기 단계의 촬상에 적합하다. 성숙한 뿌리 끝의 장기 이미징을 수행 할 때 하나는 애기 장대의 뿌리가 시야에서 빠른 속도로 100 ~ 300 μm의 / h로 성장할 것을 명심해야합니다. 매우 유용한 미래의 구현은 시간의 연장 기간 동안 다음과 같은 뿌리 끝의 성장을 허용하는 자동화 된 추적 알고리즘이 될 수 있습니다. 획득 프로세스 동안 이러한 빛의 영양 배지 조성 등의 환경 조건을 제어 할 수있는 능력은 식물 변화에 적응하는 방법을 조사 할 수있다. 루트 (28)는 유도 덱사메타손 또는 β-ESTR 등을 사용하여 화학적으로 유전자 발현을 활성화하는 약물을 적용 할 수있는 액체 매질과 직접 접촉유도 시스템 (29) adiol. 그러나, 약물을 씻어 샘플 챔버의 전체 볼륨을 교환하는 시간이 걸린다. 셋업 매체 교환을 촉진하기 위해 샘플 챔버의 체적을 최소화함으로써 개선 될 수있다. 그럼에도 불구하고,이 기술은 큰 잠재력을 가지고있다. 장착 순서, 표준 성장 조건 및 광 시트를 현미경을 사용하여 부드러운 이미지 획득의 결합은 생리적 수준의 고해상도 식물 개발 장기 연구를 허용한다. 이 식물 개발의 기본 메커니즘을 탐구하는 연구자 도움이 될 것입니다.

하나의 세포가 장기의 분화와 성장하는 동안 어떻게 행동하는지 이해 공장 개발의 핵심 질문 중 하나입니다. 이상적으로는, 유전자의 발현 패턴과 세포 내 단백질 위치 파악 등 셀룰러 이벤트는, 조직의 확대 상황에 비추어 볼 수있다. 이 목적은 기술 문제를 제기하고 높은 공간과 전체 장기 관찰뿐만 아니라 사진 독성 효과를 일으킬 수 있습니다 시간의 연장 기간 동안 시간 해상도를 필요로한다. 식물이 환경 변화에 빠르게 적응하기 때문에, 성장 조건은 엄격하게 제어되어야한다. 식물의 생리적 상태를 방해하지 않으면 장기간의 촬상을 수행하기 위해, 세 가지 샘플 챔버에서, 1)의 성장 조건을 확보 할 수있다, 2) 안정 장시간 장착 샘플, 3), 촬상 낮은 조명 강도와 사진의 손상 및 비 생리적 조건을 방지 할 수 있습니다. 생리 성장 컨디셔닝현미경 시료 챔버의 기능이 장기간 실험 중요하다. 3 - 공 초점 현미경 (1)에 대해 촬상의 성장 챔버를 설명 가능한 프로토콜들이있다. 그러나, 공 초점 현미경은 스트레스 반응을 일으킬 수있는 식물, 높은 광 강도를 소개하고 일반적으로 4 성장을 억제한다. 또한 대부분의 기존의 현미경은 그들 자신의 방향을 중력의 벡터으로 성장하려고하기 때문에 식물을위한 최적하지 않은 샘플의 수평 위치 할 수 있습니다. 9 - 지난 10 년 동안, 빛 시트 현미경은 몇 일 5까지의 기간에 대한 세포 해상도에서 큰 표본의 개발을 캡처 할 수있는 강력한 도구로 떠오르고있다. 빛 시트 현미경 수직 표본의 위치를 허용하고 점점 루트 개발 (10) 연구 식물 연구에 사용되는 - 최근 베르트 검토 (21),t과 Maizel 22. 언급 된 연구 중 많은 10,13 - 18,21 최적화 샘플의 특별한 방법을 채용 에른스트 HK Stelzer의 실험실에서 수행 하였다는 겔 (17)의 표면에 뿌리를 성장하는 것을 특징으로 실장. 이 연구에서, 주문 제작 현미경이있는 공장은 바닥에서 개최, 사용되었다. 반대로, 널리 사용 가능한 광 시트 현미경의 대부분은 상부로부터 샘플을 잡아. 따라서, 특정 제조 방법에 용이하게 적용 할 수 없다. 여기에 제시된 방법은 OpenSPIM (23), 적용하고 선택적 평면 조명 현미경 (SPIM)을 향상시키기위한 오픈 액세스 플랫폼에 적용 할 수있는 잘 확립에 표면 장착 방법에 대한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜의 전반적인 목적은 OpenSPIM 광 시트 현미경 애기 뿌리 장기 촬상을 가능하게하는 것이다. 이것은들에 똑바로 식물 성장에 의해 달성된다액체 배지에서 뿌리 겔 urface는 나뭇잎이 공중에 남아있다. 식물의 광합성 활성을 보장하기 위하여, 맞춤형 조명 시스템 잎 아닌 루트 (도 1)을 조명한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Agarose, low melting</td>
			<td >VWR</td>
			<td >AFFY3282125GM</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Black aluminum foil</td>
			<td >Thorlabs</td>
			<td >BKF12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Black plastic foil</td>
			<td >Carl Roth</td>
			<td >HT83.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED blue (453 nm)</td>
			<td >OSRAM</td>
			<td >LD&#160;CN5M-1R1S-35-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED red (625 nm)</td>
			<td >OSRAM</td>
			<td >LR T66F-ABBB-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED board - PCB design software</td>
			<td >Cadsoft Eagle</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MES monohydrate</td>
			<td >Duchefa</td>
			<td >M1503.0100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropore Surgical Tape</td>
			<td >3M</td>
			<td >1530-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Murashige &#38; Skoog Medium (MS-Medium)</td>
			<td >Duchefa</td>
			<td >M0221</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phytagel&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >P8169</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sample holder 3D print</td>
			<td>i.materialise</td>
			<td ><a href="https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1">https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Square petri dishes (245x245x25 mm)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >734-2179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sucrose</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >84097-1KG</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light sheet fluorescence microscopy of plant roots growing on the surface of a gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

밝은 장 현미경 (도 1)과 뿌리 조직을 관찰하면서 시료 전처리 방법은, 현미경의 샘플 챔버 내부의 식물의 재배 할 수있다. 식물은 맞춤 설계 샘플 홀더 (도 2)에 장착 된 겔 (½ 1.5 % 젤란 검을 함유하는 MS 배지)의 층의 표면 상에 성장한다. 샘플 홀더는 3D 재료로서 투명 수지를 사용하여 인쇄된다. 크기를 강조 제조 버전도 2c에 도시되어있다. 뿌리는 지속적으로 관류 시스템에 의해 새로 고쳐 액체 (½ MS 배지)에 담근다. 잎은 공기에 남아 계속 /이 식물 (그림 1A, B 그림 3A-C) 위의 링으로 배열되어 파란색과 빨간색의 LED에서 나오는 s의 130 μmol / ㎡ 크기의 광 강도 조명. LED가 링은 우리의 기계 공장에서 제조되며,우리는 그림 3과 재료 목록의 LED 링을 구축하는 방법에 대한 기술 정보를 제공합니다. 광 강도가 연속적으로 30 내지 250 μmol / ㎡ / s (도 3d)에 이르기까지 조정될 수있다. 루트 시스템은 물 표면을 덮는 블랙 플라스틱 포일의 작은 시트 (도 1)에 의해 차광된다. 검출 렌즈에 의해 수집 된 조명에서 어떤 미광은 GFP 필터 (그림 3E)에 의해 필터링된다. 이 설정으로, 성장 애기 측면 루트의 시간 경과는 20X / 0.5 렌즈 (그림 4)를 사용하여 17 시간 동안 기록되었다. 측면 루트는 기본 루트 내부 깊이있는 pericycle 세포 층에서 그 기원을 가지고있다. 연장 시간 동안 조직의 내부에도 깊은 촬상 기능을 설명하기 위해, 더 높은 배율 (40X / 0.75) 측면 RO의 형성을 캡처하는 데 사용 된OT 제 1 스테이지에서 primordium까지 38 시간 (도 5)의 시간 내에 기본 루트 중에서 출현. 데이터 세트의 예시적인 2D 슬라이스는도된다. 5B. 이 기록은 셀룰러 해상도로 3D (그림 5A)의 측면 루트 형성의 역학을 따라 우리를 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig1.jpg" /> 그림 1 : OpenSPIM 샘플 챔버 내부 조건을 성장. A) 이미징 챔버의 스케치입니다. 이 공장은 겔의 표면에 수직으로 성장하고있다 (참조 또한 그림 2) 사용자 정의 내장 샘플 홀더에 장착. 뿌리는 지속적으로 관류 시스템에 의해 교환되는 액체 배지에서 성장하고있다. 식물은 공기에서 성장하고 빨간색과 파란색의 LED (또한 그림 3 참조)에 의해 조명하는 단풍. 루트 시스템은 재치 음영 처리<html> 물 표면을 덮는 검은 색 플라스틱 호일 h의 작은 시트. 블랙 알루미늄 호일의 두 조각으로 이루어지는 덮개는 상기 수면 아래 빛의 양을 감소시키고 샘플 챔버의 습도를 유지한다. 오른쪽 확대 패널은 액체 매질에 침지 겔 블록의 표면에 성장하는 식물을 강조한다. 아가 방울 겔 상 루트 마운트. 점선 상자가 현미경으로 관찰하여 관심 영역을 나타냅니다. 뚜껑이없는 촬상 실 (의 B)의 사진). 숫자 (1) - (10) A와 B의 대표 (1) : LED 링 X / Y / Z / θ 스테이지 (2)의 샘플 홀더 (3) : 뚜껑 (4) : 애기 장대 (5) : 관류 시스템 (7) : 검출 대물 렌즈 (8) 액체 배지, (9) : 시료 챔버 (10)의 조명 대물 렌즈 검은 플라스틱 포일 (6)의 시트. C) 뚜껑 검정색 알루미늄 호일의 두 부분으로 이루어진다.<html> 대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig2.jpg" /> 그림 2 : 샘플 홀더. A) 3D 모델. 3D 모델 파일은 보조 재료에 제공된다. 투명 아크릴 수지로 (4) 및 (5) : 수지 (6)을 투명 수지 (3) - (1) 서로 다른 재료를 이용하여 3 차원 프린트 B)의 사진. C) 샘플 홀더의 기술 도면, 숫자는 mm 나타냅니다. 공장에 제조 된 샘플 홀더 D) 사진은 장착. 점선 영역은 현미경으로 관찰 할 수있다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55044/55044fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html> / 55,044 / 55044fig3.jpg &quot;를 업로드 /&gt; 그림 3 : 공장 조명 설치. 램프 A) 회로도. LED가 쌍 방향 번개에 대해 개별적으로 온 / 오프 전환 할 수 있습니다. LED : 발광 다이오드, R : 저항, T : 트랜지스터, JP : 핀 머리. 인쇄 회로 기판) : B), 조명 램프의 최종 설계가 PCB와 소프트웨어 (PCB를 사용하여 그려졌다. 우리는 보충 자료의 보드 디자인 파일을 제공합니다. 이 보드는 제조 및 우리 연구소의 MIBA 기계 공장에서 조립되었다. LED가 링의 C) 사진은 스위치. 빨간색과 파란색 LED의 네 쌍의 반지에 배치되어있다. D)의 전압의 범위는 3.5 V와 14.0 V. 저항력 사이에서 조정될 수는 30 내지 250 μmol / m에 이르는 빛의 양에 도달하는 데 사용 된 2 / 초 (R1-8 : 220 옴, R9-12 : 1,220 옴 ). E) 램프, GFP 및 YFP의 발광 스펙트럼.<html> TP : //ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig4.jpg" /> 그림 4 : 애기 장대의 시간 경과 기록 장대 측면 루트. 5 일 이전 종묘는 막 마커 (pUBQ10 :: YFP-PIP1를 4) 표현과 핵 기자 (pGATA23 : NLS-GUS-GFP)을 특히 측면 루트로 발전 세포 pericycle 표시. (217) 영상 (3 μm의 Z-간격)의 스택은 20 배 / 0.5 렌즈를 사용하여 17 시간 녹화 매 15 분 체포됐다. A) (69) 중 4 시점이 최대 강도 투영에 나타낸다. B) 한 시점의 Z-스택의 식스 (217) 중 하나의 조각이 표시됩니다. A와 B의 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다.로드 / 55044 / 55044fig4large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig5.jpg" /> 그림 5 : 애기 장대의 시간 경과 기록 장대 측면 루트. 6 일 이전 종묘는 막 마커 (pUBQ10 :: YFP-PIP1를 4) 표현과 핵 기자 (pGATA23 : NLS-GUS-GFP)을 특히 측면 루트로 발전 세포 pericycle 표시. 200 이미지 (1.5 μm의 Z-간격)의 스택은 40X / 0.75 렌즈를 사용하여 38 시간 녹화 매 15 분 체포됐다. A) 네 시점의 3D 렌더링 그리드 안의 숫자는 메인 루트의 중심면으로 μm의, B) 단일 슬라이스를 나타낸다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55044/55044fig5large.jpg" target="_blank">부디</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. 3D 모델 파일이 제공된다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-3D_Sample_Holder.stl" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 보충 파일 링 Board.brd을 LED. 기판 설계 파일이 제공된다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-LED_Ring_Board.brd" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

겔의 표면에 성장 식물 뿌리의 가벼운 시트 형광 현미경

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K 조회수.  Institute of Science and Technology Austria. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

연구

생물학

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

호스트 식물 휘발성 물질에 대한 선별 도구로 Electroantennographic Bioassay

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Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

공장 Vasculature의 3 차원 구조 및 기능을 시각화하기 위해 높은 해상도로 계산 된 단층 촬영을 사용하여

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면 역학의 실시간 영상

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

형광 현미경으로 Stromule 주파수를 시각화

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...