This research is supported by funding from CBCF (to ZW).

1. 라이브 영상에 대한 세포를 준비 <ol><li> 세포 배양 및 시드 <ol><li> 도세탁셀 (MCF-7 TXT) 및 무저항 부모 세포주 (MCF-7 CC)에 대한 내성을 위해 선택된 MCF-7 유방암 세포를 사용한다. 상세한 선택 프로세스 이들 선택된 세포주의 특성 (24)는 이전에 설명되었다. </li><li> 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) 및 소 태아 혈청 (FBS)의 10 %의 90 %로 이루어지는 비 필수 아미노산이 보충 된 배지에서 37 ° C에서 10cm 배양 접시에있는 모든 세포를 성장한다. 5 % CO 2 분위기에서 매체를 유지한다. 5 나노 도세탁셀에서 MCF-7 TXT 세포를 유지한다. </li><li> 라이브 이미징 된 커버에 씨앗 세포. 하룻밤 동안 UV에 노출 후 70 % 알콜로 세척 의해 24mm 폴리 -L- 리신 - 코팅 된 커버 글라스를 소독. 35mm의 6 웰 배양 판에 커버 슬립을 놓습니다. 경기 수각 웰에 하나 coverslip에 에이스. </li><li> 10 cm 배양 접시에서 미디어를 제거하고 PBS로 세포를 씻어. 접시에서 세포를 분리 접시에 트립신 EDTA 0.5 ML을 추가합니다. 세포의 분리 이후 트립신 중화 접시에 배양 배지 5 ㎖를 추가한다. </li><li> 단위 부피 당 세포의 수를 결정하는 혈구 세포를 카운트. </li><li> 각 웰 단위 부피 당 세포 수를 기준으로 약 10 5 세포를 추가한다. 부드럽게 흔들어 후, 세포가 된 커버에 부착 할 수 있도록 인큐베이터에 다시 접시를 넣어. </li></ol></li><li> GFP - 태그 α-tubulin의 발현 <ol><li> , 미소 관 역학 분석을 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 GFP 전달 제어 (예 BacMam)와 GFP-α-tubulin의 태그와 함께 세포를 형질 도입하는 방법. </li><li> 37 ° C 세포 배양 인큐베이터에서 36 시간 동안 웰에 세포를 배양 할 수 있도록 COM현명한 방법 부착 및 60 %의 합류. </li><li> 다음 식에있어서, 각 웰에 추가 GFP 표지 된 α-tubulin에 적절한 부피를 계산한다 : <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55027/55027eq1.jpg" /> 세포의 수는 표시시의 웰에있는 세포의 추정 된 총계이다 원하는 PPC는 세포 당 입자의 수이다. 참고 : MCF-7 세포를 시드 (20)의 원하는 PPC 10 5 5 10 × 2의 세포 수를 두 배로해야, 각 coverslip에 필요한 볼륨 따라서 40 μL이다. 다른 셀 볼륨은 최고하지 않을 상기 공식에 따라 계산 하였다. 정확한 부피 GFP-tubulin의 실제 발현 수준에 따라 조절되어야한다. </li><li> 균질 용액이되도록 반전하여 GFP 표지 된 α-tubulin에 수회 섞는다. 소용돌이하지 마십시오. 참고 : 컨트롤의 경우, 널 (제어) 시약은 포유 동물의 유전 부족요소 및 잠재적 배큘로 바이러스 - 매개 효과 및 배경 형광을 결정하는데 도움이되도록 사용될 수있다. 비 대상 GFP 전달 제어는 전체 셀을 점등하는 사용될 수있다. </li><li> 신선한 매체와 문화 매체를 교체합니다. 각 웰에 GFP - 태그 α-tubulin에의 새로운 매체의 2 mL의 40 μL를 추가합니다. </li><li> 문화 매체와 GFP - 태그 α-tubulin에 완벽하게 혼합 할 수 있도록 부드럽게 판을 흔들어. 문화 인큐베이터에 접시를 반환하고 GFP - 튜 불린의 표현을 할 수 있도록 24 시간 동안 배양. </li></ol></li><li> 도세탁셀과 치료 세포 주 :이 실험은 미세 소관 동적 불안정성 도세탁셀의 효과를 테스트하는 것이다. 따라서, 셀은 도세탁셀의 원하는 농도로 처리된다. <ol><li> 배지는 DMEM 중 90 % 및 10 % FBS가 이루어지는 비 필수 아미노산이 보충 준비한다. 페놀 레드가 fluorescen을 방해 할 수 있기 때문에 페놀 레드없이 DMEM을 사용하여GFP - 튜 불린의 가전. (10 nM 내지 10 μM까지) 도세탁셀의 원하는 농도를 추가합니다. 도세탁셀의 스톡 용액을 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 10 mm이다. </li><li> 사전 따뜻한 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에 도세탁셀 함유 매체. </li><li> 도세탁셀 함유 매체와 일반 배지를 교체하고 조직 문화 인큐베이터에서 30 분 동안 품어. 각 도세탁셀의 농도에 잘 당 적어도 3 커버 슬립이 있어야한다. </li></ol></li></ol> 2. 라이브 영상은 미세 소관 동적 불안정성을 검사합니다 <ol><li> 시스템 설정 <ol><li> 37 ° C, 5 % CO 2로 유지 챔버에서 실험을 수행합니다. 60X, 반전 된 형광 현미경과 CCD 카메라로 1.42 NA 오일 대물 렌즈를 구비 한 현미경 시스템 시간 경과하여 형광 이미지를 획득. </li><li> 라이브 영상에 대한 세포를 설정합니다. 사전 따뜻한 샘플 홀더 모두와37 ° C까지 매체. 검사하기 위해 커버 슬립을 선택합니다. 샘플 홀더에 주목 커버 슬립을 장착하고, 단계 1.3.1에서 제조 한 도세탁셀 함유 배지 1 ㎖와 함께 배양한다. </li></ol></li><li> 미세 소관 동적 불안정성의 라이브 영상 <ol><li> 이미징을 위해 사용되는 세포를 확인한다. 그들은 평탄한 표현 GFP-tubulin에 높은 형광 강도를 가지고 있고, 명확한 미세 소관 구조를 가져야한다. </li><li> 첫 번째 검사 단계 2.2.1에서 확인 된 세포의 그룹에서 하나의 셀을 선택합니다. 식별 된 셀의 주변 영역에 초점을 맞 춥니 다. 노출 시간에 대한 프로그램 및 이미지 수집의 주파수를 설정합니다. 노광 시간은 약 0.5 초이므로, 영상이 매 2 S를 취득한다. </li><li> 1.33에서 2.2.3 단계에 대한 추가 20 분을 허용합니다. 단계 1.3.3에서 설명 된 바와 같이 즉, 정확히 50 분 도세탁셀의 첨가 후에, (이 표준화이다) 촬상을 시작한다. </li><li> 미세 소관 d 개를 기록ynamics 2 분 동안 사진마다 2 S 복용. 전체적으로 상기 식별 된 셀 (60)의 이미지를 획득. </li><li> 다음 식별 셀로 이동 및 반복 2.2.4에 2.2.2 단계를 반복합니다. 5 세포가 몇 군데 될 때까지 절차를 반복합니다. 단계 1.3.3에서 설명 된 바와 같이 시간, 도세탁셀의 첨가 후 70 분에 도달하기 전에이를 수행하는 것이 필수적이다. </li><li> 각 처리 조건의 경우, 반복 3 가지 커버 슬립을 위해 2.2.5에 2.2.1 단계를 반복합니다. 총 이미지 15 세포, 충분한 데이터가 미세 소관 동적 불안정성을 측정하는 것입니다있다. </li></ol></li></ol> 3. 이미지 프로세싱 및 데이터 분석 <ol><li> 이미지의 디컨 볼 루션 <ol><li> 높은 품질을 달성하기 위해 상기 취득 된 영상을 Deconvolve. 현미경 시스템을 갖추고 디컨 볼 루션 프로그램을 엽니 다. </li><li> &quot;프로세스&quot;를 클릭하고 &quot;Deconvolve을.&quot; &quot;입력&quot;창에 이미지 파일을 드래그하고 클릭 &quot;해야할 일&quot; 이미지 파일은 deconvolved하고 것deconvolved 파일이 자동으로 새 파일로 저장됩니다. </li></ol></li><li> 동영상의 생성 <ol><li> 갖춘 소프트웨어를 엽니 다 deconvolved 이미지 파일을 클릭합니다. </li><li> &quot;파일&quot;을 클릭하고 &quot;동영상으로 저장합니다.&quot; 같은 &quot;AV&quot;과 &quot;애니메이션 스타일&quot;로 &quot;영화 형식&quot;선택 &quot;앞으로.&quot; 에 &quot;100 %&quot;와 &quot;프레임 속도&quot;로 &quot;압축 품질&quot;설정 &quot;5 / 초를.&quot; </li><li> &quot;시간을 통해 애니메이션&quot;을 클릭의 상자 확인 &quot;을 수행합니다.&quot; 동영상이 생성됩니다. </li></ol></li><li> 미세 소관 단축 및 성장률 측정 <ol><li> 측정에 사용되는 미세 소관을 확인합니다. 각 셀에 대해, 몇 미세 소관은 단축 또는 성장 명확하고 완전하게 따랐다 수있을 것이다. </li><li> 미세 소관 (A)의 출발 길이를 표시 프레임을 식별하는 비디오의 각 프레임을 검사차 가장 연장 또는 단축 미세 소관와 프레임. 두 개의 미세 소관과 두 프레임 사이에 경과 된 시간의 길이의 변화를 측정한다. </li><li> 시간 길이의 변화를 분할함으로써 증가 또는 단축의 비율을 계산한다 (단위는 ㎛의 / s이다). 각 처리 조건에 대해, 적어도 10 세포를 따라 적어도 20 마이크로 튜브를 측정한다. </li><li> 각 처리 조건에 대한 평균 및 표준 오차를 계산한다. 학생 테스트를 사용하여 조건 사이에 통계적으로 유의 한 차이를 분석 할 수 있습니다. 테이블 및 / 또는 차트의 데이터를보고합니다. </li></ol></li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+polymerization+dynamics.">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).</li><li>Walczak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+and+tubulin+interacting+proteins.">Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins.</a> Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

생체 외 및 생체 내에서 : 미세 소관 동적 불안정성을 측정하는 두 가지 방법이 있습니다. 생체 외 방법에서는, 정제는 튜 불린 컴퓨터 향상된 경과 미분 간섭 현미경과 달리 미세 소관 동적 불안정성을 측정하는 데 사용된다. 생체 내 방법에있어서, 형광 튜 불린를 미세 주입 또는 GFP - 튜 불린을 표현, 미세 소관에 포함된다. 미세 소관의 동역학 (성장과 단축)가 다음 상간 셀 (10), (20), (25)의 주변 영역에 민감한 카메라를 이용하여 시간 경과에 의해 기록된다. 현미경의 다양한 형태가 이러한 목적으로 사용되었지만, 우리는 여기에보고 된 프로토콜은 컨벌루션 현미경을 사용한다. 생체 내에서 동적 불안정성 반면, 단지 미세 소관 플러스 종료합니다 (β-tubulin의 바깥쪽으로 향하게 끝) 발생마이너스 단부 (외측으로 향하게 α-tubulin에 함께 단부)는 동일한 길이 (26) 남아있다. 한편, 시험 관내 조립 미세 소관은 동적 불안정성은 플러스 마이너스 단부 (27) 단부보다 더 강하다과 함께 미 세관의 양단에 발생한다. 시험관 내에서의 동적 불안정성을 분석의 주요 장점은 셀룰러지도의 부재에서 미소 관 역학에 다른 제제의 특정 역할에 대한 기계적인 정보를 제공한다는 것이다. 또한, 체외 조건에서, 동적 불안정성은 양쪽 끝에서 공부 할 수 있습니다. 이것은 약물 또는 조절 단백질의 대향 단부에서 미세 소관의 안정성에 영향을하는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공한다. 역사적으로, 마이너스 끝 플러스 10을 종료보다 훨씬 적은 추적됩니다. 미세 소관의 행동에 대한 우리의 이해의 대부분은 체외에서 정제 튜 불린 조립 미세 소관에 대한 연구에서 비롯됩니다. </P&gt; 이 연구에서 얻은 미세 소관 동작의 기본 원리의 대부분은 또한 세포에서 미세 소관에인가 될 수 있지만 단, 시험 관내 및 생체 내 사이에 미소 관 역학 일정한 차이가있다. 세포에서 미세 소관은 종종에 5- 성장 빠른 속도를 10 배, 성장 및 / 또는 단축 사이의 전환은 시험 관내에서 정제 튜 불린 조립 미세 소관보다 더 자주 ~ 10 회 발생한다. 셀룰러 미세 소관 거동의 공간 및 시간 조절 고도 반영 세포주기 전반에 걸쳐 극적 미세 소관 조직의 변화와 역학도있다. 이 문제는 시험 관내 연구에서 연구 할 수 없습니다. 또한, 미세 소관 역학의 규제는 튜 불린 번역 후 변형, 튜 불린 이소 식, 안정 또는 마이크로 불안정하거나지도 및 기타 미세 소관 - 상호 작용하는 단백질의 큰 그룹에 의해 달성된다29, 28 세관. 따라서, 살아있는 세포에 미세 소관의 불안정성을 공부하는 것이 훨씬 더 생리 학적으로 적용 할 수있다. 여기에 기재된 방법은 살아있는 세포에서 미세 소관의 동역학을 연구하기 위해 간단하고 믿을만한 프로토콜이다. 더주의를 요구하는 단계는 관찰 용 셀의 선택 및 노출 시간을 결정한다. 평평 셀을 선택하고 GFP-tubulin의 높은 형광 강도를 가지고하는 것이 중요합니다. 이 여진 강도 및 GFP 형광의 변색을 방지하기 위해, 노광 시간을 단축하는 것이 바람직하다. 물론, 생체 방법의 다른 모든 것처럼,이 프로토콜은 다양한 조작 된 조건에서 미세 소관 동적 불안정성을 연구하기에 적합하지 않다. 예를 들어, α-와 β-tubulin의 다른 아형은 미세 소관 역학의 관점에서 다르게 동작 할 수 있습니다. 오직 체외 방법에서 s로 사용할 수 있습니다tudy 미세 소관 동적 불안정성에 대한 개별 정제 튜 불린 동종의 효과. 또한, 형광 표지 된 튜 불린의 마이크로 인젝션에 비해 형질 전환 또는 형질 도입하여 플라스미드 GFP 태깅 튜 불린의 발현은 상대적으로 낮은 신호 대 잡음비를 나타낼 수있다. 그러나, 형질 전환 또는 플라스미드의 전달에 의한 세포에서 GFP - 태그 튜 불린의 표현은 더 많은 자유가 실험적으로 다른 세포 특성을 변화 할 수 있습니다. 여기에보고되는 프로토콜은 다양한 연구에 사용될 수있다. 한편으로는, 특히 유사 분열에서 세포주기의 여러 단계에서 미세 소관의 기능에 대한 신규 중요한 식견을 제공 할 수있다. 또한, 미소 관 역학, 마이그레이션 등 각종 세포 프로세스의 효과를 연구하기 위해 사용될 수있다. 한편, 정상의 미소 관 역학 (그들 중 많은 항암제이다) 다양한 미세 소관 억제제의 효과를 연구하기 위해 사용될 수 있고더 생리적 조건에서 암 세포. 우리는 모두 도세탁셀 저항 및 비 도세탁셀 저항하는 유방암 세포에서 미세 소관 동적 불안정성에 다양한 항 유사 분열 항암제의 효과를 연구하기 위해이 방법을 사용했다.

<html> 유방암 사망률의 주요 원인은 전이 (1, 2)을 통해서이다. 첫번째 줄은 전이성 유방암 2, 3, 4, 5, 6의 치료식이 요법 등 도세탁셀과 같은 탁산 파클리탁셀은 현재 사용되고있다. 그들은 미세 소관 역학을 방해 미세 소관 타겟팅 에이전트 (MTA)의 그룹의 일부입니다. 그러나, 치료 요법 탁산을 사용하는 가장 큰 과제 중 하나는 재발 7 리드 암세포 탁산 저항의 개발이다. 약물 내성은 전이성 유방암 환자 중 7 모든 사망의 90 % 이상을 차지한다. 미세 소관은 α-와 β-tubulin에 이종의 중합에 의해 형성된다클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 8, 9. 미소 관 역학의 정확한 조절은 세포 편광 세포주기 진행, 세포 이동, 및 세포 신호 전달을 포함한 많은 세포 기능에 중요하다. 미세 소관과 역학의 조절 곤란은 세포의 기능을 방해하고 세포 사멸 (10), (11)가 발생합니다. 그들은이 조절 곤란의 원인이 방법에 따라 MTA 약은 미세 소관 안정 화제 (즉, 탁산) 또는 미세 소관 - destabalizing 에이전트 (즉, 빈카 알칼로이드 또는 콜히친 현장 결합제) (20)로 분류 할 수있다. 미세 소관 질량에 대한 자신의 반대 효과에도 불구하고, 충분한 용량으로, 두 클래스는 미세 소관 역학 (21)에 미치는 영향을 통해 암 세포를 죽일 수 있습니다. 탁산은 선도, 미세 소관 스핀들 (12)을 안정화 주로 기능염색체 어긋남. 스핀들 어셈블리 검사 (SAC)의 후속 활성화는 영구 분열 셀을 체포. 장기간 유사 분열 체포는 세포 사멸 (13), (14)가 발생합니다. 탁 조립 튜 불린 (16) 만 존재하는 β-tubulin의 8, 15,에 탁산 바인딩 사이트를 통해 미세 소관과 상호 작용합니다. 탁산 저항 복합 메커니즘은, 17 (9)이 제안되어있다. 이러한 메커니즘으로 인해 약물 유출 단백질과 탁산 별 저항 5, 9, 18, 19의 과발현에 모두 일반적으로 다제 내성을 포함한다. 예를 들어 탁산 내성 ​​암세포는 특정 β-욕조의 발현과 기능을 변경할 수도ulin 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23 이소 타입. 미세 소관 동적 불안정성을 측정하는 생체 내 방법을 사용함으로써, 우리는 무저항 부모 MCF-7 CC 셀 (17)에 비해, 도세탁셀 내성 MCF-7 TXT 세포의 미소 관 역학 도세탁셀 처리 둔감 보여준다. MTA를 더의 기능과 암세포의 탁산 저항의 정확한 메커니즘을 이해하기 위해, 미세 소관의 동역학을 측정하는 것이 필수적이다. 여기, 우리는 그렇게하는 생체 내 방법을보고합니다. 세포에서 GFP 태깅 튜 불린의 발현과 결합 라이브 영상을 사용함으로써, 우리는 MCF-7 TXT 및 MCF-7 세포 CC 및 Wi 미세 소관의 동역학을 측정사전 통 보없이 도세탁셀 치료. 결과는 우리가 탁산 저항을 극복 할 수있는보다 효과적인 약물을 설계 할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco, Invitrogen</td>
			<td>12483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Anti (100x)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>docetaxel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>01885-5mg-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM phenol red-free</td>
			<td>Gibco, Invitrogen</td>
			<td>21063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10613</td>
			<td>Key reagent for expressing GFP tubulin in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>B10383</td>
			<td>Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich+B9:AA9</td>
			<td>472301</td>
			<td>for dissoving decetaxel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22-mm glass coveslip</td>
			<td>Fisher Scientifics</td>
			<td>12-545-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One International</td>
			<td>6 Well Celi Culture Plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaVision Microscopy Imaging Systems</td>
			<td>GE Health</td>
			<td></td>
			<td>This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific</td>
			<td>Hausser Scientific, Distributed by VWR</td>
			<td>Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging to study microtubule dynamic instability in taxane-resistant breast cancers

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs' long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics. 
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged &#945;-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

여기에 제시된 프로토콜을 사용하여, 우리는 (MCF-7 TXT) 유방암 세포 (MCF-7 CC) 정상 및 도세탁셀 내성의 미소 관 역학 도세탁셀의 효과를 연구 하였다. 이미지의 두 세트 MCF-7 및 MCF-CC 7 TXT 세포 (도 1A)에서 미세 소관의 성장과 단축의 도세탁셀 (0.5 μM)의 효과를 나타낸다. 우리는 또한 두 세포주 이러한 조건에서 미세 소관의 성장 또는 단축의 비율을 계산하여 0.5 μM에서 도세탁셀 강하게 MCF-7 CC 셀 튜 불린 역학 아니지만 MCF-7 TXT 세포 (도 1b)를 억제하는 것으로 나타났다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55027/55027fig1.jpg" /> 그림 1 : 미세 소관 동적에 도세탁셀의 효과MCF-7 TXT 및 MCF-7 CC 세포의의. 한 바와 같은 라이브 영상을 시행 하였다. (A) MCF-7 CC 1 시간 동안 0.5 μM 도세탁셀로 치료 다음 MCF-7 TXT 세포에서 미세 소관 역학의 라이브 영상에서 선택한 이미지. 화살표는 연장 미세 소관을 나타냅니다. 화살촉은 단축 미세 소관을 나타냅니다. 크기 바 = 5 μm의. (B) 신장율 및 미세 소관의 단축 비율은 녹화 된 영상으로부터 측정 하였다. 각 데이텀은 적어도 8 개의 다른 셀로부터 20 측정의 평균이다. 에러 바는 표준 오류입니다. ** 차이가 P &lt;0.01로 통계적으로 유의 있음을 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55027/55027fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

라이브 영상은 탁 내성 유방암의 미세 소관 동적 불안정성을 연구하는

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

live-imaging-to-study-microtubule-dynamic-instability-taxane

Nanyang Technological University

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The Cytoskeleton II: Microtubules and Intermediate Filaments

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7.5K 조회수.  University of Alberta. In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells. 

비디오: Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

연구

암 연구학

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the beginning and end of an experiment using a phase-contrast microscope, and the migration abilities of cells are evaluated by the closure of wounds. However, cell movement is a dynamic phenomenon, and a conventional method does not allow for tracking single-cell movement. To improve current wound-healing assays, we use live-cell imaging techniques to monitor cell migration in real time. This method allows us to determine the cell migration rate based on a cell tracking system and provides a clearer distinction between cell migration and cell proliferation. Here, we demonstrate the use of live-cell imaging in wound-healing assays to study the different migration abilities of breast epithelial cells influenced by the presence of TIP60. As cell motility is highly dynamic, our method provides more insights into the processes of wound healing than a snapshot of wound closure taken with the traditional imaging techniques used for wound-healing assays.

Here, we present the real-time monitoring of cell migration in a wound-healing assay using TIP60-depleted MCF10A breast epithelial cells. The implementation of live-cell imaging techniques in our protocol allows us to analyze and visualize single-cell movement in real time and across time.

TIP60의 과도 한 소모 후 유 방 상피 세포 이동의 라이브 영상

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

라이브 셀 이미징 분석 실험 연구 세포종 뇌 종양 줄기 세포 이동과 내 습을

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo cancer models. The chicken chorioallantoic membrane (CAM) model provides an inexpensive, rapid alternative that permits direct visualization of tumor development and is suitable for in vivo imaging. As such, we sought to develop an optimized protocol for engrafting gynecological and urological tumors into this model, which we present here. Approximately 7 days postfertilization, the air cell is moved to the vascularized side of the egg, where an opening is created in the shell. Tumors from murine and human cell lines and primary tissues can then be engrafted. These are typically seeded in a mixture of extracellular matrix and medium to avoid cellular dispersal and provide nutrient support until the cells recruit a vascular supply. Tumors may then grow for up to an additional 14 days prior to the eggs hatching. By implanting cells stably transduced with firefly luciferase, bioluminescence imaging can be used for the sensitive detection of tumor growth on the membrane and cancer cell spread throughout the embryo. This model can potentially be used to study tumorigenicity, invasion, metastasis, and therapeutic effectiveness. The chicken CAM model requires significantly less time and financial resources compared to traditional murine models. Because the eggs are immunocompromised and immune tolerant, tissues from any organism can potentially be implanted without costly transgenic animals (e.g., mice) required for implantation of human tissues. However, many of the advantages of this model could potentially also be limitations, including the short tumor generation time and immunocompromised/immune tolerant status. Additionally, although all tumor types presented here engraft in the chicken chorioallantoic membrane model, they do so with varying degrees of tumor growth.

We present the chicken chorioallantoic membrane model as an alternative, transplantable, in vivo model for the engraftment of gynecological and urological cancer cell lines and patient-derived tumors.

비보 모델에서 닭 융모난토암 막을 사용하여 부인과 및 비뇨기과 암을 연구

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. The leading cause of breast cancer related deaths is the metastatic burden. Therefore, preclinical models for breast cancer need to analyze metastatic burden to be clinically relevant. The 4T1 breast cancer model provides a spontaneously-metastasizing, quantifiable mouse model for stage IV human breast cancer. However, most 4T1 protocols quantify the metastatic burden by manually counting stained colonies on tissue culture plates. While this is sufficient for tissues with lower metastatic burden, human error in manual counting causes inconsistent and variable results when plates are confluent and difficult to count. This method offers a computer-based solution to human counting error. Here, we evaluate the protocol using the lung, a highly metastatic tissue in the 4T1 model. Images of methylene blue-stained plates are acquired and uploaded for analysis in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ then determines the percentage of the selected area of the image that is blue, representing the percentage of the plate with metastatic burden. This computer-based approach offers more consistent and expeditious results than manual counting or histopathological evaluation for highly metastatic tissues. The consistency of Fiji-ImageJ results depends on the quality of the image. Slight variations in results between images can occur, thus it is recommended that multiple images are taken and results averaged. Despite its minimal limitations, this method is an improvement to quantifying metastatic burden in the lung by offering consistent and rapid results.

We describe a more consistent and expeditious method to quantify lung metastasis in the 4T1 breast cancer model by using Fiji-ImageJ.

4T1 유방암 모델에서 폐 전이의 정량화를 개선하기 위해 컴퓨터 기반 이미지 분석을 사용하여

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

미생물 시스템을 사용하여 인간 유방 조직에서 유방암 모델링

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers that cause LMD are breast and lung cancers and melanoma. Patients diagnosed with LMD have a very poor prognosis and generally survive for only a few weeks or months. One possible reason for the lack of efficacy of systemic therapy against LMD is the failure to achieve therapeutically effective concentrations of drug in the CSF because of an intact and relatively impermeable blood-brain barrier (BBB) or blood-CSF barrier across the choroid plexus. Therefore, directly administering drugs intrathecally or intraventricularly may overcome these barriers. This group has developed a model that allows for the effective delivery of therapeutics (i.e., drugs, antibodies, and cellular therapies) chronically and the repeated sampling of CSF to determine drug concentrations and target modulation in the CSF (when the tumor microenvironment is targeted in mice). The model is the murine equivalent of a magnetic resonance imaging-compatible Ommaya reservoir, which is used clinically. This model, which is affixed to the skull, has been designated as the &#34;Murine Ommaya.&#34; As a therapeutic proof of concept, human epidermal growth factor receptor 2 antibodies (clone 7.16.4) were delivered into the CSF via the Murine Ommaya to treat mice with LMD from human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. The Murine Ommaya increases the efficiency of drug delivery using a miniature access port and prevents the wastage of excess drug; it does not interfere with CSF sampling for molecular and immunological studies. The Murine Ommaya is useful for testing novel therapeutics in experimental models of LMD.

Here, we describe a murine xenograft model that functionally resembles an Ommaya reservoir in patients. We developed the Murine Ommaya to study novel therapeutics for the universally fatal leptomeningeal disease.

렙토메뇌질환의 직접 표적 치료를 연구하는 뮤린 옴마야 제노이식 모델

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...