The authors have no acknowledgements.

CNTFRα 해물 1. 웨스턴 블로 팅 <ol><li> 전체 길이 sorLA 및 Myc와-태그 CNTFRα 인간 배아 신장에 구축 표현 된 pcDNA3.1 / ZEO 사용하여 293 (HEK293) 세포 (-) 및 한 pcDNA3.1 / HYG을 (-), 각각. 작 제물은 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 형질 감염 시약을 이용하여 HEK293 세포를 형질 감염. 150 μg의 / mL로 오신 및 / 또는 500 μg의 / mL의 하이 그로 마이신 B 골드 (13)를 포함하는 배지에서 안정적인 클론을 선택합니다. </li><li> HEK293의 씨앗 동일한 번호는 표현 중 하나 CNTFRα-Myc와 또는 형질의 공동 발현 Eagle&#39;s 중간 (DMEM) 수정 된 둘 베코의 세포가 10 %의 태아 보충 그림 1. 문화에서와 같이 두 개의 4 웰 플레이트에 CNTFRα-Myc와 / sorLA을 소 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린, 37 ℃에서 5 % 이산화탄소 배양기에서 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 (완전 배지). </li><li> 80 % 합류 - 세포가 50 때까지 기다립니다. </li><li> 로부터 매체를 제거우물, 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS)로 한번 세척하고, 또는 (제어) 10 나노 CLC없이 신선한 전체 매체를 추가 : CLF-1도 1에 나타낸 바와 같이. 37 ℃에서 세포를 품어. </li><li> 배양의 0 ~ 5 시간 후, 매체를 복구하고 1.5 mL의 튜브를 4 ℃에서 보관합니다. 이어서 각 웰에 단백질 분해 효소 억제제 칵테일 (1 분, 4 ℃)으로 보충 된 1 % 트리톤 X-100 용해 완충액 (20 mM의 트리스 -HCl, 10 mM의 EDTA, pH를 8.0)을 추가한다. 그 후, 1.5 ㎖의 튜브 (4 ℃)에 세포 용 해물을 전송합니다. </li><li> 배지 및 세포 용해질 (3000 XG, 3 분, 4 ℃)를 포함하는 튜브를 회전 및 1.5 ㎖의 튜브 (4 ℃)하여 상청액을 전송. 펠렛을 폐기하십시오. 새로운 1.5 ㎖의 튜브에 각각 파쇄 상등액 5 μL 이전 - 이후 단백질 함량을 측정하기 위해 그들을 사용 (170 단계). 즉시 모든 상청액을 비 환원 LDS 샘플 완충액을 추가 샘플을 소용돌이. </li><li> PROT를 측정하는 5 μL 분취 액을 사용하여제조사의 프로토콜에 따라 상업적 단백질 분석법을 사용하여 세포 용 해물의 상청액 EIN 콘텐츠. </li><li> 5 분 동안 95 ℃에서 시료를 가열한다. </li><li> (5 13 블 롯팅 SDS-PAGE (13)을 감소시키고 웨스턴 각 시료에서 단백질의 동량을 대상 방지 sorLA 16의 토끼를 사용하여 배지에 상기 세포 용 해물에 sorLA, β 액틴 및 CNTFRα-Myc와의 내용을 시각화 μg의 / ㎖), 마우스 항 β 액틴 (0.4 μg의 / ㎖) 및 항 - 마우스 나 Myc (1 μg의 / ㎖) 항체 및 적절한 HRP 결합 된 이차 항체 (1 : 2000). </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 농도계에 의해 밴드를 정량화. </li></ol> 리소좀 억제제와 병용 2. 면역 세포 화학 <ol><li> 그림 2와 같이 종자 HEK293 세포를 안정적으로 4 웰 플레이트에서 커버 슬라이드에 CNTFRα-Myc와 / sorLA로 형질. 문화 상기 완전 배지에서 세포. </li><li>40 % - 셀 합류 20 때까지 기다립니다. </li><li> 우물에서 매체를 제거하고 그림 2에 나타낸 바와 같이, 또는 류 펩틴의 50 μg의 / mL를하지 않고 세포에 펩 스타틴 A (레우 / PEP) (억제 리소좀 가수 분해 효소)의 전체 매체를 추가합니다. 37 ℃에서 세포를 품어. 매체는 배양 다음 24 시간 동안 매 6 시간을 교체해야합니다. </li><li> 24 시간 배양 한 후, 다시 한 번 (레우 / 격려와 함께 또는없이) 매체를 교체하고이 시간은 10 나노 CLC 추가 : CLF-1. 5 시간 동안 37 ℃에서 세포를 품어. </li><li> PBS에 한 번 세포를 세척하고 실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드, pH가 7을 수정합니다. 주의 : 파라 포름 알데히드는 피부, 눈 및 점막에 닿지 않도록, 매우 독성이다. 장갑, 보호 안경 착용과 솔루션은 흄 후드 내에서해야한다. </li><li> PBS에 한 번 세포를 씻고 PBS에 희석 사포닌에서 RT에서 5 분 (0.5 % 사포닌)의 세포를 Permeabilize 하시려면. </li><li> 염소 항 CNTFRα 희석 (1 μg의 / ㎖) (특히아니라 마우스 항 Myc와 0.5 % 사포닌의 웨스턴 블롯), 마우스 안티 LAMP-1 (15 μg의 / ㎖) 항체를 사용하고 RT에서 2 시간 동안 항체와 세포를 배양한다. </li><li> 0.5 % 사포닌의 셀 4 배 (5 분) 세척 및 당나귀 방지 염소 알렉사 488-와 당나귀 항 - 마우스 알렉사 568 - 복합 이차 항체 (6 μg의 / mL)을 실온에서 2 시간 동안 함께 세포를 배양. </li><li> 두 번 탈 이온수 (1 분)에, 0.5 % 사포닌의 셀 4 배 (5 분) 세척 및 설치 미디어를 사용하여 슬라이드 현미경 커버 슬라이드를 탑재합니다. </li><li> 63X C-고차 색지움 물 침지 목표, NA 1.2 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 공 초점 현미경으로 세포의 항체 염색을 분석합니다. </li></ol> pSTAT3 수준 3. 서양 얼룩 검출 <ol><li> 도 3에 도시 된 바와 같이, 4- 웰 플레이트 (CNTFRα의 내인성 수준을 발현) 시드 - HEK293 세포 sorLA. 문화 상기 완전 배지에서 세포. </li><li> 때까지 기다립니다80 % 합류 - 셀 (50)이다. </li><li> , 우물에서 매체를 제거 PBS에 한 번 세척하고, 나노 CLC 또는 10 않고 신선한 전체 매체를 추가 : CLF-1 세포에 그림 3에 나타낸 바와 같이. 5 시간 동안 37 ℃에서 세포를 품어. </li><li> , 매체를 제거 비추 DMEM에서 두 번 세포를 씻어 (빈 매체, FBS와 항생제없이), 다음 빈 배지에서 90 분 (37 ℃)에 대한 세포를 reincubate. </li><li> 그림 3에 나타낸 바와 같이 (STAT3 인산화를 시작합니다) CLF-1 : 다시 한번, 매체를 제거하고 또는 5 나노 CLC없이 비어있는 새 매체를 추가합니다. 37 ℃에서 15 분 동안 품어. </li><li> 빠르게 (1 분, 4 ℃)는 단백질 분해 효소 억제제 칵테일 및 포스파타제 억제제가 보충 1 % 트리톤 X-100 용해 완충액 (20 mM의 트리스 -HCl, 10 mM의 EDTA, pH를 8.0)을 첨가하여 세포를 배지를 제거하고 용균 각 웰에 칵테일입니다. 그 후, 1.5 ㎖의 튜브 (4 ℃)에 세포 용 해물을 전송합니다. </li><li> 이전 5 μL 오F 새로운 1.5 ㎖의 튜브에 각각 상등액 - (380 단계) 이후, 단백질 함량을 측정하도록 사용한다. 즉시 모든 상청액을 비 환원 LDS 샘플 완충액을 추가 샘플을 소용돌이. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 단백질 분석을 이용하여 5 μL 분취 액의 단백질 함량을 측정한다. </li><li> 더 이상 점착성 (약 1 분) 다음에있는 5 분 동안 95 ℃에서 가열을 RT까지 각 샘플을 초음파 처리 없음. </li><li> SDS-PAGE (13) 및 웨스턴 13 블 각 샘플로부터 단백질의 동량을 대상 토끼에게 항 pSTAT3 (1 : 2000)를 사용하여 세포 용 해물에서 pSTAT3의 내용 및 전체 STAT3 시각화 항 STAT3 및 마우스 (1 : 1000 ) 항체 및 해당 HRP-연결된 마우스와 토끼 보조 항체 (1 : 2000). </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 농도계에 의해 밴드를 정량화. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

여기에 설명 된 프로토콜 sorLA 매개 CLC을 설명하기 위해 특별히 사용되는 수 CLF-1 의존성 하향 조절 및 CNTFRα 타겟팅 리소좀뿐만 아니라 CLC에 수반 약화 응답 : CLF-1 자극. 그들은 CNTFRα 및 sorLA 단지 사소한 내인성 발현을 명시 gp130을 / LIFRβ, 형질 쉬우 며 면역 세포 적합 대형 전지 본체를 갖고, 상기 HEK293 세포주는이 프로토콜에 적합하다. 그러나 이론적으로 유사한 특성을 가진 셀 라인은 잘 작동합니다. 이 프로토콜은 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫번째 관심사는 레우 / PEP 매체는 24 시간 동안 약 6 시간마다 교체해야하는 230 단계. 그렇게하지 않으면 활성 리소좀 효소 이하 또는 리소좀 단백질의 탐지되지 축적의 원인이 될 수 있습니다. 두번째 중요한 단계 (3.4) CLC 사전 인큐베이션에 세척 우려 : CLF-1. 그것은 메신저입니다으로 중요 어떤 언 바운드 리간드를 제거하고 세포의 시간이 비추 DMEM (빈 매체)에 (계속 자극을 피할 수) 복구 할 수 있도록. CLF-1 (단계 3.5) :이 CLC와 후속 다시 자극하는 동안 pSTAT3의 낮은 배경 수준을 보장합니다. 특히,도 6은 세포 반응 (pSTAT3)이 CNTFRα의 sorLA 매개 된 하향 조절과 평행하게 감소한다는 것을 보여준다. 이는 감소 된 응답이 CNTFRα 풀의 감소 (그리고 따라 예상 할 수있는)에 따른이지만,이 저 CNTFRα 식 단독 감소 세포 반응을 차지하는 것을 증명하지 않는다는 점을 강조해야한다. 따라서, 변경 - 프리 자극 또는 형질의 결과 - 상류 pSTAT3에 신호 전달 경로의 기능 요소 중 어느 하나가 변경된 응답에 기여 할 수 있습니다. 프로토콜의 기본 개념이이 특별히 한정되지 않는다LAR 수용체 시스템. (. 즉, 다른 세포주, 기타 항체, 기타 리간드 등) - 무관 sorLA&#39;s 개입 프로토콜을 수정하여 그것뿐만 아니라 다른 수용체의 리간드 - 유도 하향 조절을 결정하기 위해 사용될 수있다. 그러나, 웨스턴 블 롯팅에 의해 수용체 하향 조절의 분석은 주로 예 수용체 느린 회전율 및 자극되지 않은 세포에서의 새로운 합성의 낮은 정도를 나타내고, GPI 고정 - 수용체에 적합한 것을 주목해야한다. 따라서, 새로운 합성의 하이 레벨을 나타내는 수용체의 리간드 - 유도 수용체 하향 조절이 새로운 합성에 의해 보상 될 수있다. 21에 기술 된 바와 같이 이러한 상황에서 풀 수용체의 하향 조절 대신 대사 라벨링 펄스 추적 실험에 의해 결정될 수있다. 선택적으로, 수용체를 방해하지 요오드화 항체 (바람직 된 Fc 단편)의 &quot;태그&quot;를 RECEPT의 ectodomain하는데 사용될 수 바인딩또는, 상기 예상 하향 조절은 세포 펠릿과 배지 방사성 계수에 의해 결정될 수있다. 물류 이유로 우리는 CNTFRα 우리의 세포는 Myc와 태그를 들고 구성 형질, 본 프로토콜에서 마우스 항 - Myc와 항체 수용체의 웨스턴 블롯 검출에 사용되었다. 대조적으로, 염소 항 - CNTFRα 항체 LAMP-1 마우스 항체에 의해 검출되었을 때 면역 세포 및 이중 표지에 사용 된 - 분명 이차 항체 불특정 (중첩) 염색 초래 개의 기본 마우스 항체를 사용한다. 염소 항 - CNTFRα도 (도시 생략) 웨스턴 블 롯팅에서 작동하기 때문에, 프로토콜은 쉽게 수정 및 태그가없는 CNTFRα 형질 세포에 적용 할 수 있습니다. 고친 화도 22 CLF-1 : 마지막으로, 최근에는 세포 내 이입이 수용체 sortilin CLC 결합하는 것으로 나타났다. 따라서, 생각할 수있는 그 sortilin처럼이며sorLA는 CLC에 상호 : CLF-1을 통해 CNTFRα 및 세포 내 이입뿐만 아니라 CNTFRα의 대상으로 리소좀을 중재 할 수 있습니다. 대신 sorLA의 sortilin을 사용하여, 본 프로토콜은이 문제를 명확히하기 위해 사용될 수있다.

CLF-1 : 1-3 콜레 스테 릭 액정 및 CLF-1 이종 사이토킨 CLC의 두 서브 유닛을 구성한다. 셀룰러 신호 유도, CLC : CLF-1 제 대상은 CNTFRα 그 차 및 GPI-고정 리셉터는 멤브레인 결합 된 삼량 체 복합체를 형성한다. 콜레 스테 릭 액정 : CLF-1 : CNTFRα 단지 이후 모집 횡단은 야누스 키나제 / 신호 변환기 및 전사 3 (JAK / STAT3) 경로 4 활성제를 통해 신호를 중재 gp130을 / LIFRβ. 세 개의 서브 유닛 중 어느 결핍 마우스는 하나의 디스플레이와 같은 표현형 인한 안면 신경 불충분 유아 5-8의 감소 된 수의 출생 후 24 시간 이내에 사망한다. 인간의 연구 결과는 마찬가지로 세 개의 서브 유닛의 기능 일관성을 강조한다. 따라서, 인간의 돌연변이 (동형 접합체 또는 화합물) CLC의 원인이 장애 : CLF-1 또는 CNTFRα, 소위 감기에 의한 발한 / Crisponi 증후군의 모든 결과, 같은 impai 등의 증상을 특징으로하는 조건빨간색 유아 및 삼키는, 다양한 기형 기능, 온도 스파이크, 그리고 역설적 및 저온 9-11에서 땀 관류. 시험 관내에서, CLC 및 CNTFRα의 조합 및 gp130을 필요 / LIFRβ과의 상호 작용 및 셀 (12) 시그널링을 유도하기에 충분한 양이다. 반면에, CLF-1의 역할은 덜 명확하다. 직접적 시그널링에 관련되지 않고, 긴 주로 CLC 1의 세포 분비를 촉진하는 역할을 부록으로 간주되어왔다. 그러나, 최근의 연구 결과는 CLF-1 시그널링 및 CLC와 CNTFRα 회전율 모두 연루 추가 등 중요한 기능을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, CLF-1은 3 개의 독립적 인 결합 부위가 포함되어 있다고 표시 : 하나씩의 CLC 결합 공지; CNTFRα에 바인딩 직접 중재 한; 및 세포 내 이입 수용체 sorLA과의 상호 작용에 대한 세 번째 (높은 친 화성) 사이트. CLC 및 CLF-1 둘 것 &amp; #로(160), 상기 CLC보다 상당히 낮은 친화력과 CNTFRα를 대상으로 : CLF-1 복잡한, (그 CNTFRα 결합 사이트를 통해) CLF-1 CLC와 CNTFRα의 통일을 촉진하여 13 신호를 용이하게 생각할 수있다. sorLA CLF-1과의 상호 작용이 본 발표의 주요 문제는 완전히 다른 역할을한다. SorLA는 Vps10p 도메인 수용체 가족 (14)를 구성하는 다섯 가지 유형 (1) 수용체의 하나입니다. 이것은 다양한 조직이 아니라 뇌 신경 조직 (15) 내의 특정 표현된다. 다른 가족 구성원과 마찬가지로 sorLA는 Vps10p - 결합 도메인 N- 말단 리간드를 수행하지만, 또한,도 저밀도 지단백질 수용체 패밀리 (15)의 부재에 위치한 리간드 - 결합 요소를 포함하는 다른 도메인 유형을 포함한다. 그것의 세포질 꼬리 여러 어댑터 단백질, 예를 들어, 어댑터 단백질-1, -2, 그리고 sorLA와 상호 작용이 효율적으로 endocytos를 전달입니다뿐만 아니라 결합 단백질 16 ~ 18의 세포 내 정렬 및 전송. Vps10p 도메인은 CLF-1 (단, 특히, CLC 생략) (13)를 포함하여 리간드 무관하는 일련의 바인딩 큰 텐 β 블레이드 프로펠러 (19, 20)를 포함한다. CLF-1의 결합 부위가 액세스 후에도 sorLA뿐만 아니라 결합을 의미 CLC 및 CNTFRα 복잡한 형성 무료 CLF-1뿐만 아니라, CLC : CLF-1과 삼량 체 복잡한 CLC : CLF-1 : CNTFRα 13. SorLA은 CLF-1 및 CLC의 신속한 세포 내 이입 전달 : CLF-1이지만 CNTFRα는 GPI 앵커에 의해 막 표면에 고정되는 반면, 이러한 수용성 단백질이다. / 및 CLF-1 : : : CNTFRα이 sorLA 전체 단지를 내면화 할 수 있도록함으로써 CNTFRα의 표면 막 식 (CLF-1 신호 유도 및 CLC에 후속 세포 감수성)을 변경하는 문제는 CLC의 따라서 경우에 구속력을 또는 CNTFRα의 회전율. 본 실험에 기재된보고서는 다음과 같은 질문을 명확히하기 위해 설계되었습니다 : sorLA은 CLC를 매개 하는가 : 표면 막 CNTFRα의 CLF-1에 의존 하향 조절? 이를 명확히하기 위해, 초기에 21에서 설명한 바와 같이 대사 라벨링 펄스 추적 실험에 의해 (부재와 sorLA의 존재하에) CNTFRα의 회전율을 결정하려고 시도 하였다. 그러나 CNTFRα는 [S (35)] 시스테인의 혼합물을 사용하여 [S (35)] 메티오닌은 방사능의 가난한 통합을 보였다 레이블을 시도합니다. 이것은 모든 확률 수용체의 급격한 상당한 손실을 보상 할 수 없을 것이다 새로운 합성은 매우 낮은 수준을 제안했다. CLC를 통해 상호 때 CNTFRα이 하향 조절되었는지 확인하려면 : CLF-1 sorLA, 그것은 따라서 단순히 이전과 CLC에 노출 된 후 (웨스턴 블로 팅 사용) CNTFRα의 총 세포 풀을 측정하기로 결정했다 : CLF-1 -과 결과를 비교 세포를 형질 전환 또는 형질하지에sorLA. sorLA은 리소좀에 CNTFRα을 대상으로합니까? 이 질문에, CNTFRα의 현지화에 대답하기 위해 - 그 CLC를 통해 내면화 : sorLA 결합 CLF-1 매개 - 면역 세포를 이용하여 조사하고, CNTFRα 향하는 항체 및 후기 엔도 좀 / 리소좀 마커 리소좀 관련 막 단백질 1 표시 (LAMP-1). 실험은 리소좀 효소의 억제제로 치료뿐만 아니라 처리 된 세포에서 수행 하였다. 아이디어는 CNTFRα이 리소좀에서 분해 된 경우 처리되지 않은 세포가 CNTFRα에 대해 거의 또는 전혀 염색을 보여줄 것입니다 반면, 효소 억제제로 치료 세포, LAMP-1 긍정적 인 소포에 축적 CNTFRα-염색을 제시 것을 물론이다. CLF-1 자극 : CNTFRα의 하향 조절은 CLC에 대한 세포 반응을 낮출 수 있나요? JAK / STAT3을 사용하여 gp130을 / LIFRβ 이질 통해 CLC, CLF-1을 CNTFRα 신호 이루어지는 삼량 체 복합체좁은 길. 따라서, 전지의 용량은 CLC에 응답하기 : CNTFRα의 하향 조절시 CLF-1 신호는 웨스턴 블롯 검출 및 sorLA의 형질 전환 체의 인산화 STAT3 (pSTAT3) / 총 STAT3 수준의 정량에 의해 탐험했다.

<table><tbody><tr><td>Zeocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-zn-1</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B Gold</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 Transfection Reagent&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11 815 091 001</td><td></td></tr><tr><td>4-well plates (Nunclon Delta Surface)</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle&amp;acute;s Medium (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F/U1</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp; (DPBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>CLC:CLF-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1151-CL/CF</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-LAMP-1&amp;nbsp;</td><td>DSHP</td><td>H4A3</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-sorLA</td><td></td><td></td><td>Reference 16</td></tr><tr><td>Mouse anti-b-actin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2228</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Myc</td><td>Genscript</td><td>A00704</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-CNTFRa&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF-303</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-pSTAT3&amp;nbsp;</td><td>Cell signaling Technology</td><td>9145s</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-STAT3&amp;nbsp;</td><td>Cell signaling Technology</td><td>9139s</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse HRP-linked antibody</td><td>Cell signaling Technology</td><td>7076s</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit HRP-linked antibody</td><td>Cell signaling Technology</td><td>7074s</td><td></td></tr><tr><td>Anti-goat HRP-linked antibody</td><td>Dako</td><td>P0160</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L8511-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4265-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1388</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Merck</td><td>1,082,191,000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA:Titriplex III</td><td>Merck</td><td>1,084,180,250</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete mini EDTA-free</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>04 906 837 001</td><td></td></tr><tr><td>LDS sample Buffer (4x)</td><td>Novex</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde (PFA)</td><td>VWR</td><td>97,135,000</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>S7900-100G</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr></tbody></table>

sorla and clc:clf-1-dependent downregulation of cntfr&#945; as demonstrated by western blotting, inhibition of lysosomal enzymes, and immunocytochemistry

이종 사이토킨 Cardiotrophin 같은 사이토 카인 : 사이토 카인과 같은 인자 1 (CLC는 : CLF-1)합니다 (glycosylphosphatidylinositol (GPI)에이어서 130 / 백혈병 억제 인자 수용체 β 당단백 모집 삼량 체 복합체를 형성 CNTFRα을 -anchored 대상 gp130을 / 신호에 대한 LIFRβ). CLC 및 CNTFRα 모두 신호하지만 지금까지 CLF-1 만 CLC 분비의 추정 촉진제로 알려져있다위한 필요하다. 그러나, 최근 CLF-1 세 개의 결합 부위 포함 나타났다 : CLC 하나씩; CNTFRα 하나 (즉, 삼량 체 복합체의 어셈블리를 촉진 할 수있다); 및 세포 내 이입 수용체 sorLA 하나. CLF-1뿐 아니라, 삼량 체 (CLC : CLF-1 : CNTFRα) 후자 사이트 CLF-1 CLC의 결합 친 화성이 높은 제공 sorLA에 복잡하고 세포를 가용성 리간드 CLF-1 및 CLC를 sorLA 발현 : CLF-1은 빠르게 흡수하고 내장되어 있습니다. CNTFRα 및 sorLA 공동 발현하는 세포에서 CNTFRα 먼저 CLC 바인딩 : CLF-1은 형성한다멤브레인 - 관련 삼량 착체뿐만 아니라 CLF-1에서의 자유로운 sorLA 결합 부위 sorLA 통해 연결된다. 결과적으로, 자체적으로 엔도 시토 시스에 대한 능력이없는 CNTFRα는 함께 당 겼고되고 CLC의 sorLA - 매개 엔도 사이토 시스에 의해 내재화 : CLF-1. 본 프로토콜)는 sorLA 매개과 CLC 전을 설명하는 데 사용되는 실험 절차에 대해 설명 : 표면 막 CNTFRα 표현의 CLF-1에 의존 하향 조절을; ⅱ) 세포 내 이입과 CNTFRα의 대상으로 리소좀 sorLA이 매개; 및 ⅲ) CLC로 하향 조정 세포 반응 : CNTFRα의 sorLA 매개 하향 조절시 CLF-1-자극.

도 1은 셀 시드 및 CLC의 개략도 보여준다 프로토콜 2.도 3 CLF-1 배양 : 프로토콜 CLF-1 배양을 1도 2는 셀 시드 및 레우 / PEP와 CLC의 개략도를 도시 sorLA 매개 CLC 프로토콜 3. 그림 4 CLF-1 배양과 자극을 보여줍니다 : 셀 - 파종 및 CLC의 개략도를 보여줍니다 CNTFRα의 CLF-1에 의존 하향 조절. 그림 5는 CNTFRα의 타겟팅 sorLA 매개 엔도 시토 시스와 리소좀을 보여줍니다. CNTFRα의 하향 조절 한 후 CLF-1 자극 : 그림 6은 CLC에 낮은 응답을 보여줍니다. CNTFRα-Myc와의 하향 조절이 sorLA의 형질 전환에 약한 밴드 afte에 의해 입증되는 반면 CNTFRα-Myc와을 상징하는 밴드, 시간 제로에서 비슷한 밀도를 가지고 있습니다R 5 시간 (그림 4). 그림 5는 CNTFRα-Myc와는 레우 / 응원 처리 된 세포의 LAMP-1 긍정적 인 소포에 축적 된 것을 알 수있다. 반대로 CNTFRα-Myc와 어떠한 축적 레우 / PEP 처리를 실시하지 세포에서 보이지 않는다. 이 CNTFRα-Myc와는 리소좀에 정렬되고 분해되는 것을 보여줍니다. CLF-1 :도 6에서 알 수있는 바와 같이 CLC에 노출되지 않은 세포에서의 수준과 비교해서 pSTAT3 수준은 상당히 예비 자극 된 세포에서 감소된다. 이것은 예비 자극 된 세포에서 관찰 된 CNTFRα sorLA 매개 된 하향 조절 (도 4)에 따른다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig1.jpg" /> 그림 1 : 두 4-에서 프로토콜 CLF-1 배양 1. 씨 HEK293-CNTFRα-Myc와 및 HEK293-CNTFRα-Myc와 / sorLA 세포 : 세포 파종 및 CLC의 도식 표현웰 플레이트 (0 ~ 5 시간) 및 CLC와 세포를 품어 : CLF-1 바와 같이. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55019/55019fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig2.jpg" /> 그림 2 : 세포 파종 및 레우 / 단합과의 도식 표현 CLC : CLF-1 4 웰 플레이트에서 커버 슬라이드 프로토콜 2. 종자 HEK293-CNTFRα-Myc와 / sorLA 세포의 배양 및 또는 레우없이 세포를 배양 / 격려와 CLC : CLF-1 바와 같이. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55019/55019fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig3.jpg" /> 그림 3 : </strong&gt; 세포 파종 및 CLC의 도식 표현 : 한 4 웰 플레이트에서 프로토콜 3. 씨 HEK293-sorLA 세포에서 CLF 배양과 자극 또는 CLC없이 세포 배양 : (. 사전 특급) CLF-1을 하향 조절하기 나타낸 바와 같이, STAT3 인산화을 시작 CLF-1 자극 (STIM.) : CNTFRα는 CLC 하였다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55019/55019fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig4.jpg" /> 그림 4 : SorLA가 중재 것을 보여주는 결과 CLC : CNTFRα의 CLF-1에 의존 하향 조절. (A) HEK293-CNTFRα-Myc와 및 (B) HEK293-CNTFRα-Myc와 / sorLA 셀 부재 (10)의 나노 CLC (흰색 칼럼) 또는 존재 (회색 칼럼)에서 배양 하였다 : CLF-1. 0 후와5 시간은, 배양이 중지되고 상기 매체 (m)의 CNTFRα-Myc와의 함량 및 세포 용 해물을 (l) 웨스턴 블 롯팅에 의해 검출하고, 밀도 측정에 의해 정량 하였다. 상단 패널은 대표적인 실험 웨스턴 블롯 결과를 표시하고, 하부 패널은 세포 용 해물에서 발견 CNTFRα-Myc와의 검출 레벨을 나타낸다. 레벨은 0 시간에서 단일 및 이중 형질의 CNTFRα-Myc와 수준을 기준으로 표시됩니다. 각 컬럼은 평균 ± SEM를 나타낸다 (n = 3)를 나타낸다. P-값은 t-test를 이용하여 계산 하였다. 원래 그림 13 후 재현. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55019/55019fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig5.jpg" /> 그림 5 :SorLA는 엔도 시토 시스와 CNTFRα의 대상으로 리소좀을 매개 것을 보여주는 결과. HEK293-CNTFRα-Myc와 / sorLA 세포는 10 나노 CLC 배양, 또는 레우 / PEP없이 처리 하였다 : 프로토콜에 기재된 CLF-1, 5 시간 반 CNTFRα 안티 LAMP-1 항체를 이용하여 고정하고, 마지막으로 염색 2. 스케일 바 : 5 μm의. 원래 그림 13 후 재현. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55019/55019fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/55019/55019fig6.jpg" /> 그림 6 : CLF-1 자극 : CNTFRα의 SorLA 매개 하향 조절이 CLC에 내려 세포 반응을 동반한다. HEK293-sorLA 셀 부재 (10) 또는 나노 CLC의 존재하에 예비 인큐베이션 하였다 (. 프리 EXP)을 5 시간 동안 CLF-1의 결핍 blan케이 90 분 동안 매체, 5 nM의 CLC로 자극 : (. STIM) CLF-1 15 분. (왼쪽) 열은 세포에서 pSTAT3의 상대적 수준을 보여줍니다. CLF-1이지만 CLC 자극 : CLF-1의 각 열은 CLC의 부재에서 전 배양 세포에서 pSTAT3 레벨 (N = 3)의 상대 ± SEM을 의미 나타낸다. t-test를 이용하여 계산 된 p- 값. (오른쪽) 웨스턴 블롯은 대표적인 실험에서 얻어진 pSTAT3와 STAT3의 응답을 보여줍니다. 원래 그림 13 후 재현. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55019/55019fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

본 프로토콜은 사이토 카인과 같은 인자 -1 (CLF-1 사이의 상호 작용에 의해 전달된다 섬모 향 신경성 인자 수용체 α (CNTFRα)의 하향 조절을 입증 할 수있는 방법을 웨스턴 블랏 및 리소좀 효소의 억제와 함께 면역 세포 설명 )와 세포 내 이입 수용체 sorLA.

SorLA 및 CLC : 웨스턴 블로 팅, 리소좀 효소의 억제 및 면역 세포에 의해 입증으로 CNTFRα의 CLF-1에 의존 하향 조절

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

sorla-clcclf-1-dependent-downregulation-cntfr-as-demonstrated-western

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.2K 조회수.  Aarhus University.  본 프로토콜은 사이토 카인과 같은 인자 -1 (CLF-1 사이의 상호 작용에 의해 전달된다 섬모 향 신경성 인자 수용체 α (CNTFRα)의 하향 조절을 입증 할 수있는 방법을 웨스턴 블랏 및 리소좀 효소의 억제와 함께 면역 세포 설명 )와 세포 내 이입 수용체 sorLA. 

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CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

연구

유전학

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western countries. The majority of CLL patients show an indolent course of the disease as well as an anergic phenotype of their leukemia cells, referring to a B cell receptor unresponsive to external stimulation. We have recently shown that the transcription factor NFAT2 is a crucial regulator of anergy in CLL. A major challenge in the analysis of the role of a transcription factor in different diseases is the identification of its specific target genes. This is of&#160;great significance for the elucidation of pathogenetic mechanisms and potential therapeutic interventions. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a classic technique to demonstrate protein-DNA interactions and can, therefore, be used to identify direct target genes of transcription factors in mammalian cells. Here, ChIP was used to identify LCK as a direct target gene of NFAT2 in human CLL cells. DNA and associated proteins are crosslinked using formaldehyde and subsequently sheared by sonication into DNA fragments of approximately 200-500 base pairs (bp). Cross-linked DNA fragments associated with NFAT2 are then selectively immunoprecipitated from cell debris using an &#945;NFAT2 antibody. After purification, associated DNA fragments are detected via quantitative real-time PCR (qRT-PCR). DNA sequences with evident enrichment represent regions of the genome which are targeted by NFAT2 in vivo. Appropriate shearing of the DNA and the selection of the required antibody are particularly crucial for the successful application of this method. This protocol is ideal for the demonstration of direct interactions of NFAT2 with target genes. Its major limitation is the difficulty to employ ChIP in large-scale assays analyzing the target genes of multiple transcription factors in intact organisms.

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia in the western world. NFAT transcription factors are important regulators of development and activation in numerous cell types. Here, we present a protocol for the use of chromatin immunoprecipitation (ChIP) in human CLL cells to identify novel target genes of NFAT2.

만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

암 연구학

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

생화학

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant cellular localization disrupting their mechanism of action. The survival of chronic lymphocytic leukaemia (CLL) cells, among other cancer cells, is assisted by the deregulation of nuclear to cytoplasmic shuttling, at least in part through deregulation of the transport receptor XPO1 and the constitutive activation of PI3K-mediated signaling pathways. It is essential to understand the role of individual proteins in the context of their intracellular location to gain a deeper understanding of the role of such proteins in the pathobiology of the disease. Furthermore, identifying processes that underlie cell stimulation and the mechanism of action of specific pharmacological inhibitors, in the context of subcellular protein trafficking, will provide a more comprehensive understanding of the mechanism of action. The protocol described here enables the optimization and subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions from primary chronic lymphocytic leukemia cells. These fractions can be used to determine changes in protein trafficking between the nuclear and cytoplasmic fractions upon cell stimulation and drug treatment. The data can be quantified and presented in parallel with immunofluorescent images, thus providing robust and quantifiable data.

This protocol enables the optimization and subsequent efficient generation of nuclear and cytoplasmic fractions from primary chronic lymphocytic leukemia cells. These samples are used to determine protein localization as well as changes in protein trafficking that take place between the nuclear and cytoplasmic compartments upon cell stimulation and drug treatment.

핵/세포질 단백질 인신 매매를 모니터링하기 위한 1차 만성 림프구성 백혈병 세포의 세포 분열

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively in the neuron and is essential for the proper functioning of Cl- homeostasis and consequently functional GABAergic inhibition. Failure in proper regulation of KCC2 is deleterious and has been associated with the prevalence of several neurological diseases, including epilepsy. There has been considerable progress with regard to understanding the mechanisms involved in the regulation of KCC2, accredited to the development of techniques that enable researchers to study its functions and activities; either via direct (assessing kinase regulatory sites phosphorylation) or indirect (observing and monitoring GABA activity) investigations. Here, the protocol highlights how to investigate KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites - Thr906 and Thr1007- using western blotting technique. There are other classic methods used to directly measure KCC2 activity, such as rubidium ion and thallium ion uptake assay. Further techniques such as patch-clamp-electrophysiology are used to measure GABA activity; hence, indirectly reflecting activated and/or inactivated KCC2 as informed by the assessment of intracellular chloride ion homeostasis. A few of these additional techniques will be briefly discussed in this manuscript.

The present protocol highlights the application of western blotting technique to study the functions and activities of neuronal K-Cl co-transporter KCC2. The protocol describes the investigation of KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites Thr906/1007 via western blotting. Also, additional methods to confirm KCC2 activity are briefly highlighted in this text.

웨스턴 블로팅을 이용한 뉴런 K-Cl 공동수송체 KCC2의 기능 및 활성 연구

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs are distinguished by a polyhedral lattice of clathrin that coats the vesicle membrane and serves as a mechanical scaffold. Clathrin coats are assembled during vesicle formation from individual clathrin triskelia , the soluble form of clathrin composed of three heavy and three light chain subunits7,8. Because the triskelion does not have the ability to bind to the membrane directly, clathrin-binding adaptors are critical to link the forming clathrin lattice to the membrane through association with lipids and/or membrane proteins9. Adaptors also package transmembrane protein cargo, such as receptors, and can interact with each other and with other components of the CCV formation machinery9.
Over twenty clathrin adaptors have been described, several are involved in clathrin mediated endocytosis and others localize to the trans Golgi network or endosomes9. With the exception of HIP1R (yeast Sla2p), all known clathrin adaptors bind to the N-terminal -propeller domain of the clathrin heavy chain9. Clathrin adaptors are modular proteins consisting of folded domains connected by unstructured flexible linkers. Within these linker regions, short binding motifs mediate interactions with the clathrin N-terminal domain or other components of the vesicle formation machinery9. Two distinct clathrin-binding motifs have been defined: the clathrin-box and the W-box9. The consensus clathrin-box sequence was originally defined as L[L/I][D/E/N][L/F][D/E]10 but variants have been subsequently discovered11. The W-box conforms to the sequence PWxxW (where x is any residue).
Sla1p (Synthetic Lethal with Actin binding protein-1) was originally identified as an actin associated protein and is necessary for normal actin cytoskeleton structure and dynamics at endocytic sites in yeast cells12. Sla1p also binds the NPFxD endocytic sorting signal and is critical for endocytosis of cargo bearing the NPFxD signal13,14. More recently, Sla1p was demonstrated to bind clathrin through a motif similar to the clathrin box, LLDLQ, termed a variant clathrin-box (vCB), and to function as an endocytic clathrin adaptor15. In addition, Sla1p has become a widely used marker for the endocytic coat in live cell fluorescence microscopy studies16. Here we use Sla1p as a model to describe approaches for adaptor-clathrin interaction studies. We focus on live cell fluorescence microscopy, GST-pull down, and co-immunoprecipitation methods.

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clathrin-mediated endocytosis depends on adaptor proteins that coordinate cargo selection and clathrin coat assembly. Here we describe procedures to study adaptor-clathrin physical interaction and live cell imaging approaches using as a model the yeast endocytic adaptor protein Sla1p.

생체내 및 아답터 - clathrin 상호 작용의 체외 연구에서

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

생물학

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

siRNA의 중재 진 입을와 결합 라이브 세포 칼슘 영상은 CA를 나타냅니다 2 + ER 막의 누출 채널과 규제 메커니즘

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

<meta charset="utf8"></head><body>전기생리학 없이 LRRC8 채널 활성을 모니터링하는 FRET 기반 방법

Monitoring Leucine-Rich Repeat Containing 8 Channel (LRRC8/VRAC) Activity Using Sensitized-Emission F&#246;rster Resonance Energy Transfer (SE-FRET)

Members of the LRRC8 protein family form heteromeric ion and osmolyte channels with roles in numerous physiological processes. As volume-regulated anion channels (VRACs)/volume-sensitive outwardly rectifying channels (VSORs), they are activated upon osmotic cell swelling and mediate the extrusion of chloride and organic osmolytes, leading to the efflux of water and hence cell shrinkage. Beyond their role in osmotic volume regulation, VRACs have been implicated in cellular processes such as differentiation, migration, and apoptosis. Through their effect on membrane potential and their transport of various signaling molecules, leucine-rich repeat containing 8 (LRRC8) channels play roles in neuron-glia communication, insulin secretion, and immune response. The activation mechanism has remained elusive. LRRC8 channels, like other ion channels, are typically studied using electrophysiological methods. Here, we describe a method to detect LRRC8 channel activation by measuring intra-complex sensitized-emission F&#246;rster resonance energy transfer (SE-FRET) between fluorescent proteins fused to the C-terminal leucine-rich repeat domains of LRRC8 subunits. This method offers the possibility to study channel activation in situ without exchange of the cytosolic environment and during processes such as cell differentiation and apoptosis.

<meta charset="utf8"></head><body>SE-FRET(Sensitized-Emission Förster Resonance Energy Transfer)를 사용하여 8채널(LRRC8/VRAC) 활성을 포함하는 류신이 풍부한 반복 모니터링

Electrophysiology is the gold standard for investigating ion channel activity. However, there are plenty of alternative approaches, including optical methods. Here, we describe a method to monitor the activity of the leucine-rich repeat containing 8 channel (LRRC8)-formed anion channels using an inter-subunit F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)-based method.

SE-FRET(Sensitized-Emission Förster Resonance Energy Transfer)를 사용하여 8채널(LRRC8/VRAC) 활성을 포함하는 류신이 풍부한 반복 모니터링

Members of the LRRC8 protein family form heteromeric ion and osmolyte channels with roles in numerous physiological processes. As volume-regulated anion ...

SorLA 및 CLC : 웨스턴 블로 팅, 리소좀 효소의 억제 및 면역 세포에 의해 입증으로 CNTFRα의 CLF-1에 의존 하향 조절

요약

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이 비디오의 챕터

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

핵/세포질 단백질 인신 매매를 모니터링하기 위한 1차 만성 림프구성 백혈병 세포의 세포 분열

웨스턴 블로팅을 이용한 뉴런 K-Cl 공동수송체 KCC2의 기능 및 활성 연구

생체내 및 아답터 - clathrin 상호 작용의 체외 연구에서

siRNA의 중재 진 입을와 결합 라이브 세포 칼슘 영상은 CA를 나타냅니다^{2 +} ER 막의 누출 채널과 규제 메커니즘

SE-FRET(Sensitized-Emission Förster Resonance Energy Transfer)를 사용하여 8채널(LRRC8/VRAC) 활성을 포함하는 류신이 풍부한 반복 모니터링

SE-FRET(Sensitized-Emission Förster Resonance Energy Transfer)를 사용하여 8채널(LRRC8/VRAC) 활성을 포함하는 류신이 풍부한 반복 모니터링

SE-FRET(Sensitized-Emission Förster Resonance Energy Transfer)를 사용하여 8채널(LRRC8/VRAC) 활성을 포함하는 류신이 풍부한 반복 모니터링