The authors would like to thank Dr. Anas Kamleh for valuable help with optimizing mass spectrometry methods, and Annika von Vollenhoven for assistance with cell sorting. This research was supported by the Swedish Foundation for Strategic Research (grant no. FFL12-0220) and the Strategic Programme in Cancer Research (IR, RN); the Swedish Heart-Lung Foundation (CEW, HG); and Mary Kay Foundation (JW, MJ).

1. 대사 추출 <ol><li> 접시에서 추출 <ol><li> 안정 동위 원소 표지 된 배양 배지 + 투석 영양 보충제 (혈청 또는 다른 성장 보조제)에서 삼중의 6 웰 플레이트에서 배양 세포는 세포는 75 %의 합류가 될 때까지. 주 : U- 13 C 40 % 글루코스를 함유하는 RPMI에서 48 시간 70 % U- 13 C, 15-N2 글루타민 및 5 % 투석 된 FBS (태아 소 혈청)은 여기 HeLa 세포 배양. 투석 FBS는 레이블이 미디어를 오염시킬 수있는 작은 분자량 대사 물질을 제거하는 데 사용됩니다. 실제 실험 이전에 투석 보충에 세포를 배양하는 세포가 배지에서 정상적으로 성장하고 확인하는 것이 좋습니다. 보충 밤새 뱀 피부 투석 튜브를 사용하여 0.15 M NaCl 용액에서 투석된다. </li><li> 추출 폐기 문화 매체의 날에, 500 μL 차가운 HBSS로 두 번 우물을 씻어 후 폐기합니다. 참고 : 여기에 HBSS 40 %를 포함하는 사용 U-13 C 글루코스가 배양 배지에도 때문이다. </li><li> 추가 600 μL의 100 % 메탄올을 드라이 아이스에 미리 냉각시켰다. </li><li> 얼음을 건조 세포 스크레이퍼와 세포 물질을 제거 할 수있는 요리를 전송합니다. </li><li> 조심 질량 분광 분석까지 -80 ° C에서 microcentrifuge 관 및 저장소에 세포 추출물 피펫. </li></ol></li><li> 모의 분류 세포의 추출 <ol><li> 안정 동위 원소 표지 된 배양 배지 + 투석 보충 교재에서 삼중의 100mm 접시에 배양 세포. 주 : 100mm 접시에 48 시간 동안 배양 여기 HeLa 세포 세포의 높은 번호 (~ 4 × 106)은 50 정렬 세포를 얻기 위해 필요하기 때문이다. 헬라 세포 추출물이 숫자는 대사 산물의 좋은 측정을 받아야했다. 사용되는 배양 배지는 40 % RPMI는 U- 13 C 글루코스 70 % U- 13 C, 15-N2 글루타민 투석 FBS, 5 %를 함유 하였다. </li><li> 추출, 폐기 문화 매체의 날에, w 우물을 씻어i 번째 1.5 mL의 따뜻한 HBSS 후 폐기합니다. </li><li> 37 ℃에서 4 분 동안 150 mL의 트립신 / EDTA를 첨가하여 세포를 분리. 4 ° C 또는 얼음에서 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 3 mL의 얼음 차가운 HBSS (행크의 균형 소금 솔루션) + 투석 보충을 추가하여 트립신을 비활성화합니다. </li><li> 3 분 동안 750 XG에 15 mL의 튜브와 원심 분리기에서 세포를 수집합니다. </li><li> 1-2 × 10 6 세포 / ㎖가, 단일 세포를 얻기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통과하고, 5 ㎖ 튜브로 전송 농도로 HBSS + 투석 보충 + 1 mM의 EDTA의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 정렬 만 단봉들에 대한 셀 소터 게이팅을 통해 세포, 4 ℃에서 3 분 동안 750 XG에 원심 분리기 분류 세포. 참고 : 여기에 정렬 헬라 계기 압력 27 PSI와 속도 1000 이벤트 / s로 세포, 및 100 μm의 노즐을 사용하여. 헬라 세포는 크고 그래서 그들은 가능한 한 그대로 펠렛을 얻기 위해 느린 이벤트 속도와 큰 노즐로 분류되어야한다. throughou 감기 블록 세포 유지t은 신진 대사를 감소 정렬. 정렬 절차의 철저한 설명은 이전 12 설명한다. </li><li> 뜨는을 취소하고 메탄올을 추가하기 전에 균일 한 펠렛을 얻기 위해 50 μL 얼음 차가운 DH 2 O의 펠렛을 재현 탁. 직접 펠릿을 냉 메탄올에 첨가 재현 탁 어렵다 고체 펠렛을 형성한다. </li><li> 드라이 아이스에 보관 540 μL 메탄올을 추가하여 대사 물질을 추출하여 액체 크로마토 그래피 때까지 -80 ° C에서 추출물을 유지 - 고해상도 질량 분석 (LC-HRMS) 분석. </li></ol></li><li> 세포주기의 추출 세포 정렬 <ol><li> 문화 미디어 + 투석 보충 교재에서 삼중의 100mm 접시에 배양 세포. 참고 : Geminin Fucci 녹색 G1 (음)과 SG2M (양의) 세포로 정렬 할 수 있습니다 (MAG1-hGem) 탐침 (13)를 포함하는 다음 문화 HeLa 세포. 세포는 안정 동위 원소 추적 미디어에서 배양 될 수있다필요에 따라 긴이야. 여기에 우리가 레이블이없는 미디어에서 46 시간 동안을 배양 한 후, 우리는 RPMI 40 % U- (13) C-포도당 70 % U- (13) C를 함유로 전환 한 15 N2 - 글루타민 2 시간 전에 정렬 시작. 이것은 짧은 펄스 라벨링 필요한 세포주기 단계를 연구 할 수 있도록하기 위해 수행되었다. </li><li> 추출, 폐기 문화 매체의 날에, 1.5 mL의 따뜻한 HBSS와 우물을 씻어 후 폐기합니다. </li><li> 37 ℃에서 4 분 동안 150 mL의 트립신 / EDTA를 첨가하여 세포를 분리. 4 ° C 또는 얼음에서 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 3 mL의 얼음 차가운 HBSS + 투석 보충을 추가하여 트립신을 비활성화합니다. </li><li> 3 분 동안 750 XG에 15 mL의 튜브와 원심 분리기에서 세포를 수집합니다. </li><li> 1-2 × 10 6 세포 / ㎖가, 단일 세포를 얻기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통과하고, 5 ㎖ 튜브로 전송 농도로 HBSS + 투석 보충 + 1 mM의 EDTA의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 셀 소터 g을 통해 정렬 세포다음, 파편과 이중선을 ating 관심의 세포 마커에 대한 게이팅, 원심 분리기 분류 세포를 4 ℃에서 3 분 동안 750 XG에. 참고 : 여기에 정렬 헬라 계기 압력 27 PSI와 속도 1000 이벤트 / s로 세포, 및 100 μm의 노즐을 사용하여. 신진 대사 속도를 감소 정렬을 통해 차가운 ​​블록 세포를 유지합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 메탄올을 추가하기 전에 균일 한 펠렛을 얻기 위해 50 μL 얼음 차가운 DH 2 O의 펠렛을 재현 탁. 직접 펠릿을 냉 메탄올에 첨가 재현 탁 어렵다 고체 펠렛을 형성한다. </li><li> 드라이 아이스에 보관 540 μL 메탄올을 추가하여 대사 물질을 추출 및 LC-HRMS 분석 할 때까지 -80 ° C에서 추출물을 유지합니다. </li></ol></li></ol> 2. 질량 분석 분석 참고 : 여기에 우리가 LC-HRMS 시스템에서 세포 추출물을 분석하기위한 프로토콜을 설명합니다. 세포 추출물의 분석에 대한 대사 체학 방법이 사용될 수있다. 전체 검사분석은 대사 산물의 다양한 검출에 유용 할 수있다. <ol><li> 질량 분석 참조 교정 믹스를 사용하여 기기를 보정합니다. </li><li> 15 초 30 분, 소용돌이 얼음에 해동 세포 추출물. </li><li> 4 ℃에서 13,000 × g으로 10 분 동안 스핀 필터 및 원심 분리하여 세포 추출물 100 ㎕를 옮긴다. </li><li> 액정-HRMS 시스템에 여액 12.5 μL를 주입한다. </li><li> (ZIC-HILIC) 칼럼 (150mm X 4.6 mm, 5 ㎛의 입자 크기) 양쪽이 온성 친수성 상호 작용 액체 크로마토 그래피를 이용하여 분리 된 대사 물질 0.1 % 포름산 구배 용출을 이용하여 ZIC-HILIC 가드 컬럼 (20mm mm 2.1 ×) 장착 물에 산 (용매 A) 및 아세토 니트릴 (용매 B). 용매 (A)의 20 % 구배 용출를 시작하고 17 분에서 80 %까지 증가한다. 각각 최소 400 μL의 흐름 -1 컬럼 온도 및 샘플 트레이 23 ° C에서 4 ° C와 4 분 동안이 비율을 유지한다. </li><li> 는 I를 사용하여대사 검출 이온화 소스로서 포지티브 및 네거티브 모드 모두에서 가열 된 전기 분무 (H-ESI II) 및 70,000 전폭 반치 (FWHM)의 질량 분해능의 전체 검사를 획득 모드의 크로마토 그래피 분리에 결합 nstrument ( m / z 200). </li><li> 플로우 (45)의 속도와 350 ° C에서 10 노소 (임의의 단위) 및 설정 증발기 온도와 긍정적 인 모드와 -3.5 kV의 4 kV로에서의 전기 분무 전압에서 시스 가스 및 보조 가스 질소 (순도&gt; 99.995 %)를 사용하여 부정적인 모드입니다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 표준이 가능하며 샘플에서 좋은 품질의 피크를 표시하는 대사 산물의 번호를 선택합니다. 양질의 피크 대 잡음비가 높은 신호. 최고 품질을 확인하고 거짓 동위 원소를 포함하지 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 모양 및 / 또는 체류 시간이 다른 동위 원소 피크 가능성이 false입니다. </li><li> 동위 원소 표지 샘플 (질량 동위 원소를 계산을 위해MI) 모든 잘못의 총 피크 면적과 각 MI의 피크 면적을 나누어 분수. </li><li> 로 각각 13 C, 15 N의 농축을 표지 탄소 / 질소 분수를 계산 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/55011/55011eq1.jpg" /> 여기서 n은 대사 산물의 탄소의 총 수 (또는 질소 각각은)이며, 혼합 x의 MI 분율이다. 주 : 모든 계산은 프로그래밍 언어를 사용하여 수행 될 수있다. </li></ol>

<ol>
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저자는 공개 아무것도 없어.

우리의 방법은 세포의 대사에서의 MID는 세포 대사 활동의 &quot;히스토리&quot;를 반영한다는 원리에 기초한다. 이것은 그들이 이전 셀 정렬 절차 세포의 복잡한 지역에서 발생으로 가능 세포의 하위 집단에서 대사 활동을 조사 할 수있다. 반면, 대사 산물의 피크 지역 분류 세포와 배양 접시 (11)에서 직접 추출 추출 사이에 현저하게 다르다. 일부 다른 화학 성분은 질량 분석, 소위 &quot;매트릭스 효과&quot;의 신호 응답을 변경하기 때문이다, 그러나 또한 세포가 버퍼 (11)로 유지하면서 아미노산이 정렬 동안 세포로부터 손실 된 것으로 나타났다. 이 정렬 동안 신진 대사 상태와 세포의 활동을 변경할 수 있지만,이 자체가 우리의 방법과 관련이 : MID를 직접 추출에서 관찰 된 것과 합리적으로 가까운 것을 제공, 데이터는 VALI 남아원래 복잡한 문화의 각 모집단의 대사 상태 라 측정. 우리는 처음에 세포가 빠른 속도로 신진 대사를 해소하기 위해 직접 추출 용액 (메탄올)로 분류 된 방법을 시험했다. 그들은 우리 질량 분석기 시스템에서 대규모 이온 진압 결과, 셀 소터 시스 유체로부터 가능한 염 및 기타 오염 물질의 다량 함유 불행히도, 얻어진 추출물을 분석하기 어려웠다. 따라서 우리는 셀 소터 장비에 의해 증착 초과 유체 추출하기 전에 세척 여기에 설명 된 프로토콜에 정착했다. 우리 프로토콜 HBSS, 세포 생존을 유지하기 위해 글루코오스가 보충 생리 식염수 정렬 수반한다. 어떤면에서, 실제의 배지에서 세포는 아미노산으로 누설 대사성 스트레스를 최소화하도록 정렬하는 것이 바람직 할 수있다. 그러나, 정렬 된 셀의 작은 펠릿을 세척하기 어렵고, theref매체에 존재하는 광석 대사는 세포 내 대사 산물의 노력의 MID를 오염시킬 것이다. 13 C 표지 글루코스 트레이서로서 사용될 때마다, 동일한 분류 글루코스뿐만 아니라 HBSS 용액에 사용되어야한다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 전부는 아니지만 많은 대사, 세포 선별 과정 후에도 MID를 유지한다. (예를 들어, 젖산) 특정 대사 산물은 특별히 변경하는 이유를 우리는 모른다. 이 결과는 관심의 MID를 모의 정렬하여 순서를 정렬 셀을 향해 강력한 있는지 확인하는 것이 중요 있음을 강조한다. 그것은 직접 정렬 모집단의 MID를 확인하는 것은 불가능하지만, (예를 들어, 글루탐산) 모의 정렬에 영향을받지 MID는이 절차는 셀의 선택을 제외하고 동일하다으로서뿐만 정렬은 실제에 의해 영향을받지 않을 것이다. 새로운 세포 유형 또는 배양 조건이 이용 될 때마다 검증 단계가 수행되어야한다. 오 것을 지적하는 것이 중요하다UR 방법은 강력한 MID는 이러한 방식으로 확인 될 수있는 대사 물질로 제한된다. 우리는 여기에 설명 된 방법은 세포 생물학 및 생물 의학에서 응용 프로그램의 숫자에 도움이 될 것으로 기대하고 있습니다. 피더 계층 문화, 신경 세포 성상 세포 모델 4, 혈액 세포 2의 소집단, 또한 동물 모델에서 분리 된 복잡한 세포 집단 - 예를 들면 대사 등 줄기 세포로 공 배양 세포의 표현형을 포함한다.

고등 생물은 더 복잡한 기능에 대해 가지고 협력 별개의 세포 유형의 복잡한 사회를 포함한다. 예를 들어, 종양은 단지 암세포 만, 섬유 아세포, 혈관을 구성하고, 주로 면역 세포가 침투 한 세포를 포함하고; 혈액은 면역 세포 아형 2의 수십의 복잡한 혼합물을 포함, 심지어 배양 세포주는 내강 및 유방암 세포 (3)의 기부 아형 여러 개체군, 구성 될 수있다. 대사 &quot;협력&quot;을 나타낼 수있다 공존 또한, 서로 다른 세포 유형. 예를 들어, 뇌, 성상이 기판 (4)을 산화 한 후 뉴런 &quot;공급&quot;인 락트산 포도당 변환 생각된다; T 림프구는 시스테인 (5)의 소스로 인접 수지상 세포에 의존하는 일부 경우에; 암 세포는 asso과 협력 할 수있다종양 6 ciated 섬유 아세포. 이러한 시스템의 대사 동작을 이해하기 위해서는 본 분리하고 다양한 종류의 세포 대사 활동을 측정하는 것이 필수적이다. 지금까지 세포 유형을 분리하기위한 가장 널리 사용되는 방법은 형광 활성화 세포 분류이다. 이 방법은 세포 유형 또는 관심 상태는 형광 항체, 조작 된 형광 단백질의 발현 또는 다른 염료를 사용하여 &quot;표지&quot;가 제공 될 수 넓게 적용 가능하다. 하나의 옵션은 셀 소터 통해 초기 개별 세포 유형, 다시 배양 얻어진 각 세포 유형이다하고이 배양 물 (7)의 대사 과정을 수행한다. 세포 유형 또는 표현형은 배양 조건에 안정하며, 이러한 세포주기 상태 않으며 공동 배양 물에서 대사 협력으로 과도 행동을 캡처 할 수없는 경우,이 경우에만 가능하다. 이러한 경우를 들어, 신진 대사가 너무 직접 측정해야rted 세포. 이 절차를 선별 세포 신진 대사 8 왜곡 될 응력 세포 주제 때문에 도전이며, 우리는이 방법 (9) (10)를 가지고 단지 약간의 연구 알고있다. 특히, 절대 대사 풍부 측정이 더 이상 신뢰성있게 아미노산 등 주요 대사 산물은 세포 정렬 버퍼에 보관 세포로부터 누출하지 않을 수 있음을 발견 하였다 (11) (정렬 된 분획의 상대 비교가 여전히 유용 할 수 있음). 이러한 문제를 회피하기 위해, 우리는 정렬하기 전에 안정 동위 원소와 셀 라벨, 및 세포 대사보다는 대사 산물 존재비에서의 MID에 초점을 맞 춥니 다. MID를 길게 시간 규모 상에 형성되기 때문에, 그들은 적은 정렬 조건에 단기간 노출에 의해 영향을받을 것이다. 우리는 DA를 제공하기에 충분히 민감 전체 스캔 고분해능 질량 분석법을 이용하여 MID를 정량화셀 정렬 시간의 약 30 ~ 60 분을 필요로하는 약 50 만 분류 세포에서 시작 대사 산물의 수백에 따. 배양 접시가 관찰 된 MID는 원래 배양 대표적되도록 이루어진다에서의 비교를 직접 제어 (특정 인구 게이팅없이 셀 소터 구 통과 세포) 및 대사 추출 &quot;모의 정렬&quot;. 안정 동위 원소 추적자의 선택에 따라 다양한 대사 경로는이 방법으로 공부하실 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1001">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:420px;">HBSS</td>
			<td style="width:165px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">H6648</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INFLUX (inFlux v7 Sorter)</td>
			<td style="width:165px;">BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-13C-Glucose</td>
			<td>Cambridge isotopes</td>
			<td>40762-22-9 / GLC-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-13C,15N2-Glutamine</td>
			<td>Cambridge isotopes</td>
			<td>CNLM-1275-H-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol (JT Baker), HPLC grade</td>
			<td style="width:165px;">VWR</td>
			<td style="width:139px;">BAKR8402.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrafree - MC - VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 &#181;m</td>
			<td style="width:165px;">Millipore</td>
			<td style="width:139px;">UFC30VV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultimate 3,000 UHPLC</td>
			<td style="width:165px;">Thermo Fisher scientific</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer</td>
			<td style="width:165px;">Thermo Fisher scientific</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 &#181;m)</td>
			<td style="width:165px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:139px;">1.50444.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20x2.1 mm)</td>
			<td style="width:165px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">A955-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Milli-Q water</td>
			<td style="width:165px;">Millipore</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Produced with a Milli-Q Gradient system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MYRSYRA 99.5% OPTIMA (Formic acid)</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">11423423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X100 Screw Vial 1.5ml, 8-425 32x11.6mm,amber, 100 units</td>
			<td style="width:165px;">Thermo Fisher scientific</td>
			<td style="width:139px;">10560053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X100 LOCK SKRUV VITT PTFE PACKNING 8-425 (Screw caps)</td>
			<td style="width:165px;">Thermo Fisher scientific</td>
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		<tr height="21">
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		</tr>
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			<td></td>
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</table>

a method for measuring metabolism in sorted subpopulations of complex cell communities using stable isotope tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of "mock sorted" cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.

일례로서, 우리가 세포주기의 단계에 따라 정렬 HeLa 세포의 신진 대사를 조사하는 실험을 기술한다. 모두 탄소와 질소에 중앙 대사의 다양한 레이블을 지정하려면, 우리는 U- (13) C-포도당과 U-13 C, 추적자로 15 N 글루타민을 사용하여 48 시간 동안 세포를 배양. 동위 원소의 중간 수준보다 다양한 MI 패턴 (14)을 생성하는 경향이 검증 실험에 대한 풍부한 MID를 얻으려면, 우리는 여기에, 40 % U- (13) C-포도당 70 % U- 13 C, 15 N2 - 글루타민의 혼합물을 선택했다. 검증 실험을 위해 우리는 85 대사의 대상으로 분석을 수행 하였다. 품질이 좋지 품질 LC-MS 피크를 제거하는 단계를 제어 후, 우리는 (66)가 모의 분류 세포 (96 %)에 존재하는의 직접적인 세포 추출물에 69 봉우리를 감지 할 수 있었다. 이들 중 60 레이블이 등장자신의 MID를 접시 추출물 및 모의 분류 세포 (그림 2A) 사이에 유사했다, 대부분의 경우 (자연 풍부 위의 동위 원소 농축). 예를 들어, (13 C, 15 N 잘못을 모두 포함) 글루타메이트의 MID는 글루타메이트 MID는 정렬 된 세포 집단에서 또한 신뢰할 수있는 것을 나타내는, 요리 및 모의 분류 추출물 (그림 2B)와 유사하다. 그러나 일부 대사 명확히 분류 절차에 의해 영향을 받는다 예를 들어, 락트산 불명 이유로 모의 정렬 셀 13 이하 C 세였다. 실제 분류 분수에서 데이터를 분석 할 때 이런 대사는주의를 볼 수 있습니다. 모의 분류 세포에서 측정 된 MI 분획의 91 %는 MID를 정렬 세포에서 높은 재현성했다 나타내는 생물학적 삼중에서 1 %보다 표준 편차 덜했다. 우리는 다음 헬라 중 하나를 G0 / G1 또는 S / G2로 분류 분석 / M 세포주기의FUCCI Geminin 프로브 (12)를 사용하여 TAGES. 이러한 세포주기 단계에 있기 때문에 2 시간 동안 마지막 만 ~ 10 시간, 여기에 우리 &quot;펄스&quot;이라는 문화는 단계 사이의 서로 다른 동위 원소 라벨을 달성했다. 예를 들어, 우리는 시티 딘이 두 집단으로 분류되지만 것을 언급 S 단계에서 뉴클레오티드의 증가 드 노보 합성과 일관되는 S / G2 / M 단계에서 높은 농축에 (도 3). 이 경우, MID는 동일한 합성 경로를 사용하는 것을 제안하는 두 분획에서 동일한 패턴을 도시하지만, S / G2 / M 단계에서 더 활성화된다. 이러한 데이터는 신진 대사의 차이도 밀접한 관련이 개체군 사이에이 방법으로 쉽게 검출 있음을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55011/55011fig1.jpg" /> 그림 1 : 실험 설계. 요리의 준비를위한 워크 플로우, 모의 정렬 및 추가 하위 집단을 분류캐럿. 접시 및 모의 분류 추출물 분류에 의한 변화 가능성에 대한 테스트에 비교 요리와 모의 분류 추출물의 검증 실험의 MID에 사용됩니다. 세포의 복잡한 인구 관심 세포 유형의 마커에 기초하여 정렬 한 후 추출된다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55011/55011fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55011/55011fig2.jpg" /> 그림 2 : 직접 추출에 대한 MID를의 검증. 분산 형 (A) (13) C의 플롯과 접시에 15 N 농축 및 모의 분류 샘플. 각 점은 복제를 나타냅니다. 삼중는 선으로 연결된다. (B) 글루타메이트의 13 C- 15 N의 MID. 락 테이트 (C) 13 C의 MID. 오류 막대는 세중 measu의 표준 편차입니다rements. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55011/55011fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55011/55011fig3.jpg" /> 도 3 : HeLa 세포에서 세포주기 상간 대사 차이. 시티 딘은 G 1 -G 0 SG 2 -M 세포에서 다르게 표시된다. (A) 시티 딘 (13) C의 G-G 1 0에서 농축하고 SG 세포주기의 단계 2 -M. 점선은 자연 질량 동위 원소에서 탄소 농축을 의미합니다. (B) 시티 딘의 MID는 배열 G 1 -G 0 플롯과 SG (2) -M 단계로 표시. 오차 막대는 삼중 측정의 표준 편차이다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55011/55011fig3large.jpg" target="_blank">V 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 더 큰 버전을 서평.

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A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.

안정 동위 원소 추적을 사용하여 복잡한 세포 공동체의 정렬 된 부분 집단에서 대사를 측정하는 방법

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

a-method-for-measuring-metabolism-sorted-subpopulations-complex-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.2K 조회수.  Karolinska Institutet. This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.

비디오: A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A modified northern blotting method for measuring N6-methyladenosine (m6A) modifications in RNA is described. The current method can detect modifications in diverse RNAs and controls under various experimental designs.

RNA 측정 방법<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup세포와 조직에서&gt; -methyladenosine 수정

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

연구

생화학

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological materials. Such approaches have received considerable attention in research on the boundary between living and nonliving matter and have been used to construct artificial cells over the past two decades. In particular, Giant Vesicles (GVs) have often been used as artificial cell membranes. In this paper, we describe the preparation of GVs encapsulating highly packed microspheres as a model of cells containing highly condensed biomolecules. The GVs were prepared by means of a simple water-in-oil emulsion centrifugation method. Specifically, a homogenizer was used to emulsify an aqueous solution containing the materials to be encapsulated and an oil containing dissolved phospholipids, and the resulting emulsion was layered carefully on the surface of another aqueous solution. The layered system was then centrifuged to generate the GVs. This powerful method was used to encapsulate materials ranging from small molecules to microspheres.

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

유 중수 에멀젼의 원심 분리에 의해 거 소포 캡슐화 미소 구의 제조

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide sequences. Synthesis of some unnatural amino acids often includes the use of a precursor consisting of a Schiff-base stabilized by a nickel cation. Unnatural side-chains can be installed on an amino acid backbone found in this Schiff-base complex. The resulting unnatural amino acid can then be isolated from this complex using hydrolysis of the Schiff-base, typically by employing reflux in strongly acidic solution. These highly acidic conditions may remove acid-labile side-chain protecting groups necessary for the unnatural amino acids to be used in microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. In this work, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff base complex. Hydrolysis conditions presented in this work are suitable for retention of acid-labile side-chain protecting groups and may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Here, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff-base complex. Hydrolysis conditions presented here are suitable for use when retention of acid-labile side-chain protecting groups is required. This technique may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

보호 그룹 산 - 불안정의 보존에 적합한 니켈 쉬프 - 자료의 가수 분해 복잡한 사용 조건

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between proteins such as transcription factors (TFs) and their DNA target. The method presented here utilizes the underlying concept of the Y1H but is modified further to study and validate protein complexes binding to their target DNA. Hence, it is referred to as the modified yeast one-hybrid (Y1.5H) assay. This assay is cost effective and can be easily performed in a regular laboratory setting. Albeit using a heterologous system, the described method could be a valuable tool to test and validate the heteromeric protein complex binding to their DNA target(s) for functional genomics in any system of study, especially plant genomics.

The modified yeast one-hybrid assay described here is an extension of the classical yeast one-hybrid (Y1H) assay to study and validate the heteromeric protein complex-DNA interaction in a heterologous system for any functional genomics study.

이성질체 단백질 복합체 -DNA 상호 작용 연구를위한 수정 된 효모 원 하이브리드 시스템

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). SM is a common sphingolipid composed of a phosphorylcholine and a ceramide as the hydrophilic and hydrophobic component, respectively. A number of SM species are present in mammalian cells due to a variety in the sphingoid long chain base (LCB) and an N-acyl moiety in the ceramide. In this report, we show a method of estimating the number of carbon and double bonds in a LCB and an N-acyl moiety based on their corresponding product ions in MS/MS/MS (MS3) experiments. In addition, we present a quantitative analysis method for SM using two stable isotopically labeled SM species, which facilitates determining the range used in SM quantitation. The present method will be useful in characterizing a variety of SM species in biological samples and industrial products such as cosmetics.

Here, we present a protocol to quantify and qualify each sphingomyelin species using multiple reaction monitoring and MS/MS/MS mode, respectively.

LC-MS Isotopically 두 안정을 사용 하 여 Sphingomyelin에 대 한 양적 및 질적 방법 Sphingomyelin 종 분류

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content is rather low in all organisms, amounting in plants to about 0.009% of dry weight. To date, one of the most accurate methods for measuring iron concentration in plant tissues is flame absorption atomic spectroscopy. However, this approach is time-consuming and expensive and requires specific equipment not commonly found in plant laboratories. Therefore, a simpler, yet accurate method that can be routinely used is needed. The colorimetric Prussian Blue method is regularly used for qualitative iron staining in animal and plant histological sections. In this study, we adapted the Prussian Blue method for quantitative measurements of iron in tobacco leaves. We validated the accuracy of this method using both atomic spectroscopy and Prussian Blue staining to measure iron content in the same samples and found a linear regression (R2 = 0.988) between the two procedures. We conclude that the Prussian Blue method for quantitative iron measurement in plant tissues is precise, simple, and inexpensive. However, the linear regression presented here may not be appropriate for other plant species, due to potential interactions between the sample and the reagent. Establishment of a regression curve is thus needed for different plant species.

We present a simple and reliable protocol for measuring iron content in plant tissues using the colorimetric Prussian Blue method.

식물에 철 분 함량을 측정 하는 색도계 방법

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

매핑 대사: 조직에서 직접 젖 산 효소 활동 모니터링

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and paleoenvironmental research from recent historical periods back to over 10 million years ago. Bulk approaches provide a representative sample for the period of enamel mineralization, while sequential samples within a tooth can track dietary and environmental changes during this period. While these methodologies have been widely applied and described in archaeology, ecology, and paleontology, there have been no explicit guidelines to aid in the selection of necessary lab equipment and to thoroughly describe detailed laboratory sampling and protocols. In this article, we document textually and visually, the entire process from sampling through pretreatment and diagenetic screening to make the methodology more widely available to researchers considering its application in a variety of laboratory settings.

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been used as a proxy for individual diet and environmental reconstruction. Here, we provide a detailed description and visual documentation of bulk and sequential tooth enamel sampling as well as pretreatment of archaeological and paleontological samples.

안정적인 탄소 및 산소 동위 원소 분석을 위한 샘플링 및 치아에 나 멜의 전처리 탄산염

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

측정 및 해석의 전체 산소 소비 속도 비행 머리 세그먼트

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-receptor 1/receptor 2 (TRAIL-R1/R2). Stimulation of these receptors with their cognate ligands leads to the assembly of the death-inducing signaling complex (DISC). DISC comprises DR, the adaptor protein Fas-associated protein with death domain (FADD), procaspases-8/-10, and cellular FADD-like interleukin (IL)-1&#946;-converting enzyme-inhibitory proteins (c-FLIPs). The DISC serves as a platform for procaspase-8 processing and activation. The latter occurs via its dimerization/oligomerization in the death effector domain (DED) filaments assembled at the DISC. 
Activation of procaspase-8 is followed by its processing, which occurs in several steps. In this work, an established experimental workflow is described that allows the measurement of DISC formation and the processing of procaspase-8 in this complex. The workflow is based on immunoprecipitation techniques supported by western blot analysis. This workflow allows careful monitoring of different steps of procaspase-8 recruitment to the DISC and its processing and is highly relevant for investigating molecular mechanisms of extrinsic apoptosis.

Here, an experimental workflow is presented that enables the detection of caspase-8 processing directly at the death-inducing signaling complex (DISC) and determines the composition of this complex. This methodology has broad applications, from unraveling the molecular mechanisms of cell death pathways to the dynamic modeling of apoptosis networks.

이 단지에서 CD95 사망 유도 신호 복합체 및 프로카스파스-8의 처리 구성 측정

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...