Name: design and implementation of an automated illuminating, culturing, and sampling system for microbial optogenetic applications
Uploaded: 2017-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
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	<li>Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics.">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li><li>Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-mediated+control+of+DNA+transcription+in+yeast.">Light-mediated control of DNA transcription in yeast.</a> Methods. 58 (4), 385-391 (2012).</li><li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. 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저자는 공개 아무것도 없어.

우리는 마음의 유연성이 장치를 설계했습니다. 사용 된 모든 코드는 무료이며 오픈 소스입니다. 세그먼트 셀 기본 이미지 분석 과정은 간단하고 신속하게 실행. 사용자 분석, 피지 그래픽 유저 인터페이스로 대표 화상을 분석하는으로 Beanshell 스크립트 입력을 변환하고 스크립트를 호출하는 플러그인을 설정하는 동안 사용자 입력을 기록함으로써 구현 될 수있다. 이 호출 될 때,이 스크립트는 배경-감산 이미지의 가장 최근의 세트에 파일 경로를 포함하는 &quot;이미지&quot;라는 문자열 배열을 전송됩니다. 이미지 데이터는 실험이 갑자기 끝나는 경우가 손실되지 않도록 수집로 저장됩니다. 블루 LED 어레이 우리 optogenetic 시스템을 유도하는 선택되었다 있지만 다른 색의 LED로 교체 될 수있다. 쉽게 만드는 PCB에 추가적인 MOSFET 스위치 및 릴레이 스위치 용 마이크로 컨트롤러뿐만 아니라 관통 구멍을 사용 가능한 추가 입력 및 출력 핀이있다이 시스템에 대해 좀 더 복잡한 용도에 적합합니다. 예를 들면, LED에 전력을 제공하고, 배양 용기에 묶여 광 센서로부터의 값을 판독 한 후 탁도를 측정 할 수있는 소프트웨어를 수정하고 이에 따라 용기를 희석하기 위해 마이크로 컨트롤러에 추가 핀을 사용하는 turbidostat로 작동이 장치를 만드는 . 주의 성 현미경 장비를 보호하고, 상기 유체 유량이 일치되도록 배양 오염되지 않도록주의해야한다. 배양 용기 의도적 접종시에 앞서 오염은 용기 내부에 접종하고 성장이 없다는 것을 확인하기 전에 몇 일을 대기에 의해 검출 될 수있다. 현미경 목적에 세포 배양을 유출 방지하기 위해, 마이크로 유체 장치는 흡수성 천 위에 그것을 통해 처음 펌핑 세포 배양에 의해 누출되지 않습니다 있는지 확인하십시오. 배양 용기에 미디어의 흐름이 일치하지 않으면, 통상 튜브 주위 때문에연동 펌프의 롤러가 너무 느슨하게되고있다. 수족관 펌프로부터의 공기의 흐름이 일치하지 않는 경우, 액체 수영장 일관성 기류 레지스트있다 유출 관에는 U 자형 굴곡부가 없다는 것을 보장한다. 매체가 그 안에 건조 때문에 튜브는 실험 후 막히게되면, 방해물을 용해 온수 욕에서 막힌 튜브 소크. 실험을 계획 또는 결과를 분석 할 때 고려해야 할이 프로토콜에 고유 제한이 있습니다. 희석율 및 사용 튜브의 길이에 따라, 세포 배양, 현미경으로 배양 용기로부터 펌핑되는 동안의 약 10 분의 지연이있다. 따라서, 잘 짧은 시간 척도를 통해 발생하는 공부 이벤트에 적합하지 않습니다. 실험 매체의 용적에 의해서만 제한 약 10 일 동안 연속적으로 실행할 수있는 반면 또한, 세포 배양의 진화 실험 증가의 기간으로 고려되어야한다. LIMI미디어 팅 영양소 대사 유전자 발현을 35, 36, 37, 38, 39에 지대한 효과를 가지므로, 연구중인 생리학의 양태에 기초하여 결정되어야한다. 결과를 분석하면, 이미지 특히 외곽 데이터에서 이미지 포인트-한다 로아 이미지 분석 루틴에 의해 식별 된 방식에서 오류를 검토. 기포 아티팩트하여 측정 된 형광 비틀림 셀 착각하는 것이 가능하다. 이러한 측정 오류를 제거 할 수있는 간단한 방법은 자동 형광 강도 아래 형광 농도 모든 ROI를 폐기하는 것이다. 이 프로토콜은, 연속 배양에서 성장할 수있는 생물에 빛에 반응하여 형광 강도 및 / 또는 유출 세포 배양의 세포 형태를 측정하는 데 유용 할 설정합니다교반하지 일관된 초점면에 TLE, 자동 이미지 분석 알고리즘에 의해 식별 될 수있다. 여기에 사용되는 기본 셀 식별 알고리즘은 효모 신진과 유사한 대략 구형 미생물에 가장 직접적으로 적용 할 수 있습니다. 대안 40이 프로토콜을 하나 배치 배양의 세트에서 미생물을 성장하고, 각 시점에 대해 하나의 배치를 샘플링하고 유동 세포 계측법에 의해 시료의 특성이다. 그러나, 여기에 기술 된 프로토콜의 장점은 동일한 배양에서 가져온 샘플 많은 샘플을 취할 수 있고, 공정이 자동화되어있다. 이 프로토콜은 optogenetic 효모가 계속 배양 및 형광으로 ROI를 식별 바이어스 신속하고하지 여러 이미지를 획득하여 현미경 (34) 아래에 몇 군데 있었다있는 유사한 방법에 개선. 이 프로토콜의 큰 장점은 개별 셀의 많은 측정이 정기적으로 witho 며칠 동안 취득 할 수 있다는 것입니다유타 사용자 입력. 노광에 미생물 배양의 응답을 측정 한 후, 다음 단계는 반응 실리 폐쇄 루프 제어에 구현 될 수있다.

Optogenetic 시스템은 유전자 발현, 1, 2, 3, 4, 5 단백질 지역화 육 단백질 활성, 6, 7, 8, 단백질 결합, 8, 9, 10, 단백질 분해 등의 세포 과정의 성장 목록을 제어하는 광을 사용한다. 프로그래밍 광 자극으로 제어 된 환경에서 세포를 배양하고, 생물학적으로 중요한 시간 척도에 걸쳐 반응을 측정하기위한 방법 (11)은 세포 생물학 및 생명 공학 연구를 위해 이러한 도구의 전위를 이용하는 것이 필요하다. 우리의 방법은, AE, 잘 혼합에 일정한 세포의 성장 속도를 유지하기 chemostasis 활용평가 및 프로그램 조명에 노출되는 온도 조절 유리 배양 용기 (12, 13). 역 현미경 배양 유출 화상에서는 개별 셀이 프로그래밍 된 조명에 문화의 반응을 측정한다. 형광 강도 및 유출 세포 배양의 세포 형태는 사용자의 입력없이 여러 날에 걸쳐 측정 될 수 있도록 배양 샘플링, 이미지, 이미지 분석은 완전 자동화된다. 이 프로토콜은 성장하는 세포 배양과 현미경 익숙한 대부분 실험실에서 구현 될 수 있으며, 사용되는 장치는, 저렴하고 용이하게 가능한 구성 요소했다. 투명 배양 용기 광의 1 μW / cm 2 mW의 -10 / cm이 발광 가능한 발광 다이오드 (LED)의 행렬 위에 배치된다. 미생물 연속 배양 용기에서 성장된다; 하나의 연동 펌프는에 미디어를 추가하는 데 사용됩니다희석 비율은 다른들은 현미경 낮은 속도로 배양을 인출하는 데 사용되며, 그 차이는 오버 플로우 출구를 통해 빠져. 가열 패드 온도를 유지합니다. 공기는 연속적으로 양압을 유지할뿐만 아니라, 혼합 배양을 통기 배양 용기에 펌핑된다. 공기 펌프를 제외하고,이 장치의 전원은 온도계와 연결된 데스크탑 컴퓨터로부터 입력을 수신하는 마이크로 컴퓨터에 의해 조절된다. 유출 세포 배양은 거꾸로 현미경의 무대에서 미세 유체 장치로 펌핑된다. 비 형광 및 형광 이미지가 자동으로됩니다. 이미지 내의 셀은 ROI (region of interest)를 각 셀의 위치를 ​​각 ROI의 특성을 측정하는 알고리즘을 특징으로한다. 이 프로토콜의 응용 프로그램을 설명하기 위해, 우리는 푸른 빛 responsi으로 설계 사카로 마이 세스 세레 비지 세포의 변화하는 빛의 강도에 대한 응답을 측정형광 단백질의 전사를 제어하는 ​​시스템 optogenetic했습니다. 이 시스템에서 유전자 발현을 제어하기위한 여러 optogenetic 시스템이 이미 14, 15, 16가 존재하기 때문에 통상적으로 빵 효모 S. cerevisiae의 알려진이 선택되었다. 또한,이 모델 생물은 일반적으로 시스템 생물학 (17)과 생명 공학 응용 프로그램을 18, 19, 20 섀시로 연구에 사용됩니다. 우리의 대표적인 결과가이 프로토콜은 입력 광 강도를 변화 형광 리포터의 생산을 측정함으로써 복수 일 배양의 전사를 조절하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다.

<table><tbody><tr><td>Extensive lab manual</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>An extensive, regularly updated lab manual is available in the &amp;ldquo;Optogenetic Chemostat Files&amp;rdquo; GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results.</td></tr><tr><td>Fritzing Design Viewer</td><td>Fritzing</td><td>NA</td><td>The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at &quot;http://fritzing.org/download/&quot;</td></tr><tr><td>Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled)</td><td>Adafruit</td><td>50</td><td>Microcontroller. 1 required.</td></tr><tr><td>Arduino Stackable Header Kit</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10007</td><td>Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required.</td></tr><tr><td>Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V</td><td>Adafruit</td><td>180</td><td>For making electrical connections to the PCB. 1 required.</td></tr><tr><td>Soldering iron stand</td><td>Adafruit</td><td>150</td><td>For making electrical connections to the PCB. 1 required.</td></tr><tr><td>Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031&quot; diameter - 100g</td><td>Adafruit</td><td>145</td><td>For making electrical connections to the PCB. 1 required.</td></tr><tr><td>0.1 &amp;mu;F capacitor</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-08375</td><td>Stabilizes voltage in PCB. 1 required.</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;F capacitor</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-00523</td><td>Stabilizes voltage in PCB. 1 required.</td></tr><tr><td>MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219</td><td>Maxim</td><td>MAX7219CNG</td><td>LED driver. 1 required.</td></tr><tr><td>8 pin IC Socket</td><td>Mouser Electronics</td><td>575-144308</td><td>16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix.</td></tr><tr><td>24 Pin IC socket</td><td>Mouser Electronics</td><td>535-24-3518-10</td><td>Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB.</td></tr><tr><td>Digital multimeter</td><td>Adafruit</td><td>2034</td><td>For troubleshooting electronics. 1 required.</td></tr><tr><td>Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1&quot;)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT-12693</td><td>Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Flush diagonal wire cutters</td><td>Adafruit</td><td>152</td><td>For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required.</td></tr><tr><td>Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12&quot; (300mm)</td><td>Adafruit</td><td>793</td><td>Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required.</td></tr><tr><td>Half-size breadboard</td><td>Adafruit</td><td>64</td><td>The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it.</td></tr><tr><td>Miniature 8x8 Blue LED Matrix</td><td>Adafruit</td><td>956</td><td>Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white.</td></tr><tr><td>Stackable header-3 pin</td><td>SparkFun Electronics</td><td>13875</td><td>8 required.</td></tr><tr><td>Resistor Kit - 1/4W (500 total)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10969</td><td>For electronics. 1 required.</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;IRL520N MOSFET</td><td>International Rectifier</td><td>IRL520N</td><td>Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required.</td></tr><tr><td>Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT 11367</td><td>Wire for electronics. 1 required.</td></tr><tr><td>5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed</td><td>Adafruit</td><td>276</td><td>Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required.</td></tr><tr><td>12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed</td><td>Adafruit</td><td>798</td><td>For peristaltic pumps. 2 required.</td></tr><tr><td>Electric Heating Pad - 10cm x 5cm</td><td>Adafruit</td><td>1481</td><td>For heating the bioreactor. 1 required.</td></tr><tr><td>Low flow variable flow peristaltic pump</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td>For pumping media. 1 required</td></tr><tr><td>Medium flow variable flow peristaltic pump</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td>For pumping culture. 1 required.</td></tr><tr><td>9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed</td><td>Adafruit</td><td>63</td><td>For microcontroller power supply. Order 1.</td></tr><tr><td>High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras</td><td>Adafruit</td><td>642</td><td>Thermometer for the bioreactor. 1 required.</td></tr><tr><td>Micromanager</td><td>Micromanager</td><td>NA</td><td>The free, open-sourced microscope control software is available at &quot;https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release&quot;</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td>NA</td><td>The free, open-sourced image analysis software is available at &quot;http://fiji.sc/&quot;</td></tr><tr><td>Arduino Integrated Development Environment</td><td>Arduino</td><td>NA</td><td>The free, open-sourced IDE is available at &quot;https://www.arduino.cc/en/Main/Software&quot;</td></tr><tr><td>Custom code</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>The custom microcontroller code and &quot;Bioreactor Controller&quot; plugin are available in the &amp;ldquo;Optogenetic Chemostat Files&amp;rdquo; GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>USB Cable A to B - 6 Foot</td><td>SparkFun Electronics</td><td>CAB-00512</td><td>Used to download data to microcontroller. 1 required.</td></tr><tr><td>bioreactorTimecourse_example.csv</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the &amp;ldquo;Optogenetic Chemostat Files&amp;rdquo; GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>Tota-frost gels (diffusion paper)</td><td>B&amp;amp;H</td><td>B&amp;amp;H # LOFSFTL&lt;br/&gt; MFR # T1-72</td><td>For LED matrix. 1 required.</td></tr><tr><td>Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in</td><td>Grainger, inc</td><td>20JL37</td><td>Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required.</td></tr><tr><td>Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>S120VC</td><td>For measuring light intensity. 1 required.</td></tr><tr><td>Labelling Tape</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015N</td><td>For labelling and securing loose components. 1 required.</td></tr><tr><td>Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4&quot; LCD</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>For measuring light intensity. 1 required.</td></tr><tr><td>100mL GL45 hybridization glass bottle</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>(7910-40150)</td><td>Bioreactor vessel. 1 required.</td></tr><tr><td>Six port assembly</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>Custom&amp;nbsp;</td><td>For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125&quot; OD x .055&quot;ID. Port A: 1.0&quot; long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0&quot; long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0&quot; long above cap slug, 65 mm&amp;nbsp; long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3</td><td>Amazon</td><td>B0009F3P3U</td><td>Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame.</td></tr><tr><td>1/16&quot; ID x 3/16&quot; OD x 1/16&quot; Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing</td><td>United States Plastic Corp.</td><td>57288</td><td>Tubing. ~25&#039; required.</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-62992-32</td><td>Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required.</td></tr><tr><td>2L Laboratory Flask</td><td>Pyrex</td><td>4980</td><td>Media flask and effluent flask. 2 required.</td></tr><tr><td>Day pinchcock</td><td>Fisher Scientific</td><td>5867</td><td>For pinching tubes shut. 3 required.</td></tr><tr><td>Replacement tubing assembly 1/16&quot; ID</td><td>Traceable Products</td><td>3372</td><td>The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.</td></tr><tr><td>Replacement tubing assembly 1/50&quot; ID</td><td>Traceable Products</td><td>3371</td><td>The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use.</td></tr><tr><td>Male luer with lock ring x 1/16&quot; hose barb, Nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-00</td><td>Connectors. ~10 luers are required.</td></tr><tr><td>Male luer with lock ring x 1/8&quot; hose barb, Nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-04</td><td>Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing.</td></tr><tr><td>Female luer x 1/16&quot; hose barb adapter, Nylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-00</td><td>Connectors. ~10 luers required.</td></tr><tr><td>Female luer x 3/16&quot; hose barb adapter</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-08</td><td>Connectors. ~10 luers required.</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>SC-45502-28</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-56</td><td></td></tr><tr><td>Microbore PTFE Tubing, 0.022&quot;ID x 0.042&quot;OD, 100 ft/roll</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06417-21</td><td>Tubing. 1 roll required.</td></tr><tr><td>Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-13</td><td>Tubing. ~25&#039; required.</td></tr><tr><td>3/16&quot; ID x 1/4&quot; OD x 1/32&quot; Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing</td><td>United States Plastic Corp.</td><td>57293</td><td>Tubing. ~1&#039; required.</td></tr><tr><td>Vacuum filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>974107</td><td>Nalgene vacuum filter for sterile filtering media.</td></tr><tr><td>Aquel Oxy-Boost 200</td><td>Rena Aquatic Supply</td><td>AP200</td><td>Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m pore syringe filter</td><td>Corning International</td><td>431229</td><td>This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required.</td></tr><tr><td>Slygard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td>For microfluidic device. 1 required.</td></tr><tr><td>American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>17989000</td><td>For cutting tubes and PDMS. 1 blade required.</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHAWB100028 ALDRICH</td><td>For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required.</td></tr><tr><td>Microscope cover glass 22x60-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>For microfluidic device. 1 required.</td></tr><tr><td>Rectangular aluminum frame with a square window</td><td>Custom</td><td>Custom</td><td>To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches.&lt;br/&gt; Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches&lt;br/&gt; Thickness: ~1/32 inches</td></tr></tbody></table>

design and implementation of an automated illuminating, culturing, and sampling system for microbial optogenetic applications

Optogenetic 시스템은 세포 과정을 변경하는 빛의 특정 파장에 대한 응답으로 형태를 변경 유전자 인코딩 된 단백질을 사용한다. optogenetic 조명 시스템의 프로그래밍 및 자극을 탑재 되 배양 시스템 및 측정이 필요하다. 우리 구축 광의 프로그래밍 용량과 균체를 조명하고, 자동으로 획득하고 유출 셀의 이미지를 분석하는 연속 배양 장치를 이용하기위한 프로토콜을 제시한다. chemostat 등이 장치의 동작은 성장 속도와 셀룰러 환경이 엄격하게 제어 될 수있다. 연속 세포 배양의 유출 물을 주기적으로 샘플링하고, 세포를 다 채널 현미경으로 이미지화된다. 형광 강도 배양 유출 물로부터 샘플링 된 세포의 세포 형태의 동적 응답이 여러 날에 걸쳐 측정되도록 배양 샘플링, 촬상 한 화상 분석이 완전히 자동화사용자 입력없이. 우리가 동적으로 전사를 활성화 optogenetic 시스템 설계 사카 세레 비지에 균주에서 단백질 생산을 유도하여 배양 장치의 유용성을 입증한다.

이 장치는 CRY2 / CIB1 단백질 쌍 (30)에 기초하여 유도 optogenetic 전사 시스템을 통해 푸른 빛의 질문에 답변 노란색 형광 단백질 (YFP)를 표현하는 S. cerevisiae의 문화를 자극하기 위해 사용되었다. 세포를 0.2 ± 0.008 평균 희석 속도 포스페이트 한정 배지에서 배양 하였다 chemostatically. 인산 제한은 일반적으로 성장 속도를 제어하는 S. 세레 비지 chemostat 실험에 사용되는 인산 제한의 효과는 잘 특징으로한다. 31 (32)는 연속적으로 희석 된 배양 용기 (33)로부터 유출 물은 거꾸로 현미경에서 미세 유체 소자로 샘플링 하였다. 도 8에 도시 된 바와 같이, 이미지는 자동으로 분석 하였다. 개별 셀 배경-감산 위상차 이미지와 자신의 YFP에 집중하고에서 확인되었다백그라운드 - 감산 형광 화상으로부터 측정 된 기들은 형광로부터 추정 하였다. 169,677 세포의 형광 실험 70 시간에 걸쳐 마이크로 유체 장치 (28)로부터 취득한 위치 유출 물의 33600 이미지에서 분석 하였다. 우리는 형광 조명 시스템 및 CMOS 카메라 장착 거꾸로 현미경을 사용 하였다. YFP 이미지는 20분의 500 nm의 여기 필터, 30분의 535 nm의 방출 필터와 T515lp 이색으로 획득 하였다. 이미지는 쾰러 조명 아래, 40X 위상 대비 목표로 촬영되었다. 마이크로 미터 제곱 당 이미지는 87 픽셀 16 비트 색 깊이에서 기록되었다. 문화는 6 시간 간격에 대한 완전한 어둠 다음, 6 시간 간격에 대한 푸른 빛의 강도 변화에 노출되었다. 배양은 그 형광 강도가 제 어두운 기간 동안 감소하는 이유는 첫번째 측정 전에 빛에 노출되어 있었다. &lt;/ P&gt; 도 9는 배양 용기의 조명에 응답 의한 optogenetic 시스템의 활성화시 YFP 생산의 형광을 나타낸다. 그것은 평균 단일 셀 측정 형광 강도의 인구 분포를 나타내 인구 위에 형광 단일 셀 측정의 유용성을 보여준다. 42 시간 26 분에서 특이를합니다. 해당 이미지를 검토 한 결과, 배경 화상 감산 된 세포 닮은 아티팩트의 결과로, 배경의 합성 이미지를 생성하는 데 사용되는 이미지의 대다수의 세포 덩어리가 있다고 명백했다. 또한, 배양 용기로부터 기포는 미세 유체 채널로 펌핑하고, 모서리 부분은 이미지 분석 알고리즘에 의해 세포와 같은 착각이었다. 기포 나 배경 차감으로부터 아티팩트도 실제 전지에 대응하기 때문에, 그 측정 된 형광 강도셀의 자동 형광보다 낮다. 이 수치는 자동으로 3 일 동안 획득 될 수있는 데이터의 품질을 보여준다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54894/54894fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/54894/54894fig8.jpg" /> 그림 8 : 영상 분석 알고리즘의 시각적 묘사. 이러한 이미지는 잘립니다 및보기의 용이성을 위해 확장되었습니다. (A) 여섯 이미지는 세포 배양의 배경 - 감산 위상차 이미지를 생성하기 위해 취득된다. 메인 이미지가 획득 된 후, 5 개의 추가 이미지 간단히 세포 변위되도록 각각의 취득 사이에 온 유출 샘플링 펌프를 취득한다. 배경의 합성 화상은 다섯 요소 화상으로부터 생성된다. 각 화소의 값배경 화상의 5 성분 화상에 걸쳐 동일한 화소의 중간 값이다. (B)이 감산 된 배경 화상은 이진으로 변환된다. 이진은 다음 넓혀되고 이진의 연속 섹션 내에서 구멍이 채워집니다. 황색 윤곽선 크기 원형 기준에 따라 선택된 관심 영역 (ROI)에 대응한다. (C) 그 ROI 각 셀의 형광은 ROI 내에서 가장 밝은 화소의 값으로서 측정되는 형광 이미지로 매핑된다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54894/54894fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/54894/54894fig9.jpg" /> 그림 9 : 시간이 지남에 따라 형광 강도의 인구 분포입니다. 측정 된 불소의 이러한 하위 도면에서 로그escence은 유동 세포 계측법의 표준 관행에 따라 표시됩니다. A 및 B의 광고들은 빛을 흡수하거나, 배양 용기 내에서 세포 배양을 통해 전송 멸균 매체 및 광 투과 한 빛의 강도 사이의 차이로서 측정된다 배양, 회절 강도를 나타낸다. 이것은 제 종축에 대해 도시된다. (A) 상자와 수염 플롯 시간에 따른 인구의 측정 된 형광의 대수 (5 번째 백분위 수, 25 번째 백분위, 중앙값, 75 번째 백분위 수, 95 번째 백분위 수). (B) 컬러 해당 빈의 범위에서 측정 된 형광과 세포의 규격화 주파수에 대응하는 동일한 데이터의 2 차원 히스토그램. 색상은 26 분 포함 42 시간의 특이없이 데이터의 범위를 확장했다. 가장 낮은 형광 빈에서 아웃 라이어의 정규화 된 주파수0.7. (C) 1 차원 광에 처음으로 기록 된 노광 전에 모집단의 측정 된 형광의 대수의 히스토그램 및 광 최대 노광 후. 그것은이 변형에 YFP의 빛에 의한 표현 바이 모달 있음을 보여줍니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54894/54894fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

우리는 거꾸로 현미경으로 유출 물에 미생물의 문화와 정기적으로 이미지 세포를 조명하기 optogenetic 시스템과 함께 사용 연속 배양 장치를 설계했다. 조명 동적 응답은 며칠에 걸쳐 측정 될 수 있도록 배양 샘플링, 촬상 한 화상 분석이 완전 자동화된다.

미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K 조회수.  University of Wisconsin-Madison.  우리는 거꾸로 현미경으로 유출 물에 미생물의 문화와 정기적으로 이미지 세포를 조명하기 optogenetic 시스템과 함께 사용 연속 배양 장치를 설계했다. 조명 동적 응답은 며칠에 걸쳐 측정 될 수 있도록 배양 샘플링, 촬상 한 화상 분석이 완전 자동화된다. 

비디오: Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

연구

유전학

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

신경과학

제브라피시에서 광유전학적 신호전달 조작을 이용한 개발 조사

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

저자 스포트라이트: 세포 운명 결정을 해독하기 위해 제브라피시 배아의 신호 전달 조작 

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

발생학

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical control allows for an unprecedented ability to dissect function and holds the potential for enabling novel genetic therapies. However, optogenetic experiments require adequate light sources with spatial, temporal, or intensity control, often a bottleneck for researchers. Here we detail how to build a low-cost and versatile LED illumination system that is easily customizable for different available optogenetic tools. This system is configurable for manual or computer control with adjustable LED intensity. We provide an illustrated step-by-step guide for building the circuit, making it computer-controlled, and constructing the LEDs. To facilitate the assembly of this device, we also discuss some basic soldering techniques and explain the circuitry used to control the LEDs. Using our open-source user interface, users can automate precise timing and pulsing of light on a personal computer (PC) or an inexpensive tablet. This automation makes the system useful for experiments that use LEDs to control genes, signaling pathways, and other cellular activities that span large time scales. For this protocol, no prior expertise in electronics is required to build all the parts needed or to use the illumination system to perform optogenetic experiments.

This protocol describes how to perform optogenetic experiments for controlling gene expression with red and far-red light using PhyB and PIF3. Included are step-by-step instructions for building a simple and flexible illumination system, which enables the control of gene expression or other optogenetics with a computer.

광유전학 실험을 위한 간단하고 다양한 조명 시스템 구축

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

생체공학

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

미생물 화학 및 단백질 생산을 위한 광 조절 발효

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction

Many neuromuscular diseases, such as myasthenia gravis (MG), are associated with dysfunction of the neuromuscular junction (NMJ), which is difficult to characterize in animal models due to physiological differences between animals and humans. Tissue engineering offers opportunities to provide in vitro models of functional human NMJs that can be used to diagnose and investigate NMJ pathologies and test potential therapeutics. By incorporating optogenetic proteins into induced pluripotent stem cells (iPSCs), we generated neurons that can be stimulated with specific wavelengths of light. If the NMJ is healthy and functional, a neurochemical signal from the motoneuron results in muscle contraction. Through the integration of optogenetics and microfabrication with tissue engineering, we established an unbiased and automated methodology for characterizing NMJ function using video analysis. A standardized protocol was developed for NMJ formation, optical stimulation with simultaneous video recording, and video analysis of tissue contractility. Stimulation of optogenetic motoneurons by light to induce skeletal muscle contractions recapitulates human NMJ physiology and allows for repeated functional measurements of NMJ over time and in response to various inputs. We demonstrate this platform&#39;s ability to show functional improvements in neuromuscular connectivity over time and characterize the damaging effects of patient MG antibodies or neurotoxins on NMJ function.

We describe a reproducible, automated, and unbiased imaging system for characterizing neuromuscular junction function using human engineered skeletal muscle tissue and optogenetic motoneurons. This system allows for the functional quantification of neuromuscular connectivity over time and detects diminished neuromuscular function caused by neurotoxins and myasthenia gravis patient serum.

인간 신경근 접합부의 광유전학 모델의 공학 및 특성화

Many neuromuscular diseases, such as myasthenia gravis (MG), are associated with dysfunction of the neuromuscular junction (NMJ), which is difficult to ...

Lustro Automation 기법을 사용한 효모 광유전학 반응 분석

High-Throughput Optogenetics Experiments in Yeast Using the Automated Platform Lustro

Optogenetics offers precise control over cellular behavior by utilizing genetically encoded light-sensitive proteins. However, optimizing these systems to achieve the desired functionality often requires multiple design-build-test cycles, which can be time-consuming and labor-intensive. To address this challenge, we have developed Lustro, a platform that combines light stimulation with laboratory automation, enabling efficient high-throughput screening and characterization of optogenetic systems.
Lustro utilizes an automation workstation equipped with an illumination device, a shaking device, and a plate reader. By employing a robotic arm, Lustro automates the movement of a microwell plate between these devices, allowing for the stimulation of optogenetic strains and the measurement of&#160;their response. This protocol provides a step-by-step guide on using Lustro to characterize optogenetic systems for gene expression control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. The protocol covers the setup of Lustro&#39;s components, including the integration of the illumination device with the automation workstation. It also provides detailed instructions for programming the illumination device, plate reader, and robot, ensuring smooth operation and data acquisition throughout the experimental process.

저자 스포트라이트: Lustro를 사용한 광유전학 연구 발전 

This protocol outlines the steps for utilizing the automated platform Lustro to perform high-throughput characterization of optogenetic systems in yeast.

자동화된 플랫폼 Lustro를 사용한 효모의 고처리량 광유전학 실험

Optogenetics offers precise control over cellular behavior by utilizing genetically encoded light-sensitive proteins. However, optimizing these systems to ...

미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현

요약

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이 비디오의 챕터

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

광유전학 실험을 위한 간단하고 다양한 조명 시스템 구축

포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

미생물 화학 및 단백질 생산을 위한 광 조절 발효

인간 신경근 접합부의 광유전학 모델의 공학 및 특성화

자동화된 플랫폼 Lustro를 사용한 효모의 고처리량 광유전학 실험