Name: online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
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We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Sant&#233; des Arm&#233;es and the D&#233;l&#233;gation G&#233;n&#233;rale pour l'Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

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The authors have nothing to disclose.

많은 고분자를 들어, 크로마토 그래피를 이용하여 최종 정제 단계는 양질의 데이터 세트를 획득 할 SAXS 데이터 수집에 앞서 요구된다. 그러나 모든 샘플은 안정적으로 유지; 그들은 올리고머 상태의 혼합물에 통합 또는 재 평형하는 경향이있을 수 있습니다. 따라서, 빔라인에 온라인 최종 정제 단계는 최고 품질 SAXS 데이터를 얻기 위해서 정제 및 데이터 수집 사이의 시간을 최소화하기 위해 요구된다. 관심 단백질의 생물 리 학적 특성에 따라 SEC-SAXS 또는 IEC-SAXS 최적 샘플 품질을 얻기 위해 선택 될 수있다. 여기서, 헬리 케이즈 / 프리 메이스 D5 유래의 단백질 구조에서 두 가지 기술이 설명되고 논의된다. SEC-SAXS 데이터의 수집은 점점 더 표준화되고 많은 BioSAXS의 빔라인에 사용할 수 있습니다. 데이터 분석, 특히 배경 뺄셈은 비교적 간단하고 쉽습니다. 그러나, 안정된 버퍼 신호및 거대 분자 화학 종의 충분한 분리가 필수적 남아있다. 따라서, 충분히 열을 평형화하기에 충분한 시간을 확보하는 것이 중요하다. 이 방법의 실패이자, 낮은 농도, 방사선에 민감한 버퍼의 단백질과 유사한 크기의 영구적 인 오염 물질에 기인 할 수있다. 실제로, 초기 SEC-SAXS 대부분의 고분자 샘플 선택의 방법으로 사용될 가능성이 높다. 여전히, 많은 정제 프로토콜은 오염물 또는 응집의 존재로 인해 종래 IEC 단계를 필요로한다. 각 농도 및 크로마토 그래피 단계 (30 % ~ 50 %로 추정) 샘플 및 시간 손실과 연관되어 있음을 감안할 때, 직접 IEC-SAXS 유리하다. SEC에 의해 정제 할 수없는 샘플 인해 비슷한 크기의 &quot;오염&quot;의 존재 또는 필요한 농도 심각 골재 IEC-SAXS 항상 더 적합한 방법이 될 것이기 때문에 그 것이다. 또한, 높은 유속 지원많은 IEC 칼럼 정제 및 측정 사이의 전송 시간을 줄일 수있다. 여기에 제시된 실시 예에서, IEC 신중 염 농도 단계를 선택하여 오염물로부터 D5의 323-785 가까운 피크의 분리를 허용하는 단계 용출로 사용 하였다. 원칙적으로, 단계의 수는 무제한이지만, 사실상, 피크 당 적어도 한 단계가 필요하며, 너무 많은 생략 선택되어야한다. 전술 한 배경 차감 법의 경우, 매칭을 찾기 위해 다른 버퍼 조성물의 상대적으로 높은 수를 측정하는 것이 중요하다. 두 기술의 공유 단점은 정확한 단백질 농도 정보의 부족이다. 이 때문에, 앞으로 산란을 기반으로 정확한 질량 측정 할 수 없습니다. 예 D5 323-785 같은 구형 단백질의 Porod 부피는 매우 유연 또는 무질서 단백질하지만 덜 정확한 질량 추정 불구 대안을 제공한다이 방법은 유효하지 않습니다. 여기에 제시된 단계적 구배 IEC-SAXS 방법의 변형 대신에 선형 구배를 사용하는 것이다. 이 단계적인 용출을 이용하여 서브 - 피크를 분리 할 목적으로 상기 선형 그라데이션 방법에서 많은 단계에서 작동하는 것이 가능하지만, 이는 전적으로 SAXS 시작 전에 피크를 분리하기 위해 신중 구배 조건을 최적화 할 필요 실험. 이 방법에 배경 차감 프레임 현명 할 수 있고, 각각의 프레임들의 비교에 의해 확인 될 수 있지만,보다 고급 데이터 처리를 요구하고, 전용 소프트웨어는 아직 존재하지 않는다. 그것은 거대 분자 종의 분리를 결정한 적당한 컬럼의 선택은 두 가지 기술에 중요하다. 이온 교환 컬럼 종류 및 밀도에 변화하면서 크기 배제 컬럼은, 적재 능력, 분리 거대 분자의 크기 범위 및 해상도에 차이가자신의 고정 요금. 여기에 제시된 프로토콜은 간단 원칙적으로 다른 SAXS 빔라인 인에 ESRF 빔라인 BM29, 적응, 특정된다. 주요 요건은 생성 할 수있는 충분히 높은 X 선 광속 초 이하의 범위에서 합리적인 신호 - 대 - 잡음 데이터를 획득하기에 적합한 검출기 (이상적인 단일 광자 카운팅), 온라인 액체 크로마토 그래피 시스템이다 그라디언트. 정확한 구현은 물론, 로컬 빔라인 환경에 의존 할 것이다. 두 가지 방법을 사용 D5 323-785에서 얻어진 결과는 약간 다르다. 관성 반경은 SEC 데이터보다 IEC 데이터 약간 작고, 산란 곡선의 국부 최소치는 약간 큰 산란 벡터로 전환된다. 이는 IEC-SAXS으로 측정 D5 323-785 약간 더 작고 SEC-SAXS으로 측정 D5 323-785 이상임을 의미한다. 이 ㄱ 있습니다SEC에 정제 된 시료 중의 오염물에 덜 정제과 측정 사이의 시간에서 샘플 준비의 차이 (IEC 빠른 경우), 또는,에 의한 전자. 두 가지 방법으로 완전히 독립적으로 얻어진 비드 모델 (그림 1H) 비교할 수 있습니다. D5 323-785은 예상 중공, hexameric 구조 (18)를 보여줍니다. 결론적으로, 온라인으로 이온 교환 및 온라인 크기 배제 크로마토 그래피 SAXS 6,7,9-12,25,26에 직접 결합 될 수있다 중요한 생화학 적 정제 방법이다. IEC-SAXS 데이터의 배경 차감 약간 SEC-SAXS보다 더 어려운 애매한이지만, 그럼에도 불구하고있다. 관심 단백질의 생물 리 학적 특성에 따라 SEC 및 IEC-SAXS 모두 고유의 장점 종 분리의 최적화를 허용한다. 유효성 검증 단계 (설명) 정확하게 관찰되어, 결과 데이터를 분석 할 수있는 재치 제공H 신뢰도 및 모델은 커뮤니티 내에서 사용 가능한 표준 도구를 사용하여 결정될 수있다. 함께, 두 가지 기술 표준 정적 측정을 통해 액세스 할 수없는 데이터를 산출, 생물학적 거대 분자의 광범위한 온라인 분리 할 수 ​​있습니다.

BioSAXS는 나노 크기의 물체 1-4의 형상을 결정하기위한 강력한 도구이다. 나노 크기 범위에서 고분자를 함유 한 용액에 의한 X 선의 산란이 매우 낮은 각도로 기록된다. 이 각도 범위는 글로벌 매개 변수에 대한 정보가 포함되어 관성 반경을; 가장 큰 입자 내 거리; 입자 형상; 및 폴딩, 변성, 또는 장애의 정도. 결정하는데 도움이되는 기술의 결정을 필요로하지 않고, 거대 분자가 이온 성 등 강도, pH가 이러한 요인의 지식 셀 특정 중요 파라미터를 흉내 낸 상태로 유지 될 수있다, 따라서 용액 내에서 유지하고, 예를 들면, 또는 관심의 단백질의 생리 학적으로 관련 올리고머 상태는 복잡한의 제안 된 모델의 유효성을 검사합니다. 다른 버퍼 조건에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 특성 누락 도메인 모델의 작성, 상 동성 모델을 정제하고, 디이산 접혀 펼친 상태의 종료가 빠르고 쉽게 5 행할 수있다. 유엔 해석 데이터가 발생할 수 있습니다 집계 또는 변성 샘플, 입자의 혼합물, 이기종 샘플, 방사선 손상, 버퍼 불일치 : 어떤 기술과 마찬가지로, BioSAXS는 본질적인 약점을 가지고있다. 많은 분석 방법의 경우, 묵시적 샘플을 실제로 얻는 것이 종종 어렵다 요구가 단 분산 인 것으로한다. 많은 경우에, 시료의 열화 미묘한 자체의 데이터를 검출 할 수없고, 데이터를 해석하는 시도가 부정확 또는 잘못된 결과를 제공한다. 이러한 장애를 극복하기 위해, 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC) 및 SAXS의 조합은 데이터 품질을 보장하고 어려워 시료 6-11이 기술은 더 접근 할 수 있도록 다수의 빔라인에서 구현 하였다. 최근에, 우리는 온라인으로 이온 교환을 개발하여 레퍼토리에 새로운 방법을 추가크로마토 그래피 (IEC)는 SAXS 12 -coupled. 두 기술은 분석하기 이전에 불가능한 생물학적 입자들의 광범위한 SAXS를 개방한다. 사용되는 방법의 선택은 관심의 입자의 생물 리 학적 특성에 의존한다. SEC는 겉보기 분자 질량의 적어도 10 % 차이가 분리된다 필요한 크기에 의해 고분자를 분리한다. 칼럼과 시료의 생리 학적 특성의 물리적 제한은 소수성 표면, 유연성, 안정성의 부족과 같이 또한 데이터 수집, 분석과 해석을 복잡. 은 IEC 칼럼, 따라서, 그들의 결합 친화도를 그 전하에 기초하여 분자를 분리하고, 이온 교환 크로마토 그래피는 대신 또는 SEC에 더하여 사용될 수있다. 총 전하를 용이하게 제어 EL 비교적 간단한 방법을 pH를 변경 또는 버퍼의 염 농도를 변화 제공함으로써 조작 될 수있다은 IEC 열에서 분자의 ution. 전하를 사용함으로써, 별도로 분리하기 어렵 유사한 종류 및 크기의 분자의 분리는, IEC에 일상적으로 수행 될 수있다. 또한, IEC 하나의 단백질을 변성의 위험을 가지고 농도 단계를 피할 수 있도록 희석하여 시료를 처리 할 수 ​​있다는 장점을 갖는다. 전하 분포가 높은 샘플에 의존 불행히도, IEC는 pH와 염 농도 (13, 14)에 대한 최적화가 필요합니다. 표현 정화, 또는 두 가지 모두 어려운 많은 단백질의 경우, 샘플의 낮은 양의 공부를 할 수 있습니다. 이는 효율적으로하고, 따라서, 손실을 정제 단계의 수를 최소화하는 것이 중요하다. 이 때문에, 최종 정제 단계는 양호한 데이터 세트를 수집 할 가능성을 증가시키기 위해, 온라인 SAXS 데이터 취득 직접 종래이다. 이리우리는 선물 및 온라인 SEC-SAXS 및 IEC-SAXS를 비교합니다. 두 기술은 그르노블, 프랑스 15 유럽 방사광 시설 (ESRF)에서 BioSAXS 빔라인 BM29에 구현되었다. 테스트 케이스로서, 우리는 다른 방법을 이용하여 구조적으로 분석 오히려 곤란했던 백시 니아 바이러스 단백질 D5의 D5N 및 헬리 케이즈 도메인을 사용 하였다. 백시 니아 바이러스는 Poxviridae 가족의 일원이며, 천연두 바이러스, 천연두의 원인으로 98 % 동일하다. 백시 니아 시스템을 사용하여, 우리는 필수 헬리 케이즈 - 프리 메이스의 D5에 여기에 집중 복제 장치를 연구한다. D5는 시스테인 클러스터 영역 (입술. 240-345) (16) 다음에 N 말단 archeo 진핵 프리 메이스 (AEP) 도메인 (16) 95-kDa 단백질이다. 또한 C 말단쪽으로 D5N 도메인 (입술. 340-460)을 제공 항상 D5 형 헬리과 관련된, 그리고 마지막 세 수퍼 패밀리 (SF3) 헬리 케이즈 도메인된다 (입술. 460-785)을 17 (Figur전자 1A). D5의 헬리 케이즈 도메인 꽉 DNA에 결합하는 데 필요한 hexameric 환 구조를 구축한다. 감사 및 EM SAXS 최근 연구에 상기 프리 메이스의 저해상도 구조 및 헬리 케이즈 도메인은 이제 18 알려져있다. 여기, 우리는 D5의 (323-785 잔류 물) C- 말단 단편의 구조에 대한 통찰력을 얻을 수 ESRF의 BioSAXS 빔라인 BM29에 구현 된 온라인 크로마토 그래피 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>1,4-dithiothreitol [DTT]</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td></td></tr><tr><td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td><td>Biorad</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>F 548</td><td></td></tr><tr><td>acetic acid glacial</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>Agarose D-5</td><td>Euromedex</td><td>LF45130653</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K</td><td>Millipore Ltd</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Euromedex</td><td>EU0400-D</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagene</td><td>70750-3</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue&amp;nbsp;</td><td>MERCK</td><td>8122</td><td></td></tr><tr><td>Complete protease inhibitor cocktail&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11231400</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10 DG Desalting column</td><td>Bio-rad</td><td>732-2010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Euromedex</td><td>26-128-6405-C</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Roche</td><td>656313</td><td></td></tr><tr><td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>H0537</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20252.295</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AppliChem Panreac</td><td>A1073,0500</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>LB broth Miller</td><td>Fluka Analytical</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td>191421</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>27808.297</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>Fermentas</td><td>ER0571</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21 Star (DE3)&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>C6010-03</td><td></td></tr><tr><td>pProEx HTb vector&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>10711018</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>&amp;nbsp;Eurofins mwg operon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel extraction kit</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kid</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>SDS&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain</td><td>Invitrogen life technology</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TEV</td><td></td><td></td><td>home made</td></tr><tr><td>TOP 10</td><td>Invitrogen life technology</td><td>C404003&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>Uno Q 1R column&amp;nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>720 0011</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>MPBiomedicals, LLC</td><td>194834</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Softwares&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beamline control software BsXCuBE</td><td>ESRF</td><td>Pernot &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td><td>local development</td></tr><tr><td>Camserver software</td><td>Dectris</td><td>n.a.</td><td>detector control software</td></tr><tr><td>DAMAVER</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>program to align ab initio models&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAMMIF</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>&lt;em&gt;ab initio&lt;/em&gt; model reconstruction program</td></tr><tr><td>HPLC program Biologic Duo Flow</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC program LabSolutions</td><td>Shimadzu</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>ISPyB</td><td>ESRF</td><td>De Maria Antolinos &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td><td>local development</td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>program, which performs the manipulation with experimental SAXS</td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>DeLano Scientific LLC</td><td>https://www.pymol.org/</td><td>software for visualization</td></tr><tr><td>SUPCOMB</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>program to superimpose 3D structures</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Duo Flow</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Biofrac Fraction collector</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC system</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labsonic P</td><td>Sartorius Stedim biotech</td><td>BBI8535108</td><td></td></tr></tbody></table>

online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline

생물학적 소각 X 선 산란 (BioSAXS)의 용액 구조, 입자 크기 및 형상, 및 고분자의 표면 대 부피 비율을 결정하는 데 사용되는 분자 구조 생물학에서 강력한 기술이다. 기술 등의 농도, pH 값, 이온 세기, 온도, 첨가제, 넓은 범위에 걸쳐 용액 상태의 매우 다양한 적용이지만, 단 분산 샘플 할 필요가있다. 이주의해야 할 점은 SAXS 빔라인에 액체 크로마토 그래피 시스템의 구현되었다. 여기서, 우리는 빔라인의 크기 - 배제 (SEC), 이온 교환 크로마토 그래피 (IEC)의 상류의 통합을 설명하는 최적 배경 차감하고, 데이터 감소하는 다른 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 우리는 우리가 D5N의 헬리 케이즈 도메인으로 구성된 필수 우두 바이러스 단백질 D5의 단편에 사항을 유의 및 IEC-SAXS를 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 우리 번째의 hexameric 구조를 보여주는 전체적인 형상 및 분자량을 결정전자 단백질.

모델없이 불변 분석의 결과는 표 1에 나열되어있다. D5 323-785 SEC-SAXS 데이터의 분석은 338 kDa의 대 345 kDa의의 (a Porod 분석)에서 분자 질량 추정을 보였다 IEC-SAXS을 사용하여 관찰 하였다. 둘 다 헥사 6 회 53.5 kDa의 (321 kDa의)의 예상 질량과 일치한다. 두 데이터 세트의 순이 론적 모델링은 더 부과 대칭으로 수행되었다 (SEC-SAXS : χ 2 = 0.88, IEC-SAXS : χ 2 = 3.1) 및 C6 대칭을 사용하여 (SEC-SAXS를 : χ 2 = 1.0, IEC-SAXS : χ (2) = 4). 모두 복원을위한 산란 데이터 전체 맞는 두 가지 경우 (도 1D 및 E)에 비교할 때, C6 대칭을 가정 할 수있다. 따라서, 모델 (SEC 부분적으로 차단 된 중앙 채널 표시와 육각 콘형 구조에 대응한다 :도 1 층;을 IEC : <str옹&gt; 그림 1G, 오버레이 그림 1H). 평균화 전에 개별 모델 시험이 방해가 평균화 처리의 이슈가 될 가능성이 있음을 보여준다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" /> 그림 1 : SAXS 데이터 분석 및 비교 D5 (323)의 -785 (그림 참조 12 및 18에서 적응). D5 단백질 및 D5 323-785의 A) 도식 도메인 구조. B)이 세 개의 피크의 표시와 함께 오프라인 이온 교환 크로마토. 오렌지 곡선 : 280 nm의 (노소), 파란색 곡선에서 흡광도 : 피크에서 버퍼 B의 버퍼 B. 백분율의 비율이 표시됩니다. C) 온라인 이온 교환 크로마토 그램. B.에서와 같은 색상 키 또한, 측정 된 강도는 녹색으로 표시됩니다. 실험 산란 곡선 AND SEC-SAXS D) 및 IEC E) 323-785 D5의 데이터 분석에 의해 얻어진 모델 곡선을 계산 하였다. SEC 데이터와 G) IEC 데이터에 기초 D5 323-785의 F) 비드 모델. 증권 거래위원회 (SEC)와 IEC 모델 H) 오버레이. F의 패널) H에)는 분자 시각화 소프트웨어 (24)를 사용하여 만들어졌습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 데이터 수집 매개 변수 </td><td></td></tr><tr><td> 악기: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> 파장 (Å) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> Q-범위 (A-1) </td><td> 0.0032-0.49 </td></tr><tr><td> 샘플 대 검출기 거리는 </td><td> 2.864 m </td></tr><tr><td> 노출 시간 (초) </td><td> 프레임 당 1 </td></tr><tr><td> 농도 범위 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 온도 (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> 탐지기 </td><td> 필라투스 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> 플럭스 (광자 / s의) </td><td> 1 × 10 (12) </td></tr><tr><td> 빔 크기 (μm의 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> D5 323-785, 삼성 전자 구조 매개 변수 </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) 기니 어에서] </td><td> 0.0237 </td></tr><tr><td> RG (Å)에서 기니 어] </td><td> (48) </td></tr><tr><td> R의 g 분 Q - 기니 어에 사용되는 Q 최대 R의 g </td><td> 0.77-1.24 </td></tr><tr><td> D 최대 (Å) 페이지에서 (R)] </td><td> (145) </td></tr><tr><td> 페이지에 사용되는 Q-범위 (R) (A-1)</td><td> 0.02-0.17 </td></tr><tr><td> Porod 볼륨 V p를 (3) 분산에서] </td><td> (570 ± 5) (10) (3) × </td></tr><tr><td> 분자 질량 M의 R (kDa의) [V 피에서] </td><td> (345) </td></tr><tr><td> 시퀀스에서 단량체 미스터 계산 (kDa의) </td><td> (321) </td></tr><tr><td> D5 323-785, IEC에 대한 구조 매개 변수 </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) 기니 어에서] </td><td> 0.386 </td></tr><tr><td> RG (Å)에서 기니 어] </td><td> 46.5 ± 0.1 </td></tr><tr><td> R의 g 분 Q - 기니 어에 사용되는 Q 최대 R의 g </td><td> 0.44-1.29 </td></tr><tr><td> D 최대 (Å) 페이지에서 (R)] </td><td> (120) </td></tr><tr><td> 페이지에 사용되는 Q-범위 (R) (A-1) </td><td> 0.03-0.18 </td></tr><tr><td> Porod 볼륨 V 피 (&amp; #197; 3) 분산에서] </td><td> (577 ± 5) (10) (3) × </td></tr><tr><td> 분자 질량 M의 R (kDa의) [V 피에서] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> 시퀀스에서 hexameric 미스터 계산 (kDa의) </td><td> (321) </td></tr></tbody></table> 표 1 : SAXS 데이터 파라미터. SAXS 표는 데이터 수집 및 분석의 파라미터를 요약 한 것이다.

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Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

소각 X 선 산란 (SAXS)에 의한 단백질의 용액 구조의 결정은 단 분산 샘플을 필요로한다. 여기에서는, 샘플 준비 및 데이터 수집 간의 최소 지연을 보장하기 위해 두 가지 가능성을 제시 : 온라인 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC) 및 온라인 이온 교환 크로마토 그래피 (IEC).

SAXS 빔라인에 온라인 크기 배제 및 이온 교환 크로마토 그래피

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

online-size-exclusion-ion-exchange-chromatography-on-saxs

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

17.2K 조회수.  European Synchrotron Radiation Facility.  소각 X 선 산란 (SAXS)에 의한 단백질의 용액 구조의 결정은 단 분산 샘플을 필요로한다. 여기에서는, 샘플 준비 및 데이터 수집 간의 최소 지연을 보장하기 위해 두 가지 가능성을 제시 : 온라인 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC) 및 온라인 이온 교환 크로마토 그래피 (IEC). 

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Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and how the domains are oriented/positioned. Here, a protocol with the potential for elucidating which specific domains mediate interactions in multicomponent system through ab initio modeling is described. A method for calculating solution structures of macromolecules and their assemblies is provided that involves integrating data from small angle X-ray scattering (SAXS), chromatography, and atomic resolution structures together in a hybrid approach. A specific example is that of the complex of full-length nidogen-1, which assembles extracellular matrix proteins and forms an extended, curved nanostructure. One of its globular domains attaches to laminin &#947;-1, which structures the basement membrane. This provides a basis for determining accurate structures of flexible multidomain protein complexes and is enabled by synchrotron sources coupled with automation robotics and size exclusion chromatography systems. This combination allows rapid analysis in which multiple oligomeric states are separated just prior to SAXS data collection. The analysis yields information on the radius of gyration, particle dimension, molecular shape and interdomain pairing. The protocol for generating 3D models of complexes by fitting high-resolution structures of the component proteins is also given.

Here, we present how Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) can be utilized to obtain information on low-resolution envelopes representing the macromolecular structures. When used in conjunction with high-resolution structural techniques such as X-Ray Crystallography and Nuclear Magnetic Resonance, SAXS can provide detailed insights into multidomain proteins and macromolecular complexes in-solution.

작은 각 엑스레이 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 고분자의 구조 연구

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

연구

생화학

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for even the most challenging projects in structural biology. However, most facilities still require the presence of a scientist on site to perform the experiments. A new generation of automated beamlines dedicated to the fully automatic characterization of, and data collection from, crystals of biological macromolecules has recently been developed. These beamlines represent a new tool for structural biologists to screen the results of initial crystallization trials and/or the collection of large numbers of diffraction data sets, without users having to control the beamline themselves. Here we show how to set up an experiment for automatic screening and data collection, how an experiment is performed at the beamline, how the resulting data sets are processed, and how, when possible, the crystal structure of the biological macromolecule is solved.

Here, we describe how to use the automated screening and data collection options available at some synchrotron beamlines. Scientists send cryocooled samples to the synchrotron, and the diffraction properties are screened, the data sets are collected and processed and, where possible, a structure solution is carried out&#8212;all without human intervention.

완전히 자치 특성화 및 생물학 고분자의 결정에서 데이터 수집

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination of the high-specificity separation technique IEX with the accurate molar mass analysis achieved by MALS allows the characterization of heterogeneous protein samples, including mixtures of oligomeric forms or protein populations, even with very similar molar masses. Therefore, IEX-MALS provides an additional level of protein characterization and is complementary to the standard size-exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) technique.
Here we describe a protocol for a basic IEX-MALS experiment and demonstrate this method on bovine serum albumin (BSA). IEX separates BSA to its oligomeric forms allowing a molar mass analysis by MALS of each individual form. Optimization of an IEX-MALS experiment is also presented and demonstrated on BSA, achieving excellent separation between BSA monomers and larger oligomers. IEX-MALS is a valuable technique for protein quality assessment since it provides both fine separation and molar mass determination of multiple protein species that exist in a sample.

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

This protocol describes the use of high-specificity ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering for an accurate molar mass determination of proteins, protein complexes, and peptides in a heterogeneous sample. This method is valuable for quality assessment, as well as for the characterization of native oligomers, charge variants, and mixed-protein samples.

단백질 분리 및 특성에 대 한 다 각 산란 (MALS)를 결합 하는 이온 교환 크로마토그래피 (전류 구동)

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ratio and conformational changes of macromolecules and macromolecular complexes. A high quality SAXS dataset for structural modeling must be from monodisperse, homogeneous samples and this is often only reached by a combination of inline chromatography and immediate SAXS measurement. Most commonly, size-exclusion chromatography is used to separate samples and exclude contaminants and aggregations from the particle of interest allowing SAXS measurements to be made from a well-resolved chromatographic peak of a single protein species. Still, in some cases, even inline purification is not a guarantee of monodisperse samples, either because multiple components are too close to each other in size or changes in shape induced through binding alter perceived elution time. In these cases, it may be possible to deconvolute the SAXS data of a mixture to obtain the idealized SAXS curves of individual components. Here, we show how this is achieved and the practical analysis of SEC-SAXS data is performed on ideal and difficult samples. Specifically, we show the SEC-SAXS analysis of the vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant.

SEC-BioSAXS measurements of biological macromolecules are a standard approach for determining solution structure of macromolecules and their complexes. Here, we analyze SEC-BioSAXS data from two types of commonly encountered SEC traces&#8212;chromatograms with fully resolved and partially resolved peaks. We demonstrate the analysis and deconvolution using scatter and BioXTAS RAW.

EFA 감소 및 분산을 통한 SEC-SAXS 데이터 분석

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, chlorine, or calcium, that are often natively present in macromolecules. This enables the direct structure solution of proteins and nucleic acids via experimental phasing without the need of additional labelling. To eliminate the significant air absorption of X-rays in this wavelength regime, these experiments are performed in a vacuum environment. Beamline I23 at Diamond Light Source, UK, is the first synchrotron instrument of its kind, designed and optimized for MX experiments in the long wavelength range towards 5 &#197;. 
To make this possible, a large vacuum vessel encloses all endstation components of the sample environment. The necessity to maintain samples at cryogenic temperatures during storage and data collection in vacuum requires the use of thermally conductive sample holders. This facilitates efficient heat removal to ensure sample cooling to approximately 50 K. The current protocol describes the procedures used for sample preparation and transfer of samples into vacuum on beamline I23. Ensuring uniformity in practices and methods already established within the macromolecular crystallography community, sample cooling to liquid nitrogen temperature can be performed in any laboratory setting equipped with standard MX tools. 
Cryogenic storage and transport of samples only require standard commercially available equipment. Specialized equipment is required for the transfer of cryogenically cooled crystals from liquid nitrogen into the vacuum endstation. Bespoke sample handling tools and a dedicated Cryogenic Transfer System (CTS) have been developed in house. Diffraction data collected on samples prepared using this protocol show excellent merging statistics, indicating that the quality of samples is unaltered during the procedure. This opens unique opportunities for in-vacuum MX in a wavelength range beyond standard synchrotron beamlines.

Here, we present a protocol for cryogenic sample preparation and transfer of crystals into the vacuum endstation on beamline I23 at Diamond Light Source, for long-wavelength macromolecular X-ray crystallography experiments.

다이아몬드 광원에서 빔라인 I23의 진공 장거리 결정예 촬영을 위한 샘플 준비 및 전송 프로토콜

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Achieving Efficient Fragment Screening at XChem Facility at Diamond Light Source

In fragment-based drug discovery, hundreds or often thousands of compounds smaller than ~300 Da are tested against the protein of interest to identify chemical entities that can be developed into potent drug candidates. Since the compounds are small, interactions are weak, and the screening method must therefore be highly sensitive; moreover, structural information tends to be crucial for elaborating these hits into lead-like compounds. Therefore, protein crystallography has always been a gold-standard technique, yet historically too challenging to find widespread use as a primary screen.
Initial XChem experiments were demonstrated in 2014 and then trialed with academic and industrial collaborators to validate the process. Since then, a large research effort and significant beamtime have streamlined sample preparation, developed a fragment library with rapid follow-up possibilities, automated and improved the capability of I04-1 beamline for unattended data collection, and implemented new tools for data management, analysis and hit identification.
XChem is now a facility for large-scale crystallographic fragment screening, supporting the entire crystals-to-deposition process, and accessible to academic and industrial users worldwide. The peer-reviewed academic user program has been actively developed since 2016, to accommodate projects from as broad a scientific scope as possible, including well-validated as well as exploratory projects. Academic access is allocated through biannual calls for peer-reviewed proposals, and proprietary work is arranged by Diamond's Industrial Liaison group. This workflow has already been routinely applied to over a hundred targets from diverse therapeutic areas, and effectively identifies weak binders (1%-30% hit rate), which both serve as high-quality starting points for compound design and provide extensive structural information on binding sites. The resilience of the process was demonstrated by continued screening of SARS-CoV-2 targets during the COVID-19 pandemic, including a 3-week turn-around for the main protease.

This paper describes the complete XChem process for crystal-based fragment screening, starting from applying for access and all subsequent steps to data dissemination.

Diamond Light Source의 XChem 시설에서 효율적인 Fragment Screening 달성

In fragment-based drug discovery, hundreds or often thousands of compounds smaller than ~300 Da are tested against the protein of interest to identify ...

화학

Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments

Accurate characterization of chemical structures is important to understand their underlying biological mechanisms and functional properties. Mass spectrometry (MS) is a popular tool but is not always sufficient to completely unveil all structural features. For example, although carbohydrates are biologically relevant, their characterization is complicated by numerous levels of isomerism. Ion mobility spectrometry (IMS) is an interesting complement because it is sensitive to ion conformations and, thus, to isomerism. 
Furthermore, recent advances have significantly improved the technique: the last generation of Cyclic IMS instruments offers additional capabilities compared to linear IMS instruments, such as an increased resolving power or the possibility to perform tandem ion mobility (IMS/IMS) experiments. During IMS/IMS, an ion is selected based on its ion mobility, fragmented, and reanalyzed to obtain ion mobility information about its fragments. Recent work showed that the mobility profiles of the fragments contained in such IMS/IMS data can act as a fingerprint of a particular glycan and can be used in a molecular networking strategy to organize glycomics datasets in a structurally relevant way. 
The goal of this protocol is thus to describe how to generate IMS/IMS data, from sample preparation to the final Collision Cross Section (CCS) calibration of the ion mobility dimension that yields reproducible spectra. Taking the example of one representative glycan, this protocol will show how to build an IMS/IMS control sequence on a Cyclic IMS instrument, how to account for this control sequence to translate IMS arrival time into drift time (i.e., the effective separation time applied to the ions), and how to extract the relevant mobility information from the raw data. This protocol is designed to clearly explain the critical points of an IMS/IMS experiment and thus help new Cyclic IMS users perform straightforward and reproducible acquisitions.

Ion mobility spectrometry (IMS) is an interesting complement to mass spectrometry for the characterization of biomolecules, notably because it is sensitive to isomerism. This protocol describes a tandem IMS (IMS/IMS) experiment, which allows the isolation of a molecule and the generation of the mobility profiles of its fragments.

탠덤 이온 이동성 실험을 위한 순환 이온 이동성 분광계 사용

Accurate characterization of chemical structures is important to understand their underlying biological mechanisms and functional properties. Mass ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed method based on molecular weight cut-off (MWCO) filtration and mass spectrometric analysis was combined with an offline high-pH reverse phase HPLC pre-fractionation step.
Secretion into CSF is the main pathway for removal of molecules shed by cells of the central nervous system. Thus, many processes in the central nervous system are reflected in the CSF, rendering it a valuable diagnostic fluid. CSF has a complex composition, containing proteins that span a concentration range of 8 - 9 orders of magnitude. Besides proteins, previous studies have also demonstrated the presence of a large number of endogenous peptides. While less extensively studied than proteins, these may also hold potential interest as biomarkers.
Endogenous peptides were separated from the CSF protein content through MWCO filtration. By removing a majority of the protein content from the sample, it is possible to increase the sample volume studied and thereby also the total amount of the endogenous peptides. The complexity of the filtrated peptide mixture was addressed by including a reverse phase (RP) HPLC pre-fractionation step at alkaline pH prior to LC-MS analysis. The fractionation was combined with a simple concatenation scheme where 60 fractions were pooled into 12, analysis time consumption could thereby be reduced while still largely avoiding co-elution.
Automated peptide identification was performed by using three different peptide/protein identification software programs and subsequently combining the results. The different programs were complementary rather than comparable with less than 15% of the identifications overlapped between the three.

A method for mass spectrometric analysis of endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF) is presented. By employing molecular weight cut-off filtration, chromatographic pre-fractionation, mass spectrometric analysis and a subsequent combination of peptide identification strategies, it was possible to expand the known CSF peptidome nearly ten-fold compared to previous studies.

인간의 중추 신 경계에서 Endopeptidomic 분석을 위한 시료 준비

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

신경과학

Ion-Exchange Chromatography

Source: Laboratory of Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Ion-exchange chromatography is a type of chromatography that separates analytes based on charge. A column is used that is filled with a charged stationary phase on a solid support, called an ion-exchange resin. Strong cation-exchange chromatography preferentially separates out cations by using a negatively-charged resin while strong anion-exchange chromatography preferentially selects out anions by using a positively-charged resin. This type of chromatography is popular for sample preparation, for example in the cleanup of proteins or nucleic acid samples.
Ion-exchange chromatography is a two-step process. In the first step, the sample is loaded onto the column in a loading buffer. The binding of the charged sample to the column resin is based on ionic interactions of the resin to attract the sample of the opposite charge. Thus, charged samples of opposite polarity to the resin are strongly bound. Other molecules that are not charged or are of the opposite charge are not bound and are washed through the column. The second step is to elute the analyte that is bound to the resin. This is accomplished with a salt gradient, where the amount of salt in the buffer is slowly increased. Fractions are collected at the end of the column as the elution occurs and the purified sample of interest can be recovered in one of these fractions. Another technique, such as spectroscopy, may be needed to identify which fraction contains the sample. Ion-exchange chromatography is especially useful in protein studies, to isolate proteins of interest that have a specific charge or size, as size can determine the number of interactions with the resin.
Ion-exchange chromatography is a more general separation technique than affinity chromatography, which is also often used in preparing protein samples, where an antibody is attached to a column to bind one specific analyte. A new affinity column must be purchased for each analyte, while the same type of ion-exchange column, often with different eluting conditions, can be used to clean up many proteins of the same charge. Ion-exchange chromatography can also be used in conjunction with other types of chromatography that separate based on other properties. For example, size-exclusion chromatography separates based on size and could be used before ion-exchange chromatography to choose compounds of only a given size.

Ion-Exchange Chromatography: Principle and Protein Separation

이온 교환 크로마토그래피

Source: Laboratory of Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Ion-exchange chromatography is a type of chromatography that separates analytes based on ...

교육

JoVE Science Education

분석 화학

Size-Exclusion Chromatography with Multi-Angle Light Scattering for Protein Oligomers

Source: Some, D. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/59615">Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS).</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes SEC-MALS, which leverages the abilities of size-exclusion chromatography (SEC) and multi-angle light scattering (MALS). In SEC-MALS, the SEC separates proteins or protein complexes based on their size, and the MALS detector determines the average molecular weight by measuring the intensity of the light scattered by the molecule at different angles.

단백질 올리고머를 위한 Multi-Angle Light Scattering을 사용한 크기 배제 크로마토그래피

Source: Some, D. et al., Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS). J. Vis. Exp. ...