저자는 크리스토퍼 씨 응우 엔, 아론 헌터와 슈 리브 포트의 Jumpstart, SMART 및 Biostart 교육 프로그램의 지원뿐만 아니라, 생물 물리학, 슈 리브 포트, LA의 100 주년 대학 루이지애나의 부서를 인정하고 싶습니다.

150mm 직경 전단 반지의 1. 건설 (그림 1) 주 : 전단 링은 외측 페트리 접시 크기를 변화 상이한 총 표면적 세포 수율 장치에서 생성 및 전단력의 범위를 개발하여 다양한 크기를 생성하도록 구성 될 수있다. 이 보고서는 98cm 2 (그림 2)의 전체 면적에 대한 내부 100mm 접시와 결합 된 150mm 요리에 대해 설명합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54632/54632fig1.jpg" /> 도 1 전단 링 조립체. 도면의 상부에는 부분적으로 조립 된 전단 고리를 나타낸다. 단단한 시일이 완전 내외 식기 사이에 형성되지 않은 경우 전송 피펫과 3mm의 구멍을 염화 메틸렌 0.5 ml에 주입한다. 전단 고리 내측 주위 EDG 실리콘 고무 접착제의 두께 1㎜ 비드를 적용하여 정지 밀봉전단 링 상단의 전자. 도면의 하단 부분은 조립 전단 고리를 나타낸다. 청색 도금 내피 세포의 영역을 나타낸다. 외부 및 내부 빨간색 화살표가 궤도 쉐이커에 배치 된 전단 링 내부의 전단 링과 미디어의 궤도 운동을 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54632/54632fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54632/54632fig2.jpg" /> (안 비율로 도시)는 150mm 전단 링 그림 2. 표면 측정. 최고 패널이 궤도 회전에 응답하여 외부 링으로 유체의 원심 이동을 보여줍니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54632/54632fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol><li> 를 생성하여 전단 링 건설 템플릿 만들기150 밀리 원의 중심에 배치 된 100mm 내경 프레젠테이션 소프트웨어 150mm 외연 단면도. A4 흰색 용지에 템플릿을 인쇄합니다. </li><li> 피펫 150 밀리 유리 페트리 접시에 염화 메틸렌 (디클로로 메탄)의 10 ㎖. 염화 메틸렌 대부분 플라스틱 가용화 및 플라스틱 부품 가입 여기서 사용 된 바와 같이 접시 유리하지 폴리스티렌 (또는 다른 비닐 수지) 인 것이 중요하다. 주의 : 적절한 후드 환기 모든 건설 용 장갑을 사용하십시오. 메틸렌 클로라이드를 접촉 자극이며 간독성이다. </li><li> 외부 전단 링 템플릿 상에 150mm 플라스틱 페트리 접시를 맞 춥니 다. </li><li> 회전 공구를 사용하여 100mm 접시의 중심에서 3mm의 구멍을 뚫는다. 시추에서 생산되는 모든 플라스틱 부스러기를 제거합니다. </li><li> 장갑을 낀 손으로 잡고 있지만, 반전 약 3 초 동안 메틸렌 클로라이드 풀에 이전 단계에서 100mm 페트리 접시의 위쪽 가장자리를 찍어. </li><li> 트랜스선봉은 신중하게 표시된 템플릿 상에 100mm 접시를 정렬하는 150mm 접시의 중심 상에 100mm 접시 가장자리 다운 &quot;젖은&quot;. 메틸렌 클로라이드는 100mm와 150mm 요리 접합 플라스틱 융합된다. 조심스럽게 100mm 접시를 시계 방향으로 회전하고 몇 번 반 시계 방향으로 150 밀리미터 접시에 우수한 접착 성을 보장하기 위해. 참고 : 외부 접시의 중심에 내부 접시의 적절한 정렬을 보장하기 위해 상당한주의를 기울입니다. 편심 정렬은 전단 링에서 서로 다른 위치에서 전단 응력의 변화가 발생할 수 있습니다. 염화 메틸렌 실수로 100mm 접시의 위치 동안 150mm 페트리 접시의 바깥 쪽 트랙 부분에 물방울을 허용하지주의하십시오. 이는 유동 교란을 일으킬 수있는 표면에 요철을 만들어 세포가 성장되는 바닥면에 플라스틱을 용융한다. </li><li> 염화 메틸렌 건조되면, 이상 새로 결합 된 배양 접시를 뒤집어 신중을 보장하기 위하여 접촉 포인트를 검사꽉 도장은이 배양 접시 사이에 형성되고있다. </li><li> 단단한 시일이 완전히 형성되지 않으면, 전송 피펫과 3mm의 구멍을 염화 메틸렌 0.5 ml에 주입. 접시를 들고 부드럽게는 염화 메틸렌 가장자리에 도달 할 수 있도록 회전합니다. 주 : 너무 빨리 회전하면, 염화 메틸렌 세포가 성장할 표면 변형과 전단 파괴 링은 150mm 접시의 외측 부분으로 유출 할 수있다. 누출 전단 링은 폐기해야합니다. </li><li> 실리콘 고무 시일의 3mm의 비드를 적용하여 100mm 접시 구멍을 봉쇄. </li><li> 평평한 절삭 헤드가 장착 된 회전 공구를 사용하여, 캡 아래 튜브의 적어도 1cm 떠나는 15 ml의 폴리스티렌 원뿔형 조직 배양 튜브의 상부 3cm 부를 잘라. 밋밋은 절삭 헤드의 평탄면을 사용까지 절단 튜브의 에지 연마. 연마에 의해 생성 된 모든 플라스틱 부스러기를 제거합니다. </li><li> 상에 차단 15 ml의에게 원뿔 튜브를 추적약 0.5 cm 떨어진 접시 가장자리로부터 마커와 150mm 접시 뚜껑. 약 원의 가장자리 1~2mm을 여백을 남겨 그려진 원 안에 구멍을 드릴. </li><li> 드릴 구멍을 통해 차단 원뿔 튜브 탑을 배치합니다. 전달 피펫을 사용하여, 150mm의 뚜껑 원뿔형 튜브에 결합하는 원뿔형 튜브의 절단 모서리에 염화 메틸렌 250 μL를 적용한다. </li><li> 상단 페트리 접시의 내주 주위에 실리콘 고무 밀봉 제의 1 mm 두께의 비드를 적용하여 150mm 접시 상 150mm 뚜껑을 밀봉. </li></ol> 전단 반지의 2. 살균 <ol><li> 피펫 인산 약 10 ㎖를 15 ㎖의 원뿔형 튜브 포트를 통해 새로 형성된 전단 링에 완충 식염수. 전단 링 내부의 이물질을 제거하기 위해 주위에 소용돌이 친다. 파스퇴르 피펫 / 진공 흡입기와 인산염 완충 생리 식염수를 제거합니다. </li><li> 이물질이 제거 될 때까지 이전 단계를 반복합니다. </li><li> steri하려면리제 전단 링, UV 조사와 70 % 에탄올 세정을 조합하여 사용한다. <ol><li> 액세스 포트를 통해 배출 캡, 피펫 70 % 에탄올의 약 10 ml의 나사를 풀고, 그리고 다시 뚜껑을 조입니다. 회전 전단 링의 내부를 철저히 세척 보장, 전단 링을 여러 번 뒤집어. </li><li> 흄 후드에서 초과 70 % 에탄올을 대기음. 스프레이 병으로, 철저하게 70 % 에탄올로 모자와 액세스 포트를 스프레이. </li><li> 완전히 건조 될 때까지 조직 문화 후드 내에서 자외선 아래에서 전단 링과 캡을 놓습니다. </li></ol></li><li> 세포 배양 도금에 사용되는 때까지 건조한 후, 실온에서 다시 모자 및 저장 멸균 전단 링을 조입니다. </li></ol> 3. 전단 응력 연구 <ol><li> 형질 내피 세포주 4 분할 비 : 통상적으로 (1)를 이용한 표준 세포 배양 프로토콜 다음 멸균 전단 링 내피 세포 접시. 참고 : 쥐 망막 microvascular 내피 세포 상업적으로 수득 하였다. 인간의 두뇌 내피 세포 (hCMEC / D3) 세포는 박사 피에르 - 올리버 Couraud (INSERM, 프랑스)에서 관대 한 선물로 제공하고 완전한 내피 기초 매체 (EBM)에서 배양 하였다. </li><li> 문화가 이전의 흐름 연구의 시작에 합류에 도달 할 수 있습니다. 조직 배양 배지 30 ㎖ (10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 암포 테리 가진 둘 베코 변형 이글 배지)를 사용한다. 3 일마다 세포 배양 배지를 바꾸고 7.5 % CO 2 및 92.5 %의 실내 공기와 37 ℃에서 세포를 유지한다. </li><li> 인큐베이터에서 궤도 통을 놓습니다. 참고 : 궤도 셰이커는 일반적으로 무거운 (&gt; 10kg). 선반 응력과 진동을 최소화하기 위해 인큐베이터의 바닥 선반에 궤도 통을 놓습니다. </li><li> 궤도 통에 실험 전단 반지를 놓습니다. 같은 인큐베이터 안에 정적 대조군 전단 반지를 놓습니다. </li><li> 쉬 내에서 최대 전단 응력을 추정방정식과 귀 반지 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq1.jpg" /> 어디에 <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq2.jpg" /> 진탕 기의 회전 반경 (cm 단위)이며 <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq3.jpg" /> 매체의 점도 (포이즈 단위)이며 <img alt="식 (4)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq4.jpg" /> (g / ㎖)에서, 매체의 밀도, <img alt="식 (5)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq5.jpg" /> (24) (회전 / 초)에서의 회전 주파수이다. </li><li> 전단 응력 응용 프로그램 (예를 들어, 72 시간)의 원하는 기간 동안 통에 전단 링을 떠나, 원하는 회전 수 (예를 들어, 90 RPM)에 궤도 통에 회전 설정을 시작합니다. 참고 : 인큐베이터 온도가 37 ° C는 실험 기간 내내 유지하기 위해 초기에 모니터링해야하므로 궤도 셰이커가, 열을 생성 할 수 있습니다. 또한,이야듣고 반지는 회전 인큐베이터 내에 배치 후 환경 챔버 (예를 들어, 모듈 형 인큐베이터 실) 및로 전송할 수 있습니다. </li><li> 셀 층을 원하는 시간에 대한 전단 인큐베이터에서 전단 링을 제거에 노출 된 후. 전단 링 뚜껑을 당겨 원하는 엔드 포인트 분석 (예를 들어, 웨스턴 블로 팅, 형광 활성 세포 정렬 등) (25) 검사에 대한 세포 및 / 또는 미디어를 검색 할 수 있습니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Resnick, N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+are+complex+regulators+of+endothelial+gene+expression.">Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression.</a> FASEB J. 9 (10), 874-882 (1995).</li><li>Malek, A. M., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+endothelial+cell+gene+expression+by+flow.">Control of endothelial cell gene expression by flow.</a> J Biomech. 28 (12), 1515-1528 (1995).</li><li>Ando, J., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+Regulation+of+Gene+Expression+in+Vascular+Endothelial+Cells.">Flow-dependent Regulation of Gene Expression in Vascular Endothelial Cells.</a> Jpn Heart J. 37 (1), 19-32 (1996).</li><li>Resnick, N., Yahav, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Gene+Regulation+by+Laminar+Shear+Stress.">Endothelial Gene Regulation by Laminar Shear Stress.</a> Adv Exp Med Biol. 430, 155-164 (1997).</li><li>Gaucher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+impact+of+physiological+shear+stress+on+endothelial+cells+gene+expression+profile.">In vitro impact of physiological shear stress on endothelial cells gene expression profile.</a> Clin Hemorheol Mico. 37 (1-2), 99-107 (2007).</li><li>Fisslthaler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cis+-Element+Regulating+Transcriptional+Activity+in+Response+to+Fluid+Shear+Stress+in+Bovine+Aortic+Endothelial+Cells.">Identification of a cis -Element Regulating Transcriptional Activity in Response to Fluid Shear Stress in Bovine Aortic Endothelial Cells.</a> Endothelium-J Endoth. 10 (4-5), 267-275 (2003).</li><li>Chen, W., Bacanamwo, M., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+p300+Histone+Acetyltransferase+Activity+Is+an+Early+Endothelial+Response+to+Laminar+Shear+Stress+and+Is+Essential+for+Stimulation+of+Endothelial+Nitric-oxide+Synthase+mRNA+Transcription.">Activation of p300 Histone Acetyltransferase Activity Is an Early Endothelial Response to Laminar Shear Stress and Is Essential for Stimulation of Endothelial Nitric-oxide Synthase mRNA Transcription.</a> J Biol Chem. 283 (24), 16293-16298 (2008).</li><li>Sumpio, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+PDGF-B+in+Endothelial+Cells+Exposed+to+Cyclic+Strain.">Regulation of PDGF-B in Endothelial Cells Exposed to Cyclic Strain.</a> Arterioscl Throm Vas. 18 (3), 349-355 (1998).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplex-forming+oligonucleotide+inhibits+the+expression+of+tissue+factor+gene+in+endothelial+cells+induced+by+the+blood+flow+shear+stress+in+rats.">Triplex-forming oligonucleotide inhibits the expression of tissue factor gene in endothelial cells induced by the blood flow shear stress in rats.</a> Acta Pharm Sinic. 41 (9), 808-813 (2006).</li><li>Sumpio, B. E., Chang, R., Xu, W. -. J., Wang, X. -. J., Du, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+tPA+in+endothelial+cells+exposed+to+cyclic+strain:+role+of+CRE,+AP-2,+and+SSRE+binding+sites.">Regulation of tPA in endothelial cells exposed to cyclic strain: role of CRE, AP-2, and SSRE binding sites.</a> Am J Physiol. 273 (5 Pt 1), C1441-C1448 (1997).</li><li>Silberman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress-induced+transcriptional+regulation+via+hybrid+promoters+as+a+potential+tool+for+promoting+angiogenesis.">Shear stress-induced transcriptional regulation via hybrid promoters as a potential tool for promoting angiogenesis.</a> Nato Adv Sci Inst Se. 12 (3), 231-242 (2009).</li><li>Dschietzig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+pressure+differentially+regulates+endothelin-1,+urotensin+II,+adrenomedullin,+and+relaxin+in+pulmonary+vascular+endothelium.">Flow-induced pressure differentially regulates endothelin-1, urotensin II, adrenomedullin, and relaxin in pulmonary vascular endothelium.</a> Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 245-251 (2001).</li><li>Nagel, T., Resnick, N., Atkinson, W. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+selectively+upregulates+intercellular+adhesion+molecule-1+expression+in+cultured+human+vascular+endothelial+cells.">Shear stress selectively upregulates intercellular adhesion molecule-1 expression in cultured human vascular endothelial cells.</a> J Clin Invest. 94 (2), 885-891 (1994).</li><li>Bateman, G. A., Levi, C. R., Schofield, P., Wang, Y., Lovett, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+venous+manifestations+of+pulse+wave+encephalopathy:+windkessel+dysfunction+in+normal+aging+and+senile+dementia.">The venous manifestations of pulse wave encephalopathy: windkessel dysfunction in normal aging and senile dementia.</a> Neuroradiology. 50 (6), 491-497 (2008).</li><li>Juurlink, B. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+a+pulse+wave+encephalopathy+component+to+multiple+sclerosis.">Is there a pulse wave encephalopathy component to multiple sclerosis.</a> Curr Neurovasc Res. 12 (2), 199-209 (2015).</li><li>Topper, J. N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+and+vascular+gene+expression:+fluid+shear+stress+as+a+modulator+of+endothelial+phenotype.">Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype.</a> Mol Med Today. 5 (1), 40-46 (1999).</li><li>Tzima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanosensory+complex+that+mediates+the+endothelial+cell+response+to+fluid+shear+stress.">A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress.</a> Nature. 437 (7057), 426-431 (2005).</li><li>Li, Y. -. S. J., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells.">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> J Biomech. 38 (10), 1949-1971 (2005).</li><li>Reinhart-King, C. A., Fujiwara, K., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiologic+Stress-Mediated+Signaling+in+the+Endothelium.">Physiologic Stress-Mediated Signaling in the Endothelium.</a> Method Enzymol. 443, 25-44 (2008).</li><li>Frangos, J. A., McIntire, L. V., Eskin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+induced+stimulation+of+mammalian+cell+metabolism.">Shear stress induced stimulation of mammalian cell metabolism.</a> Biotechnol Bioeng. 32 (8), 1053-1060 (1988).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+Flow+Chamber+and+Continuous+Flow+Circuit+to+Evaluate+Endothelial+Progenitor+Cells+under+Laminar+Flow+Shear+Stress.">Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress.</a> J Vis Exp. (59), (2012).</li><li>Reinitz, A., DeStefano, J., Ye, M., Wong, A. D., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+brain+microvascular+endothelial+cells+resist+elongation+due+to+shear+stress.">Human brain microvascular endothelial cells resist elongation due to shear stress.</a> Microvasc Res. 99, 8-18 (2015).</li><li>Dewey, C. F., Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dynamic+Response+of+Vascular+Endothelial+Cells+to+Fluid+Shear+Stress.">The Dynamic Response of Vascular Endothelial Cells to Fluid Shear Stress.</a> J Biomed Eng. 103 (3), 177 (1981).</li><li>Dardik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+orbital+and+laminar+shear+stress+on+endothelial+cells.">Differential effects of orbital and laminar shear stress on endothelial cells.</a> J Vasc Surg. 41 (5), 869-880 (2005).</li><li>Honda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-induced+adhesion+to+activated+endothelium+and+to+vascular+cell+adhesion+molecule-1+in+lymphocytes+transfected+with+the+N-formyl+peptide+receptor.">Ligand-induced adhesion to activated endothelium and to vascular cell adhesion molecule-1 in lymphocytes transfected with the N-formyl peptide receptor.</a> J Immunol. 152 (8), 4026-4035 (1994).</li><li>Watt, S. M., Gschmeissner, S. E., Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PECAM-1:+its+expression+and+function+as+a+cell+adhesion+molecule+on+hemopoietic+and+endothelial+cells.">PECAM-1: its expression and function as a cell adhesion molecule on hemopoietic and endothelial cells.</a> Leukemia Lymphoma. 17 (3-4), 229-244 (1995).</li><li>Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+endothelial+cell+adhesion+molecule-1+and+mechanotransduction+in+vascular+endothelial+cells.">Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 and mechanotransduction in vascular endothelial cells.</a> J Intern Med. 259 (4), 373-380 (2006).</li><li>Dusserre, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PECAM-1+Interacts+With+Nitric+Oxide+Synthase+in+Human+Endothelial+Cells:+Implication+for+Flow-Induced+Nitric+Oxide+Synthase+Activation.">PECAM-1 Interacts With Nitric Oxide Synthase in Human Endothelial Cells: Implication for Flow-Induced Nitric Oxide Synthase Activation.</a> Arterioscl Throm Vas. 24 (10), 1796-1802 (2004).</li><li>Bagi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PECAM-1+Mediates+NO-Dependent+Dilation+of+Arterioles+to+High+Temporal+Gradients+of+Shear+Stress.">PECAM-1 Mediates NO-Dependent Dilation of Arterioles to High Temporal Gradients of Shear Stress.</a> Arterioscl Throm Vas. 25 (8), 1590-1595 (2005).</li></ol>

J. 위니 윤은 아네트 Funicello 재단에서 연구비가 있습니다. J. 스티븐 알렉산더는 신경과, LSUHSC-S의 부서에서 연구 지원을하고 있습니다.

전단 내피 세포를 노출 전단 고리 시스템의 구성은 전단 응력의 연구를 수행하는 간단한 방법이다. 그럼에도 불구하고, 우수한 전단 반지와 더 나은 결과를 얻기위한 중요한 몇 가지 단계가 있습니다. 완전 밀봉 된 샘플간에 일치 전단 응력을 생성 할 수있는 미디어 누출을 방지하기 위해 내부 및 외륜 사이에 만들어 져야한다. 완벽한 밀봉이 수행되지 않은 경우, 메틸렌 클로라이드의 최소량은 내부 링의 구멍을 통하여 전달 피펫으로 내부와 외부 사이의 접시 가장자리에 첨가되어야한다. 부드럽게 메틸렌 클로라이드 완전한 시일을 형성 할 수 있도록한다 조정기. 또한, 실수로 절단에서 생산되는 플라스틱 부스러기, 전단 링 트랙에 존재할 수 있으므로 부정적인 세포 성장에 영향을 일관성 전단 응력 애플리케이션을 줄 수있는 이물질을 제거해야합니다 건설 후 전단 링을 세척. 의 S문서에 설명 듣고 링은 샘플 당 출력의 높은 볼륨으로 이어지는, 크기가 상대적으로 크다. 그러나 작은 버전은 작은 배양 접시를 사용하여 구성 될 수있다 (예를 들면, 60mm 인서트 100mm 페트리 접시). 다른 방법에 비해 여전히 샘플 당 상대적으로 큰 유체 볼륨과 표면 영역을 유지하면서 연구는 복제의 건설 여러 개의 작은 전단 링은 높은 번호를 허용 할 수 있습니다. 전단 링을 사용할 때 몇 가지 문제가 지적되고있다. 먼저, 어떤 궤도 쉐이커 열 과잉 생산, 일부 배양기는 온도의 증가를 제어하지 못한다. 이것은 회전기의 적절한 선택과 더 용이 열교환 비 물 재킷 인큐베이터를 사용함으로써 피할 수있다. 특히, 옥외 환경에서 조립 다음, 전단 링을 사용할 때 배양 오염은 다른 잠재적 인 문제이다. 전단 링은 철저하게 사용하기 전에 소독해야합니다. <p클래스 = &quot;jove_content은&quot;&gt; 여기에서 우리는 유체 전단 응력에 내피 세포의 큰 숫자를 노출 할 수있는 간단한 방법을 설명했다. 단방향주기적인 전단을 제조하는 다른 방법이 가능하지만 훨씬 더 고가의 복잡하고, 표면적 실험 당 노출 된 세포의 수를 고려할 때, 시간이 많이 소요. 하나의 방법은 어려운 설정하고 상대적으로 비용이 많이 드는 할 수있는 평행 판 흐름 챔버에 연동 펌프를 연결하는 것을 포함한다. 전단 링을 구성하고 사용하기 간단하지만, 전단 응력의 적용은 덜 정확하다. 안와 흐름들을 모델링, 전부는 아니지만, 유동의 물리적 상태가 정상 혈관의 생리에서 볼 수 복잡한 유동 전류를 생성 할 수있다. 정밀 전단 링의 흐름을 제어하는 ​​무능력은 극한 모델 한 전류 제한으로 간주 될 수있다. 또한, 상술 한 프로토콜에 설명 된 수학 식은 전단 링 유체 최대 전단 응력을 측정하는 도구로서 사용될 수있다.그러나, 추가 및보다 정교한 실험 및 전산 연구는 결정적으로 전단 링에서 흐름 패턴을 특성화하기 위해 필요하다. 더 전단 링 알 흐름 패턴 및 유체 전단 응력의 특성으로서, 하나는 더 실험 변수 (전단 링의 최적의 크기, 오비탈 쉐이커의 회전, 전단 링 매체의 볼륨 등을 조절할 수 있어야 ) 원하는주기, 단방향 전단 응력을 생성합니다.

시스 - 조절 요소 (6)의 기동, 히스톤 아세틸 트랜스퍼 라제 활성 (7) 및 전단 응력에 응답 요소 (SSRE) 5-8 - 유체 전단 응력은 내피 유전자 프로그램 1을 조절하는 것으로 나타났다. 조직 인자 (9) 및 조직 플라스 미노 겐 활성제 (TPA) (10) 식을 변조함으로써 응력의 영향을 응고 향해 내피 기여 전단. 전단 응력은 PDGF-B의 합성 및 응답 (8)을 조절함으로써 혈관 신생 (11)와 선박 개조의 제어에 영향을 미친다. 내피는 엔도 텔린-1, 유로 텐신 II 및 relaxin도 전단 (12)에 의해 혈관 활성 매개체의 adrenomedullin 규제 유도. 내피 산화 질소 합성 효소의 생산 및 산화 질소 생산의 전사는 모두 전단 의존 10이다. 전단은 내피 세포의 ICAM-1의 발현 (13)를 제어한다. 따라서 powerfu 수 있습니다 흐름에 의한 전단 응력에서야 베드로 내피 응답의 큰 다양성에 영향을 미친다. 중요한 혈관 맥동 이제도 14 혈관성 치매 모두 정상 혈관 노화 형태의 병태 생리에서 중요한 역할을하는 나타나고 심지어 다발성 경화증 (15)와 같은 다른 신경 퇴행성 질환에 기여할 수있다. 동맥 및 정맥 내피 세포를 본질적으로 생체 내에서 다양한 혈류 흐름 패턴에 노출되며, 많은 다른 내피 세포 표현형 16을 발휘할 수있다. 크기 및 흐름의 주기성에 따라 내피 세포에 미치는 영향은 유전자 또는 단백질 발현 (17, 18)의 변화를 반영 할 수있다 염증성 세포의 활성화 및 아폽토시스를 포함 할 수있다. 내피 세포 반응에 대한 연구는 충분히 이러한 전단 패턴을 생성 체외 모델에서 생산 때문에 어려움에 의해 복잡하게 남아 현상을 전단합니다. 많은 다른 experimental 프로토콜 세포 단층 내피 유체 전단 응력을 적용하기 위해 개발되었다. (21) - 가장 일반적으로 사용되는 시스템들 중 하나는 상기 챔버 (19) 내에서 균일 한 층류를 생성하는 평행 평판 유동 챔버이다. 연동 펌프는 대개 일반적으로 생체 내의 많은 위치 22에서 발견되는 유동 특성 요점을 되풀이 할 수 주기적 유동을 생성하도록 접속된다. 또 다른 일반적인 셋업 유체의 전단 스트레스 콘 (23)의 회전 속도에 의해 결정되는 &#39;콘 플레이트&#39;모델을 사용한다. 그들과 비슷한 두 시스템 및 기타 배열은, 설정 많은 실험실에 상대적으로 비싸고 액세스 할 수 있습니다 구성 요소를 요구하는 지루한 될 수 있습니다. 이러한 전류 모델의 다른 중요한 제한은 동시에 상대적으로 낮은 표면적, 각각 행할 수 복제 연구의 상대적으로 낮은 수있다. 이것은 시간 및 공동 증가<html> 이러한 접근 방식의 mplexity. 따라서, 단방향 및주기적인 전단을 유도하는 이상적인 모델은 상대적으로 큰 표면적 연구 복제의 높은 숫자를 쉽게 설정할 수 있습니다 하나, 각각 수 있습니다. 또한, 상기 모델은 많은 사용자를 위해 엄청난 비용이 될 수있는 상당히 복잡한 설치가 필요합니다. 기본적인 실험 재료를 사용하여 유체 전단 교란을 제조 할 수있는 모델은 여러 가지 이점을 가질 수 있습니다. 단방향 주기적 전단 응력을인가하는 간단하고 매우 경제적 인 방법은 진탕 기 (24)에 원형 접시의 배치를 포함한다. 이 프로토콜은 매우 간단하며, 필요에 따라 복제 연구의 높은 수치는 비교적 큰 표면적을 각각 달성하기 위해 확장 될 수있다. 그러나, 접시의 중심에 위치한 셀은 동일한 혼합 접시에 세포 표현형 반응을 수득 주연을 따라 셀과 다른 흐름 패턴에 노출된다. _content &quot;&gt;이 현재 보고서에서 우리는 &#39;전단 링&#39;, 단방향 및주기적인 전단 응력을 만들기위한 우리의 모델의 구성 및 사용에 대해 설명합니다. 디자인을 전단 반지를 효과적으로 제한 &#39;혼합&#39;휴대 전단에 의한 표현형을 흐름을 제한하여 내륜의 배치를 통해 주위에 순환 배양 접시 내의 통로. 전단 링의 구성 및 동작이 간단하고 경제적이며 쉽게 널리 사용할 조직 배양 공급하여 오비탈 쉐이커 광범위한 수용하도록 확장 할 수있다. 이러한 모델 병태 생리적 수준에서 단방향주기적인 유동 패턴을 제공하기 위해 내피 세포 실험에 적용 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">100 x 20 mm plastic tissue culture dish</td>
			<td style="width:119px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">430167</td>
			<td style="width:195px;">The dishes must be polystyrene</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">150 x 25 mm plastic tissue culture dish</td>
			<td style="width:119px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">430599</td>
			<td>The dishes must be polystyrene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150 mm glass petri dish&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">3160150BO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15ml polystyrene tissue culture plastic tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td align="right">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Methylene chloride</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D65100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">silicone rubber sealant</td>
			<td style="width:119px;">DAP</td>
			<td align="right" style="width:119px;">7079808641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">ethanol</td>
			<td style="width:119px;">Decon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">3 mL transfer pipette</td>
			<td style="width:119px;">Becton-Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">357524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">printer paper</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">scissors</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">gloves</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">rotary tool and set</td>
			<td style="width:119px;">Dremel</td>
			<td style="width:119px;">4000-6/50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">rotary tool cutting head</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>EZ476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">rotary tool drill head</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">distilled water</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">orbital shaker</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">57018-754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">incubator</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat retinal microvascular endothelial cells</td>
			<td>Cell Biologics</td>
			<td>RA-6065</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the assembly and application of 'shear rings': a novel endothelial model for orbital, unidirectional and periodic fluid flow and shear stress

적응뿐만 아니라 내피 표현형과 유전자 발현의 병리학 적 변화를 유도하여 정상 수준 및 혈관 생리학 및 병태 생리에 혈관 유체 전단 중요한 역할을 패턴에서 편차. 특히주기적인 단방향 흐름 유도 된 전단 응력의 영향은 여러 부적응 혈관 세포 형태, 특히 혈관 내피 세포에 대한 다양한 효과를 트리거 할 수있다. 지금까지 다양한 해부학 적 기원에서 내피 세포 배양되었지만, 깊이있는 유체 전단에 자신의 응답이 전단 모델의 상대적 복잡성에 의해 방해 한 분석 (예를 들어, 평행 판 유량 용기, 콘 플레이트 흐름 모델). 이러한 모든 훌륭한 접근 방식을 나타내는 반면, 이러한 모델은 봇에 도전을 작성, 기술적으로 복잡하고 상대적으로 길고 복잡한 설정 시간, 낮은 표면 영역, 자주 밀봉 가스켓을 필요로하는 펌프 및 가압에 대한 요구 사항을 포함하여 결점불임 여러 실험을 실행하기 위해 무능력의 시간 유지. 흐름과 전단의 높은 처리량 모델은 혈관 내피 전단 반응에 큰 진전 사용할 수 있었던 경우에는, 분자 수준에서 특히주기적인 전단 연구는보다 신속하게 고급 수 있습니다. 쉽게에 단방향,주기적인 전단 응력 연구에서 실험 복제의 높은 숫자를 허용하는 비교적 큰 표면적 소설, 간단한 - 투 조립, 저렴한 조직 문화 모델 : 여기, 우리는 건설 및 사용 전단 링을 설명 내피 세포.

여기에서 우리는 전단 링에서 배양 hCMEC / D3 뇌 내피 세포와 쥐의 망막 미세 혈관 내피 세포 단일 층 모두에서 대표적인 결과를 제시한다. hCMEC / D3 뇌 내피 세포 단층이 완전한 EBM에 합류하도록 성장시킨 후, 전단 링 72 시간 동안 진탕 기 상에 두었다. 단계 3.5에서의 방정식을 사용하여, 최대 전단 응력을 계산 <img alt="식 (6)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq6.jpg" /> 이었다 매개 변수를 사용하여 약 2.8 다인 / cm 2 ( <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq2.jpg" /> = 0.95 cm, <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq3.jpg" /> = 0.0101 균형, <img alt="식 (4)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq4.jpg" /> = 0.9973 g / mL의 24 <img alt="식 (5)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq5.jpg" /> = 1.5 회전 / 초<html> ). 우리는 세포층 보통 연구 내내 전단 링 표면에 우수한 접착 성을 가지고 있기 때문에이 균일이 관찰되지 않는다 이러한 내피 세포 단층은 때때로, 주기적 플로우 (도 3)의 방향과 평행하게 배향을 나타내는 것을 발견 하였다. 시킨 후 래트 망막 미세 혈관 내피 세포의 단층은 EGF / VEGF의 성장 인자 보충 포함한 전체 쥐 내피 세포 배지에 합류하는 성장, 전단 링 72 시간 동안 진탕 기 상에 두었다. 단계 3.5에서의 방정식을 사용하여, 최대 전단 응력을 계산 <img alt="식 (6)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq6.jpg" /> 이었다 약 12 다인 / 매개 변수 cm 2 ( <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq2.jpg" /> = 0.95 cm, <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq3.jpg" /> = 0.0101 균형,세틸 / ftp_upload / 54632 / 54632eq4.jpg &quot;/&gt; = 0.9973 g / mL의 24 <img alt="식 (5)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq5.jpg" /> = 제 4 회전 /). (4) β 액틴의 하중 제어에 비해, 내피 세포 표면에서 혈소판 내피 세포 부착 분자 (PECAM-1 / CD31)의 큰 상당한 손실이 있다는 것을 보여준다. PECAM-1 면역 수용체 티로신 - 의존성 억제 모티프 또는 &#39;ITIM&#39;(26)를 포함 -superfamily 면역 글로불린 (IG)의 구성원 인 세포막 단백질이다. PECAM-1은 내피 세포에서만 발현되는 것은 아니고, 조혈 세포에서 발견된다. PECAM-1은 전단 응력의 메카-전달, 중요한 내피 세포 - 세포 부착, 백혈구 접합부의 윤회, 세포 신호 전달에 중요한 역할을합니다. 전단 응력을 감지에서 PECAM-1의 역할은 혈관 endotheli의 기능에 중요<html> 알 세포 항상성 17. 내피 단층이 전단 응력에 노출되는 경우, PECAM-1은 캐스케이드 27 시그널링 ERK1 / 2의 티로신 인산화를 변경하여 그 위에 작용되는 기계적 힘, 및 후속의 활성화에 바로 응답한다. 또한, PECAM-1- eNOS의 복잡한 연관 전단 응력 (28)에서 외란에 의하여 중단된다. 따라서, PECAM-1은 혈관 벽 (29)의 반응성을 초래할 수 팽창 유체의 전단 스트레스 힘의 변화를 감지하는 혈관 내피 세포 수있다. 이러한 데이터는 내피 세포가 다운 조절 세포 간 접촉뿐만 아니라 transvascular 전지 교환을 매개하는 중요한 접합부 접착 결정을하여주기, 단방향 유체 전단에 노출에 응답 보여주는이 모델을 지원합니다. 632fig3.jpg &quot;/&gt; 전단 링 그림 3. 뇌 내피 세포 형태. 정기적 인 유체 전단 또는 정적 노출 48 시간 다음 전단 반지 hCMEC / D3endothelial 세포 단일 층의 외관. 문화의 정렬은 항상. (화살표로 표시) 방향 흐름에 평행하게 관찰되지 않는 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54632/54632fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54632/54632fig4.jpg" /> 주기적인 전단에 그림 4. 세포 반응. 쥐 망막 미세 혈관 내피 세포 단층 전단 링에서 배양 PECAM1 / CD31 상대의 감소가-β 액틴에 보였다주기 유체 시어 72 시간 다음 (N = 3 각, 학생들이 짝 t 테스트를, * -p &lt;0.05, 오차 막대는 표준 편차 참조)전단 반지의 연구.

Watch this Scientific Journal Video about The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress at JoVE.com

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

총회와 &#39;전단 반지&#39;의 응용 프로그램 : 궤도, 단방향 및 정기 유체 흐름 및 전단 응력에 대한 소설 내피 모델

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

the-assembly-application-shear-rings-novel-endothelial-model-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.0K 조회수.  Louisiana State University Health Sciences Center in Shreveport. Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

비디오: The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to elaborate distinct aspects of motor function and to determine even subtle loss of movement capacity. To enhance efficacy and resolution of testing, tests should permit qualitative and quantitative measures of motor function and be sensitive to changes in performance during recovery periods. The present study describes a new task to assess skilled walking in the rat to measure both forelimb and hindlimb function at the same time. Animals are required to walk along a horizontal ladder on which the spacing of the rungs is variable and is periodically changed. Changes in rung spacing prevent animals from learning the absolute and relative location of the rungs and so minimize the ability of the animals to compensate for impairments through learning. In addition, changing the spacing between the rungs allows the test to be used repeatedly in long-term studies. Methods are described for both quantitative and qualitative description of both fore- and hindlimb performance, including limb placing, stepping, co-ordination. Furthermore, use of compensatory strategies is indicated by missteps or compensatory steps in response to another limb&#x2019;s misplacement. 

The ladder rung walking task is a new test to assess skilled walking and measure both forelimb and hindlimb placing, stepping, and inter-limb co-ordination.

작업 워킹 레더 렁 : 채점 시스템과 실용적인 프로그램입니다.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

연구

생물학

Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic information including active site concentrations and intrinsic rate constants that govern macromolecular function. In case of enzymes, for example, transient or pre-steady state measurements identify and characterize individual events in the reaction pathway, whereas steady state measurements only yield overall catalytic efficiency and specificity. Individual events such as protein-protein or protein-ligand interactions and rate-limiting conformational changes often occur in the millisecond timescale, and can be measured directly by stopped-flow and chemical-quench flow methods. Given an optical signal such as fluorescence, stopped-flow serves as a powerful and accessible tool for monitoring reaction progress from substrate binding to product release and catalytic turnover1,2.
Here, we report application of stopped-flow kinetics to probe the mechanism of action of Msh2-Msh6, a eukaryotic DNA repair protein that recognizes base-pair mismatches and insertion/deletion loops in DNA and signals mismatch repair (MMR)3-5. In doing so, Msh2-Msh6 increases the accuracy of DNA replication by three orders of magnitude (error frequency decreases from ~10-6 to10-9 bases), and thus helps preserve genomic integrity. Not surprisingly, defective human Msh2-Msh6 function is associated with hereditary non-polyposis colon cancer and other sporadic cancers6-8. In order to understand the mechanism of action of this critical DNA metabolic protein, we are probing the dynamics of Msh2-Msh6 interaction with mismatched DNA as well as the ATPase activity that fuels its actions in MMR. DNA binding is measured by rapidly mixing Msh2-Msh6 with DNA containing a 2-aminopurine (2-Ap) fluorophore adjacent to a G:T mismatch and monitoring the resulting increase in 2-aminopurine fluorescence in real time. DNA dissociation is measured by mixing pre-formed Msh2-Msh6 G:T(2-Ap) mismatch complex with unlabeled trap DNA and monitoring decrease in fluorescence over time9. Pre-steady state ATPase kinetics are measured by the change in fluorescence of 7-diethylamino-3-((((2-maleimidyl)ethyl)amino)carbonyl) coumarin)-labeled Phosphate Binding Protein (MDCC-PBP) on binding phosphate (Pi) released by Msh2-Msh6 following ATP hydrolysis9,10.
The data reveal rapid binding of Msh2-Msh6 to a G:T mismatch and formation of a long-lived Msh2-Msh6 G:T complex, which in turn results in suppression of ATP hydrolysis and stabilization of the protein in an ATP-bound form. The reaction kinetics provide clear support for the hypothesis that ATP-bound Msh2-Msh6 signals DNA repair on binding a mismatched base pair in the double helix.
F. Noah Biro and Jie Zhai contributed to this paper equally.

Msh2-Msh6 is responsible for initiating repair of replication errors in DNA. Here we present a transient kinetics approach towards understanding how this critical protein works. The report illustrates stopped-flow experiments for measuring the coupled DNA binding and ATPase kinetics underlying Msh2-Msh6 mechanism of action in DNA repair.

DNA 복구 단백질의 행동의 메커니즘을 조사하기 위해 중지 흐름 속도론 방법의 응용

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

The quantity and quality of detritus entering the soil determines the rate of decomposition by microbial communities as well as recycle rates of nitrogen (N) and carbon (C) sequestration1,2. Plant litter comprises the majority of detritus3, and so it is assumed that decomposition is only marginally influenced by biomass inputs from animals such as herbivores and carnivores4,5. However, carnivores may influence microbial decomposition of plant litter via a chain of interactions in which predation risk alters the physiology of their herbivore prey that in turn alters soil microbial functioning when the herbivore carcasses are decomposed6. A physiological stress response by herbivores to the risk of predation can change the C:N elemental composition of herbivore biomass7,8,9 because stress from predation risk increases herbivore basal energy demands that in nutrient-limited systems forces herbivores to shift their consumption from N-rich resources to support growth and reproduction to C-rich carbohydrate resources to support heightened metabolism6. Herbivores have limited ability to store excess nutrients, so stressed herbivores excrete N as they increase carbohydrate-C consumption7. Ultimately, prey stressed by predation risk increase their body C:N ratio7,10, making them poorer quality resources for the soil microbial pool likely due to lower availability of labile N for microbial enzyme production6. Thus, decomposition of carcasses of stressed herbivores has a priming effect on the functioning of microbial communities that decreases subsequent ability to of microbes to decompose plant litter6,10,11.
We present the methodology to evaluate linkages between predation risk and litter decomposition by soil microbes. We describe how to: induce stress in herbivores from predation risk; measure those stress responses, and measure the consequences on microbial decomposition. We use insights from a model grassland ecosystem comprising the hunting spider predator (Pisuarina mira), a dominant grasshopper herbivore (Melanoplus femurrubrum),and a variety of grass and forb plants9.

We present methods to evaluate how predation risk can alter the chemical quality of herbivore prey by inducing dietary changes to meet demands of heightened stress, and how the decomposition of carcasses from these stressed herbivores slows subsequent plant litter decomposition by soil microbes.

Predation 위험, Herbivore 생리적 스트레스와 식물 돼지 미생물 분해를 연결

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

Introducing an Angle Adjustable Cutting Box for Analyzing Slice Shear Force in Meat

Research indicates the fibre angle of the longissimus muscle can vary, depending upon location within a steak and throughout the muscle. Instead of using the original fixed 45 &deg; or 90 &deg; cutting angle for testing shear force, a variable angle cutting box can be adjusted so the angles of the knives correspond to the fibre angle of each sample. Within 2 min after cooking to an internal temperature of 71 &deg;C on an open-hearth grill set at 210 &deg;C, a 1 cm by 5 cm core is cut from the steak, parallel to muscle fibre direction, using 2 knife blades set 1 cm apart. This warm core is then subjected to the Slice Shear Force protocol (SSF) to evaluate meat texture. The use of the variable angle cutting box and the SSF protocol provides an accurate representation of the maximal shear force, as the slice and muscle fibres are consistently parallel. Therefore, the variable angle cutting box, in conjunction with the SSF protocol, can be used as a high-throughput technique to accurately evaluate meat tenderness in different locations of the longissimus muscle and, potentially, in other muscles.

Slice shear force is a reference method for beef texture analysis. Using an angle adjustable cutting box could increase its accuracy for research purposes. The results from different locations within the longissimus muscle show a high correlation with Warner-Bratzler shear force methodology and high potential adaptability for different muscles.

고기를 슬라이스 전단력 분석을위한 각도 조절 절단 상자 소개

Research indicates the fibre angle of the longissimus muscle can vary, depending upon location within a steak and throughout the muscle. Instead of using ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

모기에 소설 Insecticidal 화학 물질의 독성을 테스트 하기 위한 프로토콜

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...