Bringhurst Meats (Berlin, NJ) is acknowledged for their genuine help in providing the swine eyeballs.

모든 프로토콜이 적용 어디에 기관 동물 관리 및 사용위원회의 정책을 준수하여 수행 하였다. 1. 준비 <ol><li> 75 %로 안정화 매체를 준비 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM), 25 % 행크스 &#39;균형 소금 솔루션 (HBSS). 사용할 때까지 -20 ° C에서 잘 나누어지는 및 저장을 섞는다. </li><li> 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비하고 고압 증기 멸균에 의해 소독. 실온에서 용액을 저장한다. 실험 (물론 당 5 ㎖) 전에 37 ° C로 PBS를 따뜻하게. </li><li> 10 %, 20 % PBS 및 30 % 수 크로즈를 준비한다. 개별적으로 살균에 대한 별도의 0.22 μm의 필터를 통해 모든 솔루션을 필터링합니다. 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다. </li><li> 90 mM의 농도로 PBS에 히스타민 스톡 용액을 제조 하였다. 0.22 μM 필터를 통해 용액을 여과에 의해 멸균. 나누어지는 및 -80 ° C에서 솔루션을 저장합니다. 여러 동결 및 해동 사이클을 피하십시오. </li><li> 실험 전에 PBS에 신선한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 확인합니다. 얼음에 놓습니다. 주의 : 흄 후드에서 PFA를 유지하고 적절한 보호 장비를 착용하십시오. </li><li> 안정화 매체 (망막 당 20 ml)에 녹여. 100 U / ml의 최종 농도로 페니실린 - 스트렙토 마이신을 추가한다. 실험 전에 인큐베이터에서 37 ° C의 매체 (망막 당 15 ㎖)의 따뜻한 부분입니다. 얼음 매체의 나머지를 남겨주세요. </li><li> 얼음에 HBSS (망막 당 10 ml)에 놓습니다. </li></ol> 2. 망막의 Organotypic 문화 <ol><li> 조직 문화 후드에 샘플을 전송합니다. 렌즈 주위를 절단하여 아이 컵을 엽니 다. 브러쉬를 사용하여 부드럽게 망막을 당겨없이 유리체 유머를 제거합니다. 조심스럽게 시신경 유두를 노출 브러시로 절단 가장자리에서 망막을 분리합니다. 광학 면도기와 신경과 망막을 해제 심한. </li><li> 페트리 접시에 망막을 전송하고 조심스럽게 차가운 HBSS를 사용하여 한 번 망막을 씻어. i에서 HBSS에서 샘플을 배치가전​​. 단계 2.1 및이 공정을 반복하여 필요한만큼의 망막 해부. </li><li> 대칭 면도칼로 절반 망막을 잘라. 부드럽게 안정화 미디어의 3 ㎖로 6 웰 플레이트에 샘플을 전송할 당 잘. 5 % CO 2를 함유하는 분위기 인큐베이터에서 37 ° C에서 30 분 동안 평형을 허용한다. </li><li> 단계 2.3에서 배양하는 동안 다음과 같은 시약을 준비 : 따뜻한 매체에서 원하는 농도 (450 μM)에 히스타민 원액을 희석. 250 NG / ㎖의 최종 농도로 배지에 (아르곤하에 저장 됨) LXA4을 녹인다. 참고 LXA4의 효과를 측정 할 때, 나머지 절반은 LXA4과 히스타민을 위해 사용되는 반면, 하나의 망막에서 절반이 히스타민 단독으로 사용된다. </li><li> 조심스럽게 안정화 매체를 기음과 각 웰 (물론 당 3 ㎖)에 준비된 매체를 추가합니다. 5 % CO 2를 함유하는 분위기 인큐베이터에서 1 시간 동안 37 ° C에서 샘플을 인큐베이션. </li><li> 린스한 번 따뜻한, 멸균 PBS에서 샘플. </li></ol> 3. 면역 염색에 대한 샘플을 준비 <ol><li> 접시에서 대기음 PBS. 4 % PFA (웰 당 3 ㎖)를 첨가하고 실온에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 빠르게 PFA를 대기음. 한 번 PBS를 사용하여 샘​​플을 씻어. 10 % 자당에 샘플 (물론 당 5 ml)에 전송하고 4 ℃에서 2 시간 4 품어. </li><li> 30 %의 자당 (물론 당 5 ㎖)에 샘플을 전송하고 4 ℃에서 하룻밤 배양한다. 작업 동결 매질을 20 % 수 크로스의 두 부분으로 상업용 냉동 매체의 일부를 혼합한다. 거품이 사라 공기까지 4 ° C 하룻밤 이상에서 그것을 둡니다. </li><li> 작업 동결 배지 샘플을 옮기고 실온에서 5 분 동안 평형을 허용한다. 사각형으로 각 망막 (5mm로 약 3mm)를 낸다. </li><li> 조심스럽게 원통형 용기 (약 1cm 반경 × 2 cm 고도) 디바이스에 포함 된 작업 동결 미디어에 샘플을 전송알루미늄 호일에서에 다루지. 망막 슬라이스와 액체 질소에서 그들을 동결 (절편에 망막의 단면을 제공하기 위해 지향) 수직 있는지 확인합니다. 사용할 때까지 -80 ° C에서 블록을 저장합니다. </li><li> 제 각각 14 μm의 두께 조각으로 그라 이오 스탯에 블록은 유리 슬라이드에 섹션을 탑재합니다. 사용할 때까지 -80 ° C에서 슬라이드를 저장합니다. </li></ol> 4. 면역 염색 <ol><li> 한 번에 5 % 자당 인산 완충액 (SPB, PBS에서 5 % 자당, 산도 7.4)와 섹션을 씻으십시오. 실온에서 1 시간 동안 (10 % 정상 염소 혈청과 0.5 % 트리톤 X-100으로 5 % SPB) 버퍼 블록의 섹션을 인큐베이션하여 비특이적 결합 부위를 차단. </li><li> 해당 차 항체 (슬라이드) 섹션을 품어 (1 희석 GFAP 또는 MAP2을, 500을 버퍼를 차단에서) 1 시간 동안. 솔루션을 대기음. 5 % SPB에 세 번 씻으십시오. 내생 IgG의 염색의 경우,이 단계를 건너 뜁니다. </li><li> 해당 SECON와 섹션을 품어1 시간 :하기 Dary 항체 (블로킹 완충액 800 Cyanine3 / FITC 접합 된 당나귀 항 - 마우스 / 항 - 토끼 IgG를는 1 희석). </li><li> 철저하게 5 % SPB 3 회 섹션을 씻으십시오. 매체 장착 DAPI를 함유 된 커버로 덮고에서 그들을 장착하여 현미경 샘플을 준비합니다. </li><li> 그룹에서 등, 드웰 시간, 레이저 강도, 게인 값과 동일한 매개 변수 아래 20X 렌즈를 통해 레이저 공 초점 현미경, 캡처 이미지를 사용. 525분의 488 나노 미터로 785분의 561 나노 미터로 (Cyanine3를 검출) 적색 채널, 447분의 408 나노 미터로 (DAPI를 검출) 및 녹색 채널 (FITC를 검출) 블루 채널의 여기 / 방출 파장을 설정 . </li></ol> 5. 이미지 분석 <ol><li> 다음 조건 (12)에 의하면 새는 혈관의 백분율을 정량화 : 카운트 부에서의면 내의 내피 세포 핵에서만 혈관 포함; 이 AG 표시되면 혈관 누설을 고려용기를 둘러싼 면역 염색의 radient. </li><li> 발현 수준을 결정하기 위해, 관심 영역을 선택하고, 화상 해석 소프트웨어를 사용하여 회색의 평균 값을 측정한다. </li><li> 프로세스의 폭을 측정하기 위해 처리 (예를 들어, 외부 핵 층 ONL) 구별되는 구역의 영역을 선택한다. 다음과 같은 프로세스가 볼과 연속 광학 필드를 선택합니다. , 미세한 설정에 따라 눈금 막대를 설정하는 과정에서 선을 그리고 측정을 수행합니다. </li><li> 프로세스의 연속성을 분석하기 위해, 관심의 선택 영역, 그 주변의 분산과, 각 화소를 대체함으로써 이미지의 에지를 강화 분산이라는 필터를 적용한 자동 콘트라스트 및 밝기를 조정 라인 카운트에 의해 카운트를 정규화 지역. </li><li> 두 꼬리 학생의 t의 -test를 사용하여 통계적 유의성을 계산합니다. * P &lt;0.05; **, P &lt;0.01; ***, P &lt;0.001. 피많은 수단으로 결과를 ± SEM. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In this report, we present a powerful ex vivo acute retinal model of BRB dysfunction using the swine retina. This model system does not require special instruments and can be easily adapted under most laboratory settings. However, to obtain a successful result, several steps require close attention. After obtaining the eyeballs from the source, they must be kept at 4 &#176;C or on ice and processed as soon as possible. When the effect of a treatment is being analyzed, two halves of the same retina must be used - one half to detect changes solely due to experimental procedures (baseline) and the other to detect the effect of the treatment. This approach also allows corrections for animal variations such as age, sex and health. 
This protocol can be successfully applied to retina from various species, such as M. musculus and B. Taurus (data not shown). Using commercial swine eyeballs is a significant cost-saving factor compared to maintaining the animals. Furthermore, in this study, the incubation time with histamine is only 60 minutes. This short incubation time provides the advantage of teasing out the early responses. It is noted that the study was carried out over different durations (20 min to 120 min) and different histamine concentrations (up to 700 &#956;M). Effects are observable at 30 min and at 225 &#956;M histamine. For illustrative purposes, the result obtained at 60 min with 450 &#956;M histamine is presented. In its present form, the following are the limitations of the model: (1) use of commercially obtained eyeballs increases the variability (but significantly cuts down on the cost); (2) the short incubation time may not allow complete manifestation of the response to the treatment - for example, those that require de novo protein synthesis. Modifications may help including longer incubation periods that could enable monitoring delayed responses.
LXA4 is chosen as the drug to investigate possible protection against the histamine-induced BRB damage. LXA4 is an endogenous compound that plays a key role in inflammatory events. It is produced in response to stress in vivo and has a short half life23. To mimic these conditions, a single addition of LXA4 was carried out along with histamine. This model system could also be used to further investigate if a prior treatment with LXA4 (or any other drug) would yield protection as well as to evaluate the duration of the protective treatment.
To the best of our knowledge, this is the first report of a retinal culture system with an experimentally-induced BRB breach. Evidently, exogenous perturbations other than histamine, such as lipopolysaccharides (LPS)24 and vascular endothelial growth factor (VEGF)25, can also be utilized to induce BRB breach. The effects of those perturbations and their potential treatments can be investigated on different cell types such as endothelial, M&#252;ller glial and neuronal cells in the presented model. Analyses may be performed on the entire retina or on one or more specific layers. Available cell-specific markers for retinal cells and synaptic layers allow an efficient detection of the responses via a large combination of parameters. Thus, we have established a retinal culture system for the rapid screening of products that protect against BRB dysfunction.

증거의 성장 몸은 혈액 망막 장벽 (BRB) 1-5과 혈액 뇌 장벽 (BBB) ​​6,7과의 유사성의 존재를 지원합니다. BBB를의 타협은 단단히 이러한 정신 착란 (10)로 인과 적 또는 알츠하이머 병 (AD)과 같은 만성 신경 퇴행성 질환에 대한 진단 마커로 8,9 급성 조건을 연결되어 있습니다. 잠재적 인 약물 표적에 대한 이러한 병리 및 발견에 기계적인 통찰력은 일반적으로 뇌의 제한된 액세스 및 네트워크 복잡함에 의해 방해된다. 이러한 생체 내 이미징 (11), 뇌의 Organotypic 문화 (12), 차 세포 배양 13, 14 및 공동 문화 시스템 (15)과 같은 대안이 생성되었습니다. 그러나, 이러한 모델의 대부분은 세포를 식별하는 특수 장비, 긴 실험 기간 또는 여러 개의 마커를 필요로한다. 기능적 및 구조적 및 BBB BRB 유사성뿐만 아니라 DY 간의 상관이 둘의 sfunctions는 16-19을 주장하고있다. 또한, 쉽게 액세스 잘 정의 세포 유형 및 적층 구조는 뇌 윈도우로 잘 특성화 망막 수있다. BBB를하고 BRB의 구조적 및 기능적 아이덴티티 상세히 비교 남아. 그러나, 망막 병증은 특히 BRB 파기는 또한 밀접 당뇨병 18-19 및 AD (21, 22)을 포함하는 다양한 질병의 진행과 연관되어있다. 따라서, BRB는 부전 시스템 메커니즘을 묘사 할뿐만 아니라 잠재적 인 약물 스크리닝뿐만 아니라 확립 관심사이다. 이 보고서에서, 단순 급성 망막 문화를 사용하여 프로토콜 가능 BRB 부전을 개발하고 제공됩니다. 증가 BBB 투과성 및 AD와 같은 병리학 적 변화는 히스타민, 프로 염증 중재자 (12)와 함께 배양 뇌의 Organotypic 문화에 설립되었습니다. 따라서, 표시 시스템에서, 히스타민은 APPL이었다BRB 부전을 유도하기 위해 생체 망막 문화 IED. 이러한 뮤스의 musculus과 보스 황소 같은 여러 종에서 망막은, 테스트되었습니다. 때문에 상업적 가용성 및 인체 조직에 유사에 신선한 돼지의 시선은 여기에보고 된 데이터를 제공하기 위해 사용되었다. 히스타민 및 / 또는 다른 약물과 배양 한 후 망막은 면역 글로불린 G (IgG의) 혈액의 주요 구성 요소 중 하나로서 여러 단백질 (12)에 대한 면역 염색으로 평가 처리 하였다; glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP), 아교 활성화를위한 잘 알려진 마커; 및 미세 소관 - 관련 단백질 2 (MAP2), 미세 소관의 조립에 필수적인 신경 세포 특이 적 세포 골격 단백질. 또한, 망막의 적층 구조는 그 폭과 연속성의 변화로 뮐러 세포 및 신경절 세포의 처리를 상세하게 분석 할 수있다. 따라서, 몇 가지 추가 매개 변수의 영향을 평가하기 위해 사용할BRB 위반 초기 단계에서뿐만 아니라 잠재적 인 치료의 반전 효과를 평가하는. 혈관 누출 (이어진), 아교 세포의 활성화 및 신경 세포의 손상 응답이 프로토콜에서, 약물 스크리닝의 전위 반전 효과는 세 가지 관점에서 평가된다. 몇몇 정량화 방법은 예를 들어, 발현이 면역, 프로세스 및 인핸스먼트 필터에 의해 도시 신경 프로세스 연속성 폭 측정 강도에 의해 도시 된 바와 같이, 사용된다. 더 나은 방법을 설명하기 위해 결과를 해석하는 데 도움이, 폭신 (lipoxin) A4 (LXA4), 내생 적 염증 부상에 대한 응답과 내피 기능 장애 (23)를 감쇠에서 합성 된 화합물은 데모 용으로 선택되었다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>J.T.Baker</td><td>4072-05</td><td></td></tr><tr><td>Histamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H7125-1G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Freezing Media&amp;nbsp;</td><td>Triangle Biomedical Sciences</td><td>TFM-5</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum&amp;nbsp;</td><td>Rockland</td><td>D104-00-0050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>GFAP Antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5804</td><td></td></tr><tr><td>MAP2 Antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>mounting medium containing DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Laser Confocal Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti microscope</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>1.45s</td><td></td></tr></tbody></table>

an acute retinal model for evaluating blood retinal barrier breach and potential drugs for treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

우리는 히스타민에 의해 유도 된 BRB 유출을 방지 할 수 잠재적 치료를 평가하는 저비용 시간 효율적이고 사용하기 쉬운 시스템을 제시한다. IgG의 제어 망막 (도 1a)의 용기 내에 구속되지만, 모델이 성공적으로 설정되었음을 확인 히스타민 노출 (도 1b)시 혈관 밖으로 유출. LXA4는 제시된 시스템의 BRB 위반에 대한 의약품에 대한 심사를 입증하기 위해 선택되었다. BRB 부전은 그 자체로 큰 영향 (그림 1C)가없는 LXA4 (그림 1D)로 치료에 감쇠. 환입 누출 혈관의 비율로 정량하고, 그 결과 상당한 (도 1E)이다. 다른 두 망막 세포 유형, 뮐러 아교 세포 (그림 2)와 신경절 세포 ( <str옹&gt; 그림 3), 추가로 평가됩니다. LXA4 치료 GFAP 염색 (그림 2, AD)를 통해 도시 뮐러 아교 세포 프로세스 (그림 2E)의 폭의 감소를 반전하지만 신경절 세포 (그림 3G)에서 수지상 프로세스의 연속성에 심각한 영향을주지 않습니다,로 표시 MAP2 염색 (그림 3, AE). 또한, 하나의 단백질의 발현 수준에서의 유의 한 변화가 검출되지 않은 것을 알 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54619/54619fig1.jpg" /> 그림 1 :. 혈액 망막 장벽이 히스타민 노출에 손상된 및 LXA4 치료에 의해 ​​구출된다 IgG의 면역 염색 (빨간색)을 치료했다 망막 (A)에서 제시 손상에 의한 히스타민 만 (B)와 C (만 LXA4 처리 ), 또는 둘 모두에 노출 histam오프라인 및 LXA4 (D). 제어부 (A) 및 LXA4 처리 된 (C) 군, IgG의 혈관 (이어진) 히스타민 그룹 (B)에있는 동안의 IgG는이 점선 원으로 표시된 누설 구름을 형성 이어진에서 검출 내로 제한된다. LXA4의 추가 첨가는 혈관 장애 (D)를 구출. 스케일 바, 20 μm의. (E) 시험 그룹간에 누설 이어진 도서의 정량적 측정. 통계적 유의성은 두 꼬리 학생의 t의 -test에 의해 결정된다. * P &lt;0.05; **, P &lt;0.01; ***, P &lt;0.001. 그래프에 플롯 (N = 18) ± SEM을 의미한다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54619/54619fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54619/54619fig2.jpg" /> 그림 2 : <st<html> 룽&gt; 뮐러 세포 프로세스는 히스타민에 의해 손상 및 GFAP에 대한 LXA4 치료. 면역 염색에 의해 구출되어이 치료했다 망막 (A)에서 제시 손상 유발 모두 히스타민에 LXA4 만 (C)로 처리 히스타민 만 (B) 또는 노출 및 LXA4 (D). 양성 염색 망막 전반과 이어진 주위 뮐러 세포의 프로세스로 얻어진다. 스케일 바, 20 μm의. (E) 모든 그룹에서 뮐러 세포 프로세스의 폭은되게됩니다. 약 30 개별 프로세스는 그룹별로 측정 하였다. 통계적 유의성은 두 꼬리 학생의 t의 -test에 의해 결정된다. * P &lt;0.05; **, P &lt;0.01; ***, P &lt;0.001. 그래프에 플롯 (N = 30) ± SEM을 의미한다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54619/54619fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> t &quot;FO : 유지-together.within 페이지 =&quot;1 &quot;&gt; <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54619/54619fig3.jpg" /> 그림 3 : 신경절 세포 프로세스의 연속성이 LXA4의 영향을받지 않습니다. MAP2 대해 면역 염색 (A)는 (A) 비 처리했다 망막 제시 손상 유발 LXA4 단 (C)로 처리 히스타민 단 (B) 또는 히스타민 및 LXA4 (D) 양쪽에 노출. 양성 염색 공정 및 신경절 세포의 세포체에서 얻어진다. 함께 해당 필터 향상된 화상 (F)와 MAP2 염색 (E)의 샘플 이미지가 제공된다. 연속 공정은 화살촉으로 표시됩니다. 스케일 바, 20 μm의. (G) 모든 그룹에서 연속, MAP2 양성 신경절 세포 프로세스의 밀도는되게됩니다. 통계적 유의성은 두 꼬리 학생의 t의 -test에 의해 결정된다. * P &lt;0.05; **, P &lt;0.01; ***, P &lt;0.001. 그래프에 플롯 (N = 18) ± SEM을 의미한다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54619/54619fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

낮은 - 비용, 사용하기 쉽고 강력한 시스템은 히스타민에 의해 유도 된 혈액 망막 장벽 위반을 개선 할 수 잠재적 인 치료를 평가하기 위해 설립된다. 혈관 누수, 뮐러 세포 활성화 및 신경 프로세스의 연속성 잠재적 약물 폭신 (lipoxin) A4를 갖는 손상 응답 및 역전을 평가하기 위해 이용된다.

치료를 위해 혈액 망막 장벽 위반 및 잠재적 인 마약을 평가하는 급성 망막 모델

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

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Nanyang Technological University

Research

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Medicine

7.1K 조회수.  Rowan University.  낮은 - 비용, 사용하기 쉽고 강력한 시스템은 히스타민에 의해 유도 된 혈액 망막 장벽 위반을 개선 할 수 잠재적 인 치료를 평가하기 위해 설립된다. 혈관 누수, 뮐러 세포 활성화 및 신경 프로세스의 연속성 잠재적 약물 폭신 (lipoxin) A4를 갖는 손상 응답 및 역전을 평가하기 위해 이용된다. 

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Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

망막 안료 상피 생리학과 Pathophysiology 연구를위한 실험 모델

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

연구

신경과학

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

혈액 - 뇌 장벽 장애의 쥐 모델 Neurovascular 치료학 타겟이 분명한 허용하려면

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

의학

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

도구로 아데노 관련 바이러스를 사용하여 질병 망막 장벽을 연구하는

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Xenopus의 세포 복구 전략을 조사하기 위한 망막 변성 생성

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair recently emerged as particularly appealing. A cellular source of interest for retinal repair is the M&#252;ller glial cell, which harbors stem cell potential and an extraordinary regenerative capacity in anamniotes. This potential is, however, very limited in mammals. Studying the molecular mechanisms underlying retinal regeneration in animal models with regenerative capabilities should provide insights into how to unlock the latent ability of mammalian M&#252;ller cells to regenerate the retina. This is a key step for the development of therapeutic strategies in regenerative medicine. To this aim, we developed several retinal injury paradigms in Xenopus: a mechanical retinal injury, a transgenic line allowing for nitroreductase-mediated photoreceptor conditional ablation, a retinitis pigmentosa model based on CRISPR/Cas9-mediated rhodopsin knockout, and a cytotoxic model driven by intraocular CoCl2 injections. Highlighting their advantages and disadvantages, we describe here this series of protocols that generate various degenerative conditions and allow the study of retinal regeneration in Xenopus.

저자 스포트라이트: Xenopus Frog의 망막 재생 메커니즘 탐구 

We have developed several protocols to induce retinal damage or retinal degeneration in Xenopus laevis tadpoles. These models offer the possibility of studying retinal regeneration mechanisms.

Xenopus 올챙이에서 망막 손상 모델 생성

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...

발생학

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, diabetic retinopathy, and retinal vascular occlusions. Rodent models of I/R injury are providing significant insights into mechanisms and treatment strategies for human I/R injury, especially with regard to neurodegenerative damage in the retinal neurovascular unit. Presented here is a protocol for inducing retinal I/R injury in mice through elevation of intraocular pressure (IOP). In this protocol, the ocular anterior chamber is cannulated with a needle, through which flows the drip of an elevated saline reservoir. Using this drip to raise IOP above systolic arterial blood pressure, a practitioner temporarily halts inner retinal blood flow (ischemia). When circulation is reinstated (reperfusion) by removal of the cannula, severe cellular damage ensues, resulting ultimately in retinal neurodegeneration. Recent studies demonstrate inflammation, vascular permeability, and capillary degeneration as additional elements of this model. Compared to alternative retinal I/R methodologies, such as retinal arterial ligation, retinal I/R injury by elevated IOP offers advantages in its&#160;anatomical specificity, experimental tractability, and technical accessibility, presenting itself as a valuable tool for examining neuronal pathogenesis and therapy in the retinal neurovascular unit.

This article describes a procedure for inducing retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure in mice. Retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure serves to model human pathologies characterized by compromised oxygen and nutrient delivery in the retina, enabling researchers to examine potential cellular mechanisms and treatments for human diseases of the retinal neurovascular unit.

안압 상승을 통해 망막 허혈 - 재관류 손상의 마우스 모델

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

생체 내 재현성 촉진을 위한 마우스 망막의 혈관 손상 판독

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

쥐 모델에서의 망막 병리생리학적 평가

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

내피 세포 트랜스사이토시스 분석법(Endothelial Cell Transcytosis assay)은 내부 혈액-망막 장벽 투과성을 평가하기 위한 시험관 내 모델로서 분석합니다.

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

치료를 위해 혈액 망막 장벽 위반 및 잠재적 인 마약을 평가하는 급성 망막 모델

요약

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이 비디오의 챕터

망막 안료 상피 생리학과 Pathophysiology 연구를위한 실험 모델

혈액 - 뇌 장벽 장애의 쥐 모델 Neurovascular 치료학 타겟이 분명한 허용하려면

도구로 아데노 관련 바이러스를 사용하여 질병 망막 장벽을 연구하는

Xenopus 올챙이에서 망막 손상 모델 생성

Xenopus 올챙이에서 망막 손상 모델 생성

Xenopus 올챙이에서 망막 손상 모델 생성

안압 상승을 통해 망막 허혈 - 재관류 손상의 마우스 모델

생체 내 재현성 촉진을 위한 마우스 망막의 혈관 손상 판독

쥐 모델에서의 망막 병리생리학적 평가

내피 세포 트랜스사이토시스 분석법(Endothelial Cell Transcytosis assay)은 내부 혈액-망막 장벽 투과성을 평가하기 위한 시험관 내 모델로서 분석합니다.