This work was supported by National Medical Research Council (NMRC)/Cooperative Basic Research Grant (CBRG)/0078/2014.

이 연구는 싱가포르 기관 동물 관리 및 사용위원회 (승인 된 프로토콜 없음. R15-0225)의 국립 대학에 따른다. 동물 모델 1. 수술 준비 <ol><li> 선박 삽관 <ol><li> 남성 흰쥐 마취 - 무게 (6 7 주)를 (203 ± 20) 복강을 통해 케타민 (37.5 ㎎ / ㎖) 및 자일 라진 (5 ㎎ / ㎖) 칵테일 g (IP) 주입 (2 ㎖ / kg) . 바늘을 정리해 또는 주입 후 주사기에서 제거하지 마십시오. </li><li> 동물이 마취되면 (핀칭 발가락으로 확인) 37 ℃에서의 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 배치. 조심스럽게 견갑골, 전방 경부, 복부, 중간 뒷다리 및 음낭 주머니에 머리를 면도. 조심스럽게 접착 종이 테이프를 사용하여 다리를 억제. </li><li> 미세 절제 가위와 직각 집게를 보는 동안을 사용하여 모든 수술 절차를 수행실체 현미경. 수술하는 동안 부상을 방지하기 위해 구멍 방지 트레이에있는 모든 날카로운 수술 도구를 놓습니다. </li><li> 절개를 수행하기 전에 수술 부위를 교대 요오드, 70 % 에탄올로 3 회 문질러. 30 IU / ml의 헤파린 생리 식염수 용액으로 모든 카테터를 플래시합니다. </li><li> 오른쪽 경정맥을 통해 수술 가위를 사용하여 견갑골에 1.5 cm 중간 선에 피부 절개 - 1을 만듭니다. 경정맥을 노출 무딘 절개하여 밴드를 분리하고,이를 폴리에틸렌 관 (PE-50) 5-0 실크 봉합사를 이용하여 헤파린 염수로 가득 cannulate. 추가 마취를 주입 할 때 필요한 (1/3 초기 용량의 1/2, 정맥 주사 (IV)) 수술과 실험의 과정을 통해. </li><li> 기도 명백을 유지하기 위해 기관 절개술을 수행합니다. 전방 경추 지역에 1.5 cm의 절개 - 1을 만듭니다. 대신에 카테터를 고정 2-0 실크 봉합사로 폴리에틸렌 관 (PE-205)를 이용하여 기관을 Cannulate. </li><li> 혈압 모니터대퇴 동맥에 삽관을 통해. 뒷다리의 왼쪽 내측 표면에서 1.5 cm의 절개 - 1을 만듭니다. 무딘 절개에 의한 대퇴 동맥을 분리합니다. 헤파린 염수 5-0 실크 봉합사를 이용하여 충전 된 폴리에틸렌 관 (PE-10)를 대퇴 동맥 Cannulate. </li></ol></li><li> Cremaster 근육 준비 및 흐름 시각화 <ol><li> 를 확장하기 위해 음낭 주머니의 정점을 5-0 실크 봉합사를 삽입합니다. 음낭 주머니의 복부 표면을 따라 절개를합니다. 노출 된 근육, 정기적으로 따뜻한 등장 성 용액 (pH 7.4의 37 ° C)를 적용합니다. </li><li> 신중하고 철저하게 결합 조직을 둘러싸고있는 면봉을 사용하여 제거합니다. </li><li> cremaster 근육의 꼭대기를 통해 5-0 실크 봉합사를 삽입합니다. 같은 길이의 두 조각으로 봉합사를 잘라 양쪽에 매듭을 묶어. 두 매듭 사이의 근육을 잘라 조심스럽게 봉합을 잡아 당겨 사용자 정의 투명한 플렉시 글라스 플랫폼에 그것을 스트레칭. 고치다블루 압정와 플랫폼 상에 봉합사의 끝. 참고 : 결합 조직을 주변의 철저한 제거는 최적의 이미지 대비를 얻는데 매우 중요하다. </li><li> 5 ~ 6 고착이 이루어 될 때까지 단계를 반복 1.2.3. 조심스럽게 고온 소작을 사용하여 부고환에서 cremaster 근육을 제거합니다. 조직의 탈수를 방지하기 위해 노출 된 근육에 따뜻한 등장 솔루션을 Superfuse. <ol><li> 거즈의 접힌 부분과 cremaster 근육을 둘러싸고 있습니다. 비닐 막을 노광 근육 커버. 영화와 함께 거즈 조각 물 침수 현미경 목표 (그림 1A) 따뜻한 등장 솔루션을 보유 얕은 분지를 형성한다. </li></ol></li><li> 생체 내에 현미경 (그림 1C)의 동물 무대에 동물을 전송합니다. 지속적인 압력 모니터링 (그림 1E)에 대한 생리 학적 데이터 수집 시스템에 동맥 삽관을 연결합니다. </li><li> 근육 temperat 유지동물 플랫폼 (그림 1B) 아래에 부착 된 발열체와 35 ° C에서 URE. 발열체 (도 1D)의 전력 제어기에 네거티브 피드백을 제공하도록 근육 옆에 온도 센서를 배치했다. </li><li> 15 분은 환경과 평형을 무대에 동물을 둡니다. </li><li> 40 배의 물 액침 대물 긴 작동 응축기와 생체 내에 현미경 혈류 시각화. </li><li> 분지 세동맥 적혈구 코어 사이에 명확한 이미지 초점 및 콘트라스트에 기초하여 (&lt;60 μm의)을 선택 CFL 및 용기 벽이 순서 혈관의 직경 평면 현미경을 집중한다. 수직으로 혈관 벽을 정렬하기 위해 현미경에 장착 카메라를 돌립니다. </li><li> 1 초 동안 3000 / 초의 프레임 레이트로 고속 비디오 카메라를 사용하여 혈액의 흐름을 기록한다. 이미지 품질을 보존하기 위해 비 압축 8 비트 그레이 스케일 AVI 형식으로 녹화 된 영상을 저장한다. 노트:<html> / 초 3000 프레임의 최소 기록 프레임 레이트는 CFL 측정 생리 동맥 흐름 조건 하에서 적어도 한번 RBC 당 수행 될 수 있도록 권장한다. </li><li> 적혈구와 플라즈마 사이의 대비를 향상시키기 위해 510 나노 미터 - 310에서 394 nm의 스펙트럼 대역의 파장에서 최대 전송과 푸른 필터를 사용합니다. 참고 : 현미경 광원 (100 W 할로겐 램프)에서 파란색 필터를 통과하는 빛의 스펙트럼이 잠재적 인 조직 손상을 방지하기 위해 낮은 조명 강도의 확인하십시오. </li><li> 실험의 끝에, 펜토 바르 비탈 나트륨의 과량으로 동물을 안락사. </li></ol></li></ol> 2. 이미지 분석 <ol><li> CFL 폭 측정 전처리 <ol><li> MATLAB을 열고 &#39;CFL_pre.m&#39;파일을 실행합니다. (이 다른 MATLAB 파일은 찾을 수 있습니다IP &quot;&gt; 기업 MATLAB 보관.) </li><li> 분석 할 비디오 파일을 선택하려면 &#39;파일 열기&#39;를 클릭하십시오. </li><li> 수직으로 혈관 벽을 정렬하기 위해 &#39;회전&#39;슬라이더를 조정합니다. 주 : 사용자는 &#39;격자에&#39;버튼을 선택하여 용기 정렬 어시스트 그리드 라인을 표시하고, &#39;축소&#39;슬라이더를 밀어 화상의 줌 레벨을 조정할 수있다. </li><li> 용기 정렬을 확인하는 &#39;확인 편집&#39;버튼을 클릭합니다. </li><li> 관심 (ROI)의 영역을 정의하려면 &#39;설정 ROI 작물에 대한&#39;버튼을 클릭합니다. 정렬 된 이미지가 팝업 창에 표시됩니다. 이미지에 직사각형 목표를 조정하고 두 번 투자 수익 (ROI)을 확인합니다. 이미지 자르기가 필요하지 않은 경우이 단계를 건너 뜁니다. 참고 : 전용 용기로부터의 CFL 폭을 분석 할 수있는 ROI에서 하나의 용기를 포함한다. 필요한 경우, 원래의 형태로 이미지를 복원 할 &#39;재설정 이미지&#39;버튼을 클릭합니다. </li><li> 클릭9 &#39;&#39;(BMP &#39;형식 연속 비트 맵 이미지를 8 비트 그레이 스케일)에 모든 편집 된 비디오 프레임을 추출 버튼&#39;이미지의 압축을 풉니 다. 추출 된 이미지는 선택된 비디오 파일과 동일한 이름을 가진 폴더에 있습니다. </li></ol></li><li> CFL 폭 측정 <ol><li> MATLAB을 열고 &#39;CFL_measure.m&#39;파일을 실행합니다. </li><li> 추출 된 이미지가 들어있는 폴더를 선택 &#39;폴더 선택&#39;을 클릭합니다. </li><li> 이미지가 들어있는 폴더를 클릭하고 &#39;폴더 선택&#39;을 클릭합니다. 폴더의 첫 번째 이미지 프레임을로드하고 &#39;이미지 히스토그램&#39;패널에서의 회색 강도 히스토그램과 함께 &#39;그레이 스케일 이미지&#39;패널에 표시됩니다. </li><li> 분석, 그렇지 않으면 제 1 이미지 프레임이 선택 될을 수행하는리스트 박스에서 원하는 영상 프레임을 선택한다. </li><li> 위치에 결정되는 이미지의 내부 용기 벽을 식별하는 &#39;선박 벽 찾기&#39;를 클릭 곳어두운 빛 강도 프로파일 피크 천이 두 픽셀 위에 점등한다. </li><li> &#39;소금과 후추&#39;소음을 줄이기 위해 이미지에 중간 필터를 적용하는 &#39;중간 필터&#39;를 선택합니다. </li><li> 이미지 대비를 강화하기 위해 디지털 이미지의 강도를 조절하는 &#39;자동 명암 조정&#39;을 선택합니다. </li><li> τ 위의 그레이 레벨 (CFL), 그리고 τ 아래의 그레이 레벨 (RBC 코어) 블랙 픽셀 화이트 픽셀 - 두 개의 클래스로 계조를 분할하는 자동 임계 값 (τ)을 결정 목록 상자에서 임계 알고리즘을 선택합니다. 참고 : 자동 - 임계 알고리즘 중 어느 것도 적절한 이미지 임계 값을 제공하지 않는 경우 다른 방법으로, 수동 임계 값을 사용합니다. &#39;수동&#39;라디오 버튼을 클릭하고 수동 임계 값을 정의하는 슬라이더를 조정합니다. </li><li> (해상도는 CFL 폭의 공간 변화를 측정하고 &#39;픽셀 해상도&#39;상자에 픽셀 해상도를 입력하려면이 실험 장치와 0.42 μm의 / 픽셀)이었다. </li><li> CFL 폭의 공간 변화를 얻기 위해 &#39;계산&#39;버튼을 클릭합니다. 표로 형식으로 CFL 폭 데이터를 내보내려면 &#39;내보내기 .CSV&#39;을 클릭합니다. </li><li> 프레임 속도 정보, 선박 따라 특정 분석 라인의 CFL 폭의 시간적 변화를 측정하고 &#39;시간 변화&#39;라디오 버튼을 클릭하고 입력하려면 (이 실험 장치에서 사용되는 프레임 속도를 3000 프레임 / 초였다). </li><li> 각각 &#39;프레임 시작&#39;과 &#39;마지막 프레임&#39;상자의 첫 번째 프레임과 분석을위한 이미지의 마지막 프레임을 입력합니다. </li><li> &#39;분석 선&#39;슬라이드 막대를 밀어 혈관을 따라 분석 라인의 위치를 ​​선택합니다. &#39;그레이 스케일 이미지&#39;와 &#39;바이너리 이미지&#39;에 모두 설명되어 분석 라인의 위치를 ​​확인합니다. </li><li> CFL 폭의 시간적 변화를 얻기 위해 &#39;계산&#39;을 클릭합니다. CLICK &#39;내보내기 .CSV&#39;는 표로 형식으로 CFL 폭 데이터를 내보낼 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+erythrocyte+aggregation+and+venous+network+geometry+on+red+blood+cell+axial+migration.">Effects of erythrocyte aggregation and venous network geometry on red blood cell axial migration.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (2), H939-H950 (2001).</li><li>Yamaguchi, S., Yamakawa, T., Niimi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+plasma+layer+in+cerebral+microvessels.">Cell-free plasma layer in cerebral microvessels.</a> Biorheology. 29 (2-3), 251-260 (1992).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

CFL 폭의 측정은 미세 순환의 혈류 역학의 이해에 필수적이다. 특히, CFL 폭의 측정은 장간막 6에서 수행되어, 24, 25 microcirculations 대뇌를 spinotrapezius. 생체 CFL 폭의 측정은 종래의 녹화 된 비디오 프레임의 수동 검사 추정치로 제한 하였다. 수동 측정은 시각 RBC 코어 및 용기의 벽 (15, 16)의 경계를 식별하기 전에 몇 개의 연속적인 비디오 프레임의 평균화가 필요했다. 또 다른 연구에서, 형광 염료 (FITC)가 적혈구 -labelled 및 로다 B의 isothiocynate은 (RITC) 표지 된 플라즈마는 고양이 대뇌 미세 혈관 (25)의 평균 CFL 폭을 결정하는 데 사용 하였다. 이러한 이전의 측정 방법은 매우 시간 소모적이며, CFL 위스콘신의 공간 및 시간 해상도를 제한하는 형광 표식에 대한 추가 단계가 필요DTH 측정. 대조적으로, 효과적인 이미지 분할 및 분석 고속 카메라 레코딩을 결합하여, 여기에서 입증 된 기술은 작은 RBC 및 크기보다 주문의 공간 해상도 (0.42 μm의)와 CFL의 시공간 변동의 정량을 허용 1 / 3,000 초의 시간 해상도. cremaster 근육의 적절한 수술 준비가 CFL 폭 측정의 정확성을 결정하는데 중요하다. 특히, 인접한 결합 조직의 완전한 제거는 cremaster 근육의 소동맥의 좋은 초점을 보장하기 위해 필수적이다. 또한, 측정의 공간적 해상도는 현미경과 카메라 사양에 의존한다. 높은 배율 목적은 공간 해상도를 향상시킬 수 있지만, 그것은 차례로 CFL 폭의 공간적 변화를 정량화하기 위해 수득 용기의 길이를 제한하는 시야를 감소시킨다. 따라서, microscopiC 구성은 기술의 특정 어플리케이션에 따라 변경 될 수있다. 이미지 분할은 CFL 폭 측정의 정확도에 대한 또 다른 중요한 인자이다. 개발 된 다양한 기술 중에서도, 그레이 레벨 히스토그램에 기초하여 화상 임계 값은 영상 분할 및 분석을위한 간단하고 효과적인 방법을 제공한다. 따라서, 전경 오브젝트는 자신의 계조 차이에 기초하여 상기 배경으로부터 추출된다. 이상적인 경우, 화상 히스토그램이 바이 모달되며 계곡의 바닥에서 임계 값은 간단하다. 그러나 생체 내에서 실험 이미지는 항상 같은 그레이 스케일 수준의 프로파일을 나타내지 않는다. 우리의 결과는 이미지 품질 및 콘트라스트의 이미지 분할 처리에 영향을 미칠 수있는 방법을 보여준다. 광 청색 필터의 사용은 현저하게 (도 3) 적혈구 및 세동맥의 플라즈마 사이의 콘트라스트를 개선하고, 그 때 applyin 필수적인 것으로 보인다g없이 알고리즘 (도 4)의 폭 CFL 측정 히스토그램 기반 임계. 이것은 하나의 유효 문턱 값을 식별 할 수있는 고유 한 쌍봉 화상 히스토그램을 초래한다. 그러나, 심지어 생체 이미지에서 얻어진 바이 모달 히스토그램 두 피크 (로컬 최대 값)의 매우 불균등 분산 히스토그램 다양한 밸리 (극소)가 여전히 임계 선택 (표 1에 영향을 미칠 수 있음을 유의해야한다 ). 따라서, 적절한 임계 값 알고리즘의 선택 검사 화상 품질에 기초해야하고 사용자 CFL 폭 정량화에 가장 적합 각 임계 값 알고리즘의 제한 사항을 고려한다. CFL 폭이 유동 상태에 크게 의존하는 바와 같이, 실험 과정에 걸쳐 연속 동맥압 측정이 필수적이다. 로컬 유동 조건을 결정하기 위해,혈류의 pseudoshear 레이트 혈관 (5) 내의 평균 유속을 측정함으로써 계산 될 수있다. 요약하면, 래트 cremaster 근육 및 여기서 설명 정량적 화상 분석 수술 준비를위한 프로토콜은 생체 내에서 CFL 폭의 동적 변동에 대한 정량적 정보를 얻기 위해 사용되어왔다. CFL 폭 측정의 정확성을 보장하는 주요 과제는 상기 언급 한 둘의 근육 및 이미지 세분화, 적절한 수술 준비를 포함한다. 이러한 기술은 용이 hemorheological 다양한 생리 학적 및 병리학 적 상황에서 혈역학 수차를 조사하기 위해 다른 미세 연구에 적용 할 수있다. 따라서,이 연구 결과는 미세 혈관 치료 방법 및 임상 개입의 미래 발전에 기여한다.

In vivo animal studies are instrumental to basic science for understanding human physiology and pathology. In particular, in vivo microhemodynamic studies can elucidate the potential impairment of microcirculatory functions altered by abnormal rheological conditions of blood. A number of previous microhemodynamic studies1 have used the rat cremaster muscle model for visualizing microvascular blood flow. The cremaster muscle is a thin layer of striated muscle surrounding the testes. Thus, the blood flow in the muscle can be visualized with a trans-illumination microscope by means of surgical exposure. This enables us to acquire the in vivo blood flow images without the use of any fluorescence or contrast agents. In addition, the entire blood perfusion of the muscle network can be controlled by reducing the upstream blood flow with abdominal aorta occlusion2. Owing to these advantages, the cremaster muscle model has been widely used to investigate the formation of cell-free layer (CFL) in microvessels1,3. 
The CFL width is a prominent hemodynamic parameter in microcirculation, which has been of great interest for its important roles in regulating microcirculatory functions. The CFL is formed by the shear-induced transverse inward migration of red blood cells (RBCs) towards the flow center4. Consequently, this migration leads to the depletion of RBCs near the vessel walls, eventually resulting in a cell-free plasma layer. Accordingly, the parietal CFL naturally becomes a diffusion barrier to oxygen (O2) delivery from the RBC core to the tissues, and to the scavenging of nitric oxide (NO) by the RBCs5,6. In addition, the production of NO can also be modulated by the dynamic variations of the CFL width7,8. Therefore, the roles of the CFL in both gas transport and the regulation of homeostasis in microcirculation need to be fully ascertained to better understand blood flow in microcirculation. Recent studies have focused on bridging the hemodynamics and gas transport functions of the CFL in the microcirculation9-12. Furthermore, a separate set of studies has also investigated how the pathological elevation in RBC aggregation modulates CFL formation and its effect on O2 and NO bioavailability in tissues13,14. 
The roles of the CFL become more significant in microcirculation where the relative size of the CFL width to the vessel diameter is prominent. This necessitates an effective approach of quantifying the CFL in in vivo blood flow. Particularly, image acquisition and image analysis are the two key components determining the accuracy of CFL width measurement. Successful visualization of tissue blood flow should be preceded by an appropriate surgical preparation of the animal model. Additionally, a proper image analysis technique is needed to overcome the limitations of conventional manual measurements that are mostly induced by human errors15,16. With advancements in optical instrumentation and computing power for digital image processing, it is now possible to achieve a more accurate and consistent measurement of the CFL width17-19. Nonetheless, the accuracy of these measurements, being image-based, still ultimately depends on the quality of the images.
Therefore, this study explores the factors influencing the measurement of the in vivo CFL width. We focused particularly on demonstrating the surgical preparation and digital image analysis for measurements of the CFL width in arterioles of the rat cremaster muscle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="788">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Intravital microscope</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">BX51WI</td>
			<td style="width:253px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">High speed camera</td>
			<td style="width:167px;">Photron</td>
			<td style="width:119px;">1024PCI</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Blue filter</td>
			<td style="width:167px;">HOYA</td>
			<td style="width:119px;">B390</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pressure sensor &#38;biopac system</td>
			<td style="width:167px;">Biopac system</td>
			<td style="width:119px;">TSD104A, MP100</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:167px;">Shimaden</td>
			<td style="width:119px;">SR 1</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Plasma Lyte A</td>
			<td style="width:167px;">Baxter</td>
			<td style="width:119px;">NDC:0338-0221</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Saline 0.9%</td>
			<td style="width:167px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heparin (5000 IU/ml)</td>
			<td style="width:167px;">LEO</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">PE-10 polyethylene tube</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">427400</td>
			<td>.024&#34; OD X .011&#34; ID&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">PE-50 polyethene tube</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">427411</td>
			<td>.038&#34; OD X .023&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">PE-205 polyethene tube</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">427446</td>
			<td>.082&#34; OD X .062&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">2-0 non-absorbable silk suture</td>
			<td style="width:167px;">Deknatel</td>
			<td style="width:119px;">113-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5-0 non-absorbable silk suture</td>
			<td style="width:167px;">Deknatel</td>
			<td style="width:119px;">106-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Water circulating heating pad</td>
			<td style="width:167px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Water bath</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Isotemp 205</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sterile Cotton Gauze&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-415-468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Cotton-tipped applicators</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-400-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dumont Forceps</td>
			<td style="width:167px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:119px;">INS14188</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Micro Dissecting forceps</td>
			<td style="width:167px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:119px;">INS15915</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Iris forceps 1x2 teeth</td>
			<td style="width:167px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:119px;">INS15917</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vessel cannulation forceps</td>
			<td style="width:167px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:119px;">INS500377</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Micro scissor</td>
			<td style="width:167px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:119px;">INS14177</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Iris scissor</td>
			<td style="width:167px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:119px;">INS14225</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vessel clip</td>
			<td style="width:167px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:119px;">INS14120</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Gemini cautery system</td>
			<td style="width:167px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">GEM 5917</td>
			<td>Surgical instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of the cell-free layer in arterioles of the rat cremaster muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

생체 내에서 CFL의 시각화 동물의 수술 준비에 크게 의존한다. 과도한 혈액 손실 또는 확장 수술 시간은 충격과 혈류 수차 동물 대상이된다. 가열 패드뿐만 아니라 수술 실험 기간 동안 맞춤형 플랫폼을 사용하는 조직의 유지 온도는 래트의 생리적 조건을 유지하기위한 중요하다. 현미경 시스템에서, 100 W 할로겐 램프를 사용하여 식별 할 수있는 조직 손상도 실험의 끝에서 관찰되지 않았다. 도 2a는 CFL의 RBC 코어와 내부 용기 벽 (도 2c) 사이에 관찰 될 수 래트 cremaster 근육에서 분지 세동맥을 통한 전형적인 RBC 흐름을 나타낸다. 실험 기간 동안 이들 구성 요소 사이의 적절한 콘트라스트 CFL 폭 측정의 정확성을 보장하기위한 중요하다. 이미지 분석의 초기 단계가 포함내부 용기 벽의 검출. 용기에 수직 분석 라인을 따라 광 강도 프로파일을 취득하여, 위치는 다크 행 천이 개의 화소 (도 2b) 위에 불 해당 피크에 근사한다. 적혈구 및 CFL 다른 광선 투과율을 가지고 같이 그레이 레벨의 차이는 두 개의 클래스 (이진 화상)으로 세분 될 수있다. 그러나, 화상 히스토그램의 2 개의 피크 사이의 정확한 문턱 값의 식별은 불량한 화질 및 콘트라스트 (도 3a)에 의해 제한 될 수있다. 블루 필터를 사용할 수있는 적혈구 및 CFL (그림 3B) 사이의 대비를 향상시킬 수 있습니다. 이렇게하는 RBC 코어의 경계가보다 정확하게 블루 필터를 사용하여 식별 될 수 있으며,도 4에서 또한 알 수있다. 또한, 임계 값 알고리즘 20-23의 선택도 CFL 폭의 측정에 영향을 미칠 수있다 (도4). 그것은 서로 다른 임계 값 알고리즘, 확인 된 다른 RBC 코어 경계에 이어진도 4a에 알 수있는 수 잘못된 CFL 측정에 차례 리드한다. 더도 4b에서 CFL 폭 측정의 임계 값 알고리즘의 영향을 설명하기 위해 서로 다른 임계 알고리즘을 이용하여 얻어진 CFL 폭에 대한 공간 정보는도 5에 도시되고 표 1에 요약되어있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54550/54550fig1.jpg" /> . 그림 1 :. 생체 내에 현미경 시스템 및 Cremaster 근육 준비 A :. 수술로 표면화 쥐 cremaster 근육 B하십시오 cremaster 근육을 배치하고 35 ° C의 온도에서 온도를 유지하기위한 가열 요소와 사용자 정의 플랫폼 : 기분이야와 현미경 시스템연속적인 압력 모니터링 생리 데이터 수집 시스템 :. 네거티브 피드백 온도 조절기 및 전원 공급 E :. 상기 cremaster 근육 D에서 미세 순환 흐름의 가시화 동물 단계 고속 카메라 tomized. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54550/54550fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54550/54550fig2.jpg" /> 그림 2 :.. 세동맥의 RBC 흐름의 전형적인 그레이 스케일 이미지 (혈관 직경 = 52 μm의) B : 분석 선을 따라 빛의 강도 프로파일 (패널 A의 실선) 선박 벽 위치 및 CFL 폭 (A)의 결정에 대한 이미지 처리 . C : 혈관을 따라 CFL 측정의 대표적인 결과입니다. 그만큼고체 점선 화살표는 각각 RBC 코어의 내부 용기 벽과 외주를 나타낸다. (LWB &amp; RWB는 : 왼쪽과 오른쪽 혈관 벽 경계, LCB 및 RCB는 : 왼쪽과 오른쪽 RBC 코어 경계) <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54550/54550fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54550/54550fig3.jpg" /> 그림 3 :.. 광학 블루 필터와 이미지 콘트라스트 향상 (A)없이 청색 필터 (B)로 얻은 그레이 스케일 이미지의 이미지 히스토그램 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54550/54550fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54550/54550fig4.jpg" /> Figur전자 4 :.. (: 블루 필터를 사용하지 않고, 아래 줄 (B) : 블루 필터 상위 행 (A))를 사용을 RBC 코어 폭은 다섯 가지 형 임계 값 알고리즘 RBC 코어와 그림 3에서 그레이 스케일 이미지에 중첩 혈관 벽의 경계를 사용하여 결정 오쓰의 방법, 최소 방법, 인터 모드 방법, 반복 선택 방법 (ISODATA) 및 퍼지 엔트로피 임계 값 (Shanbhag) (왼쪽에서 오른쪽으로). 고체 및 점선은 내부 용기 벽과 RBC 코어의 바깥 쪽 가장자리를 표시, 각각. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54550/54550fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54550/54550fig5.jpg" /> 그림 5 : CFL 폭의 공간 변화 왼쪽을 따라 4B 그림에 해당하는 CFL 폭 (A).우측 (B) 혈관벽 각각. (D : 혈관 직경의 거리) <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54550/54550fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/54550/54550table1.jpg" /> 표 1 : 그림 5. *의 P &lt;0.001에서 임계 값 및 CFL 폭 데이터 : 오오 츠의 방법과 유의 한 차이. † P &lt;0.001 : 왼쪽에서 유의 한 차이. 통계 분석은 양측 짝 t-테스트를 ​​사용하여 수행 하였다.

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Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

쥐 Cremaster 근육의 세동맥의 셀이없는 계층의 시각화 및 정량화

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

6.3K 조회수.  National University of Singapore. This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

비디오: Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

연구

생물학

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

골격근에서 Progenitors의 정화

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

엑기스의 Intravital 이미징을위한 마우스 Cremaster 근육 준비

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Many of estrogen's effects on vascular reactivity are mediated through interaction with estrogen receptors 1, 2, 3. Although two sub-types exist (estrogen receptor -&alpha; and &beta;),estrogen receptor-&alpha; has been identified in both the smooth muscle and in endothelial cells of pial arterial segments using fluorescent staining combined with confocal laser scanning microscopy 4. Furthermore, ER-&alpha; is located in the nuclei and in the cytoplasm of rat basilar arteries 5. The receptors are abundant and fluoresce brightly, but clear visualization of discrete groups of receptors is difficult likely due to the numbers located in many cell layers of pial vessel segments. Additionally, many reports using immunohistochemical techniques paired with confocal microscopy poorly detail the requirements critical for reproduction of experiments 6. Our purpose for this article is to describe a simple technique to optimize the staining and visualization of ER-&alpha; using cross-sectional slices of pial arterioles obtain from female rat brains. We first perfuse rats with Evans blue dye to easily identify surface pial arteries which we isolate under a dissecting microscope. Use of a cryostat to slice 8 &mu;m cross sections of the arteries allows us to obtain thin vessel sections so that different vessel planes are more clearly visualized. Cutting across the vessel rather than use of a small vessel segment has the advantage of easier viewing of the endothelial and smooth muscle layers. In addition, use of a digital immunofluorescent microscope with extended depth software produces clear images of ten to twelve different vessel planes and is less costly than use of a confocal laser scanning microscope.

Imaging of Estrogen Receptor-&#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

The goal of this article is to demonstrate a method to optimize immunofluorescent detection of estrogen receptor-&#945; (ER&#945;) in rat pial arterial slices using a digital immunofluorescent microscope.

디지털 Immunofluorescent 현미경을 사용하여 쥐 Pial Arterioles에서 에스 트로겐 수용체 - α의 영상

Many of estrogen's effects on vascular reactivity are mediated through interaction with estrogen receptors 1, 2, 3. Although two sub-types exist (estrogen ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 Cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

칼슘의 평가는 그대로 골격 근육 섬유에서 불꽃

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

고립 된 혈액 관류 쥐 폐 준비에 단일 미세 혈관 투과성의 양을

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

쥐 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 분리

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

마이 오신 중쇄 면역를 사용하여 쥐의 근육 크로스 섹션에서 근육 섬유 인구 분석을위한 신속한 자동화 프로토콜

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...