Name: laser-assisted cytoplasmic microinjection in livestock zygotes
Uploaded: 2016-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes at JoVE.com

Work related to this technique is supported by NIH/NICHD RO1 HD070044 and USDA/NIFA Hatch projects W-3171 and W-2112.

1. 마이크로 피펫 생산 <ol><li> 사출 마이크로 피펫 <ol><li> 보로 실리케이트 유리 모세관 (1.0 mm, 내경 (ID) : 외경 (OD) 0.75 mm) 배치 마이크로 피펫 풀러에서 (오른쪽과 왼쪽 모세관 홀더의 중심을)하고 잠급니다. </li><li> 그것은 긴 캐처 얇은 팁을 초래하므로 유리 모세관을 당겨 적절한 프로그램을 사용하십시오. (예 : 열 : 825; 당겨 : 30; 속도 : 120; 시간 : 200; 압력 : 500). </li><li> 조심스럽게 장치에서 뽑아 피펫을 제거하고 수평 위치에 microforge에 놓습니다. </li><li> 인출 된 피펫과 초점에 그 유리 구슬과 microforge 히터 필라멘트를 가져옵니다. 원하는 두께를 측정하고 히터 필라멘트 대상 내경 (5 μm의)에 도달 할 때까지 수평으로 피펫을 이동 접안 레티클을 사용합니다. </li><li> 약 45 %의 열을 조절하고 필라멘트에 닿을 수 있도록 부드럽게 아래로 피펫을 가지고. 잠시 히터를 활성화합니다. 이 w병 약간 필라멘트에 접착되도록 피펫을 용융 및 냉각시에, 피펫 직선 절단을 생성하는 접촉 지점에서 중단된다. 참고 : 너무 높은 온도가 피펫 벤드를 만들 것입니다 따라서 직선 절단 할 수 없습니다 너무 낮은 온도가 피펫 (그림 1A)를 용융하기에 충분하지 않을 것이기 때문에 적절한 온도를 설정하면이 단계의 핵심이다. </li><li> 히터 필라멘트에서 약 10 μm의 멀리 위치하여 피펫 팁 근처 대략 30 ° 각도를 확인합니다. 60 %의 온도를 상기 히터를 작동. 참고 :이 필라멘트를 통해 피펫을 구부 것입니다. 이 각도는 인젝터 (도 1b)에 장착 될 때 바늘의 선단이 주입 판 표면에 평행하도록 요구된다. </li><li> 그들은 매우 선명하고 깨지기 쉬운만큼주의를 미세 주입 피펫을 처리합니다. </li></ol></li><li> 개최 마이크로 피펫 <ol><li> borosilic 배치(: 1.0 mm, ID : OD 0.75 mm) 유리 모세관 먹었다 (오른쪽과 왼쪽 모세관 홀더의 중앙에) 마이크로 피펫 풀러의를하고 잠급니다. </li><li> 이 긴 경우에도 테이퍼 및 병렬 벽 얇은 팁을 초래하므로 유리 모세관을 당겨 적절한 프로그램을 사용하여 (: 열 : 예 815; 당겨 : 20; 속도를 : 140; 시간 : 175; 압력 : 200). </li><li> 조심스럽게 끌어 당기는 장치에서 뽑아 피펫을 제거하고 수평 위치에 microforge 홀더에 놓습니다. 히터 필라멘트 및 피펫에 초점을 조정합니다. </li><li> 피펫 직경을 측정하고 필라멘트를 통해 직경 180 μm의에 도달 할 때까지 피펫을 이동 접안 레티클을 사용합니다. </li><li> 지정된 크기에서, 다이아몬드 팁 펜으로 유리 모세관을 표시 한 다음 부드럽게 유리를 깰 수있는 뽑아 끝에 누릅니다. 이 직선 절단 (그림 1C)가 발생한다. </li><li> 필라멘트에 가까운 그것의 끝이 수직 위치로 피펫을 이동합니다. 온도를 설정<html> 60 %에 microforge의. </li><li> 화재 폴란드어는 40 μm의의 ID에 도달 할 때까지 표준 기술 7을 사용 피펫의 팁. 아이디 (그림 1D)를 확인하기 위해 접안 레티클을 사용합니다. </li><li> 피펫에 각도를 확인합니다. <ol><li> 약 10 μm의 거리에 필라멘트와 거리의 끝에서 5mm에서 다시 수평 위치로 피펫을 가져옵니다. 약 60 %로 온도를 설정하고 필라멘트를 통해 피펫이 구부러 히터를 활성화합니다. (30 O의) 소정의 각도에 도달 할 때까지 가열을 계속한다. 각도 시각 (그림 1E)에서 확인하십시오. 주 : 피펫은 일반적으로 사출 접시의 바닥에 대해 60 (O)의 대략적인 각도에서 마이크로 인젝터에 장착된다. 그것의 중간 평면에서 배아의 정확한 주입에 필요한 접시의 바닥에 평행하도록 피펫의 선단은 절곡되어있다. </li></ol></li></ol></li></ol>제작 &quot;&gt; 2. 미세 조작기 설치 <ol><li> microinjectors가 완전히 기름을 적재되는 시스템에 기포가 없는지합니다 (마이크로 인젝터에 기포가 주입의 미세 제어를 방지) 확인합니다. </li><li> 미세 조작기는 중앙 위치에 있는지 확인하십시오. 이는 피펫의 이동의 넓은 범위를 허용한다. </li><li> 왼쪽 micromanipulator에 홀더에 들고 피펫 오른쪽 미세 조작 홀더에 주입 피펫을 삽입합니다. </li><li> 오일이 모세관 현상에 의해 피펫에 입력하고 시스템이 마이크로 인젝터 컨트롤을 사용하여 피펫 내부 위아래로 오일을 이동하여 제대로 작동하는지 확인할 수 있습니다. 주 : 바늘의 내부에는 오일의 움직임이없는 경우, 막힘이있을 수도있다. 이 경우, 새로운 니들을 사용한다. </li><li> 보기의 현미경의 필드의 중심에 피펫을 가지고하는 미세 조작기 컨트롤을 사용합니다. 4 배의 배율을 사용하여 마이크로 피펫 팁 (올바른 각도로 페이지 있는지 확인접시의 바닥)에 arallel. 참고 : 바늘의 올바른 설치가 성공적으로 주입 및 결과의 일관성을 위해 중요하다. </li><li> 제조자의 설명서 교정 다음 레이저 시스템 교정. </li></ol> 사출 접시 3. 준비 (그림 2) <ol><li> 100mm의 페트리 접시 뚜껑의 중앙에 20 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 가온 (37 ° C) SOF-HEPES (재료 부분에 자세히 조성물)의 50 μL를 떨어 놓는다. 용액 2 μL 드롭 주입 드롭에 가까운 주입 할 - 1이 놓습니다. 배아는 RT 이하로 냉각하지 않았는지 확인합니다. 참고 :이 프로토콜에서 우리는 주사 부위를 시각화하고 나중에 추적 할 수 있도록 주입 용액에 덱스 트란 - 붉은 염료를 추가합니다. </li><li> 미네랄 오일을 약 10 ㎖을 사용하여 사출 접시 방울 커버. </li><li> 거꾸로 현미경의 무대에 주입 접시를 놓고 주사위를 가지고분사 방울로 ettes. 바늘 드롭 내부에 초점이 있는지 확인합니다. micromanipulator에 컨트롤을 사용하여 필요에 따라 자신의 높이를 조정합니다. </li><li> 사출 강하의 상측 - (20 시간 후 수정 (HPF) (17)) 30 접합자 - 마이크로 디스펜서를 사용하여 약 20로드. 사출 강하 배아의 개수가 사람을 주입 할 수있는 속도에 의해 결정되도록 상온에서 주입을 수행한다. 30 분에 주입 할 수있는 것보다 더 많은 배아를 넣지 마십시오. <ol><li> 마이크로 디스펜서에 배아를로드하려면 완전히 플런저를 우울하게하고 배아를 포함하는 용액에 끝을 담가. 터치 배아 유리 모세관의 선단 (시 하나)로 촬상 천천히 플런저 각각의 배아 모세관 체결 해제된다. 모든 배아가 선택됩니다 또는 마이크로 디스펜서의 용량이 가득 찰 때까지이 과정을 반복합니다. </li><li> ,로드 된 배아를 해제 전체 볼륨의 공동 때까지 부드럽게 플런저를 우울하게하려면배아를 ntaining하는 모세관에서 해제된다. </li></ol></li></ol> 4. 미세 주입 <ol><li> 4 배의 대물 렌즈를 사용하여 부압 (흡인)을인가하여 주입 피펫으로 주입 할 수있는 용액을로드. 3 접합자 - 2를 주입 할 수있는 충분한 솔루션을로드합니다. 그런 다음 주입 드롭으로 이동합니다. </li><li> 끝이 접합체에 가까운 얻을 수 있도록 주입 드롭 내에서 유지 피펫을 이동합니다. 수정란은 20 배 목표로 유지 피펫과 변화에 고정되는 있도록 유지 마이크로 인젝터와 부압 (흡인)을 적용합니다. </li><li> 수정란이 유지 피펫에 부착되면, 조심스럽게 분리하지 않고 주위의 배아를 이동 주입 피펫을 사용하여 품질을 확인합니다. 좋은 품질의 접합자는 두 극성 몸이 (하나만 볼 가끔 있지만)과 균일 한 세포질한다. 이상 접합자 (그림 3A)를 주입하지 마십시오. </li><li> 필요한 경우, 적절한 주입 배아 재배치위치. 좋은 위치 결정되는 ZP와 PM 사이에 약간의 공간이 때문에 PM이 레이저에 의해 손상되지 않는다는 것이다. </li><li> 주입 피펫은 부드럽게 주사 부위의 접합자를 터치하여 배아의 중간면에 위치되어 있는지 확인합니다. 그것의 중간면에없는 경우, 바늘 배아 대신 천자 회전하게하는 경향이있다. 필요에 따라 주입 피펫의 높이를 조정한다. </li><li> 레이저 (그림 3B)를 사용하여 ZP에 구멍을 만듭니다. <ol><li> 레이저의 소프트웨어 놓고 구멍 (배아가 유지 피펫에 부착되는 곳의 반대측에) 될 것이다 ZP되는 레이저 레티클 사용. 화재 버튼 레이저 제어 창 클릭을 사용. 구멍의 크기가 PM에 손상을주지 않고 통과 바늘 용 ZP에 개구를 생성하기에 충분히 큰지 확인 (예 : 0.662 msec의 펄스 폭 / 6.9 ㎛의 구멍 크기). </li></ol></li><li> 주사 바늘을 통과상기 ZP 구멍을 통해 PM과의 접촉을 만든다. 바늘이 배아 (그림 3C)에 방법의 ¾ 때까지 앞으로 피펫을 눌러 계속합니다. </li><li> 이것이 일관 주입량을 제어 할 수있는 바와 같이, 솔루션 오일 계면에서의 메 니스 커스의 위치를 ​​관찰한다. </li><li> PM과 세포질이 주사 바늘로 흡입 할 것을 발생합니다 주입 피펫에 부압 (흡인)을 적용합니다. 바늘로 세포질의 움직임이 가속 될 때까지 또는 주사 용액과 함께 혼합 세포질 함량을 알 수있는 경우에 계속. 다음은 PM (그림 3D)의 파손을 나타냅니다. </li><li> 용액 유 계면에서의 메 니스 커스가 시작점 과거 1 접합체의 직경에 상당하는 고급까지 양압 (주입)을인가하여 접합체의 세포질 내로 용액 다음 세포질 콘텐츠를 주입한다. 참고 : 우리의 조건이 파트 :변위량 주입 솔루션 (그림 3E)의 약 7 와줘. </li><li> 4 배 목표로 변경하고 주입 드롭의 하부에 주입 된 배아 / s로 이동합니다. 유지 마이크로 인젝터에 양압을 적용하여 배아를 놓습니다. 분사 / 비 - 주입 된 배아를 추적하고 효율적으로 작업 할 수 있도록 상측의 비 주입 배아 드롭의 하측에 삽입 된 것들을 유지한다. </li></ol> 5. 배아 복구 및 사출 결과 <ol><li> 미리 예열 SOF-HEPES로 새로운 접시에 약 200 ㎕를 3 방울을 확인합니다. 마이크로 디스펜서 (위의 설명 참조)를 사용하여 주입 된 배아를 수집합니다. 3 SOF-HEPES를 통해 방울을 이동하여 주입 된 배아를 씻으십시오. </li><li> 미세 주입 중에 용해 배아를 계산하고이를 폐기합니다. 첫 번째 전체 ZP을 작성, 반투명 나타납니다 보낸 용해 접합자는 그대로 하나 쉽게 구별 할 수 있으며, 일반적으로 세포질을 가지고 참고 :배아의 외부로 누출되는 콘텐츠. </li><li> 선택적으로, 형광 현미경을 이용하여 미세 주입 효율을 확인합니다. 자외선 노출이 후속 개발에 영향을 미칠 수있는 배아의 손상을 유도 할 수 있음을 유의하십시오. </li><li> 38.5 ℃에서의 미네랄 오일 아래 4 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA)으로 보충 칼륨 단면 최적화 배지 50㎕의 방울 (KSOM) 25 주입 배아 배양 기, 포화 5 % 공기 중의 CO 2, 습도. </li><li> 이일 주사 후 5 % FBS와 문화 매체를 보충합니다. </li><li> 주사 후 배반포 (BL) 요금 7 일을 확인합니다. 배반포 배아 / 그 드롭 배양 된 배아의 총 수의 총 수와 BL 속도를 계산합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+lipids+in+immature+cattle,+pig+and+sheep+oocytes+with+intact+zona+pellucida.">Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida.</a> J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li><li>Ross, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+activation+of+bovine+oocytes+using+bovine+and+murine+phospholipase+C+zeta.">Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta.</a> BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).</li><li>Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumonji+domain-containing+protein+3+regulates+histone+3+lysine+27+methylation+during+bovine+preimplantation+development.">Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).</li><li>Bogliotti, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4+Developmental+outcomes+and+effiency+of+two+CRISPR/Cas9+microinjection+methods+in+bovine+zygotes.">4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes.</a> Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).</li><li>Bakhtari, A., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DPPA3+prevents+cytosine+hydroxymethylation+of+the+maternal+pronucleus+and+is+required+for+normal+development+in+bovine+embryos.">DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos.</a> Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).</li><li>Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+process+of+polishing+borosilicate+glass+capillaries+used+for+fabrication+of+in-vitro+fertilization+(iVF)+micro-pipettes.">Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes.</a> Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).</li><li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pipette Cookbook 2015 P-97 &amp; P-1000 Micropipette Pullers. , (2015).</li><li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). , (2014).</li><li>Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of cloning. , (2002).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+reporter+gene+after+microinjection+of+mammalian+artificial+chromosomes+into+pronuclei+of+bovine+zygotes.">Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes.</a> Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

접합체의 미세 주입은 포유 동물의 배아에 솔루션을 도입하기위한 잘 정립 된 방법이다. 종 및 실험 목적에 따라 일부 변형이 기술은 광범위하게 사용될 수있다. 우리는 평활 말단 마이크로 피펫의 입구를 돕기 위해 레이저를 사용하여 세포질 마이크로 인젝션을 수행하는 방법을 보여준다. (예 : 소, 양, 돼지 등) 일부 가축 종의 접합자는 배아의 내부에 한 번 주입 피펫의 시각화를 방해, 어두운 세포질을 가지고있다. 또한, 자신의 세포막이 매우 신축성있는 달성하기 어렵다 (주로 설치류의 접합체를 주입하는 데 사용)를 경사 아군 바늘 그들의 침투하기. 이러한 한계를 극복하기 위해, 세포막 및 배아의 세포질 내부 용액의 방출이 파손되도록하여 투명대 세포질 콘텐츠의 후속 흡입 통해 평활 말단 바늘의 통과를 가능하게하는 레이저를 사용했다. 또한, injecti에 의해바늘 입구의 반대 사이트에서 NG (약 3/4 배아 내부) 우리는 PN을 대체함으로써 자신의 흡입 / 주입을 방지하는 것을 목표로하고 있습니다. 또한,이 이렇게 낮은 용해 속도의 결과로, 깨진 막 치유하기위한 접촉의 더 많은 지점을 제공합니다. 미세 조작기로 설정 좋은 가능한 Micropipette (특별히 주입 피펫)을 생산하고 적절하게하는 것은이 기술 좋은 결과를 달성하는 열쇠입니다. 주사 바늘이만큼 주입 용액이 바늘의 내부로 원활하게 이동을 위해 사용될 수있다. 때때로, 세포질 콘텐츠 또는 콘텐츠 전핵 흐름이 불균일하게 실행할 일으켜 주입을 복잡 바늘의 선단 내부에 걸리면 (이 또한 용해 속도를 증가시키고 프로세스를 지연시킨다). 이런 주사 바늘이 장착 프로토콜에 최적의 결과를 얻기 위해 필요하다. 배아 인큐베이터 벗어난 시간은 중요일관된 생존율을 얻기 위해 30 분을 초과 할 수 없습니다. 훈련과 연습을 한 후, 운영자는 일반적으로 분당 1-2 주입 된 배아의 주입 속도를 달성한다. 이 프로토콜의 성공을위한 또 다른 중요한 점은 일관 배아 당 용액의 부피의 동일한 양을 주입하는 것이다. 이것은 용이하고 정확하게 용액 오일 인터페이스 메 니스 커스의 이동을 관찰함으로써 제어된다. 이는 피펫 직경 조작 사이에 선단이 규칙적이고 일정한 직경이 일치하는 것이 중요하다. 팁에서 5 μM의 ID 피펫으로 7 - 주입 부피 10 PL은 접합체의 길이에 상응 주입함으로써 달성된다. 이상 주입은 종종 배아 용해가 발생합니다. 이 프로토콜을 이용하여, 배아의 100 % 완전히 잘못된 난황 주위 공간을 주입 (도 4) 피 세포질 내로 적절히 주입된다. (이는 신뢰성을 극대화하고, 상기 분석의 재현성이 행해지고상관없이 결과 사람 주입 용액) 만 주사 용액의 효과가 아닌 주입 불일치에 기인한다. 주입 된 접합자 중 일부는 일반적으로 인해 주입시 기계적 손상에 용균됩니다. 주입 후 생존의 일반적인 비율은 75 % (11)이다. 이 방법을 사용하여, 우리는 용해 배아 (그림 5)의 최소 비율을 얻을 수 있습니다. 또한, 포배 발달율은 분사 기술은 초기 배아 발달에 유해한 영향이없는 것을 나타내는 비 주사 (대조군) 배아 (도 6)으로 비교 하였다. 이 프로토콜의 효율은 최근 소 접합체 (5)를 주입하기위한 종래의 세포질 마이크로 인젝션 프로토콜 (레이저의 사용없이 경 사진 유리 아군 바늘을 사용하여 직접 세포질 마이크로 인젝션이 ZP 드 침투)와 비교 하였다. 결과는 용해 배아의 상당히 높은 요금과 직접 cytopl에 대한 배반포 형성의 낮은 비율을 보였다asmic 미세 주입. 우리는 레이저를 이용한 세포질 마이크로 인젝션을 사용하여이 프로토콜 우리의 실험실에서 가축 종을 주입하기위한 바람직한 일 할 때 이러한 차이가 바늘 침투 중 적은 기계적 손상에 기인 생각합니다. 여기서는 체외 수정에 의해 얻어진 소 및 양의 태아에 대한 데이터를 제공 할뿐만 아니라 유사한 결과를 획득하는 돼지 배아 (데이터 미도시) 생체 내 및 시험관 사용되는 프로토콜을 시험 하였다. 분사 된 용액에 따라,이 프로토콜은 많은 응용에 사용될 수있다. 최근에, 우리는 노크 아웃하는 특정 유전자를 체외 수정 된 소 배아에 CRISPR / Cas9 시스템을 도입하는 데 사용하고 높은 돌연변이 시퀀스 포배의 비율 발견 배아의 50 % (N = 6) biallelic 돌연변이를 가지고 있었다 , 33 %는 (N = 4) monoallelic 돌연변이가 있고, 17 %는 (N = 2) 야생형 5이었다. 이 프로토콜은 매우 안정되어 왔으며에 사용될 수있는여러 종과 수많은 응용 프로그램.

1 셀 배아의 세포질 미세 주입은 매우 강력한 기술이다. 또, 예를 들면, 유전자 기능을 연구 나 유전자 편집 동물을 생성하는 유전자가 녹아웃을 제조 배아에 어떤 솔루션을 제공에 사용될 수있다. 대부분의 농업 관련 농장 동물 접합자는 세포질이 불투명 한 어두운 만드는 매우 높은 지방산 조성. 또한 상당히 탄성 원형질막 (PM)을 갖는다. 이러한 특성은 설치류 종의 도전과 종종 부정확에 사용되는 기존의 전핵 / 세포질 주입을 사용하여 미세 주입을합니다. 이를 수행하기가 쉽습니다 또한 더 높은 생존 능력이 결과, 주입 된 배아에 덜 손상이 발생하기 때문에 세포질 마이크로 인젝션은 전핵 미세 주입을 통해 이점이있다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 농장 동물 접합체의 세포질에 솔루션을 제공하기위한 성공적인 방법을 설명하는 것입니다. 수행 할 수 있어야합니다가축 배아 고효율 세포질 마이크로 인젝션은 레이저는 평활 말단 유리 바늘이 미세 주입에 사용되는 투명대 (ZP) 다음에 구멍을 생성하는데 사용된다. 이 전략은 주입하는 동안 배아에 각인 기계적인 손상을 감소하는 것을 목표로하고있다. 그리고, 주사 바늘 내부 세포질 콘텐츠 흡인 용액 배아의 세포질 내로 전달되는 것을 보장 PM 효율적 자신감 파괴 할 수있다. 이 기술은 이미 성공적 접합체 세포질 3,4-으로 siRNA를 전달하고 클러스터 정기적 interspaced 짧은 상동 반복 (CRISPR) / CRISPR 연관된 시스템 (9) (Cas9) 시스템 (5)을 사용하여 돌연변이를 생성 소 태아에서 사용되어왔다. 또한 소 운 동봉 된 난 모세포 (6)를 주입하기 (약간의 수정과)에 적합하다. 여기서, 우리는 우리의 염료를 제공 주입 프로토콜을 설명하는 데 어떤 주입에 적용 할 수있다수정란 내로 IRED 용액 및이 기술을 사용하여 최소한의 용해가 발생 초기 배아 발달에 영향을주지 않는 것으로 나타났다.

<table><tbody><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Sutter instruments</td><td>B100-75-10</td><td>These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td>Equipped with 10X magnification lense.</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Nikon/ Narishige</td><td>NT88-V3</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>TE2000-U</td><td>Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system.</td></tr><tr><td>Laser</td><td>Research Instruments</td><td>7-47-500</td><td>Saturn 5 Active laser.</td></tr><tr><td>Microdispenser</td><td>Drummond</td><td>3-000-105</td><td>The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.</td></tr><tr><td>100 x 15 mm culture dish</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used.</td></tr><tr><td>35 mm culture dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>These dishes are used for culturing the embryos in 50 &amp;mu;l drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them.</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td>Any incubator that can be set to 38.5 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; conditions can be used.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used.</td></tr><tr><td>Control Unit HT</td><td>Minitube</td><td>12055/0400</td><td>Heating system attached to the stereomicroscope.</td></tr><tr><td>Heated Microscope Stage</td><td>Minitube</td><td>12055/0003</td><td>Heating system attached to the stereomicroscope.</td></tr><tr><td>Dextran-Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1828</td><td>A sterile 10 mg/ml solution is used to inject.</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>sigma</td><td>M8410</td><td>Keep the mineral oil at room temperature and&amp;nbsp; protected from light using foil paper.</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve Bovine</td><td>Zenit</td><td>ZEBV-100</td><td>Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-525</td><td>Use a stem-cell qualified FBS.</td></tr><tr><td>Zygotes</td><td></td><td></td><td>Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be &lt;em&gt;in-vitro&lt;/em&gt;- or &lt;em&gt;in-vivo&lt;/em&gt;-derived.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Sodium DL-lactate</td><td>Sigma</td><td>L4263</td><td>Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>D-(&amp;minus;)-Fructose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F3510</td><td>Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>BME-EAA</td><td>Sigma</td><td>B6766</td><td>Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P4562</td><td>Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-3311</td><td>Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G-1397</td><td>Final concentration: 5 &amp;mu;g/ml. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Water for embryo transfer</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td>Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>SOF-HEPES medium</td><td>Made in the lab</td><td></td><td>pH 7.3 - 7.4, 280 &amp;plusmn; 10 mOs. Filter sterilized through a 22 &amp;mu;m filter can be stored in the fridge at 4 &amp;deg;C for 1 month. Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr></tbody></table>

laser-assisted cytoplasmic microinjection in livestock zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

레이저를 이용한 세포질 미세 주입은 가축 접합체의 세포질에 솔루션을 제공하는 강력하고 신뢰할 수있는 프로토콜입니다. 3 전 및 사출뿐만 아니라 기술의 전반적인 개요 후 접합자의 일반적인 개요를 보여줍니다. 덱스 트란 레드 주입 및 주입 효율 및 정확도를 추적 사이트 있도록 주입 용액으로서 사용된다. 용액의 성공적인 전송은 염료가 균일 세포질에 분포되어있는 최근 주입 배아를 나타내는도 4에 도시되어있다. 배아의 100 %가 세포질 주입이 기술을 사용. 이 프로토콜은 소 및 양의 접합자 최소한의 용해 속도를 가지고 설명했다. 전용 15.6 ± 5 주입 배아 5.8 ± 3.9 %로 마이크로 인젝션 한 결과, 각각 소와 양에 용해시켰다 <str옹&gt; (그림 5). (그림 6) 또한, 통계적으로 유의 한 양 소에 대한 주입 그룹에 비해 컨트롤의 배반포 개발 속도의 차이 (32.8 ± 6.6 % 컨트롤, 31.4 ± 5.9 % 주입)과 양의 배아 (40.3 ± 7.8 제어가 30.3,있다 6.0 % ~ ±) 주입. 이러한 결과는 레이저를 이용한 세포질 내 주입이 정상 배반포 개발 속도에 주입 결과 중 최소한의 피해를 나타냅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54465/54465fig1.jpg" /> 그림 1 : 일반 다이어그램 지주 및 주입 피펫을 확인하는 방법을 표시합니다. AB) 주입 피펫, CE) 피펫을 들고. A)는 조심스럽게 원하는 직경 (5 μm의)에서 뽑아 피펫 필라멘트를 터치합니다. 히터 짧게 활성화 (O를 보여 주었다<html> 범위). 이 필라멘트와, 피펫은 피펫을 배치하여 약 0.5 cm 거리의 끝에서 피펫 인치 B) 확인하고 각도 직선 컷을 생성 접점에서 중단됩니다 냉각에 부착 있도록이 약간 피펫을 녹아 약 10 μm의 거리 가열기 필라멘트. 원하는 각도가 될 때까지). C 가열을 계속 표시하는 다이아몬드 팁 펜을 사용 할 때까지, 화재 - 폴란드어를 수직 위치에서 원하는 직경 (180 μm의). D)에서 유지 피펫의 팁을 유지 피펫을 잘라 원하는 내경 (40 μm의). E)가 몇 μm의 거리에 필라멘트에서 약 0.5 cm 거리의 끝에서 수평 위치로 다시 피펫을 가져 피펫에 각도를 확인 도달한다. 필라멘트를 통해 피펫이 구부러 히터를 활성화합니다. 원하는 각도가 달성 될 때까지 가열을 계속한다. 바늘을 만드는 방법에 대한 자세한 내용은 8,9,10를 참조하십시오.= &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54465/54465fig2.jpg" /> 그림 2 :.. 사출 접시의 일반 설정 피펫, 배열 방울 및 배아이 도면에 표시되는 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54465/54465fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54465/54465fig3.jpg" /> 그림 3 :. 레이저를 이용한 세포질 내 주입 프로토콜 A) 주입하기 전에 유지 피펫에 부착 된 접합체의 일반도. PB : 폴라 기관, ZP : 투명대, CYT : 세포질, PN : 전핵, PM : 플라즈마 membran즉, HP : 지주 피펫, IP는 :. B) 레이저를 이용하여 유지 피펫에 부착 된 접합체의 ZP에 구멍을 만들기 C) 배아의 반대측을 향해 분사 피펫 소개 :. 주입 피펫) 마이크로 인젝션 단계 BE . 메 니스 커스 (b) 과거의 시작점 한 접합체 직경에 도달 할 때까지)의 메 니스 커스 (a). D의 위치를 확인 주입 피펫 내부 세포질 콘텐츠를 흡입하여 세포막 브레이크. E를)이 접합체 세포질로 세포질 함량 및 용액을 다시 주입 . 거리 AB 주입 솔루션입니다. F) 주입 후 접합자의 일반 다이어그램 ~ 7 (PL)을 나타냅니다. 주입 된 용액이 균일하게 세포질에 퍼져 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54465/54465fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 4 :..와 덱스 트란 붉은 삽입 된 Zygote의 A) 주입 된 수정란 (B)의 명 시야 이미지) 주입 된 수정란의 형광 이미지의 대표 그림 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54465/54465fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54465/54465fig5.jpg" /> 그림 5 :. 데이터 (4) 소 배아에 대한 복제 나타내는 두 개의 다른 종에 Zygote의 미세 주입 후 용해 배아의 비율은 3 (103 주입 접합체의 총)는 양의 배아 (173 주입 접합체의 총)에 대한 복제합니다. 오차 막대는 SEM 대표 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54465/54465fig5large.jpg" target="_blank">보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 더 큰 버전. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54465/54465fig6.jpg" /> . 그림 6 : 소와 양의 태아 데이터의 포배 요금은 4 주입 (102) 및 (156) 제어 배아의 총 소 종에 대한 복제 및 3 주입 163, 239 제어 배아의 총과 양의 종에 대한 복제 나타냅니다. 오차 막대는 SEM을 대표하는 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54465/54465fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes at JoVE.com

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

레이저를 이용한 가축 접합체의 세포질 미세 주입을

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

laser-assisted-cytoplasmic-microinjection-in-livestock-zygotes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

8.9K 조회수.  University of California, Davis. This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

비디오: Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

애벌레 Zebrafish의 피부에 유도 GAL4 / UAS 식 시스템을 사용하여 선천성 면역과 종양 전 세포 상호 작용의 라이브 영상

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

연구

발생학

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,<em&gt; Ceratitis의 capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

유전학

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

생물학

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

생쥐에서 유전자 카세트 knock-in 및 Flox 대립 유전자를 생성하기위한 접합체 미세 주입

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

성게 접합자의 높은 처리량 Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the host chromosome and is passed on to progeny. Thus, they are ideal vectors for creation of stable cell lines, in vivo delivery of indicators, and transduction of single cell fertilized eggs to create transgenic animals. However, mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against lentiviral gene delivery. Lentiviruses are too large to penetrate the zona and are typically delivered by microinjection of viral particles into the perivitelline cavity, the space between the zona and the embryonic cells. The requirement for highly skilled technologists and specialized equipment has minimized the use of lentiviruses for gene delivery to mouse embryos. This article describes a protocol for permeabilizing the mouse fertilized eggs by perforating the zona with a laser. Laser-perforation does not result in any damage to embryos and allows lentiviruses to gain access to embryonic cells for gene delivery. Transduced embryos can develop into blastocyst in vitro, and if implanted in pseudopregnant mice, develop into transgenic pups. The laser used in this protocol is effective and easy to use. Genes delivered by lentiviruses stably incorporate into mouse embryonic cells and are germline transmittable. This is an alternative method for creation of transgenic mice that requires no micromanipulation and microinjection of fertilized eggs.

Mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against gene delivery. This article describes a protocol for perforating the zona with a laser to transduce embryonic cells with lentiviral vectors and to create transgenic mice.

마우스를 레이저를 이용한 Lentiviral 유전자 전달 수정 된 계란

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Zebrafish Microinjection Techniques

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage embryos. Using this technique, solutions containing genetic material or knockdown constructs are delivered into the blastomeres: the embryonic cells sitting atop the yolk of the newly fertilized egg. Delivery into the cytoplasm is achieved either through direct injection into the blastomere, or via natural cytoplasmic movements that occur after a solution is injected into the yolk. Successful genetic manipulations are usually followed by quantification of embryonic phenotypes in order to elucidate the genetic mechanisms of development.
This video will provide an introduction to carrying out microinjections in zebrafish embryos. The discussion begins with a review of the essential tools for the technique, including the injection apparatus and the microinjector, which controls fluid movement with pressure pulses of air. Next, important preparatory steps are demonstrated, such as the pouring of agar plates to stabilize embryos during injection and calibration of the microinjection apparatus. The injection procedure is then presented along with tips on when and where injections should be performed. Finally, applications of the microinjection technique are discussed, including gene overexpression via mRNA injection, gene silencing by delivery of antisense morpholino oligonucleotides, and the generation of transgenic zebrafish using specially engineered plasmid DNA.

Introduction to Microinjection of Early Zebrafish Embryos

제브라피시 미세 주입 기술

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage ...

교육

JoVE Science Education

기초 생물학

동물모델 II: 마우스, 제브라피쉬, 닭

Laser-Assisted Lentiviral Gene Delivery: A Technique to Permeabilize Mouse Fertilized Eggs to Facilitate Lentiviral Gene Delivery

Source: Martin, N. P., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/58327">Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs.</a> J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the laser-assisted permeation of the protective layer of zona pellucida in mouse fertilized eggs for facilitating lentiviral gene delivery. Lentivirus enables the generation of transgenic animals with a gene of interest stably integrated into their genome.

Laser-Assisted Lentiviral Gene Delivery: Lentiviral 유전자 전달을 촉진하기 위해 마우스 수정란을 투과하는 기술

Source: Martin, N. P., et al. Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs. J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the ...