Ministry of Science and Technology of Taiwan provided financial support of this research under contracts MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.

MNP을 감지하는 방법으로서 참고 :이 섹션은 금 나노 입자의 하이브리드 매개 성장에 따라 MNP를 감지하는 절차를 설명합니다. <ol><li> 프로브 DNA 농도 100 μM에서 (5&#39;-티올 GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 &#39;) 솔루션을 준비합니다. </li><li> 프로브 DNA 변성 AuNP (AuNP 프로브) 입자를 준비합니다. (21) 참고 : 여기에 사용되는 볼륨이 프로브 DNA 변성 AuNP (AuNP 프로브) 입자의 요구 사항에 따라 달라집니다. 이 실험의 수를 실시 할에 따라서 달라집니다. 우리는 일반적으로 스페어로 초과 AuNP 프로브 입자를 준비합니다. 이 단계에 사용 된 볼륨 조절하고 유연하다. <ol><li> 농도 1 OD / ㎖에서 금 나노 입자 용액 (13 내지 17 ㎚)에 (100 μM, 단계 1.1에서 준비를) 프로브 DNA를 추가합니다. </li><li> 도데 실 황산나트륨의 최종 농도를 가지고 NAC (12 H 25 SO 4, SDS) 및 인산염 완충액 (PBS) 0.01 % 및 0.01 M, respectivel 행와이. </li><li> 20 분 후, 염화나트륨 (2 M)과 PBS (0.01 M) 0.01 % SDS로 유지하면서 용액에 0.05 M의 염화나트륨의 농도를 가지고, 20 분 동안 배양한다. </li><li> 1 M 20 분 간격의 최종 농도 0.1 M의 단위 염화나트륨 농도를 증가시킨다. </li><li> 23 ° C에서 와류 믹서에 진탕 밤새 품어. 진동 속도만큼 DNA 샘플과 AuNP 프로브 혼성 해짐에 따라 실험에 영향을주지 않습니다. </li><li> 30 초 동안 7,000 XG에서 금 나노 입자를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. </li></ol></li><li> 25 nM의 (AuNP 프로브 용액)의 농도에서 탈 이온수 (DI 수)로 AuNP 프로브 입자를 추가한다. </li><li> 타겟 DNA 샘플을 준비한다 ( &#39;3 개의 염기쌍 미스 매치 : 5&#39;-CTTGCCTAC TTT ACCAGCTC-3&#39;5&#39;-CTTGCCTACGCCACCAGCTC -3- 완전히 상보 여섯 염기쌍 불일치를 : 5&#39;-CTTGCCT TTTTTT CCAGCTC-3 &#39;)의 농도로0.06, 0.11, 0.17, 각각 0.20, 0.30, 0.50 μM. </li><li> 염화나트륨 (14 μM)와 DNA 샘플 (350 μL)에 AuNP 프로브 솔루션 (6 μL, 25 nm의)를 추가합니다. </li><li> DNA 혼성화 5 분 동안 23 ℃에서 와동 혼합기 DNA 샘플과 AuNP 프로브 혼합물을 흔들어. </li><li> AuNP 성장을위한 솔루션 (DNA 샘플과 AuNP 프로브의 혼합물)에 NH 2 OH (6 μL, 400 밀리미터) 및 HAuCl 4 (6 μL, 25.4 mm)를 추가합니다. AuNP의 성장은 종료 약 30 초 소요됩니다. 착색의 꾸준한 변화 이상의 1 시간을 유지합니다. 주의 : HAuCl 4 피부에 접촉했을 때 심각한 독성 효과를 얻을 수 있습니다. 사용하기 전에 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 장갑을 착용하고 HAuCl 4 사용할 때 연기 찬장을 사용하십시오. </li></ol> 공기 방울 조작 플랫폼 2. 제작 참고 : P 다음 PDMS 기반 방울 조작 플랫폼은 두 개의 구성 요소를 포함수퍼 소수성 표면과 공기 채널 층 (5 ㎜)와 DMS 막 (100 μm의). 멤스 공정없이 일반적인 가공 공정의 제작이 미세 유체 성분의 조형하는 금형 PDMS 주조 및 복제하기 위해 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 마이크로 포함 디바이스, 레이저 미세 가공을 제조하는데 사용 하였다 수퍼 소수성 표면 (도 3 참조). <ol><li> 마이크로 구조체와 PMMA 계 마스터 주형 (도 3 참조)를 생성하기 위해 드릴 비트 (0.5 mm)를 구비 한 CNC 기계를 사용한다. 드릴 비트 7mm / sec의 이송 속도와 회전을 26000 rpm의 속도를 사용한다. PMMA를 스크랩을 제거하고 상기 마스터 주형의 표면을 세정하기 위해 송풍기 및 DI 물을 사용한다. </li><li> PDMS의 기반과 비 10 경화제의 혼합물을 준비한다 : 1. 모든 기포가 제거되고 30 분 동안 또는까지 건조기 내부의 혼합물을 탈기. </li><li> 일에 PDMS를 부어즉 마스터 몰드와 공기 챔버의 역 마이크로 구조 (PDMS 막)와 공기 채널 (PDMS 층)을 얻기 위해 오븐에서 60 ℃에서 3 시간에 대한 PDMS 굽는다. </li><li> (손으로) 마스터 금형에서 PDMS 층을 제거합니다. 공기 흡입 입구의 PDMS 층에 구멍을 펀치. </li><li> 산소 플라즈마 처리 시스템의 챔버로 PDMS 막의 상기 PDMS 층 및 유리 기판을 넣어. 산소 플라즈마 처리 후, 10 분 동안 핫 플레이트 (90 ° C)에서 함께 PDMS 막의 상기 PDMS 층과 유리 기판을 접합. </li><li> 레이저 절삭 기계 (PDMS 막면을 위로)에 복합 칩을 넣어. 초 소수성 영역 (15mm × 12mm)를 정의 할 .DWG 파일을 가져옵니다. 그림 3을 참조하십시오. 직접 PDMS 막 (전력 12 W, 스캔 속도 106.68 mm / 초)에 초 소수성 영역을 생성하기 위해 CO 2 - 레이저 기계와 PDMS 멤브레인을 새기다. </li><li> 씻어 DI 물과 초 소수성 표면을 청소표면에서 떨어져 탄화 잔기. </li><li> 솔레노이드 밸브를 통해 공기 흡입구 및 진공 펌프에 연결 (도 4 참조). 디지털 I / O의 USB 모듈과 컴퓨터와 제어 솔레노이드 밸브를 연결합니다. </li></ol> 공압식 플랫폼에 MNP의 검출 3. 운영 주 :이 부분은 공기 방울 조작 플랫폼 비색 및 급속 MNP를 식별하는 동작을 설명한다 (도 5 참조). 모든 단계가 23 ° C (주위 온도)에서 장소와 상대 습도 85 %를 가져 가라. <ol><li> 공기 방울 조작 플랫폼의 초 소수성 영역 (10 μL, 0.5 μM)을 대상 DNA 샘플 방울을 배치합니다. </li><li> 공기 방울 조작 플랫폼의 초 소수성 영역의 AuNP 프로브 방울을 (10 μL, 25 nm의) 배치합니다. </li><li> 솔레노이드 밸브 및 SI로 PDMS 막의 편향을 일으키는 공기 흡입을 제어mple 프로그램 (예를 들어, LabVIEW는). 물방울이 서로 충돌하여 유착되도록 PDMS 막에 (각각 표적 DNA와 프로브 AuNP 함유) 물방울의 이동 경로를 따라 각 공기 실의 공기 흡입을 제공한다. -80 kPa의 (게이지 압력)의 진공 펌프의 작동 압력을 사용합니다. <ol><li> 또한, 수동으로 한 방울 완전히 혼합으로 공기 흡입을 제어 할 수 있습니다. 손으로 연결하거나 시험의 초기 단계에서 튜브 진공 펌프 및 공기 챔버의 입구를 분리합니다. </li></ol></li><li> 솔레노이드 밸브의 제어 시스템을 사용하여 3 분 동안 혼합 효율을 향상시키기 위해 앞뒤로 합체 액적 롤의 공기 흡입을 제어한다. 타겟 DNA와 AuNP 프로브는 잘 혼합하여 3 분 이내에 혼성화된다. 각각의 구동 주파수 및 5 Hz에서 -80 kPa의 (게이지 압력)의 작동 압력을 사용한다. </li><li> NH 2 OH (2 μL, 400 mM)을하고 HAuCl를 함유하는 액 적을 배치공기 방울 조작 플랫폼의 소수성 영역 4 (2 μL, 25.4 mm)이다. </li><li> 방울이 서로 병합 충돌 있도록 공기 흡입구 (-80 kPa의 게이지 압력)을 제어한다. 이어서 전후로 합체 액적 롤 1 분간 혼합 효율을 향상시킬 수 있도록 상기 공기 흡입관 (5 Hz에서 -80 kPa의 게이지 압력)을 제어한다. </li><li> 측정 및 육안 합체 방울의 색을 기록한다. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

이 프로토콜에서는 간단한 비색 방법은 MNP는 0.11-0.50 μM에서의 microcentrifuge 튜브 범위의 농도에서 구현 될 수 감지. 또한, 제안 된 MNP 검출 방법은 DNA 스크리닝 및 기타 생물 의학 응용에 대한 높은 가능성을 가지고 공기 방울 조작 플랫폼에서 수행된다. 실제로, 샘플 DNA 농도의 검출 범위는 운영 플랫폼의 혼합 효율에 의존한다. 합체 물방울이 완전히 혼합되도록하려면,이 프로토콜의 중요한 단계는 합체 방울의 크기에 따라 공기 흡입 (압력 및 주파수)의 컨트롤입니다. 완전히 상보적인 DNA 샘플과 일치 샘플 DNA 간의 혼성화 친화력의 차이가 긴 DNA 서열 단편에 대해 육안으로 구별하는 것은 곤란하다. 이러한 검출 기술의 한계 때문에, 샘플 DNA 단편의 길이이다. 긴 DN과 샘플시퀀스 크기 또는 성장 AuNP의 형태는 다양 불일치를 포함하는 다양한 DNA 샘플의 것과 유사하다. 프로브에 DNA 샘플의 불일치는이 프로토콜의 중간 부분에 나타납니다. 동일한 길이와 샘플 DNA의 homomeric 불일치로, 불일치의 위치도 AuNP의 하이브리드 친화력과 성장의 크기에 영향을 미칠 수 있습니다. 많은 질병은 현재 특정 결함이있는 유전자를 추적하고있다. 특정 질병에 대한 게놈 데이터베이스는 여전히 확장 및 개선된다. 특정 DNA 단편의 DNA 서열 변이가 특정 질환에 대한 책임이 확인되면 (적절한 길이 및 DNA의 부정합 위치 제공) 설계된 프로브에 샘플 DNA의 미스 매칭 수를 획득하는데 사용될 수있다 에 기초하여 상기 검출 농도 범위 내 프로브가 이미이 연구에서 시험 하였다. 제안 된 공기 방울 조작 플랫폼이다 수행개방 된 환경에서 에드. 방울의 증발은 DNA 시료의 농도를 증가시키고, 비색 판독의 정확도에 영향을 미친다. MNP 분석의 정확성을 높이기 위해, 제어 된 환경 온도 및 습도가 요구된다. 레이저 미세 가공이 제시 플랫폼에 소수성 표면을 제조하기 위해 적용 하였다. PDMS의 세포막의 superhydrophobicity는 액적 조작 (&gt; 20 회)의 많은 반복에서 유지되지 않습니다. superhydrophobicity의 손실이 액적 조작 플랫폼의 이동 기동성을 감소시킨다. 액적 조작 플랫폼 (반복 2.6-2.8 단계)에 PDMS 막의 superhydrophobicity을 remodifying 표면에 superhydrophobicity 손실되면 요구된다. 더 내구성이 초 소수성 표면의 간단한 제조는 미래를 고려 중이다. 이 프로토콜에서는 차를 제어하기 위해 (데이터 수신 장치)와 솔레노이드 밸브와 간단한 제어 프로그램을 사용전자 공기 흡입. 공기 흡입의 제어는 다른 방식으로 또는 장비를 포함하되, 솔레노이드 밸브의 사용 등이 이용 될 수있다. 이 논문에서는 DNA 검출 간단한 비색 방법 및 공기 방울 조작 플랫폼의 조합을 소개했다. 두 기술은 독특하고 매우 유망하다; 우리는 동일한 결과를 달성하기 위해 (즉, 신속하고 시각적 둘 다) 대안 DNA 검출 방법을 발견하지 못했다. optowetting, 22 유전, 23 일렉트로 웨팅 (24)가 진동 (25)가 보온병 - 모세관 작동 (26)이보고되었다 포함 오픈 표면에 몇 방울 조작 기술. 모든 액적 조작 기술의 결점은 우리의 이전 연구에서 논의 하였다. 20 제안 공압 플랫폼은 상기 한 방법보다 생체 적합성이다. 이 기법은 O 다중 뉴클레오티드 다형성을 검출 할NA 공기 방울 조작 플랫폼은 샘플 및 시약 직접로드 피펫으로 수집 될 수 있음을 의미 생화학 분야의 연구자를위한 간단합니다. 제시된 플랫폼의 통합은 자동 제어 시스템과 앞으로 개선되고 광범위한 사용을위한 사용자 인터페이스의 설계를 수행하고있다.

DNA 서열에서 단일 염기쌍 차이 인 단일 염기 다형성 (SNP)는 가장 흔한 유전 적 변이의 하나이다. 현재 연구의 SNP는 질병 위험, 약제의 효능 및 유전자 기능에 영향을주지하여 개인의 부작용과 연관되어 있음을보고한다. 1, 최근의 연구는 2 차원 또는 다중 점 돌연변이 (멀티 염기 다형성) 특정 질환 및 개별 원인 밝혀 질병의 효과의 차이. 3,4- 염기 다형성의 검출은 질환의 사전 선별 때문에 필수적이다. 서열 - 특이 적 올리고 뉴클레오티드의 신속한 검출을위한 간단하고 효율적인 방법은 매우 지난 20 년에 개발되었다. 등 프로브 고정화, 형광 라벨, 겔 전기 영동을 포함한 절차를 일반적으로 DNA 돌연변이를 식별 포함하는 1,5 현재 접근, 6,7 그러나 이러한 방법은 일반적으로 expen 긴 분석 과정을 필요로시브 장비, 잘 훈련 된 기술자, 샘플 및 시약의 중요한 소비. 체적 고유의 물리 화학적 성질에 대한 표면적의 비율이 큰 나노 입자와 특정 바이오 마커에 대한 고감도 저렴 검출 플랫폼으로서 적합한 물질이다. 금 나노 입자 (AuNP)는 널리 올리고 뉴클레오티드 프로브를 수정할 때문에 큰 능력의 DNA의 검출을 위해 사용된다. 8-10 SNP 검출 기술도 AuNP을 사용하여 개발 하였다. 11-13 본 연구에서 우리는을 검출하는 신규 한 측색 방법을 채용 다 염기 다형성 (MNP) AuNP 프로브 DNA 혼성화 - 매개 성장으로. (14)이 간단하고 빠른 프로빙 방법이 이론에 기초하는 접합 단일 가닥 DNA (ssDNA를) 또는 이중 가닥 DNA (dsDNA)의 가변 길이 AuNP의 성장의 크기 및 형상에 영향을 AuNP (도 1 참조). 15 DNA 검출이 방법을시약의 작은 소비, 작은 분석 기간 (몇 분), 임상 진단 및 국내 의료 검진에 대한 전향 적으로 적용 열 제어없이 간단한 절차를 제공합니다. DNA의 감도, 검출 한계 및 특이성을 개선하기 위하여 실험 프로토콜을 대규모 장치의 적은 부분을 필요 전통적인 실험 프로토콜 진화 16 그러한 마이크로 유체 시스템 및 단순화 된 상기 DNA 서열을 검출하는 방법에는 여러 미세 유체 시스템은 개발되어왔다 바이오 센서. 마이크로 유체 시스템의 DNA 검출 방법은 여전히 이종 SNP를 식별하는 하나의 판독을 위해, 그러나, 신호 증폭 및 형광 판독기 같은 PCR (중합 효소 연쇄 반응)과 같은 후속 처리의 계기 장치를 필요로한다. (17, 18)를 간단한 개발 이후의 처리없이 플랫폼 직접 멀티 염기 다형성의 결과를 판독매우 바람직하다. 비교 잘 사용에, 종래의 미세 유체 시스템을 폐쇄, 미세 유체 장치가 유망 같은 명확한 광경, 샘플에 액세스 할 수있는 쉬운 방법, 직접 환경 접근성과 더 용이하게 형성 캐비테이션 또는 계면 방해의 여러 장점을 제공하는 오픈 표면 채널. 19 우리의 이전 작품은이있는,이 플랫폼, 방울 동시에 수송과 흡입력을 이용하여 구동 에너지로부터 간섭을받지 않고 조작 할 수 있습니다에 오픈 표면의 물방울 조작 (그림 2 참조). (20)에 대한 간단한 공압 플랫폼을 도입 생물 및 화학 분야에서 큰 잠재력. 이 공기 플랫폼 따라서 AuNP 프로브 DNA 혼성화 매개 성장의 개념을 사용하여 비색 방법과 조합 MNP 감지 DNA 샘플의 조작을 수행하는 데에 이용 하였다. 이 논문에 제시된 프로토콜 설명오픈 표면에 공기 방울 조작 플랫폼에서 다중 염기 다형성의 단순한 시각적 감지. 이 작품은 멀티 염기 다형성 (polymorphism)이 육안으로 감지 할 것을 확인; 제안 된 공기 플랫폼은 생물학적, 화학적 응용 프로그램에 적합합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:245px;">PDMS</td>
			<td style="width:204px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD 184</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">benchtop engravers</td>
			<td style="width:204px;">&#160;Roland DG</td>
			<td style="width:119px;">EGX-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">laser cutting machine</td>
			<td style="width:204px;">Universal Laser Systems, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">VLS 3.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Oxygen plasma treatment system</td>
			<td style="width:204px;">Femto Science Inc. Korea</td>
			<td style="width:119px;">CUTE-MPR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">solenoid valve</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>home built</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">vacuum pump</td>
			<td>ULVAC KIKO, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">DA-30D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">13-nm AuNP solution</td>
			<td style="width:204px;">TAN Bead Inc., Taiwan</td>
			<td style="width:119px;">NG-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">DNA (with 5 -end labeled thiol)</td>
			<td style="width:204px;">MDBio, Inc., Taiwan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>UniRegion&#160;Bio-Tech,. Taiwan</td>
			<td>PBS001-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:204px;">J. T. baker</td>
			<td style="width:119px;">4095-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:245px;">Hydroxylamine solution (NH2OH)</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">467804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:245px;">Chloroauric acid (HAuCl4)</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">vortex mixer</td>
			<td style="width:204px;">Digisystem Laboratory Instruments Inc.</td>
			<td style="width:119px;">VM-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">centrifuge</td>
			<td style="width:204px;">Hermle Labortechnik GmbH.</td>
			<td style="width:119px;">Z 216 MK</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the visual colorimetric detection of multi-nucleotide polymorphisms on a pneumatic droplet manipulation platform

다 염기 다형성 (MNP)를 검출하는 간단하고 시각적있어서 열린면에 공기 방울 조작 플랫폼에서 행 하였다. 비색 DNA 검출이 접근 방식은 금 나노 입자 프로브 (AuNP 프로브)의 하이브리드 매개 성장을 기반으로했다. AuNP의 성장의 크기와 구성은, 프로브와 하이브리드 DNA 샘플의 수에 의해 지배된다. 나노 입자의 형상 및 크기 - 특정 의존의 광학 특성에 기초하여, 프로브에 샘플 DNA 절편의 미스 매칭 수를 판별 할 수있다. 시험은 각각 시약 및 샘플 DNA를 함유하는 물방울을 통해 수행하고,가요 성 PDMS 계 소수성 멤브레인의 제어 공기 흡입 반송 및 공압 플랫폼에서 혼합 하였다. 물방울은 어떤 측면 EFF와 높은 생체 적합성 인 제안 공압 플랫폼에 오픈 표면에 동시에 정확하게 전달 될 수있다액적 내부 DNA 샘플 요법. 두 방식들을 제안 결합 다중 염기 다형성 공기 방울 조작 플랫폼 시야에서 검출 될 수있다; 추가 장비가 필요하지 않습니다. 최종 결과에 플랫폼에 방울을 설치에서 절차는 기존의 방법보다 훨씬 적은보다 5 분 걸립니다. 또한,이 결합 MNP 검출 방식은 매크로 시스템에 비해 현저하게 작다 각 연산에 ​​10 μL의 샘플 용적이 필요하다.

본 연구에서는 세 개의 DNA 샘플을 AuNP 프로브의 DNA 혼성화 매개 성장을 통해 검출하는 간단하고 신규 한 방법을 사용하여 시험 하였다. 프로브 DNA와 삼가지 DNA 샘플의 순서는, 특히, cDNA를 프로토콜의 1 단계에 나와있는, TMDNA (세 염기쌍 일치하지 않는 DNA) 및 SixMDNA (여섯 기본 쌍 일치하지 않는 DNA)을 (완전히 보완 DNA를 조사하기 위해). 여기서 테스트 DNA 샘플을 프로브에 불일치가 DNA 샘플의 중간 세그먼트 모두이다.도 6은 다양한 농도의 DNA 시료에 대한 성장 AuNP 용액의 색을 나타낸다. 완벽하게 일치하는 DNA (CDNA)의 경우, 솔루션의 색상은 DNA 농도 증가와 함께 투명 한 후 인디고에 분홍색에서 다양합니다. TMDNA 들어, 용액의 색이 진한 보라색 핑크로 진행하고 인디고 및 SixMDNA 들면 색 DNA 농도가 증가함에 따라 짙은 분홍색으로 핑크로 진행한다. 별도의 D<html> NA 샘플 AuNP의 다양한 크기와 성장 용액의 색 변화를 야기 프로브 DNA에 혼성화 다양한 유사성을 갖는다. TMDNA 샘플 프로브에서 세 개의 염기쌍 돌연변이 더불어 AuNP 적은 성장 크기를 야기 된 cDNA 샘플보다 혼성화 친 화성을 갖는다. 그림 6은의 결과로서, 특히 큰 DNA 농도에서 CDNA 및 TMDNA 샘플 사이의 색의 구별이있다. 프로브 많은 불일치를 통해 SixMDNA 샘플도 0.2 μM보다 큰 DNA 농도, AuNP에 접합 몇 dsDNA 결과 프로브에 약한 하이브리드 친 화성을 가지고있다. AuNP의 성장 크기는 AuNP 솔루션은 분명 육안으로 측정되지 아마란스에 핑크로 변경하는 원인이 SixMDNA 샘플에서 결과적으로 작다. 색상 이미지, cDNA를 바탕 TMDNA SixMDNA 및 0.50 μM로 0.11로부터 DNA의 농도에 대한 대략 차별화된다. &quot;FO : 유지-together.within 페이지 =&quot;_content. 여기에 제시된 프로토콜 및 방법과 함께 1 &quot;&gt; 오픈 표면 미세 유체위한 간단하고 새로운 액적 기반의 조작 플랫폼은을 생성하는 힘으로 공기 흡입을 사용하여 입증되었다 PDMS의 멤브레인 방울의 용이 한 운송 및 조작면 변형 (도 7a 참조)에서 물방울이 경우, 바이오 시료 DNA에 중단없이 달성 될 수있다. MNP의 새로운 시각적 검출은 이것에 설명된다 공기압 개방 표면 액적 조작 플랫폼.도 7b에 도시 된 바와 같이 결과적으로, DNA 불일치의 검출은 육안으로 쉽게 관찰 할 수있다. 원래 상태에서, AuNP 프로브 방울은 적색을 나타냈다. 최대 광 흡수 AuNP 프로브는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 기인은 520nm에서. 다양한 DNA 샘플 방울 완전 코팅과 AuNP 대상 프로브 DNA 이중 가닥과 혼성화 후 발생<html> 증가 된 AuNP의 SPR 기능이 사라로 omplementary DNA (CDNA) 샘플 액 투명되었다. 반면, AuNP는 세 가지 기본 쌍 일치하지 않는 DNA (TMDNA)과 일치하지 않는 DNA (SixMDNA)이 각각 파란색과 보라색이었다 여섯 염기 쌍의 혼성화. 이 방법으로, DNA 검출 제안 된 플랫폼 및 방법과 결합하는 간단한 방법으로 달성했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54424/54424fig1.jpg" /> AuNP의 티올 - 개질 된 ssDNA를의 혼성화 MNP. 티올 - 개질 된 단일 가닥 DNA (ssDNA를) 또는 이중 가닥 DNA (dsDNA)의 비색 검출도 1 원리는 AuNP의 성장의 크기 및 형상에 영향 그리고 AuNP의 원인이 다양한 광학적 특성. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> &quot;fo를하기 : 유지-together.within 페이지를 =&quot;1 &quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54424/54424fig2.jpg" /> 공기 방울 조작 플랫폼 그림 2. 개략도. 유연한 PDMS 기반의 초 소수성 멤브레인의 변형을 야기하는 힘으로 공기 흡입으로, 멤브레인에 방울함으로써 활성화됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig2large.jpg" target="_blank">의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54424/54424fig3.jpg" /> 그림 공기 방울 조작 플랫폼 3. 제작가. 제조는 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 마이크로, PDMS 주조 또는 복제 기술 및 레이저 미세 가공을 포함했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig3large.jpg" target="_blank">larg의를 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 어 버전입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54424/54424fig4.jpg" /> 공기 방울 조작 플랫폼도 4 실험 셋업. 진공 펌프는 공기 챔버 내의 감소 된 압력을 제공하고 액적 조작 할 PDMS 막의 편향을 유발하는 공기 흡입 생성. 진공 펌프와 솔레노이드 밸브를 통해 연결되어있는 공기 통로의 입구입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54424/54424fig5.jpg" /> 이 MNP 검출 기술의 동작을도 5 도식 그림. 타겟 DNA를 함유하는 물방울과 AuNP 프로브가 플랫폼에 탑재되어, 혼합 HYBridized. NH 2 OH 및 HAuCl 4를 모두 포함하는 액 플랫폼에로드 AuNP 성장을위한 혼합한다. 마지막으로, AuNP의 대상 프로브 DNA 이중은 최대 흡수를 이동 및 색상. 변경 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54424/54424fig6.jpg" /> 그림 농도 다양한 DNA 샘플의 색상 6. 변화. 완전히 보완 DNA (CDNA)의 경우는 솔루션의 색상은 DNA 농도가 증가 인디고하는 핑크 다릅니다. TMDNA를 들어, 솔루션의 색상은 어두운 자주색에 분홍색에서 진행하고, SixMDNA를 들어, 색상은 DNA의 농도를 증가 어두운 분홍색에 분홍색에서 이동합니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig6large.jpg" target="_blank">고맙다을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 게르 버전입니다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/54424/54424fig7.jpg" /> 그림 공압 플랫폼입니다. A의 방울의 7 이미지) 공기 흡입. B에 의해 제어) 제안 된 공기 방울 조작 플랫폼에 AuNP의 해당 대상 프로브 DNA 이중의 이미지와 공기 플랫폼에서 액적 수송의 직렬 이미지. 구동 주파수와 작동 압력의 작동 상태를 각각 5 Hz에서 -80 kPa의 (게이 지압)이었다. 원래 상태에서, AuNP 프로브 액 적색을 나타낸다. cDNA에 존재 하에서 AuNP의 표적 프로브 DNA 듀플렉스 투명이었다. TMDNA 및 SixMDNA와 하이브리드 AuNP 프로브는 파란색과 각각 보라색이었다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54424/54424fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. &lt;</a>가 /&gt;

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The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

이 작품은 공기 방울 조작 플랫폼에서 다중 염기 다형성을 검출 할 수있는 간단하고 시각적 인 방법을 제시한다. 액적 조작 및 다 염기 다형성의 검출을 포함하는 제안 된 방법은 전체 실험을 통해 고급 장비의 도움없이 23 ° C 부근 수행 될 수있다.

공기 방울 조작 플랫폼에서 멀티 염기 다형성의 비주얼 색도계 감지

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

7.5K 조회수.  National Taiwan University.  이 작품은 공기 방울 조작 플랫폼에서 다중 염기 다형성을 검출 할 수있는 간단하고 시각적 인 방법을 제시한다. 액적 조작 및 다 염기 다형성의 검출을 포함하는 제안 된 방법은 전체 실험을 통해 고급 장비의 도움없이 23 ° C 부근 수행 될 수있다. 

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

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연구

유전학

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

접합에 참여 전송 단백질의 서열 별 분석을위한 공역 결합 분석 실험

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Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

꼬마 선 충 에 Ploidy의 조작

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Exploring the Effects of Spaceflight on Mouse Physiology using the Open Access NASA GeneLab Platform

Performing biological experiments in space requires special accommodations and procedures to ensure that these investigations are performed effectively and efficiently. Moreover, given the infrequency of these experiments it is imperative that their impacts be maximized. The rapid advancement of omics technologies offers an opportunity to dramatically increase the volume of data produced from precious spaceflight specimens. To capitalize on this, NASA has developed the GeneLab platform to provide unrestricted access to spaceflight omics data and encourage its widespread analysis. Rodents (both rats and mice) are common model organisms used by scientists to investigate space-related biological impacts. The enclosure that house rodents during spaceflight are called Rodent Habitats (formerly Animal Enclosure Modules), and are substantially different from standard vivarium cages in their dimensions, air flow, and access to water and food. In addition, due to environmental and atmospheric conditions on the International Space Station (ISS), animals are exposed to a higher CO2 concentration. We recently reported that mice in the Rodent Habitats experience large changes in their transcriptome irrespective of whether animals were on the ground or in space. Furthermore, these changes were consistent with a hypoxic response, potentially driven by higher CO2 concentrations. Here we describe how a typical rodent experiment is performed in space, how omics data from these experiments can be accessed through the GeneLab platform, and how to identify key factors in this data. Using this process, any individual can make critical discoveries that could change the design of future space missions and activities.

The NASA GeneLab platform provides unfettered access to precious omics data from biological spaceflight experiments. We describe how a typical mouse experiment is conducted in space and how data from such experiments can be accessed and analyzed.

오픈 액세스 NASA GeneLab 플랫폼을 사용 하 여 마우스 생리학에 Spaceflight의 효과 탐험

Performing biological experiments in space requires special accommodations and procedures to ensure that these investigations are performed effectively ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

Drosophila 시각 시스템에서 낮은 풍부한 셀의 정화

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

멕시코 Cavefish에서 유전자 기능 조작

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...