The authors would like to acknowledge Dr. John Sheehan and Dr. Lubna Abdullah for their guidance and mentoring that were central in the completion of this work. This work was supported by funds from the National Institutes of Health (P01HL108808, UH2HL123645) and the Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey is supported by an NHMRC Early Career Research fellowship.

1. 점액 젤 웨스턴 블로 팅에 대한 버퍼를 준비합니다 <ol><li> 50 배 TAE (트리스 - 아세테이트 - EDTA) 버퍼 1 리터를 준비합니다. <ol><li> 증류수 (DH 2 O) 700 ml의 트리스베이스 (0.4 M) 242 g, 빙초산의 57.1 g (무게 액체) (0.2 M) 및 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (50 밀리미터)의 14.61 g을 추가합니다. </li><li> 8.0으로 산도를 조정하고 DH 2 O. 1이 리터 볼륨을 만들 </li></ol></li><li> 10 배 로딩 버퍼 10 ㎖를 준비합니다. <ol><li> 1X TAE 버퍼 5 ㎖를 준비합니다. 이를 위해, 글리세롤 (50 %) 5 ㎖, 브로 모 페놀 블루 (0.25 %), 25 mg의 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) (1 %), 100 mg의 추가. </li></ol></li><li> 20 배 나트륨 염 구연산 (SSC) 버퍼 2 리터를 준비합니다. <ol><li> DH 2 O의 1.5 리터에서 염화나트륨 (3 M)의 350.6 g 및 트리 소듐 시트 레이트 (나 3 C 6 H 5 O 7) (0.3 M)의 176.4 g을 추가합니다. 7.0으로 산도를 조정하고 DH 2 O와 2 리터 볼륨을 만들 </li></ol></li><li> 1X TAE-0.1 % SDS 버퍼 1 리터를 준비합니다. <ol><li> DH 2 O의 980 ml의 50 배 TAE의 20 ML을 추가 0.1 % SDS-TAE 솔루션을 만들기 위해 SDS의 1g을 추가합니다. </li></ol></li></ol> 2. TAE-SDS 아가 로스 젤 준비 <ol><li> (. 즉, 150 ㎖) - 7mm 두께의 젤 충분한 볼륨을 부어 전자 레인지 삼각 플라스크에 1X TAE-0.1 % SDS 버퍼는 5를 확인합니다. 0.8 % (1.2 g) 아가로 오스 분말을 추가합니다. </li><li> (- 3 분 보통 1) 아가까지 간헐적으로 선회 30 초 간격으로 전자 플라스크를 완전히 용해시킨다. 이 과정에서 뜨거운 손 패드를 사용합니다. 소용돌이 치는 동안 폭발적인 비등주의하십시오. </li><li> 10 분 - 아가로 오스 솔루션은 5 냉각 할 수 있습니다. 참고 : 플라스크의 바닥이 5 초 동안 손바닥에 남아있을 수 있습니다 때 아가로 오스 용액을 주입 할 준비가 될 것입니다. </li><li> 테이프로 가장자리를 밀봉 위치에 빗 잘 배치하여 전기 주조 트레이 (10 × 15cm)를 준비합니다. </li><li> t 천천히 아가로 오스 솔루션을 부어그 기포의 형성을 방지하는 트레이를 캐스팅. 피펫 팁을 사용하여 거품을 제거합니다. 냉각 완전히 고체화하는 젤 기다립니다. 응고되면 흡입하여 우물을 붕괴 방지하고 트레이의 가장자리에서 테이프를 제거하기 위해 천천히 빗를 제거합니다. </li><li> 겔 상자에 아가 로스 젤을 놓고 젤이 완전히 덮여 때까지 1X TAE-0.1 % SDS 버퍼와 전기 장치를 입력합니다. </li></ol> 3. 샘플로드 및 전기 영동 분리 참고 : 우리의 실험실에서, 우리는 일반적으로 기관지 세척액 포함 마우스와 인간 모두에서 샘플을 사용하여 인간 기관지 상피 세포 (HBE), 인간의 타액과 객담 샘플에서 세포 세척액 (BALF 두 종). 시료 수집시 6 M 우레아로 변성 또는 단백질 분해 효소 저해제 칵테일을 첨가하여 시간 (6 시간)의 짧은 시간 동안 저장 될 수있다. <ol><li> 샘플 3 (각각의 샘플에 로딩 염료를 10 % 첨가하여, 즉. 로딩 샘플 준비, 30 μL염료의 μL). 위아래로 피펫 팅에 의해 샘플을 균질화. 간단히 방울을 수집하기 위해 5,0​​00 rpm으로 튜브를 스핀 다운. </li><li> 조심스럽게 우물에 샘플의 동일한 볼륨을로드합니다. <ol><li> 사전 젖은 팁 및 / 또는 점성이 높은 샘플의 로딩을 용이하게하기 위해 긍정적 인 변위 피펫을 사용합니다. 천천히 흡인 (80) - 샘플 염료 용액의 90 % (즉, 27-30 μL)를 피펫 거품을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 천천히 우물의 바닥에로드하고 점진적으로 상향 피펫 팁을 이동합니다. 피펫 팁에 부착 된 상태를 유지 샘플의 경우, 45 ° 각도로 분배 똑바로 잘 이상 연장 또는 부드럽게 실 같은 점액을 깰 잘의 측면을 사용합니다. 우물을 너무 많이 넣지 마십시오. </li></ol></li><li> 전기 영동 발전기에 겔 상자에서 전극을 연결합니다. 전극이 제대로 연결되어 있는지 확인 (예., 발전기의 양의 출력에 연결 적색 리드)에 부정적인 허용은 긍정적 인 방향으로 실행하는 뮤신 청구<html> 전극. </li><li> 두 행 사이의 중복을 방지하기 위해 이중 빗 겔 75 분 - 하나의 빗 겔 90 분, 또는 60 80 볼트에서 젤을 실행합니다. </li><li> 발전기의 전원을 끄고 전원에서 전극을 분리합니다. </li><li> 조심스럽게 겔 장소에 남아 있도록 주조 트레이의 양쪽에 한 손으로 겔 상자에서 젤을 제거합니다. </li></ol> 4. 효율적인 점액 전송을 위해 아가로 오스 젤 감소 <ol><li> 조심스럽게 유리 용기에 겔 평면 배치. TAE-SDS 버퍼의 흔적을 제거하기 위해 DH 2 O와 젤을 씻어. </li><li> DH 2 O. 800 ㎖ 중에 20 배 SSC 200 ㎖를 첨가하여 4X SSC 완충액 1 리터 준비 4X SSC 완충액 200 ㎖로 신선한 DTT 309 ㎎을 첨가하여 10 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT) 4X SSC 용액 200 mL로. </li><li> DTT-4 배 SSC 버퍼와 커버 젤을 만끽 해보세요. 조심스럽게 20 분 (분당 10 회전)에 대한 바위. DTT없는 4 배 SSC 버퍼와 젤을 씻어. </li></ol>&quot;&gt; 5. 니트로 셀룰로오스 막에 블로터 조립 및 샘플 전송을 진공 청소기 <ol><li> 전송을 위해 진공 흡착을 준비합니다. <ol><li> 조심스럽게 겔 (예., 10 × 15cm)보다 약간 더 넓은 차원에서 니트로 셀룰로오스 막 잘라. </li><li> DH 2 O 젖은 다공성 매트 및 흡착 부드러운 사이드 업 놓습니다. </li><li> DTT없는 4 배 SSC 버퍼 젖은 니트로 셀룰로오스 막과 다공성 매트의 중앙에 배치합니다. </li><li> 정확하게 니트로 셀룰로오스 막과 정렬 가스켓의 개구부를 남겨두고 고무 개스킷 다공성 매트 커버. 다공성 매트가 계속 표시되는 경우, 신중하게 틈 가스켓과 막 사이에 남아 보장하기 위해 멤브레인을 조정합니다. </li></ol></li><li> 조심스럽게 막 위에 아가로 오스 겔을 배치합니다. 가스켓에 단단히 밀착 겔의 우물이 전송을위한 막에 위치 겔 형태를 확인합니다. <ol><li> 막과 젤 사이에 기포의 형성을 피할 것. 을 최소화하도록거품의 형성은 4 배 SSC의 몇 방울은 막에 버퍼 및 형성 거품을 플러시 위에서 아래로 젤을 밀어 물총. 단백질이 즉시 지워 시작할 것 같이 막에 젤을 이동하지 마십시오. </li></ol></li><li> 조심스럽게 배 SSC 버퍼와 젤을 커버한다. </li><li> 흡입에 의해 점액 전송을 시작합니다. <ol><li> 50 밀리바 - 40 진공 ON 흡착 및 설정 압력을 켭니다. 이 건조 겔을 방지하기 위해 10 분 - 겔상의 모든 5 4X SSC 완충액 몇 방울을 추가한다. 90 분 동안 실행 전송. 옵션 : 완료되면, 방향에 대한 연필로 우물을 표시합니다. </li></ol></li><li> 겔 폐기 멤브레인의 가장자리에 플라스틱 핀셋을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막 검색. </li></ol> 6. 막 차단 및 탐지 <ol><li> 1X 인산 완충 식염수 (PBS)로 즉시 막을 씻어. 멤브레인은 건조하게하지 마십시오. </li><li> 소유주에 버퍼와 장소를 차단 3 % 우유 PBS의 50 ㎖로 막 빠져1 시간 동안 실온에서 cker. 배양 후, 블로킹 버퍼를 폐기합니다. </li><li> 1 % 우유 PBS 차 항체 용액에서 막 빠져. 밤새 4 ℃에서 로커에 차 항체 용액 막을 인큐베이션. 배양 후, 차 항체 용액을 버린다. 블로킹 완충액을 항체 용액 2,000 비율 : 1에 일차 항체를 희석. 주 : 마우스 유래 시료를 위해, 우리는 222 UNC 토끼 항 MUC5B 및 염소 항 - 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용한다. 인간에서 발생하는 샘플을 위해, 우리는 H300 방지 MUC5B 및 45M1 안티 MUC5AC 차 항체를 사용합니다. </li><li> 로커에 10 분 동안 PBS로 세척 막 3 회. </li><li> 1 % 우유 PBS 차 항체 용액에서 막 빠져. (. 예를 들어, 700 및 항 - 토끼 항 염소 680)를 차단 완충액에 항체 용액 7500 비 로커에 실온에서 1 시간 동안 배양한다 : 1의 이차 항체를 희석. 불투명 공동으로 배양하여 빛으로부터 보호의 ntainer. 1 시간 후 이차 항체 솔루션을 폐기하십시오. </li><li> 5 분 동안 PBS로 세척 막 3 회. 소금을 제거하기 위해 DH 2 O와 멤브레인을 씻어. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 적외선 형광 시스템에서 멤브레인을 읽는다. </li></ol>

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이 비디오에 설명 웨스턴 블로 팅 점액의 프로토콜은 단백질 검출을위한 정기적 인 기술, 즉., 면역과, 분리 및 DNA 큰 거대 분자를 전송하는 분자 생물학에서 사용되는 종래의 기술을 결합한다. 동일한 기술은 고 분자량 히알루 론산 (18)의 고장과 같은 복잡한 글리코 사 미노 글리 칸의 생물학을 연구하기 위해 적용될 수있다. 이 방법은 분석의 넓은 범위에서 사용할 수 있지만, 성공 아가 웨스턴 블롯 세심한 및 시간 의존적 동작을 요구 단계의 다수에 의존한다. 성공을 최대화하기 위해, 몇 가지 중요한 단계가 검토되어야한다. 샘플 준비 및 겔 로딩은 정확한 결과를위한 중요한 단계이다. 점액이 풍부한 샘플, 즉., 타액,이다, 실험 튜브에 부착 자연, 즉., 피펫 팁, 원심 분리기 튜브, 필터에 의해. 용적 피펫 및 사전 사용피펫 팁은 -wetting 웰로 점탄성 물질의 로딩을 용이하게 할 수있다. 이러한 샘플 인해 고조 부력과 이들 물질의 끈적 거림에 특별한주의가 필요합니다. 농축 된 시료 (5 mg의 위 / ㎖) 저조한 0.8 % 아가로 오스 겔의 공극 크기를 통해 이주하고 최대 6 M 우레아에 상기 희석 및 / 또는 변성을 요구할 수있다. 그러나 SDS와 침전 것 아니 디늄 등의 구 아니 디늄 클로라이드 (GuHCl)에 변성 샘플을 실행하지 마십시오. 따라서, GuHCl에 저장된 샘플을 추가 투석 단계가 필요합니다. 비중 합체 상태 연구를 들어, 부분 환원 (5 분 동안 0.5 mM의 DTT)을 크게 농축 된 샘플 (도 3 참조)의 이동이 향상된다. 니트로 셀룰로오스 막에 단백질 전송이 프로토콜의 핵심 단계이며 정밀하게 실행하지 않을 경우, 스테인드 막, 약한 신호 거짓 정량 결과로 이어질 수 있습니다. 니트로 셀룰로오스 멤브레인은 섬세하고 쉽게 오염항상 장갑으로 취급하고 불특정 바인딩 및 손상을 방지하기 위해 치료해야한다. 막 상에 겔의 배치는 단단히 밀봉을 생성 및 얼룩 발생 및 전달 효율을 감소시킬 전송 버퍼 누설을 방지하기 위해 정확한 정렬이 필요합니다. 겔 막 사이에 기포의 형성은 단백질의 전달을 방지하고 신중 피해야한다. 최적의 면역 대상 뮤신 단백질 골격에 대해 높은 친 화성 높은 특이성 항체에 의존한다. 최근, 소설 예방 접종 전략, 항원 설계 및 스크리닝 기술은 점액 항체의 생성을 증가 성공에 굴복하고 점액 생물학​​을 연구하는 새로운 도구를 제공했다. 하나의 오 즉., MUC5AC와 MUC5B 두 가지 뮤신을 검출하기 위해, 두 가지 주요 항체는 다른 호스트의 종류, 즉, 토끼, 염소로부터 유도되어야한다. 또한, 이차 항체는 다른 형광 물질로 표지 할 필요S는 모두 700 nm- 800 nm의 채널에서 검출된다. 상대 뮤신 풍부하고 뮤신 크기는 이미징 소프트웨어와 직접적으로 정량화 할 수있다. 형광 신호는 샘플의 넓은 범위의 정량화에 높은 (예., 세포 세척)에서 낮은 (예., 가래) 농도 점액 있도록 표적 점액의 양에 정비례한다. 이 압둘라 등. (19)에 설명 된 길고 어려운 과정입니다 그러나, 절대 점액 농도는이 프로토콜에 설명되지 않은 점액 표준의 정화가 필요합니다. 또한, 아가로 웨스턴 블 롯팅은 중합 또는 탈 중합 과정을 연구하기 위해 점액 변화 분석법을 수행 할 수있는 가능성을 제공한다. 뮤신의 전기 영동 이동성이 큰 중합체의 이동이 지연된다. 이들 폴리머 상태, 즉,에 따라, 상기 영상 소프트웨어를 사용하여 정량화 할 수있다. 예를 들어, 에이전트를 감소시키는 것은 이동성 쉬를 유도합니다점액의 생물 리 학적 특성의 변화에​​ 상관 신호의 IFT. 이러한 분석은 점액 멀티 머화 공정 (13)을 연구하기 위해 이용 될 수 있지만, 또한 점액 네트워크 (11)에 영향을 미치는 대상으로되는 약물을 시험하기. 형광 라벨과 함께 아가 로스 웨스턴 블로 팅 점액, 결론적으로는 상당히 높은 질적 및 양적 데이터를 생산하여 점액을 연구하는 우리의 접근 방식을 변경했습니다. 낮은 신호 강도, 높은 배경 및 / 또는 막에 punctates의 모양 : 다음과 같은 결과가 발생할 수 있습니다 웨스턴 블로 팅 점액 아가로 오스와 일반적인 문제. 몇몇 해결 전략은 뮤신 겔의 이미지를 향상시킬 수있다. 신호 강도가 큰 양의 샘플을 로딩 및 / 또는 일차 및 이차 항체의 농도를 증가시킴으로써 증가 될 수있다. 통상적으로, 높은 배경 신호는 더 이상 블록을 수행함으로써 해결 될 수 불충분 차단 및 / 또는 세정액에 기인/ 배양을 씻어뿐만 아니라 상업적으로 사용할 수있는 버퍼를 차단 최적화 된 사용. punctates의 모양은 박테리아의 성장을 촉진 실온에서 연장 막 배양의 결과 일 수있다. Punctates 또한 DTT 침지 용액에서 니트로 셀룰로오스 막에 손상 (스텝 4.1)에 의해 발생 될 수 있고 충분히 전달하기 전에 아가 로스 겔을 세정 및 / 또는 5 mM의 DTT 농도를 감소시킴으로써 방지 할 수있다. 웨스턴 블롯 점액 아가의 주요 한계는 절대 정량 점액을 방해 고 분자량 단백질 및 표준 단백질 뮤신 사다리의 부족이다. 점액 아가 로스 젤에서 발표 한 결과 대부분의 크기와 농도에 대한 비교 연구이다. 굴절률 결합 광산란으로 크기 배제 크로마토 그래피는 일반적으로 정밀한 분자량 및 거대 분자의 농도를 결정하기 위해 사용되는 또 다른 기술이다. 그러나,이 기술은 고가 A는ND는 뮤신에 대한 특이성 부족, 따라서, 다른 방법 큰 분자는 샘플, 예를 들면, DNA에 포함. 또한, 크기 배제 크로마토 그래피는 예., MUC5AC 대 MUC5B, 점액 유형을 구별하지 못하고, 방법 및 점액의 혼합물의 평균 농도와 크기가 소정의 시험편에 포함. 다른 기술 한 밀도 (isopycnic) 및 레이트 띠 회 원심 6 산란 동적 멀티 앵글 빛, 전자 현미경, 질량 분석 -1,7,8,8- 포함 뮤신을 연구하는데 사용될 수있다. 그러나, 점액 분자를 대상으로 새로운 약리 에이전트의 조사, 점액 생물학​​을 연구하는 신뢰성있는 실험 기법을 개발하기 위해 필수적이다. 웨스턴 블로 팅 점액 아가로 오스는, 예. 점액 프로세스에 대한 중요한 질문에 대답하는 데 사용할 수있는 비교적 간단하고 저렴한 기술이다, 부담, 크기 및 비율을 점액의 변화. 이 분석은 사용될미래의 응용 프로그램에 시험관 및 생체 내 모델에 부착 점액을 제거하기위한 새로운 분자 약물의 효능과 독성을 테스트합니다.

뮤신은 일반적으로 외부 환경에 노출되는 공동 라인 점막 표면에 의해 생성된다 (예., 호흡, 소화, 생식 책자, 안구 표면) 및 내부 기관 (예, 췌장, 담낭, 젖샘). 이러한 당 단백질의 존재는 표면의 수분을 유지하고 병원체에 대한 물리적 장벽을 형성한다. 점액 생산은 돌이킬 수없는 조직 손상을 일으킬 수 덕트 방해, 세균성 식민지 및 만성 염증으로 이어질 수 있습니다, 점액 hyperconcentration 및 / 또는 비정상적인 점액 속성을 건강 점막하는 것이 필수적이지만. 유사한 이벤트 캐스케이드 여러 질환에서 관찰되는 등., 낭성 섬유증 한 만성 중이염 2 자궁 경부 감염 3. 따라서, 건강과 질환에서 점액의 역할을 이해하고 단백질 식별을 위해 루틴 프로토콜을 설정하는 것이 중요하다. 현재까지19 뮤신 유전자 식별 및 1200에 이르기까지 큰 폴리펩티드 사슬을위한 인코딩 된 (예., MUC1) 22,000 (예를 들어, MUC16) 아미노산에. 뮤신 유전자 패밀리는 두 개의 하위 유형으로 나눌 수있다 점액 겔의 점탄성 특성에 대한 세포 시그널링 및 차폐면에 관여하는 막 - 관련 뮤신, 상기 겔 형성 뮤신은 책임. 막 - 관련 뮤신 주로 단량체이며 소수성 막 - 스패닝 도메인을 통해 세포 표면에 부착. 대조적으로, 겔 형성 뮤신 동적 고분자 네트워크의 형성에 필수적인 여러 폰 빌레 브란트 인자 (vWF의) -like 시스테인 풍부 도메인을 갖는다. 큰 글리 칸은 세린과 apomucin에 걸쳐 분산 트레오닌 잔기에 부착된다. 이러한 고밀도 O 결합 올리고당 분자량 (4)의 80 %에 기여할 수있다. 뮤신 단량체 접속 인트라 및 분자간 이황화 결합은 뮤신 겔 networ의 무결성을 보장케이. 무거운 글리코 실화 및 멀티 머화 결과, 뮤신은 동물계에서 가장 큰 분자에 있으며, 종래의 SDS-PAGE 폴리 아크릴 아미드 겔 및 표준 단백질 사다리를 사용하여 표준 겔 전기 영동에 의해 분석 될 수 없다. 점액 단량체 MUC16의 경우 2 MDA까지 도달 할 수 있지만 이러한 방법은 250 kDa의보다 낮은 분자량 / 별도의 단백질을 해결. 그러나, 고 분자량 단백질 래더 작은 점액 단량체를 연구하는데 사용될 수있다 (예., MUC1). 다양한 기술 뮤신 크기, 형태 및 상호 작용을 연구하기 위해 적용될 수있다. 전통적으로, 뮤신의 생화학 적 특성은 크기 배제 크로마토 그래피 및 면역이어서 변성 버퍼 밀도 (isopycnic) 밀도 구배 원심 분리를 통해 분리 점액에 의해 달성된다 (예., 슬롯 블롯) 5. 동적 및 / 또는 멀티 앵글 빛 산란 뮤신 풍부한 샘플 올리고머 상태에 대한 정보를 제공 &lt;SUP&gt; 1. 또한, 면역 및 투과 전자 현미경과 결합 된 레이트 - 띠 원심 일반적 뮤신 (6)의 고분자 입체 구조를 결정하는 데 사용된다. 질량 분석은, 뮤신을 정량화 단백질 분해 절단을 검출 올리고당 조성물 -1,7,8,8-을 분석하기 위해 사용된다. 이러한 기술들은 시간이 소요 종종 큰 양 및 / 또는 샘플의 높은 농도를 필요로 비싸다. 이 방법은 본 명세서에 기재된 예., 전기 영동에 의해 분리 점액 재현 저비용이고 상대 뮤신 정량을 제공하고, 중합체 조립체를 조사 높은 처리량의 연구에 사용될 수있다. 그러나이 분석은 드문 점액 사용할 수 없습니다 높은 친 화성이 높은 특이성 점액 항체가 필요합니다 (예., MUC19) 또는 특정 종 (예., 돼지, 흰 족제비). 아가로 웨스턴 블 롯팅은 집중하고 함께 점액 풍부한 샘플의 다양한 해결하기 적합50 μg의 / ㎖ (예., 셀 세척) 5 ㎎ / ㎖로 (예., 객담)에 이르기까지 TIONS. 이 분석은 1990 년대에 도입 된 단지 몇 개의 전문 실험실 9, 10에서 수행되었다. 우선,이 기술은 인간의 호흡기 분비물 11,12 뮤신 단량체의 개체군을 식별 돕고 골지체 13 다이머 멀티 머화 하였다 소포체의 이량 체 형성 구성 술잔 세포 올리고머 프로세스를 확인했다. 최근 쥐의 점액에 대한 클론 항체의 생성은 점액을 제거하기위한 테스트 약리 화합물을 작은 동물 모델에 대한 연구 (예., 부족, βENaC, OVA-도전 마우스 모델 점액을) 촉진 및 임상 연구에 연구의 새로운 분야를 개방 폐 14-17. 생물학 및 신규 생성 점액에 대한 관심이 증가의 결과로서, 더 구체적 점액 항체, 우리는를 설명 hereiN 방법론은 아가 로스 겔 전기 영동하고 니트로 셀룰로스 두 색 적외 형광 검출에 의해 진공 반송 뮤신을 분리한다.

<table><tbody><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T6060-1kg</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Sigma</td><td>ARK2183-1L</td><td>1 L</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS-100g</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma</td><td>114391-5g</td><td>5 g</td></tr><tr><td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td><td>Sigma</td><td>L6026-50g</td><td>50 g</td></tr><tr><td>20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>1 L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Trisodium Citrate (Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>W302600-1kg</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>10 mM DTT (dithiothreitol)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Milk Powder</td><td>Saco</td><td></td><td>Instant non-fat dry milk</td></tr><tr><td>Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS)</td><td>Gibco lifetechnologies</td><td>14200-025</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples)</td><td>Rockland antibodies and assays</td><td>600-101-215</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples)</td><td>UNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20119</td><td>200 &amp;#956;g</td></tr><tr><td>45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples)</td><td>Abcam</td><td>ab3649</td><td>100 &amp;#956;g</td></tr><tr><td>Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32213</td><td>0.5 mg</td></tr><tr><td>Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68022</td><td>0.5 mg</td></tr><tr><td>Electrophoresis Gel Box and Casting Tray</td><td>Owl Seperation Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power Supply Box</td><td>Biorad</td><td>Model 200/20</td><td></td></tr><tr><td>Membrane Blotting Paper</td><td>Amersham&amp;nbsp;</td><td>10600016&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Paper and Nitrocellulose membrane&amp;nbsp;</td><td>GE&amp;nbsp;</td><td>10 439 196</td><td></td></tr><tr><td>Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v</td><td>Expotech USA</td><td>230600-2</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Infrared Fluorescence System</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mucin agarose gel electrophoresis: western blotting for high-molecular-weight glycoproteins

뮤신, 점막 표면에 선을 긋고 무겁게-당화 단백질, 침입 병원균에 대해 상피 세포를 보호하여 타고난 방어의 핵심 구성 요소로 진화했다. 이러한 거대 분자의 주요 역할은 점막의 윤활을 추진하면서 입자 트래핑과 간격을 촉진하는 것입니다. 단백질 합성 중에 뮤신 극적 이들 분자의 질량 및 크기를 증가 강렬한 O 글리코 실화 및 멀티 머화를 겪는다. 이러한 번역 후 변형이 점액의 점탄성 특성에 대한 중요하다. 이들 분자의 복잡한 생화학 적 및 생물 물리학 적 성질의 결과로서, 뮤신과 협력하여 통상의 단백질의 분석 방법에 의해 극복 될 수없는 많은 문제점을 제공한다. 예를 들어, 높은 분자량 일반 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 통해 이동을 방지 및 접착 성질은 실험 튜브에 접착시킨다. 그러나, 건강 점액의 역할을 조사(예., 점막의 무결성 유지)과 질병 (예., hyperconcentration, mucostasis, 암) 최근에 얻은 관심과 뮤신은 치료 대상으로 연구되고있다. 생산과 점액 거대 분자의 기능의 더 나은 이해는 새로운 제약 접근 방법, 예를 들어, 점액 과립 세포 외 유출 및 / 또는 mucolytic 에이전트의 억제제가 발생할 수 있습니다. 따라서, 일관되고 신뢰할 수있는 프로토콜은 점액 생물학​​은 과학의 발전에 중요한 조사합니다. 여기서는, 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 점액 고분자 분리 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 전송하고, 점액 특정 항체의 신호뿐만 아니라, 적외 형광 겔 리더를 검출하는 종래의 방법을 설명한다. 이러한 기술은 점액 정량 멀티 머화를 결정하고, 점액에 대한 약리학 적 화합물의 효과를 시험하기 위해 널리 적용 할 수있다.

우리는 쥐의 폐 (그림 1)에서 폐포 세척액에서 아가로 오스 겔 전기 영동 다음과 같은 점액 표현의 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 예에서는 TG-MUC5AC 마우스 모델의 IL-13 처리 다음 뮤신 생산 상향 조절을 보여 아가 로스 겔을 사용 하였다. 웨스턴 블롯 합체 또는 단량체 밴드 신호 강도 (도 2)의 정량 분석에 사용할 수있는 점액 식의 시각적 표현을 나타낸다. 이 방법은 인간 기관지 상피 (HBE) 세포 세척액 인간 객담 시료 뮤신의 발현을 표시 할 수있다. 이 방법은 환원제로 처리 다음 뮤신의 감소를 표시하기 위해 사용될 수있다. 우리는 DTT (그림 3)의 증가 농도로 처리 HBE의 세척 대표 결과를 보여줍니다. 우리는 환원성 연령 치료 뮤신 환원 다음 합체 신호 세기의 손실을 정량화NT (그림 4). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54153/54153fig1.jpg" /> Tg가-MUC5AC / 녹색 형광 단백질의 IL-13 처리 (GFP) 마우스 모델에 따라 그림 1. 상향 조절 점액 생산의 MUC5AC는 GFP 태그 과발현 마우스는 PBS로 주입 하였다. (-) 또는 IL-13 (+) 유도 잔 폐 (그룹 당 N = 3)에서 세포 화생 및 증가 점액 생산. BALF 수확 및 점액 아가 로스 웨스턴 블로 팅을 통해 분리 하였다. 멤브레인은 토끼 다 클론 항 MUC5B (적색)과 염소 다 클론 항 - GFP (녹색)와 프로브했다. 적외선 시스템은 오버레이로 결과를 표시하는 데 사용 또는 흑백으로 이미지를 변경할 수있는 옵션을 하나의 채널로. 할 수있는 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54153/54153fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 도 2 IL-13 처리 된 마우스에서 점액 분비의 상향 조절을 보여주는 점액 아가 로스 겔 정량 분석. MUC5B 신호 강도는도 1에 도시 된 뮤신 겔의 각 레인을 측정 하였다. 결과 점액 분비를 증가되었음을 보여 이상 5.1 배 IL-13 처리 된 동물에서 PBS 처리 마우스 (N = 3, p &lt;0.005). 로 표시 데이터가 ± SEM을 의미한다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54153/54153fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54153/54153fig3.jpg" /> DTT. HBE 세척 처리 HBE 세척시 MUC5AC와 MUC5B 뮤신도 3 환원 30 37 ℃에서 0, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 및 100 mM의 DTT로 처리 minut에스. 멤브레인은 토끼 다 클론 항 MUC5B (녹색) 및 마우스 클론 항 MUC5AC (빨간색)와 프로브 하였다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54153/54153fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54153/54153fig4.jpg" /> DTT. MUC5AC와 MUC5B 신호 강도로 치료 HBE 세척에서 다량 밴드의 점액 아가로 오스 젤보기 실종의 정량 분석은 점액 젤의 각 레인을 측정 하였다 그림 4. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54153/54153fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

점액 아가로 오스 겔 전기 영동 : 높은 분자량 당 단백질에 대한 웨스턴 블로 팅


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

mucin-agarose-gel-electrophoresis-western-blotting-for-high-molecular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

25.4K 조회수.  University of North Carolina at Chapel Hill. Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly. 

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Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동을 사용하여 인간의 MXA의 멀티 서브 유닛 단백질 복합체의 특성

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

연구

생화학

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

웨스턴 Invitrogen NuPage Novex BIS 트리스 MiniGels를 사용하여 모래 바닥

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

생물학

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. The ability to readily detect the formation of these fibers under various experimental conditions is essential for understanding their potential function. Many methods have been used to detect the fibers, but not without some drawbacks. For example, electron microscopy (EM), or staining with Congo Red or Thioflavin T often requires purification of the fibers. On the other hand, semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis (SDD-AGE) allows detection of the SDS-resistant amyloid-like fibers in the cell extracts without purification. In addition, it allows the comparison of the size difference of the fibers. More importantly, it can be used to identify specific proteins within the fibers by Western blotting. It is less time consuming and more easily accessible to a wider number of labs. SDD-AGE results often show variable degree of heterogeneity. It raises the question whether part of the heterogeneity results from the dissociation of the protein complex during the electrophoresis in the presence of SDS. For this reason, we have employed a second dimension of SDD-AGE to determine if the size heterogeneity seen in SDD-AGE is truly a result of fiber heterogeneity in vivo and not a result of either degradation or dissociation of some of the proteins during electrophoresis. This method allows fast, qualitative confirmation that the amyloid or amyloid-like fibers are not partially dissociating during the SDD-AGE process.

Here we use two-dimensional semi-denaturing agarose gel electrophoresis to confirm the presence of amyloid-like fibers of heterogeneous size and exclude the possibility that the size heterogeneity is due to dissociation of the amyloid fibers during the gel running process.

2 차원 반 변성 세제 Agarose 젤 전기 이동 법 확인 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유의 크기가 하 사용

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

세미 Denaturing 세제 - 아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 아밀로이드 집계에 대한 심사

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

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Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. However, monoclonal antibody functionality and half-life may be reduced by the type and distribution of host-specific glycosylation. Attempts to produce superior antibodies have inspired the development of genetically modified producer cells that synthesize glyco-optimized antibodies. Glycoengineering typically requires the generation of a stable knockout or knockin cell line using methods such as clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9. Monoclonal antibodies produced by engineered cells are then characterized using mass spectrometric methods to determine if the desired glycoprofile has been obtained. This strategy is time-consuming, technically challenging, and requires specialists. Therefore, an alternative strategy that utilizes streamlined protocols for genetic glycoengineering and glycan detection may assist endeavors toward optimal antibodies. In this proof-of-concept study, an IgG-producing Chinese hamster ovary cell served as an ideal host to optimize glycoengineering. Short interfering RNA targeting the Fut8 gene was delivered to Chinese hamster ovary cells, and the resulting changes in FUT8 protein expression were quantified. The results indicate that knockdown by this method was efficient, leading to a ~60% reduction in FUT8. Complementary analysis of the antibody glycoprofile was performed using a rapid yet highly sensitive technique: capillary gel electrophoresis and laser-induced fluorescence detection. All knockdown experiments showed an increase in afucosylated glycans; however, the greatest shift achieved in this study was ~20%. This protocol simplifies glycoengineering efforts by harnessing in silico design tools, commercially synthesized gene targeting reagents, and rapid quantification assays that do not require extensive prior experience. As such, the time efficiencies offered by this protocol may assist investigations into new gene targets.

The glycosylation pattern of an antibody determines its clinical performance, thus industrial and academic efforts to control glycosylation persist. Since typical glycoengineering campaigns are time- and labor-intensive, the generation of a rapid protocol to characterize the impact of glycosylation genes using transient silencing would prove useful.

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Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

생체공학

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role in a variety of basic biological structures and processes. As polymers, GAGs exist as a polydisperse mixture containing polysaccharide chains that can range from 4000 Da to well over 40,000 Da. Within these chains exists domains of sulfation, conferring a pattern of negative charge that facilitates interaction with positively charged residues of cognate protein ligands. Sulfated domains of GAGs must be of sufficient length to allow for these electrostatic interactions. To understand the function of GAGs in biological tissues, the investigator must be able to isolate, purify, and measure the size of GAGs. This report describes a practical and versatile polyacrylamide gel electrophoresis-based technique that can be leveraged to resolve relatively small differences in size between GAGs isolated from a variety of biological tissue types.

This report describes techniques to isolate and purify sulfated glycosaminoglycans (GAGs) from biological samples and a polyacrylamide gel electrophoresis approach to approximate their size. GAGs contribute to tissue structure and influence signaling processes via electrostatic interaction with proteins. GAG polymer length contributes to their binding affinity for cognate ligands.

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Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Two-Dimensional Gel Electrophoresis

Two-dimensional gel electrophoresis (2DGE) is a technique that can resolve thousands of biomolecules from a mixture. This technique involves two distinct separation methods that have been coupled together: isoelectric focusing (IEF) and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). This physically separates compounds across two axes of a gel by their isoelectric points (an electrochemical property) and their molecular weights.
The procedure in this video covers the main concepts of 2DGE and a general procedure for characterizing the composition of a complex protein solution. Three examples of this technique are shown in the applications section, including biomarker detection for disease initiation and progress, monitoring treatment in patients, and the study of proteins following posttranslational modification (PTM).
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Two-dimensional, or 2D, gel electrophoresis is a technique utilizing two distinct separation methods which can separate thousands of proteins from a single mixture. One of the techniques, SDS-PAGE or sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, cannot fully separate complex mixtures alone. 2D gel electrophoresis couples the SDS-PAGE to a second method, isoelectric focusing or IEF, which separates based on isoelectric points, allowing for the resolution of potentially all proteins in a cell lysate. This video will show the principles of 2D gel electrophoresis, a general procedure, and some of its biomedical applications.
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2D gel electrophoresis begins with IEF as the first dimension. Every protein has a pH value, called the isoelectric point or pI, where the net charge is zero. When a protein is subjected to an electric field, it will move toward the electrode with opposite charge. Samples of interest are loaded onto immobilized pH gradient, or IPG, strips which have embedded ampholytes, molecules containing both acidic and basic groups. An electric field is then applied to the pH gradient strip, causing the proteins to migrate until they reach the pH value matching their pI, where they lose their net charge.
Prior to running the second-dimension, the embedded proteins are treated with SDS, denaturing them and providing a uniform negative charge. Once completed, the IPG strips are placed onto a polyacrylamide gel. An applied electric field draws the proteins toward the anode, with larger proteins moving more slowly through the gel.
Once the protein mixture has been separated according to pI and molecular weight, the proteome map is visualized using stains, and proteins of interest are identified.
Now that we have discussed the principles of 2D gel electrophoresis, let&#39;s go over a typical laboratory procedure.
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Before the experiment can be performed, the proteins must be solubilized into media. Solubilization of the sample is achieved by de-aggregating proteins with a combination of chaotropic agents for disrupting hydrogen-bonding interactions, nonionic detergents to prevent altering of the proteins&#39; charge, reducing agents to break disulfide bonds, and buffers. To remove interfering abundant proteins and other molecules, the material is sequentially extracted by centrifugation, and collection of the resulting pellet; followed by treatment with endonuclease, an enzyme used to consume any DNA that would interfere with the experiment.
Once the proteins have been solubilized, IPG strips are prepared by rinsing with a strip-cleaning solution and left upside-down to dry. Each strip is then assigned a strip holder number. Once ready, the cellular extract is loaded onto the strips in a slow, sliding motion from the negative to the positive end. For the purpose of rehydration, damp blotting paper is placed on top of the electrode and under the gel strips; the IPG strips are then lined onto the IEF instrument. A high electric current is applied, and the proteins begin to migrate.
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Following completion of the first dimension, the gel for SDS-PAGE is prepared in a casting apparatus. The IPG strips are treated by placing them face down in SDS-containing equilibration buffer. The electrophoresis unit is readied with the addition of electrophoresis buffer. The treated IPG strips are collected using tweezers, placed on top of the gel plates, and sealed with agarose-sealing solution. A voltage source then applies an electric field, which is held until the fastest-moving proteins are 1 cm from the bottom of the gel.
After completion of the electrophoresis, the proteins must be visualized. Traditionally this is performed by staining with Coomassie blue or silver nitrate. Proteins of interest may be transferred from the gel, and analyzed by Western blot analysis.
A second identification approach involves excision of the proteins from the gel, digesting them, than analyzing them by mass spectrometry.
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Now that we&#39;ve reviewed a procedure, let&#39;s look at some of the uses for 2D gel electrophoresis.
One of the most common uses for this technique is the identification of molecules involved in disease initiation and progression. 2D gel electrophoresis, coupled with mass spectrometry, can detect the up- or down-regulation of specific proteins in diseased areas in comparison to healthy ones.
Additionally, 2D gel electrophoresis is useful in following the progress of patients&#39; response to a potential therapeutic drug. Specimens may be taken from patients at various timepoints following administration of the treatment. In this way, 2D gel electrophoresis coupled with Western blot or mass spectrometry analysis, can detect proteins associated with negative responses such as inflammation; or the absence of proteins in an alleviated state.
Another use for 2D gel electrophoresis is in the study of protein structure and function following posttranslational modification, or PTM, which are additions to proteins following their translation from mRNA. PTM&#39;s can regulate a variety of functions, including protein signaling, gene expression, or cause oxidative damage. 2D gel electrophoresis is sensitive to modifications such as methylation or acetylation, which can cause a shift in pI as well as the molecular weight.
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You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on 2D gel electrophoresis. This video described the principles of the technique, a typical experimental procedure, and several of its applications in the field of biomedicine.
Thanks for watching!
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Two-dimensional gel electrophoresis (2DGE) is a technique that can resolve thousands of biomolecules from a mixture. This technique involves two distinct ...

교육

JoVE Science Education

화학

Polyacrylamide Gel Electrophoresis: An Analytical Technique to Detect Heparan Sulfates of Varying Chain Lengths Isolated from Mouse Lung Tissue

Source: LaRiviere, W. B. et al., <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/62319">Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining</a>. J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the separation procedure of heparan sulfates isolated from mouse lung tissue using polyacrylamide gel electrophoresis.

폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 마우스 폐 조직에서 분리된 다양한 사슬 길이의 헤파란 황산염을 검출하는 분석 기법

Source: LaRiviere, W. B. et al., Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining. J. Vis. Exp. (2021)
This video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Electrophoresis Techniques

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

Source: Zhan, X., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56739">Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we demonstrate a two-dimensional gel electrophoresis method that separates individual proteins from a complex protein mixture obtained from tumor tissues of human nonfunctional pituitary adenoma (NFPA). The proteins are separated based on their electric charge in the first dimension and further separated based on molecular weights in the second dimension.

2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 전하와 분자량에 근거를 둔 복잡한 단백질 혼합물에 있는 단백질의 분석을 위한 별거 기술

Source: Zhan, X., et al. Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue ...