This project was funded by the DFG Excellence Cluster 171, the Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, the Bernstein Center for Computational Neuroscience and the ENC-Network, an Erasmus Mundus Joint Doctoral Program. The authors thank Stephan Junek, Mihai Alevra and Guobin Bao for providing MATLAB codes and custom-written programs for image evaluation and data analysis.

Xenopus의의 laevis의 올챙이 모든 실험은 동물 실험 윤리의 괴팅겐 대학위원회가 승인 한 지침에 따라 수행 하였다. 1. Electroporation에 <ol><li> Nieuwkoop 및 페이버 7 항에있어서, 단계 49-54의 동물을 선택합니다. </li><li> 녹화 설정은 큰 작동 거리와 최소 2 Hz의 주파수에서 20 밀리 초 20 V의 전압 펄스를 적용 할 수있는 전기 장치와 실체 현미경으로 구성되어 있는지 확인합니다. 그들이 손상시키지 않고 올챙이 &#39;콧 구멍에 삽입 할 수 있도록 200 ㎛의 대략 직경 개의 백금 전극을 통해 전압 펄스를 적용한다. </li><li> 덱스 트란 복합 염료의 결정을 준비합니다 (예를 들어, 칼슘 그린 10 kDa의 덱스 트란, 또는 알렉사 플 루어 647 10 kDa의 덱스 트란)의 작은 방울을 증류수 약 100 ㎕의 5 밀리그램의 일반적 전달 양을 용해시키는로파라 필름 한 장에 건조 2 μL. 참고 : 크리스탈 미만 하루에 건조 년 이상 동안 냉장고에 -18 ° C에서 나중에 저장할 수 있습니다. </li><li> 이 특징 수술 마취 상태에 도달 할 때까지 1-2 분 동안 3 % Tricaine 메탄 설포 네이트를 함유하는 수돗물을 배치하여 동물을 마취는 심박수, 모든 움직임의 감소 및 기계적 자극에 대한 응답의 부족을 감소시켰다. </li><li> 순수한 수돗물에 10 초 동안 마취 동물을 담가. </li><li> 젤 쿠션에 동물을 배치하고 그것을 해치지 않고 주위에 바늘을 삽입하여 고정합니다. 참고 : 그 피부를 통해 바늘을 파고에 의해 동물을 수정하지 마십시오. </li><li> 부드럽게 티슈로 코 주변 지역을 건조. </li><li> 실체 현미경하에 동물을 놓고 콧 구멍에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> , 콧 구멍 구멍을 일치하는 크기의 염료 크리스탈을 선택하는 집게를 사용하여 비강 중 하나에 배치하고 완전히 용해 될 때까지 승, 대기HICH 미만 1 분 걸립니다. 결정이 작은 경우가 아닌 투명한 고 농축 용액을 제조 할 때까지, 각각의 캐비티 내에 2 또는 3을 추가한다. </li><li> 올챙이의 피부와 콧 구멍 중 하나에 양극에 음극을 배치합니다. 참고 :이 특정 설정 단계 1.3에서 인용 된 염료에 적용됩니다. 다른 극성 염료의 염색 결과는 콧 구멍에 캐소드를 배치함으로써 개선 될 수있다. 염료의 극성에 대해 확신이 양 전극은 코 (비공 당 하나)에 동시에 배치 될 수 있으면 단일 극성 전압 펄스를 번갈아. </li><li> 자극 간격의 약 0.5 초 20 V, 20 밀리의 여섯 펄스를 적용합니다. 주 : 작은 기포가 전극을 피부와의 비공 액과 접촉하는 것을 제공하는 일렉트로 동안 비공에 전극의 주위에 표시한다. 기포를 볼 수없는 경우 연결 케이블을 확인하고 확인 electroporating의 배포 장치를 만들E는 소정의 전압 펄스를 제공한다. </li><li> 두 번째 콧 구멍 절차 (1.9-1.11)를 반복합니다. </li><li> 실온에서 수돗물로 가득 비커에 일렉트릭 올챙이를 전송합니다. 동물이 의식을 회복하고 수영을 다시 시작까지 5 ~ 10 분을 기다립니다. 를 공급하고 염료가 후각 망울에 후각 신경을 따라 이송되는 동안 적어도 하루 동안 복구 할 수 있습니다. </li><li> 최고의 이미징 결과에 대한 전기 다음 1-7일 내에서 전기 천공 동물을 사용합니다. 촬영 전에 염료 전송 및 복구를 위해 최소 24 시간의 시간을 준다. </li></ol> 2. 전체 마운트 준비 <ol><li> 모든 동작이 정지 했으므로 더이상 기계적 자극에 응답 할 때까지 3 % Tricaine 메탄 설포 네이트를 함유하는 수돗물 동물을 마취. </li><li> 실체 현미경 하에서 젤 쿠션에 올챙이를 전송하고 FO의 양쪽에있는 피부를 통해 바늘을 파고하여 단단히 고정rebrain. </li><li> 그 척수를 절단하여 올챙이를 희생. </li><li> 비강, 후각 신경과 후각 전구 (그림 1A)를 모두 포함하는 조직의 블록을 해부하는 메스를 사용합니다. 터치-없이 콧 구멍 가까운 왼쪽에있는 첫 번째 절개를하여-과 telencephalic-diencephalic 국경까지 왼쪽 후각 신경 전구 함께 블레이드 앞으로 절단 이동합니다. 오른쪽에 마찬가지로 마십시오. telencephalon에 파이널 컷 후방함으로써 신경계의 나머지 제조 격리. </li><li> 올챙이의 몸 폐기 및 두뇌 준비의 복부 측면이 위쪽으로 향하도록 조심스럽게 거꾸로 조직 블록을 뒤집습니다. </li><li> 후각 신경 사이에 두 바늘을 삽입하여 다시 조직 블록을 고정. </li><li> 개구리 링거액 (98 mM의 염화나트륨, 2 mM의 KCl을 한 방울을 넣고, 1 mM의 CaCl2를 2 밀리미터의 MgCl 2, 5 mM의 글루코오스, 5 mM의 나트륨 피루 베이트, 10 mM의 HEPES는 pH가 7.8, osmola 조정조직에 230 mOsmol / L)의 RITY. </li><li> 미세 가위를 사용하여 세 절개를하여 축삭 정렬 영역을 커버하는 수막과 후각 전구를 제거합니다. 전구에 후각 신경의 입사 점 (축삭 정렬 영역)까지 왼쪽 후각 망울 따라 caudorostrally 가깝게 절단 티슈 블록의 후방 에지로부터 출발. </li><li> 오른쪽 반구 단계를 반복 2.8. </li><li> 집게와 수막을 올리고 축삭 정렬 영역에서 이전의 것들에 수직, 세 번째 컷을 확인합니다. 참고 : 후각 망울의 복부 측면은 이미징 및 일시 로딩 이제 액세스 할 수 있습니다. </li><li> 투과광 화상의 화상 품질을 개선하기 위해, 등쪽을위한 절차를 반복한다. 이러한 추가 단계는 일시로드의 마이크로 피펫의 탐색을 용이하게하지만, 엄격하게 필요하지 않습니다 수 있습니다. </li><li> 추가 처리 및 이미징 개구리 벨소리로 채워진 기록 챔버에 샘플을 전송합니다. 의 확인복부 쪽이 위를 향 및 나일론 섬유의 순으로 샘플을 확보 것을 URE 작은 백금 프레임에 걸쳐 스팬. </li><li> 자극의 쉽게 응용 프로그램의 나일론 섬유의 하나의 상단에있는 비강을 배치합니다. </li></ol> 3. 일시로드 <ol><li> (V / W) AM 염료 원액을 제조 플루로 닉 F-127의 20 %를 함유하는 디메틸 술폭 시드 20 μL (DMSO) 칼슘 AM 염료 (예 FLUO-8 AM) 50 μg의 녹인다. 1-2 μL 볼륨의 작은 분량 씩 주식 솔루션을 동결. 원액 적어도 반년 동안 안정하지만, 동결 - 해동 사이클을 피한다. </li><li> 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 5-8 MΩ의 저항과 1 ~ 2 ㎛의 팁 직경과 피펫을 잡아 당깁니다. </li><li> 250-500 μM의 농도에서 개구리 링거액의 염료의 제조 원액을 녹인다. </li><li> 약제 내성 수송을 차단하는 500 μM의 농도에 도달하는 MK571를 추가합니다. </li><li> 신장 된 피펫 팁을 사용하여 용액 10 μL와 마이크로 피펫을 입력하고 마이크로 피펫을 쓸어 넘겨 모든 기포를 제거합니다. </li><li> 피펫 홀더에 마이크로 피펫을 마운트하고 압력이 주사기 또는 공기 약물 방출 장치를 수동으로 적용 게이지에 적용되는 압력을 모니터링 할 수 있는지 확인하십시오. </li><li> 가능하다면 마이크로 피펫 팁으로부터 유출 시각화 및 조절 될 수 있도록 분사 염료를 자극하는 기능을 현미경 설정을 사용한다. 이상적으로, 공 초점 이미지 설정을 사용합니다. 조직은 마이크로 피펫에 도달 할 수 있도록 침지 목적으로 직립 현미경을 사용합니다. </li><li> , 현미경 전체 마운트 준비를 놓습니다 전구까지 후각 신경을 따라 후각 망울에 대한 관심의 영역에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 제조의 가능성을 높이고 색소 누출을 세척하기 위해 상기 기록 챔버를 통해 신선한 링거 용액을 관류마이크로 피펫 팁에서. </li><li> 끝이 준비 주동이의 방향으로 가리키는, 후각 망울의 표면에 피펫을 낮 춥니 다. </li><li> 피펫의 막힘을 방지하고 부드럽게 조직에 삽입하는 마이크로 피펫에 작고 일정한 양의 압력 (~ 25 고전력 증폭기)를 적용합니다. </li><li> 피펫은 외부 조직 층을 위반하면, 승모판 세포 층에 rostro - 지느러미 방향으로 이동합니다. (전기에 의한 후각 수용체 뉴런의 카운터 염색은 마이크로 피펫의 위치를​​ 조정하는 것이 도움이된다합니다.) 이상적으로, 원하는 녹화 사이트 50-100 ㎛의 거리에 피펫 팁을 배치합니다. <ol><li> 온도에 민감한 γ-사구체 염색의 경우, γ-사구체의 시냅스 neuropil의 위치에서 약 50 μm의 rostrally 지역을 대상으로. </li></ol></li><li> 100 ~ 200 고전력 증폭기의 범위에 양압을 적용합니다. 크기에 따라 압력의 강도를 조정마이크로 피펫 팁. 압력은 처음인가 brightlight 조명 아래 보이는 약간 조직의 움직임에 대한 관찰하여 피펫의 유출을 확인한다. </li><li> 마이크로 피펫은 조직에 남아있을 때 약 10 분 동안 일정한 압력을 유지한다. 가능하면 성공적으로 로딩 시간이 지남에 따라 강도가 증가함에 따라 눈에 보이는 세포 인 somata 염색 발생하므로, 형광 조명 아래 셀 로딩에 대한 그 동안의 neuropil를 확인합니다. 주 : 종종 실패 넣는 이유는 팁 또는 응집 염료 클러스터를 들어 조직에 의한 피펫 막힘이다. 부드럽게 기록 챔버의 하부면에 그 끝을 위반하여 피펫을 구하기 위해 때때로 가능하다. 그러나, 피펫 팁 몇 마이크로 미터를 초과 할 수 없습니다. 일시 로딩 중 낮은 압력을 적용하여 더 큰 피펫 구멍을 보정합니다. </li><li> 로딩 10 분 후, 제로로인가 된 압력을 감소시키고 염색을 확인한다. 노트: 스테인드 영역의 크기가 매우 다양하며 주입 염료 및 배출 사이트의 위치의 양 등 여러 매개 변수에 따라 달라집니다. 좋은 염색 약 100 μm의 × 100 μm의의 영역을 다룹니다. </li><li> 스테인드 영역이 너무 작거나 원하는 녹화 사이트를 포함하지 않는 경우, 반복 3.10-3.13 단계를 반복합니다. 이 아직 막혀 있지 않은 경우, 다음 주사 동일한 마이크로 피펫을 사용한다. </li><li> 염료 흡수 및 deesterification 수 있도록하는 실험을 시작하기 전에 마지막 주사 후 최소 30 분을 기다립니다. 항상 신선한 링거 용액 기록 챔버를 관류하는 것을 계속한다. </li></ol> 4. 측정 설정 <ol><li> 측정 설정이 세 가지 차원 볼륨을 기록하기에 충분한 속도로 공 초점 현미경으로 구성되어 있는지 확인합니다. 스택 당 적어도 1 Hz에서의 수집 속도를 선택합니다. 참고 : 적절한 설정 샘플 라인 현명한 대신에 P로 포인트를 스캔 예 라인 조명 현미경을위한 포함OINT. 이러한 설정의 간단한 구현은 앞서도 6을 설명 하였다. 다른 옵션은 디스크 현미경을 회전합니다. 이러한 설정을 사용할 수없는 경우, 정상 점 스캐닝 설정으로 작은 영역을 측정하는 것이 여전히 가능하다. </li><li> 사구체의 크기에 맞게 충분히 큰 볼륨을 커버 할 수 있도록, 측정 파라미터를 설정한다. 주 : 기록 량의 전형적인 두께는 적어도 5 층에 의해 커버되어야 20 μm의 범위이다. </li><li> 표백에 대한 모든 시냅스 측정을 확인합니다. 녹화 된 영상의 평균 형광 강도는 기록 시간 경과 이상 떨어지지 않을 때까지 레이저 출력을 조정한다. </li><li> 20-30 초 표백 초과 측정에 발생할 수 있지만, 가급적 백화를 방지하는 시냅스 측 기록에 대한 측정 시간과 면적을 제한한다. </li></ol> 5. 냄새 응용 프로그램 및 온도 실험 <ol><li> (25)을 붓고신선한 링거 용액 ㎖를 50 ㎖의 튜브 (이전 39 ° C에서 저장). 얼음 양동이에 튜브를 놓습니다. </li><li> 튜브로 온도계의 깨끗한 프로브를 삽입하여 냉각 링거의 온도를 모니터한다. 온도가 실험을 시작하기 전에 1 ° C 이하로 떨어질 때까지 기다립니다. </li><li> 10 μM의 농도에서 링거 용액에 용해 L 히스티딘 50 ㎖를 준비한다. </li><li> 챔버 내의 물 흐름 자극 용액의 방출 동안 일정하고 방해받지 유지되도록 깔때기 어플리케이터 8 또는 관류 벨소리로 병용 자극 전달을 허용 유사 응용 시스템을 사용한다. 원위 출구 1mm 미만 떨어져 후각 상피로부터되는 방식으로 깔때기를 놓고. </li><li> 상피에 디지털 온도계 가까이 깔때기 어플리케이터의 출구에 연결에 NiCr - 니켈 온도 센서를 배치합니다. 기록 시각 DIS하는 컴퓨터 온도계 출력 단자 배선작은 온도 변화를 반영하는 전압 변경을한다. </li><li> 실험을 시작하기 전에, 전압 - 온도 스케일 팩터를 확립하는 표준 온도계 다른 thermosensor 연결한다. </li><li> 기록 용기 내의 욕 온도 조사하고 22 ° C를 초과하지 않는 것을 보장한다. </li><li> 이미지 획득을 시작하고 순차적으로 20 ~ 30 초간의 interstimulus 간격으로 전자 피펫을 통해 차가운​​ 벨소리, L 히스티딘과 상온 벨소리 (20-22 °에 C)의 200 ~ 400 μl를 적용합니다. 자극 프로그램의 더 나은 제어를 위해, 피펫 가능한 경우에 선택 이미지 설정에 의해 전송 된 트리거 신호에 의해 자극을 해제. 재현 가능한 결과에 대한 응용 프로그램 프로토콜을 반복합니다. </li><li> 그들이 활동 상관 이미징 후 영상 분석을 위해 바람직하기 때문에 자극의 여러 라운드에 더 이상 녹음의 세트를 가져 가라. 주 : 기록 시간 슬라이스 생존 절충을 갖는다찾을 수 있습니다. 6 자극 프로그램을 덮고 약 2 분의 측정은 네트워크의 양호한 재구성을위한 충분한 활성을 제공한다. </li></ol> 6. 이미지 처리하여 활동의 상관 관계 이미징 (ACI) <ol><li> 사전 시냅스 녹음의 이미지 처리 <ol><li> 차가운 링거 용액과 히스티딘에 의해 자극과 녹음에서, 서로 다른 응답 프로필 (Kludt 등. 5 참조) 이웃 히스티딘에 민감한 사구체에서 온도에 민감한 γ-neuropil를 구분합니다. </li><li> ORNs는 γ-사구체의 양자 신경 분포를 시각화하기 위해 두 개의 서로 다른 염료로 전기 천공되어있는 두뇌 준비의 녹음에서 축 방향으로 최대 강도 투사를 만듭니다. </li></ol></li><li> 활동의 상관 관계 이미지를 사용하여 후 시냅스 녹음의 이미지 처리 (ACI) <ol><li> 충분한 시간 포인트 (10 개 이상으로 선택 녹음0 프레임) 및 활동의 상당한 금액 (적어도 두 개의 이벤트). 참고 : 활동이 후각 자극에 의​​해 활성화 된 셀룰러 네트워크를 나타 내기 위해 동일한 기록하는 동안 자극의 여러 응용 프로그램에서 하나의 승모판 세포의 프로세스 또는 유도 공개를 자발적 될 수 있습니다. </li><li> 측정 된 구조는 기록의 시간 과정을 통해 더 이상 2-3 이상의 픽셀을 이동 위치 기록을 선택합니다. 참고 : 너무 많은 운동과 녹음이 Kludt 등에 설명 된 시프트 보정 절차를 적용하여 구조 할 수있다 (5). </li><li> 녹음이 표백 고통 있는지 확인합니다. 화상 전체의 평균 강도는 기록 시간 경과에 걸쳐 떨어지면, 표백제 보정 그렇지 않으면 다음의 두 단계를 건너 뛸 필요가있다. </li><li> 선형 회귀 분석을 수행함으로써, 각 화소의 시간 추적에 대해 선형 추세를 계산한다. </li><li> 각 픽셀의 결과 빼기 개별적 선형 componen을 제거표백의 t. 주 : 바오 및 차일드 (9)에 의해 설명 된 바와 같이 대안 르장 피팅이 사용될 수있다. </li><li> Junek 등에 의해 설명 된 바와 같이 활동 상관 이미징을위한 단계별 가이드 (ACI)와 함께 즉시 사용 MATLAB 스크립트를 다운로드합니다. (6) 참고 :. 제공된 MATLAB 스크립트를 사용하는 대신 Junek 등 6에 설명 된 단계를 따릅니다. </li><li> 데이터 평가에 사용되는 시스템의 MATLAB 경로 다운로드 용기로부터 파일 &#39;aci.m&#39;, &#39;matVis.m&#39;및 &#39;aci_roiSelector.m&#39;을 이동. </li><li> X 및 Y는 측방 치수, Z 축 방향과 t, 시간 경과에 참조와 함께 [X, Y, Z, t] -matrix로 구성 MATLAB의 사용자 작업 공간 변수로 단계 5.8에서 취득한 원 데이터를로드 . </li><li> MATLAB 명령 줄에서 전화 &#39;ACI&#39;. </li><li> 사용자 인터페이스 (UI)선택의 데이터를 준비 &#39;나타나는, 데이터 및 결과가 저장 될 디렉토리를 포함하는 변수를 선택한다. 참고 : UI에 대한 자세한 설명이 매뉴얼은 ACI 스크립트를 동반 참조하십시오. </li><li> 표시 분산 맵의 개요를 얻을 수있는 UI에 해당 슬라이더를 이동하여 측정 된 Z-층을 스크롤합니다. </li><li> 인터페이스에 대한 관심 (ROI)의 영역의 크기를 입력한다. 승모판 세포 소마의 경우 약 10 μm의 측면에 5 μm의 축 방향에 걸쳐 투자 수익 (ROI)을 조정합니다. 사구체를 들어, 축 (20) 측면 μm의 10 μm의의 약간 높은 값이 적합합니다. 주 : ROI의 크기는 기록을 위해 선택된 화소 스케일링에 따라 다수의 픽셀로 입력한다. </li><li> cente에 마우스 가운데 버튼으로 클릭하여 주변 승모판 각 셀 볼 소마의 γ-사구체 및 추가 지역을 포함하는 투자 수익 (ROI)을 선택셀 / 사구체의 연구. </li><li> 상관의 계산은 모든 참조 추적 맵을 트리거 메인 UI를 닫습니다. 결과는 자동으로 저장되어 표시됩니다. </li></ol></li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+silent+cells,+synchronization+and+modulatory+activity+in+developing+cellular+networks.">Detection of silent cells, synchronization and modulatory activity in developing cellular networks.</a> Dev Neurobiol. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Xenopus의의 후각 망울이 올챙이를 laevis의에서 여기에 제시된 방법은 기록 온도 처리를 목표로하고 있습니다. 첫 번째 프로토콜 얼룩과 후각 망울에서 2 차 신경 세포와 후각 시스템이 주로 그대로 남아있는 샘플 준비를 제공합니다. 따라서, 온도에 민감한 γ-사구체의 작동을 모니터링 및 항암 성 사구체 이웃과 비교 될 수있다. 이 사구체의 독특한 양자 신경 분포는 스펙트럼 서로 다른 염료로 전지 전기에 의해 가시화된다. 또한, 일시로드는 후각 망울 내에서 많은 양의에 걸쳐 승모판 세포의 염색이 가능합니다. 신경 네트워크 처리 온도 - 유도 신호는 반복 자극 애플리케이션 칼슘 측정과 후속 활동 상관 촬상하여 데이터를 분석함으로써 드러난다. 이 프로토콜은 두 개의 정교한 염색 proce을 강조<html> 만족하고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 신중한 조작과 실제 필요할 둘 절차들. 일렉트로 동안 동물의 부상은 콧 구멍에 전극을 위치시키는, 특히 피해야한다. 최적, 후각 상피 세포와 접촉이 발생하지 않습니다. 동물이 여전히 전기 과정을 거친 후 살고과 복구 시간이 고려되어야합니다. 염색 사용한 색소의 종류에 따라 발생할 수있는 전기의 일주 후 너무 약한 남아 있으면, 그 강도는 콧 구멍에 염료 농도를 증가시킴으로써 향상 될 수있다. 덱스 트란 결합 분자 및 수동 확산 (1-2 월 / 10 일의 속도) 느린 축삭 수송 등 여러 가지 메커니즘을 통해 전송되기 때문에, 다른 대안은 동물을 희생하기 전에 전기 후 48 시간 기다려야하는 것입니다. 대안 적으로, 전기 복구 1 일 후 반복 될 수있다. jove_content는 &quot;&gt; 루스 로딩 공 초점 형광 현미경 절차를 모니터링. 승모판 셀에 진입하면 규제 어렵고 애플리케이션의 피펫 팁의 크기 및 위치와 같은 다양한 파라미터에 의존 색소 량이 보낸 중요한 단계이다 유용한 것으로 입증 염색 프로그램의 지속 기간을 조정함으로써 제제 걸쳐 유사한 염색 결과를 발생시킨다. 또한, 이전에 전기 천공 올챙이는.합니다 (γ-사구체를 포함하는) 작은 클러스터의 위치를​​ 식별하여 색소 애플리케이션에 대한 최적의 위치를​​ 결정하는 데 사용되어야하는 가장 측정시 주요 단계는, 상기 샘플의 양 변화 및 ​​탈색을 방지한다. 시프트 신중 현미경 링거 흐름을 위치시킴으로써 피할 수있다. 관심 영역의 표백을 제한하는 바와 같이, 측정 시간이 필수적으로 감소되어야 . 칼슘에 민감한 염료와 일시 로딩 염색은 매우 제공제한된 반면 건강한 세포는 일반적으로 이렇게 낮은 칼슘 농도가 이후 기저 약한 형광을 나타낸다. 활동의 상관 관계 이미징을 적용하면 유사한 칼슘 신호와 활동과 주요 구조에 따라 명암을 생성하여이 제한을 우회. 이 포스트 수집 해석 방법은 칼슘이자 (기준 트레이스)의 선택된 영역의 신호와 상기 3 차원 볼륨 각 화소의 사이의 상관 계수를 계산한다. 따라서 강력 얻어진 결과는 기준 트레이스로서 선택된 활동 패턴에 의존한다. 주요 초점은 승모판 세포의 신경 분포 패턴을 시각화하는 경우 자발적 신경 활성로부터 유도 된 기준 신호가 바람직하고, 가장 좋은 결과를 얻을 가장 활성 승모판 셀을 선택한다. 승모판 세포의 화학 치료 또는 온도에 민감한 네트워크를 드러내는를 들어, 만 히스티딘 또는 차가운 벨소리 중 하나에 대한 응답을 포함하는 기준 흔적을 선택해야합니다. 전체 사구체 오의 선택항상 두 개의 서로 다른 자극에 응답하는 구조가 서로의 상단에 누워있다 특히, 명확한 기준 추적을 제공하지 않을 수도 있습니다 관심의 영역과 연구 승모판 세포 소마. 이러한 경우, 관심있는 영역으로서 사구체 또는 전지 본체의 작은 영역을 선택하는 것이 유용하다. 지난 수십 년 동안, 전기가 하나 또는 여러 개의 셀 (11, 12)를 착색 할 수있는 효율적인 방법으로 설명되었다. 여기는 특히 후각 수용체 뉴런 레이블을하는 데 사용됩니다. 덱스 트란 공액 분자는 높은 효율을 제공하고, 비 - 칼슘 민감성 염료, 선택의 폭이 넓다 통상적 형광 현미경 (13)에 사용되는 전체 스펙트럼을 커버한다. 그러나 성공적으로 후각 수용체 신경 세포에 전기 천공되어 칼슘에 민감한 염료는 칼슘 녹색 덱스 트란에 한정되는 순간에, 그리고 FLUO-4 덱스 트란 여전히 경우 시중에서 판매. 또한, 녹음은 주로 superficia을 대상으로단지 후각 망울의 복부 표면에 L 층 빠른 측정 기술의 침투 깊이를 제한하기 때문이다. 이광자 촬상 부분적 이러한 한계를 극복하지만 종종 속도 부족 및 상기 선택 칼슘 민감성 염료의 양을 제한 할 수있다. 우리는 후각 망울에서 온도에 의한 활성을 측정 여기 프로토콜을 설명했다. 뇌 neuropil는 온도의 후각 처리에 관련된 복잡한 셀룰러 네트워크를 시각화하는 세 가지 차원 볼륨으로 스캔됩니다. 후각 망울에서 온도에 의한 활성 측정은 아주 최근 5를보고 다른 기술을 결합 구체적으로 정의 절차를 필요로하고있다. 위에서 설명한 기술의 주요 자산 세포 수백 후각 시스템의 대부분은 그대로 남아 준비 입체적으로 묘화되어있다. 이러한 이점은 뇌 P뿐만 아니라 염색 기법 높은 요구 넣어배상 및 이미징. 예를 들어, 셀 전기와 일시 로딩 후각 상피 세포 및 전구 세포를 대량 충돌하고, 따라서 완전한 셀룰러 네트워크의 시각화를 가능하게한다. 또한, 대신 유전자 인코딩 된 형광의 일시로드를 통해 화학 지표의 전달은 종의 잠재적으로 큰 세트에서 측정을 할 수 있습니다. AM 염료 목욕 배양 같은 다른 대안은 주로 손상 조직의 단지 몇 백 마이크로 미터를 떠나, 심각한 후각 망울에 손상을 조각에서 작동합니다. γ-사구체의 양자 신경 분포가 그대로 남아 있고 녹음 따라서 여전히 작동 시스템에서 찍은 것을 비교하여, 우리의 프로토콜에서 사용되는 전체 마운트 준비는 예를 들어 보장합니다. 마지막으로, 영상 자체가 3 차원 볼륨의 획득을 허용하는 라인 조명 현미경에 의해 수행된다. 라인 조명 현미경 가능한 최고 수집 속도 6을 제공하는 공 초점 기술 중 하나 인 &lt;/ SUP&gt; 필요한 후각 망울의 큰 부분을 커버한다. 느리게 수집 시스템을 사용하지만, 기록 된 볼륨의 크기가 감소되어야하는 단점을 가질 수있다. 최근에는, 빠른 화상 취득하는 다른 방법이 개발되었으며, 대안 (14, 15)로서 사용될 수있다. 그럼에도 불구하고, 라인 조명 현미경 충분한 속도와 해상도를 모두 얻을 수있는 가장 쉬운 방법 중 하나 남아있다. 여기에 적합한 이미지 설정을 선택하기위한 가이드 라인과 같은 몇 가지 정보를 다음과 같습니다. 칼슘 이미징이 두꺼운 뇌의 준비에서 내에서 수행되기 때문에, 설치가 괜찮은 confocality를 제공해야하며, 목표는 1.0 이상의 개구 수 있어야합니다. 참조 포인트에 대한, 라인 조명 현미경으로 찍은 녹음 0.5-1 공기 단위 핀홀 크기 표준 레이저 주사 현미경으로 촬영 된 영상에 대응한다. 빠른 획득 속도가 바람직하다. 20 ㎛의 두께를 갖는 볼륨 적어도 5리터 적용즈 100 μm의 × 100 μm의 관점의 측면 필드 및 0.5 ㎛ 이하의 화소 크기는 스택 당 1 Hz의 최소 속도로 스캔한다. confocality를 감소시키는 것은 계산의 광자의 양을 증가시키고 필요에 따라서 빠른 획득을 가능하게하지만, 더 포커스 아웃 광을 기록하는 단점이있다. 이러한 접근은 광학 슬라이스의 두께가 증가하기 때문에, 실제로 ACI (6)의 도포 후 다른 Z 플레인 통해 돌기의 추적을 용이하게 할 수있다. 필요한 도구는 광범위하게 여기 제시 후각 망울 네트워크에서 온도 처리를 공부합니다. 온도 - 유도 활성 칼슘 민감성 염료 및 신호 도착 및 γ-사구체 벗어나지 모두를 통하여 상기 제 1 및 제 2 차 뉴런에 기록된다. 또한, 범위는 개별 승모판 세포는 모두 화학 물질 및 온도 정보가 평가 될 수 처리합니다. 준비 레아 이후후각 망울 그대로 VES, 후각 처리에서의 신경 분포의 양자의 역할을 더욱 조사 할 수있다. 절차는 또한 후각 네트워크 (5)를 중복으로 인코딩하는 방법 서모 및 chemoinformation 여부 및 공개에 유용합니다. 마지막으로, 전술 한 기술은 후각 망울의 온도 반응 연구에 한정되는 것이 아니라 후각 시스템의 일반적인 평가 대형 입체 볼륨 특히 셀룰러 처리 네트워크에 적용될 수있다. 일시로드 및 활동 상관 영상은 서로 다른 뇌 네트워크 (16)에 적용하고, 관찰하고 신경 세포의 수십의 활동을 비교 할 수있는 강력한 도구입니다.

Over the last years, temperature sensitivity has no longer been described as a somesthetic sense only, but also as a physiological function relevant for the olfactory system. In rodents, the main olfactory bulb receives input from the Grueneberg ganglion (GG), an organ in the nasal cavity, consisting of thermosensitive neurons. GG neurons respond to cool temperatures1 as well as to chemical stimuli, and their chemosensitivity is modulated by temperature fluctuations2. These observations suggest that the olfactory bulb may integrate chemical and temperature information collected at the nose. In order to explore this hypothesis, we present here a set of experiments enabling the detection of temperature responses in the olfactory bulb of non-transgenic animals, using the Xenopus laevis larva as a model. The organization of the olfactory system in these animals closely resembles that of mammals. The olfactory receptor neurons of premetamorphic X. laevis terminate in tufts, and make synaptic contacts with the dendrites of second-order neurons, the mitral cells. Pre- and postsynaptic fibers intermingle and form skein-like neuropil structures called glomeruli3. The abundant synapses of the glomerular layer represent the first processing center of olfactory information. Mitral cells further integrate the sensory input and convey it to higher olfactory areas.
We have developed a protocol combining electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) with calcium-sensitive and non-sensitive dyes followed by bolus loading of the postsynaptic network of glomeruli and mitral cells. The staining by electroporation of two spectrally distinct dyes loaded in the nasal cavities serves to single out the &#947;-glomerulus3 through its bilateral innervation by ORNs from both olfactory epithelia. Thus, the location of the &#947;-glomerulus is identified prior to further measurements. Subsequently, bolus loading4 with Fluo-8 acetoxymethyl (Fluo-8 AM) is carried out in a volume comprising the &#947;-glomerulus. Imaging calcium changes with fast confocal microscopy allows the visualization of temperature responses in the 3D neuropil surrounding the &#947;-glomerulus, a unique temperature-sensitive glomerulus in this system5. Mitral cells innervating this specific structure can also be identified by their Ca2+ signals responsive to induced temperature drops. Next, activity correlation imaging6 uses the specific Ca2+ traces of these cells to reveal the dendritic morphology of thermosensitive mitral cells. Alternating repeated applications of cold Ringer solution and chemical odorants in one measurement can be used to visualize the mitral cell networks for odor and temperature processing surrounding the &#947;-glomerulus and identify potential overlaps. To unambiguously assign the responses to either the chemical or the temperature stimulus, we constantly monitor temperature at the olfactory epithelium.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="969">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Reagents</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:305px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:305px;">1064040500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:305px;">1049360250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:305px;">1023820250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:305px;">1058330250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">D(+)-Glucose</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:305px;">1083371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:305px;">P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">HEPES</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:305px;">1101100250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Calcium Green 10 kDa Dextran</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:305px;">C-3713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:305px;">D-22914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Alexa Fluor 546</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:305px;">D-22911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fluo-8 AM</td>
			<td style="width:191px;">TEFlabs</td>
			<td>203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MK571</td>
			<td>Alexis Biochemicals</td>
			<td style="width:305px;">340-021-M005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS-222</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:305px;">E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pluronic acid F-127</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:305px;">P2443</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">L-Histidine monohydrochloride monohydrate</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>53370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore</td>
			<td>1029522500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Equipment</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:305px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Electronic pipette</td>
			<td>BrandTech</td>
			<td style="width:305px;">HandyStep Electronic Repeating Pipette</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NiCr-Ni thermocouple</td>
			<td>Greisinger Elektronik</td>
			<td style="width:305px;">GTF 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td style="width:305px;">Model PC-10</td>
			<td>two-step puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Funnel applicator</td>
			<td>(Custom-made)</td>
			<td style="width:305px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Line-illumination microscope</td>
			<td>(Custom-made)</td>
			<td style="width:305px;"></td>
			<td>otherwise, a commercially available spinning disk microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective W Plan-Apochromat 63x/1.0&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:305px;">441470-9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective W Plan-Apochromat 40x/1.0 DIC</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:305px;">441452-9900-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Software</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:305px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">MATLAB</td>
			<td>The MathWorks</td>
			<td style="width:305px;"></td>
			<td>from R2010b upwards</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recording temperature-induced neuronal activity through monitoring calcium changes in the olfactory bulb of xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

후각 수용체 뉴런의 전기 (ORNs)는 활성 축삭 수송을 통해 선행 성 라벨링에 대한 덱스 트란 분자와 결합 알렉사 플 루어 염료 또는 칼슘 지표 달성했다. 전 염료 벌브의 사구체 층에서 분파 감각 뉴런 및 엑손 단자 밝게 염색을 제공하는 반면, 후자는 이들 세포에서 신경 세포 활성도를 측정 할 수 있도록 (도 1 및도 2). 먼저, 상기 열성 γ-사구체의 위치 및 신경 분포 패턴은 좌우 후각 상피 각각 (도 1a)에 형석 알렉사 647 덱스 트란 렉 형석 546 덱스 트란 electroporating 시각화 하였다. 스물 네 시간 시술 후, 콧 구멍에서 ORNs, 두 개의 후각 신경과 두 반구의 사구체 형광 현미경 아래에서 볼 수 있었다. 서로 다른 사구체 클러스터는 identifia했다각각의 위치에 의해 상상력의 γ-사구체 (그림 1B)를 포함 특히 작은 클러스터. 반대측 후각 섬유 소수의 전방 접합면을 건너 동측 γ-사구체 (그림 2A)에 종료, 반대측 후각 망울을 통해 달렸다. γ-사구체의 시냅스 섬유 칼슘 응답을 기록하기 위해, 칼슘 그린 덱스 트란 동일한 절차에 따라, ORNs에 전기 천공 하였다. 음의 온도 점프 빙냉 링거액의 제어 방출을 통하여 비공에서 유도 된 (0-1 ℃). γ-사구체를 포함하는 3 차원 볼륨 빠른 라인 조명 공 촛점 현미경으로 이미지화 하였다. -1 ° C ΔTs가 인식 할 수있는 ΔF / F 칼슘 흔적 가역 봉우리 (그림 2B &lt;으로 감기 γ-사구체에서 응답 및 구 심성을 유발하기에 충분했다/ strong&gt;을, C). 또한, 실험적인 단계들은 ramifying 수지상 말단 통해 γ-사구체 접속 승모판 세포 유도 초기 활성을 측정하기 위해 수행 하였다. 이러한 시냅스 섬유 및 주변 neuropil 효과적으로 칼슘에 민감한 염료 FLUO-8 오전 일시로드에 의해 염색, 수행 며칠 알렉사 647 후 덱스 트란은 ORNs에 전기 천공되었다 (그림 3A, B). 두 번 다음과 같은 패러다임에 따른 승모판 막 세포 FLUO-오전 8시로 가득하고, 후각 상피를 자극했다 : 차가운 벨소리, 히스티딘 (10 μM) 및 상온 벨소리는 이후에 적용했다. 두 개의 기준 흔적, 기록 된 볼륨에 대한 관심의 영역에서 하나 만 히스티딘하는 온도 방울, 다른 하나는, 독점적으로 응답을 촬영했다. 활동 상관 영상 (ACI) (6) 계산 된 선택 기준에 기반콘트라스트가 높은 온도 또는 히스티딘 응답 칼슘 신호 (그림 3C, D)에 하나를 대응하는 시냅스 네트워크의 수지상 형태를 시각적으로 추적합니다. 마지막으로, 열성과 chemosensitive지도는 색으로 구분했고, 온도 및 화학 물질 정보가 후각 2 차 뉴런 (그림 3E)에 각각의 사구체에서 전달되는 방법을 보여, 서로의 위에 겹쳐. 공유 후각 네트워크에서 정보의 두 가지 유형의 통합 및 처리에 대한 설명은 Kludt 등의 알을 참조하십시오. (5) <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig1.jpg" /> 그림 1 : ORN의 전기 및 러스로드의 개요 (A) X의 양쪽 비강에있는 후각 수용체 뉴런. laevis의 유충은 알렉사 염료 또는 calciu와 전기 천공 하였다덱스 트란 분자에 결합 m에 민감한 염료. 형광 표시기는 터미널 축삭 arborization 때까지 anterogradely 수송되었다. 24 시간 전기 후, 두 반구의 사구체 층은 형광 염색을 보였다. 하나의 반구에있는 후각 망울의 세포 조직의 (B) 도식. 사구체 층은 클러스터의 전구에 걸쳐 다음, 중간 작은, 중간 및 측면 클러스터를. 후각 정보 사구체에서 흥분성 시냅스를 통해 세포를 승모판하는 수용체 뉴런에서 전송된다. Periglomerular 세포 과립 세포는 후각 처리 및 부호화 변조 억제 뉴런이다. γ-사구체 (시안)을 쉽게 동측 (빨간색)과 반대측 (오렌지) 후각 섬유 병합 작은 neuropil로 확인되었다. (C) 루스 로딩 주로 승모판 세포 및 dendri 이루어진 시냅스 후 neuropil 얼룩하도록 γ-사구체 근방에서 이루어졌다사구체 층에 상당히 분기 틱 나무입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54108/54108fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig2.jpg" /> 그림 2 : ORNs의 Electroporation에 구조적 및 기능적 연결을 보여 동측 (녹색)에 의한 γ-사구체의 (A) 양측 신경 분포와 반대측 (적색) 후각 수용체 뉴런 (ORNs).. 스케일 바는 50 μm의 =. (B) 칼슘에 민감한 염료 칼슘 그린 덱스 트란과 전기 후 후각 망울. 인터 미디어 (IMC), 중간 (MC)와 작은 클러스터 (SC)를 볼 수 있습니다. 이미지를 100 ㎛의 두께의 측정 량의 최대 투영이다. 스케일 바는 50 μm의 =. (C) 작은 클러스터의 근접 촬영보기. 기록 된 볼륨 (12 μm의)입니다최대한의 투사로 표현. 이미지 오버레이 회색과 컬러 코딩 ΔF / F지도의 기초 형광 수준을 보여줍니다. 차가운 링거 용액과 자극에 대한 최대 응답이 그려집니다. 두 이웃 사구체가 침묵하는 동안 γ-사구체 강하게 반응. 삽입 된 관심의 표시 영역에 대응하는 γ-사구체에 대한 ΔF / F 추적을 보여줍니다. 파란색 막대는 자극 응용 프로그램을 나타냅니다. 스케일 바 = 20 μm의. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54108/54108fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig3.jpg" /> 그림 3 :. 작은 클러스터 종료 ORNs의 일시로드 및 ACI는 열성과 chemosensitive 네트워크를 해리 (A) 축삭은 비 calci와 전기에 의해 염색 하였다민감한 염료 알렉사 647 덱스 트란 음. 점선은 γ-사구체을 설명합니다. 칼슘에 민감한 염료 FLUO-오전 8시와 일시로드에 이어 두 번째 측정 채널 (A)과 동일한 영역의 (B) 이미지. 일부 승모판 세포 인 somata을 볼 수 있었다하지만, 반대로 제한했다. 화살표 다음의 두 가지 반응 미량 역가 상관 영상 (ACI)에 사용 된 플롯 하였다. 블루, 흔적 아래 빨간색과 검은 색 막대는 차가운 벨소리, 히스티딘 (10 μM) 각각 상온 벨소리와 같은 음성 대조군의 응용 프로그램의 시작을 묘사한다. 두 칼슘 흔적은 측정 된 볼륨의 관심을 다른 지역에서 촬영되었다. (C) 차가운 벨소리에 주로 응답 영역을 강조의 추적 (B)의 ACI 결과. (D) 히스티딘에 주로 응답 영역을 강조의 추적 (B)의 ACI 결과. 두 ACI지도 (E) 오버레이. 시간에 응답 승모판 막 세포istidine와 신경 지배 사구체 (적색) 열성 승모판 막 세포와 γ-사구체 (시안)에서 쉽게 구별했다. 이 그림의 모든 이미지는 28 μm의 두께 볼륨의 최대 강도 예측이다. 스케일 바 = 20 μm의. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54108/54108fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

의 후각 망울에서 칼슘의 변경 사항을 모니터링을 통해 온도에 의한 신경 세포의 활동을 기록<em&gt; Xenopus의의 laevis의</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

recording-temperature-induced-neuronal-activity-through-monitoring

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

7.2K 조회수.  Georg-August-Universität Göttingen. Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose. 

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Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

광 반사율과 Autofluorescence 신호를 사용하여 마우스 후각 망울에서 이미징 냄새 Evoked 활동

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

연구

신경과학

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., homosynaptic facilitation) 1. These hypotheses can be tested by simultaneously monitoring changes in intracellular calcium and alterations in synaptic efficacy. We demonstrate how this can be accomplished by combining calcium imaging with intracellular recording techniques. Our experiments are conducted in a buccal ganglion of the mollusc Aplysia californica. This preparation has a number of experimentally advantageous features: Ganglia can be easily removed from Aplysia and experiments use adult neurons that make normal synaptic connections and have a normal ion channel distribution. Due to the low metabolic rate of the animal and the relatively low temperatures (14-16 &deg;C) that are natural for Aplysia, preparations are stable for long periods of time. 
To detect changes in intracellular free calcium we will use the cell impermeant version of Calcium Orange 2 which is easily 'loaded' into a neuron via iontophoresis. When this long wavelength fluorescent dye binds to calcium, fluorescence intensity increases. Calcium Orange has fast kinetic properties 3 and, unlike ratiometric dyes (e.g., Fura 2), requires no filter wheel for imaging. It is fairly photo stable and less phototoxic than other dyes (e.g., fluo-3) 2,4. Like all non-ratiometric dyes, Calcium Orange indicates relative changes in calcium concentration. But, because it is not possible to account for changes in dye concentration due to loading and diffusion, it can not be calibrated to provide absolute calcium concentrations. 
An upright, fixed stage, compound microscope was used to image neurons with a CCD camera capable of recording around 30 frames per second. In Aplysia this temporal resolution is more than adequate to detect even a single spike induced alteration in the intracellular calcium concentration. Sharp electrodes are simultaneously used to induce and record synaptic transmission in identified pre- and postsynaptic neurons. At the conclusion of each trial, a custom script combines electrophysiology and imaging data. To ensure proper synchronization we use a light pulse from a LED mounted in the camera port of the microscope. Manipulation of presynaptic calcium levels (e.g. via intracellular EGTA injection) allows us to test specific hypotheses, concerning the role of intracellular calcium in mediating various forms of plasticity.

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

We demonstrate how changes in the intracellular free calcium concentration and synaptic efficacy can be simultaneously monitored in a ganglion preparation of Aplysia. We image intracellular calcium using a fluorescent dye, Calcium Orange, and induce and monitor synaptic transmission with sharp (intracellular) electrodes.

연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

에서 신경 Explant의 문화<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

의 해부, 문화, 및 분석<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 배아 망막 조직

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (<em&gt; Schistocerca 아메리카나</em&gt;) 강한 회로

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

테스트 시각 기능에 대한 간단한 행동 분석<em&gt;는 Xenopus laevis의</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

깨어 마우스의 신경 활성 물질의 Microiontophoretic 응용 프로그램과 결합하여 신경 활동의 세포 외 기록

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

후각 감각 축색 돌연변이 분자 식별 코드의 시각화를위한 뒷 전구의 4 배 면역 면역 측정법

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...