We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.

세포의 1. 형광 표식 참고 : 형광 염료 9 레이블 아교 모세포종 세포주 및 미세 아교 세포. 대안 적으로, 14에서 설명한 바와 같이 이러한 구조적 GFP / RFP 형광 단백질을 발현 세포주를 생성한다. <ol><li> 염색의 날에 80 % 합류 - 6 웰 플레이트에 플레이트 세포는 70이 될 것이다하도록. 뮤린 아교 모세포종 세포주 GL261 인간 아교 모세포종 세포주 U87, 플레이트 1 × 106 1.5 × 106 세포에 각각 염색 전에 6cm 접시에 24 시간. </li><li> , DMSO에 형광 세포 염색 염료 솔루션을 준비하고 미디어에 5 μm의 염료를 추가하거나 로즈웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) 또는 대 식세포 무 혈청 배지 (MSFM), 잘 소용돌이. </li><li> 37 ° C에서 30 분, 5 % CO 2의 염료로 세포를 인큐베이션. </li><li> 염료 포함 된 용지를 제거하고 세포에 신선한 미디어 (RPMI 또는 MSFM)를 추가합니다. </li><li> 30 분 동안 세포를 품어. 참고 : 세포는 지금염색 준비가 실험에 사용된다. </li></ol> 2. 사전 코팅 매트릭스 상공 회의소 공동 배양 침략 분석 <ol><li> 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) (15)를 사용하여 THP-1 세포 분화. <ol><li> 접시 2 - 6 웰 배양 접시에 RPMI / 10 % FBS, 1.5 ml의 3 × 105 THP-1 세포. 즉시 도금 후 100 나노 PMA를 추가하고 48 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2 부화. 참고 : 48 시간 후, 성공적으로 차별화를받은 THP-1 세포가 부착되며 잘 둥근 형태에 복용의 바닥에 퍼졌다. </li><li> 1X PBS로 한번 세척하여 PMA를 제거하고 신선한 RPMI / 10 % FBS로 교체합니다. 세포 분석에 사용할 준비가 될 때까지 또 다른 48 시간을 기다립니다. </li></ol></li><li> 잘 형 미디어 500 μl를 포함하는 (아무 혈청)에 배치하고 상단 형 미디어의 500 μl를 추가하여 매트릭스 사전 코팅 챔버 평형. 37 ° C에서 2 시간 5 % CO 2 챔버를 품어. <br/&gt; 참고 : 사전 코팅 챔버 제조 업체에서 구입 한; 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. </li><li> 부드럽게 세포 (형광 표지 된 아교 모세포종 세포 라인과 미세 아교 세포 / 대 식세포)를 분리하려면, 흡인 세포에서 용지를 제거합니다. 2 mM의 EDTA / PBS와 함께 접시에 세포를 씻으십시오. 2 mM의 EDTA / PBS 500 μl를 추가하고 5 품어 - 37 ° C에서 세포 배양기에서 10 분 5 % CO 2. </li><li> 0.3 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유 배지 5ml에 재현 탁 된 세포. </li><li> 120 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> MSFM / 0.3 % BSA 배지에서 기음 뜨는 재현 탁 펠렛 또는 (U87 및 THP-1 세포) RPMI / 0.3 % BSA (GL261 세포 및 미세 아교 세포의 경우) 세포의 농도가 1 × 106 세포 / ml로 동일 같은 것을 . 세포를 계산하는 혈구를 사용합니다. </li><li> 24 웰 플레이트의 웰 당 500 ㎕의 미디어 / 0.3 % BSA를 추가합니다. </li><li> 적어도 2 시간 (단계 2.2)에 대한 평형 된 챔버에서 용지를 제거합니다. 장소 chambe잘 500 μL 미디어 / 0.3 % BSA (단계 2.7)를 포함에서 RS. </li><li> 억제제는 마크로파지에 미치는 효과를 연구하기 위해 사용되는 경우 / 미세 아교 세포는 하부 챔버의 상부 부분 모두에 적절한 농도를 추가 교종 침윤 자극. 주 : CSF-1R의 농도 GL261 아교 모세포종의 침윤이 기준 9에서 발견 될 수 자극 완전히 미세 아교 세포를 억제하는 데 억제제. </li><li> 마우스 아교 모세포종 (2.10.1) 인간 아교 모세포종 (2.10.2)에 사용되는 세포주에 따라 다음의 두 단계로 설명 된 바와 같이 상부 챔버에 셀을 추가한다. <ol><li> 1.5 × 10 5 GL261 (아교 모세포종) 세포 (150 μL), 5 × 10 4 마우스 미세 아교 세포 (50 μl를) (미디어 자세한 내용은 단계 2.6 참조) 섞는다. 300 μL MSFM / 0.3 % BSA를 추가하여 500 μL에 볼륨을 가져와. 상단 챔버에 세포 혼합물을 추가하고 48 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2 부화. 참고 : 나는 설명 된대로 쥐 미세 아교 세포는 신생아 쥐에서 분리되어n은 1 6. </li></ol></li></ol> 7.5 × 10 4 U87 (아교 모세포종) 세포 (75 μL) 2.5 × 10 4 THP1 (대 식세포) 세포 (25 μL)을 섞는다. 400 μl의 RPMI / 0.3 % BSA를 추가하여 500 μL에 볼륨을 가져와. 상단 챔버에 세포 혼합물을 추가합니다. 24 시간 동안 37 ℃로, 5 % CO 2에서 세포를 품어. <ol><li> 배양 후, 부드러운 흡인 챔버의 상단에서 세포를 제거하고 PBS에서 3.7 %의 포름 알데히드에 배치하여 실을 수정합니다. 챔버는 실온에서 15 분 (또는 밤새 4 ° C)에 대한 정착에 남아있을 수 있습니다. 부드러운 흡인 정착액을 제거하고 PBS 1 배 500 μL로 교체합니다. 이미지 분석을위한 섹션 4로 넘어갑니다. 참고 : 실험이 순간에 일시 정지와 1X PBS에서 영상 저장할 수 있습니다. 형광 염료의 신호가 고정 후까지 2 주간 검출 할 수있다. </li></ol> 매트릭스에서 신경 교종 및 대 식세포 / 미세 아교 세포를 -embedding 3. 침략 분석 &quot;3D&quot; <ol><li>밤새 4 ° C에서 해동 매트릭스 믹스. 후드에서 얼음에 매트릭스를 사용하여 모든 추가 조작을 수행합니다. </li><li> 얼음에 0.3 % BSA와 미디어 매트릭스의 10 ㎎ / ㎖ 농도 (MSFM 또는 RPMI)를 준비합니다. 참고 : 행렬의 재고 농도는 일반적으로 약 15 ㎎ / ㎖이다. </li><li> 매트릭스 서스펜션 (1 단계에서 표시) 세포를 준비하려면, 흡인 세포에서 용지를 제거합니다. 2 mM의 EDTA / PBS와 함께 접시에 세포를 씻으십시오. 셀에 2 mM의 EDTA / PBS 500 μl를 추가하고 5 품어 - 37 ° C에서 인큐베이터에서 10 분 5 % CO 2. </li><li> 0.3 % BSA를 함유 배지 5ml에 재현 탁 된 세포. </li><li> 120 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 펠렛에서 대기음 뜨는. 세포의 농도가 1 × 106 세포 / ml로 동일하도록 미디어 / 0.3 % BSA에 재현 탁 펠릿. 세포를 계산하는 혈구를 사용합니다. </li><li> 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 + 5 × 10 4 미세 아교 세포 (50 μL에서) (150 μL)에 1.5 × 10 5 GL261 세포를 추가합니다.별도의 1.5 ML의의 microfuge 튜브에 2 × 10 5 GL261 세포 (200 μL)를 추가합니다. 참고 형 미세 아교없이 GL261 세포는 대조군으로 작용한다. </li><li> 120 X g에서 5 분의 microfuge에 스핀 세포. </li><li> 얼음에 200 μl의 차가운 매트릭스를 Resuspend 세포. </li><li> 8 μM 공경 챔버 인서트의 상부 구획의 중앙 판 (50) 상 μL (50,000 세포). </li><li> 중합이 발생하여 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. </li><li> 하부 웰에 상부 챔버 700 ㎕의 혈청을 포함하는 세포 증식 배지에 200 μL의 혈청 배지를 추가한다. </li><li> 48 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 품어. </li><li> 배양 후, 부드러운 흡인 챔버의 상단에서 세포를 제거하고 PBS에서 3.7 %의 포름 알데히드에 배치하여 실을 수정합니다. 챔버는 실온에서 15 분 (또는 밤새 4 ° C)에 대한 정착에 남아있을 수 있습니다. 부드러운 흡인 정착액을 제거하고 PBS 1 배 500 μL로 교체합니다. (4) FO로 진행R 영상 분석. </li></ol> 4. 영상 분석 실험 <ol><li> 3.7 %의 포름 알데히드에서 챔버를 제거하고 PBS 1 배 신선한 500 μl를 포함하는 잘 씻는다. 참고 : 챔버 건조하는 것을 허용하지 않습니다. </li><li> 목화 팁 어플리케이터를 사용하여 부드럽게 필터 표면을 긁어 필터의 상단부 (측 챔버의 내부를 향하는)에서 비파괴 세포를 세척. 부드럽게 시작하고 점차적으로 압력을 증가. 챔버 당이 적어도 3 회를 수행합니다. </li><li> 중 유리 바닥 접시에 실을 놓거나 24 웰 플레이트에 둡니다. </li><li> 카메라와 이미지 캡처 소프트웨어 (9, 10)가 장착 된 epifluorescent 또는 레이저 공 초점 형광 현미경의 무대에서 샘플을 놓습니다. </li><li> 대표적인 필드의 몇 배 또는 20 배의 이미지를 가져 가라. </li><li> 이러한 ImageJ에 같은 영상 분석 소프트웨어를 사용하여, 하부 9,10-에 필터를 넘었다 아교 모세포종 세포의 수를 계산. </li><li> 은 &quot;3D 이미징 경우. 4.6 전술 - &quot;침략 분석 (3 절에 기재된), 형광 레이저 공 초점 현미경 5-6를 사용하여 Z 스택 시리즈를 생성하는 이미지에 필터의 하부에 침입 세포 집단을, 프로토콜을 따라 4.2 단계를 반복합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

높은 등급의 성상 세포종과 교 모세포종의 매우 침습적 인 특성은 이러한 뇌 암은 매우 치명적인합니다. 그것은 아교 모세포종 침공의 분자 및 세포 메커니즘을 이해하는 것이 가장 중요하다. 많은 아교 모세포종 침공 이미 17의 과정에 대해 알게되었습니다. 10 배 -이 문서에 설명 된 분석 형식을 사용하여, 우리 연구실은 종양 관련된 대 식세포는 5 신경 교종 세포 침공을 자극 할 수있는 모두 마우스와 인간의 모델에 보여 주었다. 이 공 배양 모델에 충실 잠재적 간의 쌍방향 통신에 참여 (예 : 노치 델타 Ephrin-Ephs로서 리간드 - 수용체 시스템을 통해) 분비 및 juxtacrine 상호 작용 허용 물리적 식세포 / 미세 아교 세포와 상호 작용하는 아교 모세포종 세포의 기능을 복제 종양 세포와 대 식세포. 신경 교종 세포 침윤에 대한 대 식세포의 효과를 발견하고자 다른 분석 포맷은 일반적으로 셀을대 식세포는 웰의 바닥면에 도금 및 아교 모세포종 세포 챔버 3,4에있는 바와 같이 물리적으로 분리되어있다. 따라서,이 연구는 대 식세포 자극 된 신경 교종 침공 (2 배)에서 더 완만 한 증가를 보여줍니다. 이 공 배양 분석이 효과를 향상 - 가능성 식세포 동안 juxtacrine 상호 작용의 중요성을 나타내는 (5 ~ 10 배) / 미세 아교 세포는 아교 모세포종의 침략을 자극. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 만족스러운 결과를 달성하기 위해 신중하게 수행해야하는 여러 단계를 포함한다. 실험은 여기에 설명 된 바와 같이 수행된다 더 침입 세포가 보이지 않는 경우, 상기 형광 염료는 매우 약하거나 존재하지 않는 얼룩을 초래할 것이다 만료된다. 프리 코팅 챔버를 이용하여 침입 분석의 경우, 유효 기간을지나 아니며 실험을 수행 할 때까지의 전체 시간을 냉동 보관 된 신선한 침입 챔버를 사용하는 것이 필수적이다. 왼쪽 된 챔버이상 12 시간 동안 실온에서 더 이상 본래 정상보다 훨씬 높은 주파수에서 세포 침입 없었다는 매트릭스 장벽 불량 인 것으로 밝혀졌다. 3D 이미지 분석을 위해, 모든 얼음 피펫 튜브를 유지 절대적 중요하다. 상당히 오랜 시간 동안 실온에서하면 매트릭스 중합되며, 그것에 세포를 재현 탁하는 데 사용될 수 없다. 얼음을 가득 작은 트레이가 매트릭스와 접촉하는 모든 재료를 개최 후드에 사용하는 것이 좋습니다. 프로토콜은 그러나이 신경 교종 침윤에 최적의 효과를 확인하기 위해 필요한 시간의 길이에 영향을 미칠 수 있고, 더 높은 셀 밀도를 포함하도록 수정 될 수있다. 이는 다른 세포 유형이 배양 한 분석에서 추가 될 수 있으며 침윤 잠재 어떤 영향을 미칠 수 있는지 관심이 될 것이다. 마지막으로, 우리는 뇌의 미세 환경은 시험관 내에서 복제 독특하고 어렵다는 것을 인정합니다.이 프로토콜의 한 가지 제한이 침공 채널이여기에 사용 ambers는 아교 모세포종 세포 침공하는 동안 발생합니다 정상적인 뇌 (즉, 조밀 신경 세포와 성상 세포)의 전형적인 구성 요소가 부족하다. 그 경고, 대 식세포의 자극 효과가 있지만 /이 분석에서의 미세 아교 세포가 생체 내에서 관찰되며, 억제제 및 / 또는 단백질이 과정을 방해 할 수있는 예측하는데 사용될 수있는 것과 일치한다. 문화의 종양 미세 환경을 모방하는 것은 세포 유형 및 매트릭스 단백질이 악성 종양의 여러 단계에서 종양에 존재 얼마나 많은 변화 주어진 어려운 작업입니다. 그러나 미세 성분의 종양 작용의 시험 관내 모델에서 상당히 정확한 크게 새로운 치료 길의 발견을 용이하게한다. 이러한 대 식세포와 같은 세포가 혈관 신생, 침략, 면역 회피 및 약제 내성을 포함한 악성 종양으로의 진행과 관련된 여러 가지 측면에서 중요한 역할을한다는 것을 그것은 지금 감사합니다. COC여기에 설명 ulture 침윤 분석에서 높은 등급의 아교 모세포종 환자에서 관찰 식세포로 종양 세포의 비를 사용하여 (약 3 : 1, 5). 그것은 아교 모세포종의 침략을 자극하는 대 식세포 / 미세 아교 세포의 기능이 CSF-1R 및 사용하여 이러한 경로의 약리학 적 억제와 같은 EGFR 신호에 의존하는 것으로 밝혀졌다 JNJ-28312141는 PLX3397 (CSF-1R)과 피티 니브 (EGFR)가 강하게 증가를 감쇠 침략 9인치 또한, 매립 매트릭스 분석을 이용하여, 그것 Semapimod 또한 미세 아교 세포를 차단할 수 있고, 대 식세포와 미세 아교 세포를 대상으로 공지 된 소분자는 아교 모세포종 침입 열 자극 것을 증명 하였다. 이 공 배양 실험 결과는 생체 내 모델에서 사용이 화합물의 유효성을 검사 할 수있는 원동력을 제공했다. 이 문서에 설명 된 체외 분석에서 데이터와 일치, (혈액 뇌 장벽을 통과) 억제제 PLX3397와 CSF-1R의 봉쇄는 크게 차단GL261 신경 교종 세포의 능력은 C57BL / 6 마우스 (9)의 뇌에 침입합니다. 뇌가 침입을 억제하는데 크게 GL261 종양 (10)를 보유하는 생쥐의 생존 기간을 연장 표준 방사선 치료와 함께 상승 작용을 보여 주었다으로 유사 Semapimod 배달. 이러한 접근 방식은 모두 병원에서 효과가 입증 할 수있다. 지금은 잘 식세포 시스템은 3-6, 11-13 악성 종양 다양한 암의 진행에 매우 중요하다는 것을 알 수있다. 그것은 분명히 종양 관련된 대 식세포가 종양 세포의 침윤과 전이에 중요한 유방암, 뇌종양 모델에서 설립되었습니다. 또한, 대 식세포가 감염 18에 응답하여 적응 면역 조율 전문 항원 제시 세포로 면역 식세포 같은 이탈 (및 수지상 세포와 같은 관련 혈통의 세포) 기능을 매개하는 매우 중요한 것으로 보인다. 이제 정상적인 산도 분명 하나입니다적응 면역 체계의 ysiological 기능이 비정상적인 세포를 파괴하여 제어되지 않은 증식을 방지하는 것입니다. 종양 세포를 향해 내성 의한 암세포의 높은 돌연변이 자연 적응 면역 시스템에 의해 외부로 인식 네오 - 항원을 생성한다는 사실 쉽다. 실제로 &quot;면역 회피&quot;하는 과정은 암세포가 종양 파괴 (특히 세포 상해 성 림프구, 자연 살해 세포 및 염증성 식세포) 면역계를 방지해야하므로 암의 중요한 부분으로 가정된다. 이 대 식세포와 아교 모세포종 상호 작용의 연구를 용이하게하고 잠재적으로 우리가 체외 배양 분석에 사용하는 악성 암에 대해 해결할 수있는 질문의 유형의 확장을 허용이 문서에 설명 된 분석을 기대한다.

아교 모세포종의 홍반 진단 1, 2의 시간에서 약 12 개월 평균 생존과 적극적인 인간의 뇌 암이다. 교 모세포종은 표준 화학 요법과 수술 적 절제에 난치성 인으로 가장 치명적인 임상 도전 암 중 하나입니다. 아교 모세포종의 확산 특성은 수술로 완전히 절제에 고급 종양이 사실상 불가능하게 정상 뇌 전체에 확산 종양 세포 수 있습니다. 이 매우 침습적 인 측면은 교 모세포종 및 기타 고급 성상 세포종의 특징 특징이다. 따라서, 많은 연구의 초점은 아교 모세포종 세포 침윤의 분자 메커니즘왔다. 아교 모세포종 종양 미세 환경은 악성 종양 3-6 확립에 중요한 역할을한다. 종양 관련된 대 식세포는 / 미세 아교 세포는 아교 모세포종 침공 7,8 홍보에 대한 책임 것으로 나타났다. 이러한 연구의 대부분은 사용하지만 식세포 / 미세 아교 세포의 효과를 측정물리적으로 아교 모세포종 세포에서 구분 분석. 우리의 실험은 우리가 아교 모세포종 침공이 공 배양에서 대 식세포 / 미세 아교 세포에 의존하는 방법을 연구하고 침략하는 동안 이미지에 그들 사이의 물리적 상호 작용을 우리를 활성화 할 수 있도록 개선 된 분석을 생성하기 위해 밖으로 설정하고있다. 클래식 분석은 세포 침공은 &quot;표준&quot;보이든 챔버 화성과 chemoinvasion 형식을 포함 측정합니다. 공부하는 여기에 세포를 지정된 크기 (직경 일반적으로 사이 0.4 및 8 μM)의 구멍이 하단에 폴리 카보네이트 필터가 포함 된 플라스틱 챔버에서 도금. 세포 침윤의 방법은 일반적으로 세포 외 매트릭스 단백질로 이루어진 물리적 배리어를 포함한다. chemoinvasion 분석에서 사용 된 바람직한 행렬은 마트 리겔 (이하, &quot;매트릭스&quot;라 함), Engelbreth-Holm이 - 스웜 (EHS)에 의해 분비 된 세포 외 매트릭스 단백질의 혼합물을 마우스 육종 세포이며 크게 COL 이루어져lagen 유형 IV 및 라미닌. 챔버 후 또는 침윤을 촉진하는 것으로 의심되는 성장 인자없이 세포 배양액을 포함하는 조직 배양 웰에 배치된다. 더 높은 주파수에서 세포 외 기질 코팅 된 필터를 통해 침투하고, 필터의 하측에 부착하는 높은 침윤성 용량 셀. 우리는 아교 모세포종 세포 침윤에 미세 아교 세포 및 종양 연관된 대 식세포의 역할을 평가하기 위해이 시험을 수정했다. 10 배 9,10 - 우리는 미세 아교 세포는 5 개의 아교 모세포종 세포 라인의 침공을 자극 할 수있는이 문서에서 설명 공 배양 분석을 사용하여 확인 할 수 있었다. 이 아교 모세포종의 동물 모델에서 관찰되는 것을 반영한다. 더욱이, 우리는 아교 모세포종 세포와 대 식세포 간의 상호 작용 / 미세 아교 세포가보다 직접적으로 검토 할 수있는 입체 침윤 분석을 개발 하였다. macropha에 의해 자극 아교 모세포종 세포 침윤의 정도3 차원 분석에서 GES / 미세 아교 매트릭스 코팅 챔버 방식을 사용하여 본 것과 대등하다. 비슷한 분석은 이전에 침공 11 ~ 13시 대 식세포와 유방암의 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었다. 이 문서에 설명 된 두 가지 방법은 아교 모세포종 세포의 식세포 / 미세 아교 세포 자극 침공의 분자 메커니즘 (들)을 해부 할 수있는 능력에 도움이됩니다.

<table><tbody><tr><td>Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix</td><td>Corning/Fisher Scientific</td><td>Cat: 354481</td><td></td></tr><tr><td>Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml)</td><td>Life Technologies</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX Dye</td><td>Life Technologies/Molecular Probes</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Life Technologies/Molecular Probes</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>GL261 cell line</td><td>National Cancer Institute (NCI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U87 cell line</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 cell line</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (500 ml)</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 &amp;micro;M pore) 48 per pack.</td><td>Corning</td><td>CLS3422</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear</td><td>Trevigen</td><td>3445-005-01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>Cat: 10500064</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated</td><td>Fisherscientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

coculture assays to study macrophage and microglia stimulation of glioblastoma invasion

아교 모세포종의 홍반 (등급 IV 신경 교종)은 1 년 후 진단의 평균 생존에 매우 적극적인 인간의 암이다. 아교 모세포종을 야기 분자 사건의 증가 이해에도 불구하고,이 암은 여전히 ​​기존의 치료에 매우 내화 남아있다. 고급 뇌 종양의 수술 적 절제로 인해 아교 모세포종 세포의 높은 침윤성 특성으로 거의 완료되었습니다. 아교 모세포종 세포 침공을 약화 치료 방법 따라서 매력적인 선택이 될 것입니다. 우리의 실험실과 다른 사람은 종양 관련된 대 식세포와 미세 아교 세포 (상주 뇌 식세포) 강하게 아교 모세포종의 침략을 자극을 보여 주었다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 체외 배양 분석을 사용하여 아교 모세포종 - 대 식세포 / 미세 아교 세포의 상호 작용을 모델링하는 데 사용됩니다. 이러한 접근 방식은 크게이 악성 behav 가능 식세포와의 통신을 방해 약물의 개발 및 / 또는 검색을 용이하게 할 수있다IOR. 10 배 - 우리는 미세 아교 세포 / 대 식세포는 5 신경 교종 세포 침공을 자극하는 두 가지 강력한 공 배양 침공 분석을 설립했다. 형광 마커 또는 구조적 형광 단백질을 발현 표지 아교 모세포종 세포 기질 코팅 폴리 실에 삽입하지 않고 식세포 / 미세 아교 도금 또는 입체 매트릭스에 포함된다. 세포 침윤은 필터의 하부에만 침입 세포 이미지를 형광 현미경을 사용하여 카운트에 의해 평가된다. 이러한 분석을 사용하여 여러 가지 약리 억제제 (JNJ-28312141는 PLX3397, 피티 니브 및 Semapimod) 대 식세포를 차단, 확인 된이 / 미세 아교 세포는 아교 모세포종의 침략을 자극.

여기에 설명 된 방법을 사용하여, 우리는 미세 아교 세포와 대 식세포가 실질적으로 아교 모세포종 세포 침공을 자극 할 수 있음을 보여 주었다. 두 개의 다른 침윤 분석이 이용되고도 1에 도시된다.도 2에서, 구조적 형광 단백질을 발현 mCherry GL261 세포와 48 시간 동안 미세 아교없이 프리 코팅 챔버에서 배양 하였다. 미세 아교 세포로 침입 용량이 약 10 배 증가하지만 때 배양 GL261 세포는 자신에 대한 최소 침습했다. 우리는 인간 세포주를 사용하여 유사한 효과를 관찰한다. 차별화 된 THP-1 세포와 공 배양 할 때 그림 3에서 (5 chloromethylfluorescein 디 아세테이트 (CMFDA) 녹색으로 염색) U87 세포는 5 ~ 6 배 높은 침략을 보여줍니다. THP-1 (급성 단핵구 백혈병 환자에서 파생 된) 인간 단핵구 세포주 될 수 있습니다 디입니다포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) (15)을 사용하여 대 식세포와 같은 상태로 fferentiated. 분화 된 THP-1 세포는 시토 킨 분비 및 포식 작용을 수행하는 등, 인간 대 식세포의 많은 특성을 표시. 대안 적으로, 세포 침윤 매트릭스들을 포함하고, 챔버 인서트 필터 상에 직접 도금에 의해 측정 될 수있다. 공 초점 레이저 현미경 삼차원 표현 (Z 스택)를 생성 일련의 이미지를 생성 할 수있다. 매트릭스 코팅 챔버 분석에서 관찰되는 것과 유사한 (도면에 도시는 2-3)을 교차 한 세포의 수에 의해 측정 (CMPTX 적색 염색) 미세 아교 세포의 공 배양을 침범 GL261 세포 (CMFDA 녹색)을 자극 필터의 밑면 (도 4). 이 형식은 glio 사이의 잠재적 인 세포 - 세포 상호 작용을 시각화 할 수있는 장점이있다침략 동안 모세포종 세포와 미세 아교 세포. 사실, 미세 아교 세포는 밀접하게 3D 매트릭스 (그림 5)에 현탁 신경 교종 세포와 연결하는 것 같다. 만 포인트 분석이 필요하고, 공 초점 레이저를 사용할 수없는 경우, 매트릭스 코팅 챔버에서 기술 한 바와 같이, 셀 챔버를 세정 할 수있다. 다음 나머지 (침입) 셀의 개수가 기준 epifluorescent 현미경로부터 획득하여 이미지를 카운트함으로써 결정될 수있다. 영화 1은 이러한 분석의 삼차원 조립체를 도시한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53990/53990fig1.jpg" /> 그림 1 :. 미세 아교 세포 / 대 식세포 자극 아교 모세포종 세포를 시금에 대한 두 개의 다른 프로토콜의 도식은 침략 톱 패널은 사전 코팅 매트릭스 챔버 침공 분석 (제 2 장)를 보여줍니다. 하단 패널은 3D 매트릭스 침공 분석 (제 3 장)를 보여줍니다. 그림에서 적응9. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53990/53990fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53990/53990fig2.jpg" /> 그림 2. 미세 아교 세포 (MG) GL261 아교 모세포종 세포 침공을 향상시킬 수 있습니다. (A) 부재시 GL261 셀 (mCherry 표현) 침입 대표 화상 (왼쪽 패널 단독 GL261) 또는 미세 아교 세포의 존재 (오른쪽 패널; GL261 + MG)는 48 배양 후, 결합 된 매트릭스 코팅 챔버에 도말 시간 필터 교차 한 세포의 수를 평가 한 다음. 이미지는 10 배 목표를 사용하여 촬영. 스케일 바 = 400 μM. (B) 분석은 침략 GL261 세포 (적색) 계산의 정량. 표시된 데이터는 3 개의 독립적 인 실험에서 평균 ± SEM이다. presenc에서 미세 아교 세포 자극 GL261의 침공 (C) 정량약리 억제제의 피티 니브 (5 μM), JNJ-28312141 (10 μM), PLX3397 (1 μM), PLX5562 (1 μM)의 전자. 표시된 데이터는 여섯 독립적 인 실험에서 ± SEM 평균입니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53990/53990fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53990/53990fig3.jpg" /> 그림 3. THP1 대 식세포는 U87 아교 모세포종 세포 침공을 향상시킬 수 있습니다. 또는 차별화 된 THP1의 대 식세포와 (오른쪽 패널, U87 + THP1), 후 24 시간 및 평가를 위해 배양 한 다음, (A)는 CMFDA 녹색으로 염색 U87 세포를 침입의 대표 이미지는 혼자 매트릭스 코팅 챔버에 (U87 왼쪽 패널)을 도금 필터를 교차 한 세포의 수. 이미지 10 배 목표를 사용하여 촬영. 스케일 바 = 400 μM. (B) 분석은 계산의 정량침습성 U87 세포 (녹색). 표시된 데이터 10 독립적 인 실험에서 ± SEM 평균입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53990/53990fig4.jpg" /> . 또는 쥐의 미세 아교 세포로 (; 표시 GL261와 소교 공동 배양의 그림 4. 3D 침략 분석 (A) 이미지 혼자 매트릭스에 포함 된 GL261 세포의 이미지 (CMFDA 녹색으로 염색)의 Z 시리즈에서 전망이다 (GL261 패널 왼쪽) CMPTX 빨간색으로 표시, 오른쪽 패널, GL261 + MG). Z 축 돌기 필터 챔버의 바닥을 포함한다 화상 스택의 바닥 4 조각으로 하였다, 따라서 세포 침입을 나타낸다. 스케일 바 = 200 μM. GL261 세포 (녹색)의 (B) 정량 전술 한 바와 같이, 필터의 하측에 것으로 판정. 침입 GL261 셀의 총 개수는 결정되고, 단종에 GL261 세포의 정상화 하였다. 표시된 데이터는 평균 ± S를 나타냅니다중복 (10에서 적응도)에서 수행 3 독립적 인 실험의 EM은. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53990/53990fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53990/53990fig5.jpg" /> GL261 (녹색)와 매트릭스. GL261와 미세 아교 세포의 상호 작용에 포함 된 미세 아교 세포 (적색) 공동 배양의 3D 스택 내에서 조각에서 그림 5. 이미지 흰색 화살표로 강조 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μM. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53990/53990movie1.jpg" /> 영화 1 :. GL261 (녹색) 및 미세 아교 세포 (적색) 공 배양에서 촬영 한 이미지의 전체 Z 시리즈의 3D 프로젝션의 X 축을 중심으로 3D 회전에 아교 모세포종 및 미세 아교 세포의 상호 작용은 엄마에 포함트릭스. 조각은 5 μM 단위에 있습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53990/Movie1.avi" target="_blank">이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.

공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

13.9K 조회수.  Kean University. Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.

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In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

연구

암 연구학

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer growth and metastasis. Paracrine signals can involve cell-cell contact between different cell types, such as PD-L1 expressed on the surface of tumors interacting directly with PD-1 on the surface of T cells, or the secretion of ligands by a tumor cell to affect an immune cell. Here we describe a co-culture method to interrogate the effects of tumor-secreted ligands on immune cell (macrophage) activation. This straightforward procedure utilizes commercially available 0.4 &#181;m polycarbonate membrane permeable supports and standard tissue culture plates. In the process described, macrophages are cultured in the upper chamber and tumor cells in the lower chamber. The presence of the 0.4 &#181;m barrier allows for the study of intercellular signaling without the confounding variable of physical contact, because the two cell types share the same medium and exposure to paracrine ligands. This approach can be combined with others, such as genetic alterations of the macrophage (e.g., isolation from genetic knock-out mice) or tumor (e.g., CRISPR-mediated alterations) to study the role of specific secreted factors and receptors. The approach also lends itself to standard molecular biological analyses such as quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) or Western blot analysis, without the need for flow sorting to separate the two cell populations. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) can similarly be utilized to measure secreted ligands to better understand the dynamic interaction of cell signaling in the multiple cell type context. Duration of co-culture can also be varied for the study of temporally regulated events. This co-culture method is a robust tool that facilitates the study of tumor-secreted signals in the immune context.

Here, we present a method using permeable membrane supports to facilitate the study of non-contact paracrine signaling used by tumor cells to suppress the immune response. The system is amenable to studying the role of tumor-secreted factors in dampening macrophage activation.

투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite significant advances in the genetics of these tumors, how GBM cells invade the healthy brain parenchyma is not well understood. Notably, it has been shown that GBM cells invade the peritumoral space via different routes; the main interest of this paper is the route along white matter tracts (WMTs). The interactions of tumor cells with the peritumoral nervous cell components are not well characterized. Herein, a method has been described that evaluates the impact of neurons on GBM cell invasion. This paper presents an advanced co-culture in vitro assay that mimics WMT invasion by analyzing the migration of GBM stem-like cells on neurons. The behavior of GBM cells in the presence of neurons is monitored by using an automated tracking procedure with open-source and free-access software. This method is useful for many applications, in particular, for functional and mechanistic studies as well as for analyzing the effects of pharmacological agents that can block GBM cell migration on neurons.

Here, we present an easy-to-use co-culture assay to analyze glioblastoma (GBM) migration on patterned neurons. We developed a macro in FiJi software for easy quantification of GBM cell migration on neurons, and observed that neurons modify GBM cell invasive capacity.

이동 및 세포 상호 작용을 연구하기 위해 패턴 뉴런에 교모 세포 종 줄기 와 같은 세포의 공동 배양

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

뇌의 Organotypic 슬라이스와 암 세포의 3 차원 회전 타원체와 공 배양 시스템

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

의학

<meta charset="utf8"></head><body>3D 콜라겐 매트릭스 설정에서 대식세포-종양 스페로이드 상호 작용 검사

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Direct-Contact Co-culture of Astrocytes and Glioblastoma Cells Patterned using Polyelectrolyte Multilayer Templates

Glioblastoma Multiforme (GBM) is the most abundant and fatal malignant brain cancer. There are more than 13,000 cases projected in the United States in 2020 and 2021. GBM tumors most often arise from astrocytes and are characterized by their invasive nature, often recruiting healthy tissues into tumor tissue. Understanding communication between astrocytes and glioblastoma cells is vital for the molecular understanding of tumor progression. This protocol demonstrates a novel patterned co-culture method to investigate contact-mediated effects of astrocytes on GBM employing layer-by-layer assembly and micro-capillary-force driven patterning. Advantages include a protein-free cell culture environment and precise control of cellular interaction dictated by the pattern dimensions. This technique provides a versatile, economical, reproducible protocol for mimicking cellular interaction between glioma and astrocytes in glioma tumors. This model can further be used to tease apart changes in GBM molecular biology due to physical contact with astrocytes or with non-contact mediated soluble cofactor communication.

This protocol describes a patterned direct contact glioma-astrocyte co-culture utilizing micro-contact printing on polyelectrolyte multilayers (PEMs) to pattern U87 or A172 GBM cells and primary astrocytes.

Glioblastoma Multiforme (GBM) is the most abundant and fatal malignant brain cancer. There are more than 13,000 cases projected in the United States in ...

생체공학

Matrix-Based Tumor Invasion Model Using Microglia Glioblastoma Co-Culture

Source: Coniglio, S., et al.&#160;<a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/53990">Coculture assays to study macrophage and microglia stimulation of glioblastoma invasion.</a> J. Vis. Exp. (2016)
In this video, glioblastoma and microglia cells are mixed with a polymer matrix solution and transferred to a porous chamber insert where a gel forms, embedding the cells. Microglia stimulate the migration of glioblastoma cells through the porous insert, mimicking tumor cell invasion into surrounding tissue, Cells are then fixed and prepared for further analysis.

Source: Coniglio, S., et al.&#160;Coculture assays to study macrophage and microglia stimulation of glioblastoma invasion. J. Vis. Exp. (2016)
In this ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuropathology

Tumors

Co-Culturing Glioblastoma Cells on Patterned Neurons: A Technique to Monitor the Migration of Glioblastoma Cells on Rat Hippocampal Neurons In Vitro

Source: Guyon, J. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/62213" target="_blank">Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video describes a co-culture assay of glioblastoma cells on micropatterned neurons, which mimic the myelinated neuronal tracts invasion by the glioblastoma stem-like cells as they migrate on neurons in the peritumoral spaces. This assay can help analyze the effects of pharmacological drugs that inhibit glioblastoma cells&#39; migration on neurons in a glioma.

패턴화된 뉴런에서 교모세포종 세포 공동 배양: 체외에서 쥐 해마 뉴런에서 교모세포종 세포의 이동을 모니터링하는 기술

Source: Guyon, J. et al. Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions. J. Vis. Exp. 
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공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기

요약

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종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석

투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구

이동 및 세포 상호 작용을 연구하기 위해 패턴 뉴런에 교모 세포 종 줄기 와 같은 세포의 공동 배양

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대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

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