저자는 원고의 자신의 검토를 위해 Karsta Luettich과 그레고리 Vuillaume에게 감사의 말씀을 전합니다.

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모든 저자 필립 모리스 인터내셔널의 직원입니다. 필립 모리스 인터내셔널은이 프로젝트의 자금 조달과 스폰서의 유일한 근원이다.

동물 실험의 대안에 대한 새로운 높은 처리량 테스트 방법에 대한 요구가 널리 지난 몇 년 동안 논의되어왔다. 이 밀접하게 표적 조직의 생리를 모방 세포 분석을 이용하여 표준 독성 시험에 대한 대체 방법을 조사하기 위해 과학자들과 규제 당국을 주도하고있다. 본 연구는 인간의 폐 상피 세포의 단일 CS 성분에 대한 노출의 영향을 평가하기 위해 고 함량의 스크리닝 (HCS) 플랫폼 실시간 세포 분석기 (RTCA)를 조합의 적용을 설명했다. 이 설정은 유사 각종 공기 오염, 부유 입자 및 나노 입자에 의해 유도 된 세포 독성을 평가하기 위해 적용될 수있다. 또한, 얻어진 결과는 인과 생물학적 네트워크에 기초하여 전체 게놈 transcriptomics 및 계산 방법의 것과 일치 할 수있다. 이전에보고 된 바와 같이,이 방법은 분자 경로에 대한 데이터를 확증하기 위해 우리를 허용HCS 엔드 포인트와 CS 노출 5시 섭동, 또한 표현형이 경로의 교란을 해결. 흐름도 분석으로 실시간 세포 분석 량과 노출 시점 하류 분석 (14)에 대한 바람직한 수있다 나은 의사 결정을 할 수있는 투여 량 및 시간 의존적 해상도에서 세포 생존과 관련된 정보를 제공한다. 분석기의 원리들은 금 미세 덮여 배양 웰의 표면 상에 부착 확산으로 세포에 의해 생성 된 온 저항의 변화에​​ 의존한다. 임피던스 궁극적 형태 및 세포 생존, 확산, 세포 접착 성을 모니터링하는 데 사용할 수있는 셀 인덱스라는 무 차원 파라미터로 변환된다. 이 기술은 세포 독성 기전에 대한 정보를 제공하지 않지만, 감도에도 HCS 유익하지 않은 아주 낮은 용량에서 세포 형태의 변화를 검출 가능하게 (데이터는 보이지 않음). previ을 바탕으로OU를 실험, 우리는 RTCA 방법은 HCS 엔드 포인트에 비해 낮은 용량에서 형태 학적 변화를 감지 할 수 있다고 지적했다. 실시간 세포 분석기 초기 스크리닝 다음하는 HCS 플랫폼은 각 HPHC 의해 유도 독성의 종류에 대한보다 상세한 정보를 얻기 위해 사용되었다. 세포 구획에 미치는 잠재적 인 영향으로 HPHCs을 프로파일 허용 HCS 분석 패널 / 세포 기관뿐만 아니라 유전 독성 또는 산화 스트레스를 유도 사람들을 식별하는. 분석은 선택 HPHCs가 NHBE 세포에서 세포 독성을 유도함으로써 서로 다른 프로파일을 밝혔다. 일반적으로, 모든 화합물은 페놀을 제외하고 가장 높은 시험 용량으로 괴사를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 잠재적 인 유전 독성에 대한 마커로 H2AX의 암 발생 1 aminonaphtalene에 의한 인산화의 역할, 그러나 미토콘드리아 독성 판독이 HPHC의도 폭로 활동 HCS 패널 (질량 증가 시토크롬 C의 relea과 일치SE) 및 산화 스트레스 (GSH 고갈). 전술 한 바와 마찬가지로, 페놀 미토콘드리아의 기능 장애를 유발하고, DNA 손상과 GSH의 고갈을 일으키는 것으로 밝혀졌다. 크롬 (VI), 그룹 I 발암 물질로 분류되는 화합물 중 하나, 및 크로톤은 모두 특히 크롬 (VI) 또한, 세포 사멸을 유도 (카스파 제 캐스케이드의 활성화) 및 크로톤에서 ROS 생성을 증가 야기 같은 유전 독성을 확인 하였다. 마지막으로 비소 (V)은, 스트레스 키나아제 경로의 활성화 마커 cJun 인산화를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 본 연구는 시험관 내에서 상피 세포 폐암 모델로 NHBE 세포를 이용했다. HCS 설정에서이 세포를 사용하는 것은 전례가 및 유전 독성 및 산화 스트레스 마커를 포함하는 엔드 포인트의 넓은 범위의 조사를 활성화. 생균 고정 세포 염색 방법 모두 전반적인 기술의 유연성을 보여 우리 프로토콜에서 설명 하였다. F에서행위는, 아주 동일한 프로토콜은 형광 염료 또는 항체의 사용에 의해 해결 될 수있는 대상의 넓은 범위에 적용될 수있다. 라이브 염색 프로토콜을 성공적으로 실행하기 위해, 상기 염료 중 일부가 한정된 반감기와 화상 획득이 완료되기 전에 감소 할 수 형광 신호를 같이 배양 시간을 존중하는 것이 중요하다. 이는 다른 세포 유형이 사용되면, 모든 염색 조건에 최적의 염료 농도, 재평가되어야하며 배양 시간은 상이 할 수 있음을 고려하는 것도 중요하다. 현재 논문에서는 다섯 화합물은 HCS 방법으로 상영 시나리오를 설명했다. 전술 플레이트 배치를 고려하면, 그들은 이에 이상의 화합물 또는 동시 스크리닝 수 24 판 (6 세이 2 시간 점) 판 국지적 수는 증가 될 수있는 총 2 개 이상의 서로 다른 플레이트 세트를 투여했다 inves의이상의 엔드 포인트의 tigation. 그렇게하기에 앞서 하나의 특정 종점 (GSH 및 ROS)이 즉시 획득을 필요로하는 것이 고려되어야하고, 그 결과, 판의 투여 이전 판의 획득을 허용하는 지그재그 방식으로 수행되어야한다. 플레이트는 이후 단계에서 염색 절차를 완료하기 위해, 정착 후의 어떤 단계에서 프로토콜을 방해하는, 적층 될 수있는 반면에, 고정 된 세포 염색 프로토콜을 사용하는 장점을 나타낸다. 이러한 접근법은, 예를 들면, 데이터의 품질을 손상시키지 않고 모든 생균 착색 판을 작성하는 시간과 운전자에게 제공한다. 상기 판의 수를 감소시킴으로써 흐름을 최적화하기 위해, 또한 서로 이상의 엔드 포인트를 다중화하는 것이 가능하다. 이 상황에 맞는 DNA 손상과 스트레스의 예를 들어 키나제 다른 C에서 방출 형광 색소로 간단하게이 차 항체를 사용하여 함께 조사 할 수있다hannels. 연속 전자동 셀 시드 화합물 희석 투여 및 염색 포함하는 HCS 플랫폼의 개발뿐만 아니라, 새로운 엔드 포인트의 첨가는 또한 상피에 HPHCs 및 다른 유형의 세포에 대한 강력한 프로파일 링 툴로서 HCS 플랫폼의 기능을 확장 할 .

독성 위험 평가는 역사적 생명 과학에 기초하지만, 또한 인간과 고비용으로 일관 번역 가능성 단점으로 연결되며, 동물 모델의 사용에 의존 하였다. 또한,는 &quot;3RS&quot;이 (대체, 감소 및 정제)의 정신에서 동물 실험의 대안을 찾을 수 증가 노력이 있었다. 이러한 노력은 지난 몇 년 동안 가속화되었다뿐만 아니라 때문에 특히 유럽 연합 (EU)의 높은 처리량 기술과뿐만 아니라, 때문에 동물 실험의 사용을 제한하는 법률의 시스템 생물학 접근 방식으로 최근의 진보,의. 욕설 독성에 대한 반응을 조절 세포 신호 전달 경로의 복잡성은 하나의 독성 엔드 포인트를 사용하여 특정 화합물의 독성 학적 근거를 설명하는 데 충분하지 않을 것이라는 것이 명백한다. 이를 위해 상호 P 수백 상호생물학적 네트워크에 기여 roteins도 고려 될 필요가있다. 이러한 네트워크에서 독성 물질의 효과를 연구하기 위해, 표현형 중간 및 높은 처리량 스크리닝 분석과 결합 시스템 독성 접근 역가를 추정 함과 동시에 각각의 독성 물질의 작용 기전에 대한 추가 정보를 제공하는 것이 유용하다. 본 연구에서는 취득 처리 및 특정 형광 기반 세포 분석으로부터 유도 된 화상 데이터를 분석 할 수있는 자동화 현미경 및 생물학적 소프트웨어 애플리케이션 구성되어 강력한 선별 도구으로 HCS를 사용. 이 단일 세포 또는 세포 내 수준에서 정량 셀 내의 시각적 인 변화를 허용하고, 다수의 파라미터가 동시에 분석한다. (3) 예를 들어, DNA 이중 가닥 나누기 히스톤 H2AX 인산화의 항체 - 기반 식별자를 사용하여 평가하고, 반응성 산소 종 (ROS)은 셀 파마하여 정량화eable 슈퍼 옥사이드 민감한 염료. 폐 상피 세포가 담배 연기를 포함하여 흡입 독성 물질,에 대해 첫 번째 생물학적 장벽을 나타 내기 때문에, 우리는 미국 식품의 약국 (FDA)에 의해 출판 HPHCs의 효과를 프로파일 체외 모델 1 차 기관지 상피 세포를 이용했다. 4이 원고의 후속이다 우리가 HPHCs의 다른 부분 집합의 생물학적 영향을 평가하는 이전의 연구 5 - 최대. 체외에서 세포 독성을 평가하는 워크 플로우의 일환으로, 우리는 처음에 우리가 다음 HCS에 적합한 용량 범위를 설정할 수 (RTCA) 시스템 임피던스 기반의 실시간 세포 분석을 사용하여, 15 HPHC의의 선택의 효능을 평가 분석 (그림 1). 다음 세포 독성 구 파라 메트릭 다중 엔드 포인트를 이용하여 수행 하였다 HCS 독성 평가는, 각각 두 개의 시점 (4 및 24 시간)에서 모니터. 표 1에 기재된 바와 같이 7 활성, 시토크롬 C 분리와 세포막 투과성 - 사용 된 마커는 미토콘드리아 독성, DNA 손상, 스트레스 키나아제 활성 산소 종 (ROS), 글루타치온 (GSH) 함량, 카스파 제 3 지시 하였다. 우리의 접근 가능 식별 및 투여 량 및 시간 의존적 샘플링 통해 담배 연기 성분의 효과의 특성화. 궁극적으로, 이것은 각 HPHC 대한 시험 관내 독성 프로파일을 만들었다. 멀티 오 믹스 방식은 상기 HCS 분석을 보완 할 수있다. 이것은 결국에는 세포 신호 및 / 또는 전사 수준에서의 효과의 깊은 이해를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader</td><td>Thermo</td><td>N01-0002B</td><td></td></tr><tr><td>xCelligence RTCA MP</td><td>ACEA</td><td>05331625001</td><td></td></tr><tr><td>Screener (HCS)</td><td>Genedata</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CASY counter TTC</td><td>Roche</td><td>05 651 719 001</td><td></td></tr><tr><td>e-Plates VIEW 96</td><td>ACEA</td><td>06 472 451 001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Frame 96</td><td>ACEA</td><td>05232392001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Cardio Temperature Tool</td><td>ACEA</td><td>2801171</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealer breathseal</td><td>Greiner bio-one</td><td>676051</td><td></td></tr><tr><td>Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-2540</td><td>non-smoking 60-year-old Caucasian male donor&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Warm at 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>ReagentPack Subculture Reagents kit</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>Warm at 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Easy Flask filter cap 75&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr><tr><td>96 well assay plate&amp;nbsp; black&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-62249</td><td></td></tr><tr><td>Draq5 (For Far Red Nuclear Staining)</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7513</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: Dihydroethidium</td><td>Sigma</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: CellROX</td><td>Life technologies</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: MitoSOX</td><td>Life technologies</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>GSH Dye: Monochlorobimane</td><td>Sigma</td><td>69899</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>GSH Dye: Monobromobimane</td><td>Life technologies</td><td>M-1378</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: YO-PRO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>Y3603</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: TO-PRO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3602</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: TOTO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3600</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green</td><td>Life technologies</td><td>C10423</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Cytochrome C antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA5-11823</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA5-15889</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA1-2022</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG DyLight 650&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab96878</td><td></td></tr><tr><td>10x permeabilization buffer</td><td>Fisher</td><td>8408400</td><td></td></tr><tr><td>4% Formaldehyde solution</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>10x blocking buffer</td><td>Fisher</td><td>8408500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Sigma</td><td>S4400</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Anisomycin</td><td>Sigma</td><td>A9789</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Ethacrynic acid</td><td>Sigma</td><td>E4754</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>1-Aminonaphthalene</td><td>Sigma</td><td>34390</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>2-Nitropropane</td><td>Sigma</td><td>130265</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acetamide</td><td>Sigma</td><td>695122</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Arsenic (V)</td><td>Sigma</td><td>A6756</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Benzene</td><td>Sigma</td><td>12540</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Chromium (VI)</td><td>Sigma</td><td>216623</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Crotonaldehyde</td><td>Sigma</td><td>262668</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Methyl ethyl ketone</td><td>Sigma</td><td>34861</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Nickel&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>203866</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Nitrobenzene</td><td>Sigma</td><td>48547</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma</td><td>P5566</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Quinoline</td><td>Sigma</td><td>241571</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma</td><td>34866</td><td>Toxic</td></tr></tbody></table>

high content screening analysis to evaluate the toxicological effects of harmful and potentially harmful constituents (hphc)

담배 연기 (CS)은 심혈관 및 폐 질환의 주요 위험 인자이다. CS는 전반적인 독성 개별 구성 요소의 기여를 평가하기 위해 도전 1 7,000 개 이상의 화학 물질을 포함하는 복잡한 에어로졸이기 때문이다. 미국 식품의 약국에 의해 정의 된 개별 구성 요소뿐만 아니라 혼합물의 독성 프로파일 그러나, 관통 넣어 담배 연기의 유해 및 잠재적으로 유해한 구성 성분 (HPHCs)의 프로파일 링을 가능하게 선별 도구, 높은 적용하여, 시험관 내에서 설정 될 수있다 청 (FDA). (2) 초기 평가, 임피던스 기반 장비가 화합물의 독성을 실시간으로, 라벨없는 평가에 사용 하였다. 기기의 판독은 모두 함께 세포 상태의 개요를 제공하는 세포 접착, 생존 및 형태에 의존합니다. 셀 인덱스라는 차원 매개 변수는, 정량에 사용됩니다. DIF의 집합ferent 염색 프로토콜은 형광 이미징 기반 조사 개발 및 HCS 플랫폼은 각 HPHC 의해 유도 독성의 종류에 대한보다 상세한 정보를 얻기 위해 사용되었다. 그들은 계산 가능한 LD 50 (&lt;20 mm)를 등록 된 시험 15 성분 중 다섯은 HCS 기반 분석을 위해 선정되었다. 이들은 1 aminonaphtalene, 비소 (V), 크롬 (VI), 크로톤 알데히드 및​​ 페놀을 포함했다. HCS에 미치는 영향에 기초하여, 1 aminonaphtalene 페놀이 증가 히스톤 H2AX 인산화에 기초 유전 독성과 같은 크롬 (VI)와 함께, 미토콘드리아의 기능 장애를 유도하는 것으로 확인 될 수있다. 크로톤은 스트레스 키나아제 경로 활성제로서 산화 스트레스 유발 비소로 확인되었다. 본 연구는 임피던스 기반 HCS 기술의 조합 CS 성분의 시험 관내 평가를위한 강력한 수단을 제공한다는 것을 보여준다.

RTCA 독성 효과가 감지되지 않을 때 HCS 엔드 포인트가 유익하지 않기 때문에, 표시되지 화합물은 HCS (그림 3b, C, D, G, K, L, m에 의해 테스트되지 않은 RCTA에서 가장 높은 농도로 세포 생존 능력의 최대 감소 쪽). 화합물 보여주는 만 높은 농도에서 세포 생존 능력을 감소 (그림 3E는 오)도 HCS에 대한 선택이 취소됩니다. 마지막으로, 계산 가능한 LD 50 (&lt;20 mM)을 가진 성분 만 더 HCS 분석 (도 3a, F, H, J, N)에 대해 선택된다. 위의 기준을 충족 HPHCs은 다음과 같습니다 : 1 aminonaphtalene, 비소 (V), 크롬 (VI), 크로톤 알데히드와 페놀. HCS 품질 검사 (QC)으로, 양성 대조군은 파이입니다RST 정확하게 수행되는 오염 절차를 보장하기 위해 분석 하였다. 양성 대조군 처리 된 세포의 대표적인 이미지가도 6에 도시한다. 데이터 값은 상술 한 바와 같이 차량에 대해 정규화된다. 어떤 용량 - 반응 곡선은 세 가지 용량이 테스트로 그려되지 않고 모든 세 가지 용량마다 시간이 시점에서 고려하지. 적절한 반응은 4 시간에서 24 시간 모두에서 각 포인트에 대해 관찰되도록 양성 대조군 용량이 선택 (이전 실험에 기초하여, 데이터는 도시하지 않음). 특정 투여 량으로도 1 및도 2는 용량 (2, 3)은 24 시간의 효과를 평가하기 위해 사용되는 동안 4 시간의 효과를 평가하기 위해 사용된다. 응답이 양성 대조군 투약 관찰되지 않으면 플레이트는 파기된다. 미토콘드리아 막 전위 및 GSH 함량​​을 제외한 모든 엔드 포인트에 대한 신호 강도의 증대가 예상되고 있습니다. 페놀을 제외한 모든 화합물은,하는 괴사 pheno을 유도<html> 유형 증가 세포막 투과성 (도 7a, F, H, L)에 기초하여. 1 aminonaphtalene, 크롬 (VI)을, 크로톤 알데히드 및 페놀 증가 히스톤 H2AX의 인산화 (도 7E, J, N, P)에 기초하여 유전 독성 인 것으로 확인되었다. 페놀과 1 aminonaphtalene은 심각한 미토콘드리아 기능 장애 1 aminonaphtalene으로 증가 시토크롬 C 릴리스 (그림 7C)되었다 (도 7b, 오)를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 증가 카스파 3/7 활동의 검출은 크롬 노출시 세포 사멸 사건의 증거를 제공했다. 산화 스트레스 유도 (ROS 또는 GSH)도 1 aminonaphtalene, 크로톤 알데히드와 페놀 (그림 7D, m, Q) 치료에 검출되었다. 전사 인자 cJun (도 7g)의 인산화 증가에 의해 입증 된 바와 같이 마지막으로, 비소 세포 스트레스를 유발한다. 로드 / 53987 / 53987fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1. 화합물 독극물-프로파일 러는 워크 플로우.가) 워크 플로우의 도식은이 연구에서 따랐다. 우선, 용량 범위 연구 결과는 후속 HCS는 화합물 특이 적 독성 프로파일. b) 연구 실험 설계를 특성화하기위한 적절한 투여 량을 선택 RTCA 플랫폼을 이용하여 수행 하였다. HCS 엔드 포인트는 4 조사하고 24 시간 투여 후. 한 반면, 24 시간 시딩 후, 세포를 투여하고, 임피던스 값은 계속해서 다음 24 시간 동안 모니터링 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53987/53987fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig2.jpg" /> 도 2 RTCA 노출 접시. 화합물 마스터 플레이트는 제 5 단계 1시 10분 일련의 희석을 수행하여 생성된다. 각 화합물,(용량 0) 차량 제어를 포함하는 다음 컨트롤과 같은 매체 및 스타 우로 스포린과 함께 노광 판 중으로 첨가 하였다. 차량 컨트롤이 행 번호 7에있는 동안 순서가 전송에 유지되는 용량은 최고 용량은 행 번호 1 참고 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53987/53987fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig3.jpg" /> 도 3 주제 RTCA 세포 생존 결과. a) -1- aminonaphtalene, b) -2- 니트로 프로판, C) 아세트 아미드, d) 아세톤, E) 아크릴 아미드, F) 비소 (V), g) 벤젠, h)에 크롬 (VI) , j)의 크로톤 알데히드, k)를 메틸 에틸 케톤, L) NickeL (II), m) 니트로 벤젠, N) 페놀, O) 퀴놀린, P)을 톨루엔. 24 시간 후 투여에서, 곡선 (AUC) 아래의 면적은 0 내지 0의 활성을 반영 -100 % 활성 (Y 축)에 대한 범위 및 정규화 (양성 대조군 및 비히클 포함) 각 용량에 대해 계산 된 비히클 및 양성 대조군의 -100. 값들은 플롯하고 4- 파라미터 힐 방정식 가능한, LD (50)는 계산을 이용하여 부착 하였다. 농도를 로그 스케일 (x 축)에 표현된다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53987/53987fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig4.jpg" /> 그림 4. HCS 분석 실험에 대한 긍정적 인 제어 화합물에 대한 희석 계획. 긍정적 인 컨트롤) 추가 및했습니다시리얼 희석 판. b)는 양성 대조군 용액을 희석. c) 200X 양성 대조군 투약. DE) 배지 (1시 40분의 200X 양성 대조군 량의 희석)에 hicle는 5 배 용량을 포함하는 양성 대조군 플레이트를 생성한다. ) 각각의 투여가 노출 판의 최종 레이아웃을 반영하기 위해 삼중에 희석되어 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53987/53987fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig5.jpg" /> 도 5 HCS 노출 접시. 화합물 마스터 플레이트는 제 5 단계 희석을 행함으로써 생성된다. 차량 제어 각각 포함하는 화합물 (복용량 0) 후 양성 대조군과 함께 노광 판 중으로 첨가 하였다. , 복용량의 주문이 전달에 유지합니다차량 컨트롤이 행 번호 7에있는 동안 가장 높은 용량은 행 번호 1에있는 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53987/53987fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig6.jpg" /> 항체 또는 염료 염색 된 세포의 그림 6. 대표 형광 사진 A) 핵 매개 변수 - 핵 염료 :. 라이브 또는 고정 세포에서 DNA에 결합하는 투과 염료. 이 얼룩 핵 영역 라벨링 개별 셀을 식별하기 위해 사용된다 b) 괴사 - 세포막 투과성 염료 :. 세포막 무결성 염료 계 검출. 시약 세포막에 본질적으로 불 투과성이다. 괴사 동안, 멤브레인은 투과되고 염료 셀 들어가 강한 형광의 제조 DNA 결합. ignal C) 세포 사멸 - 사이토 크롬 C : 시토크롬 C의 출시 초기 세포 사멸의 잘 알려진 특징의 항체 기반의 탐지. 세포 사멸의 유도에 따라, 시토크롬 C는 미토콘드리아에서 해제되고 핵 D) DNA 손상에 확산 - pH2AX :.. 히스톤 H2AX의 인산화의 항체 기반의 탐지, 이중 가닥 DNA 나누기의 잘 알려진 특징 전자) 스트레스 키나제 - cJun :. 빼앗아-73 cJun의 세포 스트레스의 잘 알려진 특징에서 인산화의 항체 기반 탐지 f)의 산화 적 스트레스 - DHE : 슈퍼 옥사이드 라디칼의 염료 기반 탐지. . 무료 GSH 분자의 염료 기반 감지 : mBcl - 산화 된 형태의 에티 디움은 DNA 인터 g에 따라 빨간색 형광 동안 Dihydroethidium 자체는 GSH) 세포질에서 파란색 형광. mBcl는에 GSH와 반응. 카스파 제 3/7 활동의 염료 기반 감지 : 카스파 3/7 활성화 - 높은 형광 제품 시간) 세포 사멸을 생성합니다. 시약은 DNA 결합을 저해하는 네 개의 아미노산 펩티드와 비 형광등이다. 카스파 7분의 3 활성화되면, 펩티드는 DNA에 결합하여 밝은 형광 반응을 생성하기 위해 염료를 분해 가능하게되어있다. 패널은 긍정적 인 제어 처리 된 세포를 표시 BH. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53987/53987fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig7.jpg" /> 그림 7. 대표 HCS 결과. 1 aminonaphtalene (AE), 비소 (V)의 (f 및 g), 크롬 (VI) (홍콩), 크로톤 알데히드 (LN) 및 페놀 (OQ). 4 시간 (파란 선)과24 시간 (오렌지 라인)의 신호는 각각의 용량에 대해 계산 된 차량 활동 (0 %)로 정규화 하였다. 커브 피팅 계산에 포함되지 않은 값은 회색으로 표시됩니다. 농도를 로그 스케일 (x 축)에 표현된다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53987/53987fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 시험 </td><td> 엔드 포인트 # </td><td> 생물 엔드 포인트 </td><td> 셀룰러 구획 </td><td> 출력 기능 </td></tr><tr><td rowspan="4"> 세포 독성 </td><td> 1 </td><td> 미토콘드리아 질량 (6) </td><td> 세포질 </td><td> 스팟 평균 면적 </td></tr><tr><td> 이 </td><td> 미토콘드리아 막 전위 (6) </td><td> 세포질 </td><td> 스팟 평균 강도 </td></tr><tr><td> 삼 </td><td> 사이토 크롬 C 출시 <sup&gt; 7 </td><td> 핵 </td><td> 평균 강도 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 세포막 투과성 8 </td><td> 핵 </td><td> 평균 강도 </td></tr><tr><td> DNA 손상 </td><td> (5) </td><td> 포스 H2AX 9 </td><td> 핵 </td><td> 평균 강도 </td></tr><tr><td> 스트레스 키나제 </td><td> 6 </td><td> 포스 cJun (10) </td><td> 핵 </td><td> 평균 강도 </td></tr><tr><td> ROS </td><td> (7) </td><td> ROS (11) </td><td> 핵 </td><td> 평균 강도 </td></tr><tr><td> GSH 콘텐츠 </td><td> 8 </td><td> GSH (12) </td><td> 세포질 </td><td> 스팟 평균 강도 </td></tr><tr><td> 세포 사멸 </td><td> 9 </td><td> 카스파 제 3 (13) </td><td> 세포질 </td><td> 스팟 평균 강도 </td></tr></tbody></table> HCS (a)의 표 1. 목록ssays 및 엔드 포인트. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td rowspan="2"> 차량 </td><td colspan="6" rowspan="2"> RTCA 량 (μM) </td><td rowspan="2"> LD (50) </td><td colspan="5"> HCS 량 </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> 세포 생존 선택 (μM) </td><td> 3R4F (㎚) </td></tr><tr><td colspan="2"> 1 Aminonaphtalene </td><td> EtOH로 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> 280 μM </td><td> 2,000 </td><td> (500) </td><td> (200) </td><td> (150) </td><td> 0.27 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2- 니트로 프로판 </td><td> EtOH로 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 아세트 아미드 </td><td> EtOH로 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 아세톤 </td><td> 물 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 아크릴 아미드 </td><td> 물 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 비소 (V) </td><td> 물 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> 160 μM </td><td> (200) </td><td> (100) </td><td> (50) </td><td> (25) </td> &lt;TD&gt; 0.17 </td></tr><tr><td colspan="2"> 벤젠 </td><td> EtOH로 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 크롬 (VI) </td><td> 물 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> 20 μM </td><td> (100) </td><td> (50) </td><td> (20) </td><td> (10) </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td colspan="2"> 크로톤 </td><td> 물 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> 200 μM </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 2,000 </td></tr><tr><td colspan="2"> 메틸 에틸 케톤 </td><td> 물 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt;20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 니켈 </td><td> 물 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 니트로 벤젠 </td><td> EtOH로 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 페놀 </td><td> EtOH로 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> 2300 μM </td><td> 5,000 </td><td> 2,000 </td><td> 1,000 </td><td> (500) </td><td> (240) </td></tr><tr><td colspan="2"> 퀴놀린 </td><td> EtOH로 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td&gt; <td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 톨루엔 </td><td> 물 </td><td> 20000 </td><td> 2,000 </td><td> (200) </td><td> (20) </td><td> 이 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM의 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 2. 치료의 24 시간에서 상대 LD (50) 테스트 HPHC 화합물의 목록입니다. HCS 분석을 위해 선택된 화합물은 주황색으로 강조하고 테스트 용량도 제공됩니다. 3R4F 용량은 기준 담배 3R4F에서 한 스틱의 연기 성분의 양은 동일합니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 시험 </td><td> 화합물 </td><td> 원액 </td><td> 용제 </td&gt; <td colspan="3"> 투여 량 (들) (μM) </td></tr><tr><td> 세포 생존 </td><td> 스타 우로 스포린 </td><td> 10 mM의 </td><td> DMSO </td><td colspan="3"> (50) </td></tr><tr><td> 세포 독성 </td><td> 발리 노마 이신 (Valinomycin) </td><td> 10 mM의 </td><td> DMSO </td><td> (50) </td><td> (20) </td><td> (5) </td></tr><tr><td> DNA 손상 </td><td> 파라콰트 </td><td> 100 밀리미터 </td><td> DMSO </td><td> (500) </td><td> (200) </td><td> (50) </td></tr><tr><td> 스트레스 키나제 </td><td> 소마 이신 </td><td> 2 밀리미터 </td><td> DMSO </td><td> (10) </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ROS </td><td> 로테 </td><td> 200 밀리미터 </td><td> DMSO </td><td> 1,000 </td><td> (400) </td><td> (100) </td></tr><tr><td> GSH 콘텐츠 </td><td> 에타 크린 산 </td><td> 200 밀리미터 </td><td> DMSO </td><td> 1,000 </td><td> (400) </td><td> (100) </td></tr><tr><td> 세포 사멸 </td><td> 스타 우로 스포린 </td><td> 40 mM의 </td><td> DMSO </td><td> 200 &lt;/ TD&gt; <td> (50) </td><td> (20) </td></tr></tbody></table> 각 분석에 사용 긍정적 인 통제와 농도 표 3. 목록.

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High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.

유해 및 잠재적으로 유해한 구성 성분의 독성 효과를 평가하기 위해 높은 콘텐츠 심사 분석 (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

high-content-screening-analysis-to-evaluate-toxicological-effects

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

12.1K 조회수.  Philip Morris International R&D. The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds. 

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Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

화학 물질 안전 검사 및 시스템 생물학 데이터 생성을 위해 발생 독성 시험 법을 바탕으로 인간 다 능성 줄기 세포

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

연구

발생학

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been hindered partly due to a lack of standardized methods and availability of robust, user-friendly technology. In this study, commercially available, division-arrested cell lines were employed to quantitatively screen for endocrine activity of chemicals present in water samples of interest to environmental quality professionals. A single, standardized protocol that included comprehensive quality assurance/quality control (QA/QC) checks was developed for Estrogen and Glucocorticoid Receptor activity (ER and GR, respectively) using a cell-based Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) assay. Samples of treated municipal wastewater effluent and surface water from freshwater systems in California (USA), were extracted using solid phase extraction and analyzed for endocrine activity using the standardized protocol. Background and dose-response for endpoint-specific reference chemicals met QA/QC guidelines deemed necessary for reliable measurement. The bioassay screening response for surface water samples was largely not detectable. In contrast, effluent samples from secondary treatment plants had the highest measurable activity, with estimated bioassay equivalent concentrations (BEQs) up to 392 ng dexamethasone/L for GR and 17 ng 17&#946;-estradiol/L for ER. The bioassay response for a tertiary effluent sample was lower than that measured for secondary effluents, indicating a lower residual of endocrine active chemicals after advanced treatment. This protocol showed that in vitro transactivation bioassays that utilize commercially available, division-arrested cell &#34;kits&#34;, can be adapted to screen for endocrine activity in water.

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

물 사용에 내분비 활동에 대한 선별 시판<em&gt; 체외</em&gt; 전이 활성화 생물학적 정량

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

환경과학

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

당 식별-및 결합된 대상 및 비 대상 심사 고해상도 질량 분석 워크플로 Polyfluorinated 화학 종

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

Demonstration of the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility Tool for Rapid Assessment of Protein Conservation

The US Environmental Protection Agency Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) tool is a fast, freely available, online screening application that allows researchers and regulators to extrapolate toxicity information across species. For biological targets in model systems such as human cells, mice, rats, and zebrafish, toxicity data are available for a variety of chemicals. Through the evaluation of protein target conservation, this tool can be used to extrapolate data generated from such model systems to thousands of other species lacking toxicity data, yielding predictions of relative intrinsic chemical susceptibility. The latest releases of the tool (versions 2.0-6.1) have incorporated new features that allow for the rapid synthesis, interpretation, and use of the data for publication plus presentation-quality graphics.
Among these features are customizable data visualizations and a comprehensive summary report designed to summarize SeqAPASS data for ease of interpretation. This paper describes the protocol to guide users through submitting jobs, navigating the various levels of protein sequence comparisons, and interpreting and displaying the resulting data. New features of SeqAPASS v2.0-6.0 are highlighted. Furthermore, two use-cases focused on transthyretin and opioid receptor protein conservation using this tool are described. Finally, SeqAPASS&#39; strengths and limitations are discussed to define the domain of applicability for the tool and highlight different applications for cross-species extrapolation.

Here, we present a protocol to utilize the latest version of the US Environmental Protection Agency Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) tool. This protocol demonstrates the application of the online tool to rapidly analyze protein conservation and provide customizable and easily interpretable predictions of chemical susceptibility across species.

단백질 보존의 신속한 평가를 위한 종 간 감수성 도구를 예측하기 위한 서열 정렬 입증

The US Environmental Protection Agency Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) tool is a fast, freely available, online ...

유전학

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

멀티 주입-모 세관 전기 이동 법 질량 분석을 사용 하 여 높은 처리량 및 포괄적인 약물 감시

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

화학

A High-Throughput Screening Approach for Evaluating the Binding Affinity of Environmental Pollutants to Nuclear Receptors

Increasing levels of compounds have been detected in the environment, causing widespread pollution and posing risks to human health. However, despite their high environmental occurrence, there is very limited information regarding their toxicological effects. It is urgent to develop high-throughput screening (HTS) methods to guide toxicological studies. In this study, a receptor-ligand binding assay using an HTS system was developed to determine the binding potency of environmental pollutants on nuclear receptors. The test is conducted using a microplate reader (i.e., a 96-well plate containing various chemicals) by measuring the fluorescence polarization (FP) of a specific fluorescent probe. This assay consists of four parts: the construction and transformation of recombinant vectors, the expression and purification of the receptor protein (ligand-binding domain), receptor-probe binding, and competitive binding of chemicals with the receptor. The binding potency of two environmental pollutants, perfluorooctanesulfonic acid (PFOS) and triphenyl phosphate (TPHP), with peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR&#947;) was determined to illustrate the assay procedure. Finally, the advantages and disadvantages of this method and its potential applications were also discussed.

This protocol describes a high-throughput screening system that uses fluorescence polarization of a specific fluorescent probe binding to a nuclear receptor as a readout for screening environmental pollutants.

Increasing levels of compounds have been detected in the environment, causing widespread pollution and posing risks to human health. However, despite ...

High-Content Screening Assay for the Identification of Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Modifying Compounds

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells expressing the epidermal growth factor receptor HER2 can be targeted by the anti-HER-2 antibody trastuzumab. Antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) is an important mechanism implicated in the antitumor action of HER-2. Trastuzumab bound to cancer cells can be recognized by the Fc receptors of ADCC effector cells (e.g., natural killer (NK) cells, macrophages, and granulocytes), triggering the cytotoxic activity of these immune cells leading to cancer cell death. We set out to develop an image-based assay for the quantification of ADCC to identify novel ADCC modulator compounds by high-content screening. In the assay, HER2 overexpressing JIMT-1 breast cancer cells are co-cultured with NK-92 cells in the presence of trastuzumab, and target cell death is quantified by automated microscopy and quantitative image analysis. Target cells are distinguished from effector cells based on their EGFP fluorescence. We show how compound libraries can be tested in the assay to identify ADCC modulator drugs. For this purpose, a compound library test plate was set up using randomly selected fine chemicals off the lab shelf. Three microtubule destabilizing compounds (colchicine, vincristine, podophyllotoxin) expected to interfere with NK cell migration and degranulation were also included in the test library. The test screen identified all three positive control compounds as hits proving the suitability of the method to identify ADCC-modifying drugs in a chemical library. With this assay, compound library screens can be performed to identify ADCC-enhancing compounds that could be used as adjuvant therapeutic agents for the treatment of patients receiving anticancer immunotherapies. In addition, the method can also be used to identify any undesirable ADCC-inhibiting side effects of therapeutic drugs taken by cancer patients for different indications.

This protocol presents an automated, image-based high-throughput technique to identify compounds modulating natural killer cell-mediated breast cancer cell killing in the presence of a therapeutic anti-HER-2 antibody.

항체 의존성 세포 독성 변형 화합물의 식별을 위한 High-content screening assay

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells ...

암 연구학

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

세포 독성의 평가 인간의 정밀 컷 폐 분할 영역에서 물질의 Immunomodulatory 효과

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

면역학 및 감염병학

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to gases, particles or complex atmospheres (e.g., cigarette smoke), thus providing realistic physiological exposure of the apical surface of the human alveolar region to air. In contrast to sequential exposure models with linear aerosol guidance, the modular design of the radial flow system meets all requirements for the continuous generation and transport of the test atmosphere to the cells, a homogenous distribution and deposition of the particles and the continuous removal of the atmosphere. This exposure method is primarily designed for the exposure of cells to airborne particles, but can be adapted to the exposure of liquid aerosols and highly toxic and aggressive gases depending on the aerosol generation method and the material of the exposure modules.
Within the framework of a recently completed validation study, this exposure system was proven as a transferable, reproducible and predictive screening method for the qualitative assessment of the acute pulmonary cytotoxicity of airborne particles, thereby potentially reducing or replacing animal experiments that would normally provide this toxicological assessment.

We present a robust, transferable and predictive in vitro exposure system for the screening and monitoring of airborne particles concerning their acute pulmonary cytotoxicity by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface (ALI).

공기-액체 인터페이스에서 재배된 인간 폐 세포를 노출하여 공기 중 입자의 급성 흡입 독성 평가

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

의학

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...