이 연구는 뷔르츠부르크 대학 병원의 학제 임상 연구 (IZKF, 보조금 BD247) 센터와 (헤이 케 Walles 부여) 바이에른 맞춤 프로그램에 의해 후원되었다.

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저자는 공개 아무것도 없어.

우리는 시험 관내 결합 확립 / 바이오 마커 유도 치료를위한 예측 실리 종양 테스트 시스템이다. 시험 관내 모델은 또한 실리코 (17)에서 시뮬레이션 될 수있는 특정 돌연변이 배경에서 종양 세포 증식 및 아폽토시스의 변화와 같은 복합 작업의 다른 중요한 측면을 평가한다. 여기서는 3D 종양 모델 생성 및 증식 및 아폽토시스의 정량 및 실리코 모델 예측의 확립을 포함하여 화합물을 시험하기위한 표준 프로토콜을 제안한다. 3 차원 모델은 종양 특이 돌연변이를 담지 종양 세포주에 기초한다. 세포는 세포 크라운에 decellularized 조직 매트릭스에서 재배된다. 발판의 매트릭스 생물 반응기 시스템의 조립 탈세 포화, 두 개의 금속 링 (셀 크라운) 사이에 고정뿐만 아니라 시드 25 전에 조브에서 가시화되고있다. 체외에서 </EM&gt; 3D 종양 모델 병원에 여기에 달성 결과의 번역은 선택된 대상 의약품에 대한 바이오 마커에 따라 환자를 분류하기 위해 관심의 돌연변이 베어링에 적합 종양 세포의 신중한 선택이 필요합니다. 층화 의학, 차세대 시퀀싱에 의해 druggable 드라이버 돌연변이의 식별 특히 비소 세포 폐암의 주요 관심사입니다 희망 미래 (29)의 새로운 유전자 마커를 공개합니다. 시험 관내 시험을 위해, 관심있는 화합물은 선택된 세포주 또는 일차 세포에서 높은 활성 사이트 타겟팅한다. 여기서, 세포주 HCC827 및 A549는 EGFR 돌연변이 상태에서의 차이에 의한 선택 및 과민성 (HCC827 세포) 및 2D 배양 30-32에서 TKI 피티 닙쪽으로 중간 감도 (A549 세포)에보고되었다. 선택된 종양 3D 종양 모델 생성, 세포 수 및 배양 기간의 제 1 단계에서 세포 adju 할 필요여기에 언급 된 다른 세포가 사용되는 경우 STED. 최적의 화합물 농도를 찾기 위해서, 2D에서 시판 생존 분석의 도움으로 IC50 값을 결정하는 것이 바람직하다. 이 시험에 기초하여, 상기 화합물은 IC50 농도 및 3D 모델의 다음 높은 농도로 사용되어야한다. 우리는 2 ~ 3 주 이내에 다른 한편 2D 종양 테스트 시스템에 쉽게 비교 결과를 얻기 위해 한 손으로 치료 사흘 선택했다. 그러나, 치료 기간은 장기 효과를 조사하기 위해 연장 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 장기 처리 또는 시험 화합물의 높은 투여함으로써 증식 또는 다른 면역 마커의 평가를 방지하는 완전한 세포 손실을 야기 할 수 있음을 고려해야한다. 신뢰성 시그널링 네트워크 분석을 위해, 특정 화합물과 처리시 종양 반응은 증식 및 아포 구별 분석 할안검 하수. 이러한 판독 아웃 다르게 시그널링 네트워크에 접속된다. 따라서, 두 변수의 특징적인 분석은 약물 작용 및 후속 목표 예측을 더 잘 이해할 수있다. 앞서 언급 된 바와 같이, 종양 세포의 증식이 2 차원 배양 조건에 비해 우리 3D 모델에서 감소되고, 따라서, 테스트 화합물의 증식 억제 위양성을 감소한다. 확산 지수를 결정하기위한, 핵의 총수 및 사료된다 염색​​ 양성 핵의 수는 예를 들어 소프트웨어 피지하여 정량한다. 이는 이것이 핵이 낮거나 높은 수치 결과로 세포가 꽉 응집체를 형성하는 경우, 각각 그러나 가능하지 않은 종양 세포의 배양 2D 매크로의 사용으로 단순화 될 수있다. 모든 경우에, 매크로 설정은 각 세포주 및 염색주의 깊게 조절되어야한다. 아폽토시스 WH, 카스파 제 절단 사이토 케라틴 18 측정 상청액에서 비 침습적으로 정량화 할 수있다무형 문화 유산은 M30-ELISA를 사용하여, 상피 특성을 가진 세포로 제한됩니다. 이것은 몇 가지 장점이있다 : I) 이것은 시간이 지남에 따라 치료 효과를 모니터하고 치료 효과의 시점을 식별 할 수있다. II) 샘플이 파괴되지 않고, 다른 판독 기술에 사용될 수있다. III) 상피 세포 아폽토시스는 공동 배양 설정에서 최적 간엽 세포 사멸로부터 구별 될 수있다. 이 기술은, 그러나, 이에 의해 그 상피 표현형 달리기 EMT을받은 종양 세포 부적절 할 수있다. 이 기술을 적용하기 전에 따라서, 사용 된 각각의 종양 세포주의 사이토 케라틴 (18)의 발현이 면역 조직 화학 염색에 의해 확인되어야한다. 시험 화합물은보다 종양 줄기 세포와 유사한 표현형 수행 될 수있다. 일반적으로 약물 검사에서 다른 침략 단계는 TKIs으로 대상 약물의 대부분은, 고급 종양 단계에서 적용되는 경우에도 무시한다. 우리의 모델은 더 침습적 또는 조사를 할 수 있습니다세포 침윤 과정 건너야 인해 보존 기저막 (17) N-침윤성 종양 세포. 세포 운동성 및 침입 향해 중요한 단계는 TGF 베타 1 17,33으로 자극 다른 폐암 모델에서 유도 될 수 EMT이다. 그러나, 이것은 발판을함으로써 증식 세포 수를 감소시킨다. 이러한 부정적인 부작용은 강한 3 차원 모델에서 종양 세포 밀도를 증가 동적 배양 조건을 적용함으로써 회피 될 수있다. 생물 반응기는 생리 학적 조건으로 배양을 조정하더라도, 이는 세포 성 및 시그널링 응력 전단 (25), 노광에 의해 영향을받을 수 있음을 고려하여야한다. 실리 시뮬레이션에서 사용하면 속도 업하는 세포 라인을 특정 약물 테스트 단지 반 정량적이지만, 이벤트의 순서는 적절하게 관리하여 실리 우리 모델에 의해 모델링되고완전히 각 특정 세포주 알려진 돌연변이를 고려. 이 세포주를 다양한 수용체 활성화 수준의 특정 변형을 포함하는 범위는 키나제 활성화 관여 때 얼마나 네트워크 출력 사멸 또는 증식 예상 될 등한다. 예를 들어, 하나의 취득 항 EGFR 치료 저항 (30)의 약 20 %에서 발생하는 것으로 생각되는 임상 공지 C-MET의 증폭을 고려할 수있다. 이어서, 실리코의 모델은, 시간 경과에 대응하는 네트워크 동작을 계산 예., 게 피티 니브 내성 발달 증식 증가로 표시하고 아폽토시스를 감소시켰다. 이 모델에서는, 가장 유망한 표적 후보로서 MEK 및 PI3K을 확인 하였다. 따라서, 새로운 잠재적 인 치료의 조합이 더 빠르게 시험 관내 시험을위한 기초로서 작용하는, 인 실리코 미리 평가할 수있다. 또한, 시험 관내 실험에서 출력 데이터 수가장 실험 결과에 맞게 조정하여 네트워크 실리 시스템에서 정제를 위해 이용 될 수있다. 실리 전략에 반 정량적는 (100 단백질 - 단백질 상호 작용이 고려 될 수있다 주위) 네트워크 크기에 대한 몇 가지 제한이있다. 또한, 실제적인 결과를 산출하기 위해 네트워크 토폴로지에 모든 키 단백질 노드를 통합하는 것이 중요하다. 에 실리 모델 따라서 살아있는 종양 세포에서 기존의 네트워크의 근사값을 제공한다. 그러나이 집중보기 관심의 특정 변경, 예. 셀 라인에서 서로 다른 돌연변이 배경에 약물 조합의 효과를 시뮬레이션하기 위해 우리가 할 수 있습니다. 이것은 우리가 체계적 새로운 치료 전략을 도출뿐만 아니라 암 시그널링 네트워크의 복잡도를 이해하는 것을 돕는다. 우리가 쉽게 precli에 통합 될 수 시험관 도구의 설계 도움이 조직을 개발했다고 결론적으로, 우리는 확신단일 약물 화합물 및 이들의 조합의 효능에 nical 테스트. 테스트 비용 및 시간을 줄이기 위해,이 종양 모델은 또한 실리코 예측 도구에서이 병원 중심 표적 치료하거나 고려할 수있는 새로운 플레이어를 포함한 약물 및 약물 조합 효과 세포 형 특정 예측에 수집 된 데이터를 확장시킴으로써 보완 (예.,의 miRNAs).

제약 산업은 막대한 비용 1-5 일으키는 임상 단계에서 암 치료의 분야에서 95 %까지의 높은 마모 속도를 향하게된다. 이 결핍 한 가지 이유는 현재 잠재적 인 새로운 화합물의 효능은 암 세포주의 2D 세포 배양 또는 동물 모델에서의 대규모 스크리닝에서 평가 된 사실이다. 동물 모델은 더 복잡하지만,이 마우스 및 인간 -6,7- 간의 중요한 차이가있다. 지난 10 년간, 다른 접근법을 사용하여 3 차원 암 모델 차원 암 세포주의 배양 및 생체 내의 종양 6,8,9 복잡한 간의 격차를 생성 하였다. 세포 분화에 또한 시그널링 3D 환경의 영향 년전 여러 연구에 도시되어있다 (예., 미나 BISSELL 의해) 10,11. 오늘날, 많은 3D 세포 배양 모델은 회전 타원체 문화, 하이드로 겔 또는 미세 유체 칩 12-16로 사용할 수 있습니다. 심지어 살전하지만전자 모​​델들은 주로 또한 종양지지 효과 및 영향 약효가 공지 된 미세 조직이없는 종래의 2 차원 배양 시스템에 비해 복잡도를 향상시킨다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 decellularized 돼지의 소장에서 유래 SISmuc (소 소장 - 점막하 + 점막)라고하는 생물학적 골격에 기초하여 3D 종양 모델을 생성. 따라서, 조직 구조와 같은 다른 콜라겐과 기저막의 구조와 ECM의 중요한 구성 요소 (17)를 유지한다. 이러한 독특한 특징은 상피에서 발생하고 고형 종양의 약 80 %를 포함하는 암의 종양 모델 생성을 위해 중요하다. 또한, 우리의 조직​​ 공학 종양 모델의 확산 속도는 2D 문화에 달성 인위적으로 높은 가격에 비해 감소된다. 확산은 약물 효능을 평가하는 중요한 매개 변수이기 때문에, 약물 검사는 더 비슷한 우리의 모델에서 사용 가능생체에 대한 조건은 17 종양이. 정확하게 자신의 EGFR -biomarker 상태 상이한 두 가지 폐암 세포주를 들어, 여기에서 본 데이터 바이오 마커 약물 의존적 효능을 예측하는 우리의 모델의 가능성을 평가하기 위해. 이 돌연변이 상태는 비소 세포 폐암 환자에서 일상적으로 결정하기 시작했다. 백금 기반 화학 요법 18-21 가진 사람에 비해 활성화 EGFR 돌연변이 쇼 우수한 결과를 베어링 종양에 대한 EGFR -inhibitor 피티 니브로 TKIs와 표적 치료. 우리는 화합물의 효능을 평가하기위한 관련이있는 여러 판독 기술을 설립했다. 또한, TGF 베타 1 자극 이후 우리는 악성 변형 22,23 중요한 단계로 생각되고 약물 resistan 접속되어되는 EMT 프로세스를 시작 암세포 복합 작업을 조사 할 수있다가전 ​​24. 3 차원 종양 모델을 대상으로 치료, 화학 요법, 또는 좋은 대조와 약물의 조합에 세포 특이 반응을 모니터링 할 수 있습니다. 더욱 강화하고 약물 검사의 속도와 저항을 발생하기 위해이가 실리 시뮬레이션에 의해 보완됩니다. 몇몇 실험에 기초하여, 종양 반응 약물 그들의 조합의 전체 범위에 대한 결과에 대하여 인 실리코 예측 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Bioreactors</td><td>Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, W&amp;uuml;rzburg (GER)</td><td></td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji)</td><td>Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell crowns</td><td>Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, W&amp;uuml;rzburg (GER)</td><td></td><td>for static 3D culture</td></tr><tr><td>CellDesigner</td><td>http://www.celldesigner.org/</td><td>-</td><td>This software was used for drawing the network.</td></tr><tr><td>Citrate buffer stock solution (10x)</td><td>in house production</td><td></td><td>42 g/L Citric acid monohydrate, 17.6 g/L Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6.0, stored at RT.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Citrate buffer working solution</td><td>in house production</td><td></td><td>10% Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT.</td></tr><tr><td>Citric acid monohydrate</td><td>VWR, Darmstadt (GER)</td><td>1002441000</td><td>used for the citrate buffer</td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>VWR, Darmstadt (GER)</td><td>631-1339</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>SouthernBiotech, Birmingham (USA)</td><td>SBA-0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes &amp;amp; Pathways)</td><td>http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/</td><td>-</td><td>Different known literature databases were used for generating the network topology.</td></tr><tr><td>Female Luer Lug Style Tee</td><td>Mednet, M&amp;uuml;nster (GER)</td><td>FTLT-1</td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>Female Luer Thread Style with 5/16&quot; Hex to 1/4-28 UNF Thread</td><td>Mednet, M&amp;uuml;nster (GER)</td><td>SFTLL-J1A&amp;nbsp;</td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Bio&amp;amp;SELL, Feucht (GER)</td><td>FCS.ADD.0500</td><td>not heat-inactivated</td></tr><tr><td>Gefitinib</td><td>Absource Diagnostics GmbH, M&amp;uuml;nchen (GER)</td><td>S1025-100 mg</td><td>100 mM stock solution with DMSO</td></tr><tr><td>Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection</td><td>Weckert, Kitzingen (GER)</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Histofix 4% (Paraformaldehyd)</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>P087.1</td><td></td></tr><tr><td>Hose coupling</td><td>Mednet, M&amp;uuml;nster (GER)</td><td>CC-9</td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>Incubator for bioreactors</td><td>Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, W&amp;uuml;rzburg (GER)</td><td></td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>M30 CytoDeath&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; ELISA</td><td>Peviva, Bromma (SWE)</td><td>10900</td><td></td></tr><tr><td>Male Luer Integral Lock Ring</td><td>Mednet, M&amp;uuml;nster (GER)</td><td>MTLL230-J1A</td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>Moisture chamber</td><td>custom made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti Pan-Cytokeratin</td><td>Sigma-Aldrich, Munich (GER)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>C2562-2ML</td><td>Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3
+M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence</td></tr><tr><td>Needlefree Swabable Valve Female Luer</td><td>Mednet, M&amp;uuml;nster (GER)</td><td>NVFMLLPC</td><td>Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized</td></tr><tr><td>O-Ring MVQ 10 red 37 x 3 mm</td><td>Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER)</td><td>21444</td><td>O-ring large, Bioreactor setup</td></tr><tr><td>O-Ring MVQ 70 red 27 x 2.5 mm</td><td>Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER)</td><td>19170</td><td>O-ring small, Bioreactor setup</td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Dako, Hamburg (GER)</td><td>S002</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>6642.6</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER)</td><td></td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich, Munich (GER)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>D8537-6x500ml</td><td></td></tr><tr><td>Pump tubing cassette</td><td>Ismatec, Wertheim (GER)</td><td>IS 3710</td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>Rabbit anti Ki67</td><td>Abcam, Cambridge (UK)</td><td>ab16667</td><td>Clone SP6, used for 1/100 for IF</td></tr><tr><td>Rabbit anti Vimentin</td><td>Abcam, Cambridge (UK)</td><td>ab92547</td><td>used 1/100 for IF</td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Life technologies, Darmstadt (GER)</td><td>61870-044</td><td>warm in 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Silicone tube</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER)</td><td>HC66.1</td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich, M&amp;uuml;nchen (GER)</td><td>30620-1KG-R</td><td>used for the citrate buffer</td></tr><tr><td>SQUAD</td><td>http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm</td><td>-</td><td>This software was used for performing the semiquantitative simulations.</td></tr><tr><td>Sterile air filter, pore size 0.2 &amp;micro;m</td><td>Sartorius Stedium Biotech, G&amp;ouml;ttlingen (GER)</td><td>16596-HYK</td><td>Bioreactor setup</td></tr><tr><td>Syringe Luer Lok 5 ml</td><td>BD Biosciences, Heidelberg (GER)</td><td>309649</td><td>for bioreactor sampling</td></tr><tr><td>Tissue culture test plates: 6-,&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 12-, 24-, 96- well</td><td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER)</td><td>92006, 92012, 92024, 92048&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Transforming growth factor-beta 1 (TGF-&amp;beta;1) with carrier</td><td>Cell Signaling, Frankfurt (GER)</td><td>8915LC</td><td>stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, M&amp;uuml;nchen (GER)</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich, M&amp;uuml;nchen (GER)</td><td>P7949-500ml</td><td>for washing buffer of immunofluorescent staining</td></tr></tbody></table>

a combined 3d tissue engineered in vitro/in silico lung tumor model for predicting drug effectiveness in specific mutational backgrounds

본 연구는 특정 돌연변이 배경에 기초하여 약물 반응을 예측 최적화 실리 모델에서와 체외 3D 폐 종양 모델을 조합. 모델은 기저막을 포함한 세포 외 매트릭스 성분과 구조에 관한 조직 - 특이 적 특징을 재현 decellularized 돼지 지지체 상에 생성된다. 우리는 약물 치료 사흘 포함한 14 일 이내에 인공 종양 조직의 생성을 가능하게하는 프로토콜을 표준화. 우리의 기사는 3D의 몇 가지 자세한 설명은 판독 검사 기술의 효과를 평가하기위한 유용한 도구입니다 중간 엽 전이에 M30-ELISA에 의해 상층 액에서 확산 지수 사료된다 염색의, 세포 사멸의 결정 및 상피의 평가 (EMT)처럼 제공 치료 화합물. 우리는 2D 문화에 relat 우리의 3D 종양 모델에서 증식의 감소를 비교 보여줄 수임상 상황에 에드. 이 낮은 확산에도 불구하고, 모델 HCC827 폐 암종 세포주의 비교에 의해 도시 된 바와 같이 정확하게 바이오 마커의 상태에 따른 EGFR -targeted 약물 반응을 예측 (EGFR은 -mutated, KRAS 야생형)와 A549 (EGFR 야생형, KRAS - 티로신 키나제 억제제 (TKI) 피티 니브로 처리) 돌연변이. 멘틴 / 팬 사이토 케라틴 면역 형광 염색에 의해 평가 같은 고급 종양 세포의 약물 반응을 조사하기 위해, 우리는 TGF 베타 1 장기 치료에 의해 유도 EMT. 유동식 생물 반응기는 조직 생성을 향상 생리적 조건으로 배양을 조정하기 위해 사용되었다. 세포 사멸, 증식 지수 EMT - - 부울로 실리 모델 더욱이, 우리는 피티 니브 처리 또는 TGF 베타 1 자극시 약물 반응의 통합을 도시한다. 또한, 우리는 특정 돌연변이 배경 및 카운트를 갖는 종양 세포의 약물 반응 방법을 설명저항에 대한 erstrategies는 예측 될 수있다. 우리는 특히에 실리 확장과 체외 접근 방식에서 우리의 3D는 2 차원 세포 배양에서보다 더 현실적인 조건에서 임상 약물 테스트에 대한 부가 가치를 제공한다는 확신합니다.

SISmuc 지지체 (C로도 2A)에 기초하여, 우리는 3D 종양 테스트 시스템 (도 2D)의 생성을 자극하고 치료를위한 표준 운영 프로토콜을 세웠다. 이 모델은 확산 지수는 각각도 1 및도 3에 도시 된 바와 같이, M30-ELISA를 사용하여 아폽토시스를 정량의 결정을 가능하게한다.도 3 A549 및 HCC827 모델 나타내는 H &amp; E 염색 및 게 피티 니브 한 대표적인 아폽토시스 측정도. 여기에 제시된 모델은 성공적으로 병원에서 대상 억제제로 치료 EGFR -mutated 비소 세포 폐암의 예를 사용하여 설계되었습니다. 대응하여, 단지 EGFR은 HCC827 -mutated 세포 및 A549 세포 아폽토시스의 증가에 의해 평가 우리의 모델에서 TKI 피티 닙 의한 EGFR 억제에 반응하지.도 4 </&gt; 강한는 EMT의 유도의 TGF-베타 1과 자극 후 우리의 모델 중 하나를 대표 염색을 보여줍니다. 도 5c 및 D와 같이. 또한 동적 문화 조건 피티 니브 아래의 흐름 생물 반응기 강화 된 조직 생성에 동적 배양 조건은 EGFR -mutated HCC827 (그림 5D)에 강한 영향을 미친다. 도 6은 네트워크 토폴로지 (도 6A) 및 세포 HCC827 (도 6b, c)에 항 EGFR 치료 내성 실리 모의 상세를 나타낸다. 시그널링 네트워크는 CellDesigner 소프트웨어 (26)과 시각 (42) 노드와 55 가장자리의 토폴로지, 결과 등 HPRD, KEGG 및 QIAGEN (유전자 및 진학)를 공지 된 문헌 데이터베이스를 사용하여 생성되었다. 알려진 드라이버 돌연변이 EGFR (빨간색)와 C-MET 공동 활성화의 시뮬레이션 (녹색, 값은 약 0.7) 증가 prol를 보여줍니다iferation 속도 (연어 곡선) 및 MEK 및 PI3K (그림 6B, 어두운 녹색과 시안)의 활성화와 함께가는 HCC827 세포에서의 저항 (노란색) 피티 닙을 반영 시간이 지남에 따라 감소 된 세포 사멸 율 (바이올렛 곡선). 결합 PI3K 및 MEK 억제제 (어둡고 밝은 회색 곡선)을 방지 EGFR 저항 효과의 반전 결과의 모델링 증식을 감소시키고 세포 사멸 (그림 6C)를 유도한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53885/53885fig1.jpg" /> 도 1 확산 레이트. 차원 세포 배양에 비해 3D 저감 사료된다 양성 HCC827 세포 (적색 및 B) SISmuc (B)에 2 차원 세포 배양 물 (A) 및 3D 세포 배양에서 염색된다. HCC827 세포 및 A549 세포를 C (계산하고, 확산 지수 (사료된다 양성 세포의 비율)을 측정 하였다 &lt;/ strong&gt;을, 한 대표는) 오에서 계산. 스케일 A의 바, B :. 100 μm의 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53885/53885fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53885/53885fig2.jpg" /> TKI 피티 니브 그림 2. SISmuc 비계 형태와 처리 일정 세포가 소장 점막하 (SIS) + 점막 (A 구성되어 SISmuc에 시드됩니다. 시야, B : DAPI 염색 된 세포를 SISmuc, C의 위에 : 오버레이 A와 B)와 일 0에서 세포 크라운에서 해결의 치료 방식은 D에 표시됩니다 : 중간 변경 (MC)가 매 2 ~ 3 일을 수행한다. 하루에 11에서 처리가 시작됩니다. 상청액을 수집하고 M30-ELI에 사용시간이 지남에 따라 세포 사멸을 정량화하기 위해 SA (파란색 화살표와 상자). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53885/53885fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53885/53885fig3.jpg" /> 그림 A549 3D 종양 모델 3. 피티 니브 치료 변경 셀 HCC827에서 SISmuc 및 유도 세포 사멸에 성장, 그러나되지 않음. 어떤 치료를하지 않으면, 두 세포주는 SISmuc (A와 B)의 단층을 형성하고, 또한 전 토굴 구조를 정착. A549 세포의 성장 패턴은 게 피티 닙 (C)로 처리 한 후 변경되지 않지만, HCC827 세포의 수는 신장 세포 형태 (D)에 대한 변경과 함께 감소된다. 배양 상층 액에서 M30-ELISA 측정에 의해 본 고사가 E (HCC827 모델 피티 닙에 의해 유도된다 </st룽&gt;, 오 중 하나의 대표 측정). D의 스케일 바 :. D에 대한 100 μm의 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53885/53885fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53885/53885fig4.jpg" /> SISmuc에 HCC827 세포에서 그림 4. TGF-베타 1 유도의 EMT. 3D에서 배양 HCC827 세포가 팬 - 사이토 케라틴 (PCK)의 전체 표현 표시 (A 녹색은 A1) 만 단일 세포는 (A)에 (빨간색 멘틴을 표현 A2). TGF 베타 1 자극 후에 세포가 긴 형상으로 그들의 형태를 변경하고 멘틴의 발현이 크게 증가된다 (B에서 빨간색, B2) PCK의 발현이 유지되는 반면, (B 녹색, B1). B의 스케일 바 : A에 대한 100 μm의 </strong&gt;를 B. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53885/53885fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53885/53885fig5.jpg" /> 그림 5. 동적 세포 배양은 향상 조직 생성. 생물 반응기에서 3D 조건 (B), 정적 모델 (A, H &amp; E 염색) 다층 조직에 단층 (A)의 변경 (C, H &amp; E 염색에서 단일 층에서 배양 할 때 ). HCC827 세포는 게 피티 니브 처리 (D, H &amp; E 염색)에 따라 강한 약물 반응을 보여줍니다. D의 스케일 바 :. A, C 및 D 100 μm의 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53885/53885fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53885/53885fig6.jpg" /> 무화과. 실리 종양 모델 생성 및 안티 EGFR 치료 내성. 네트워크 적색 (EGFR 경로) 키 신호 노드 종양 세포의 토폴로지 및 녹색 (c-MET) 및 다운 스트림 노드의 시뮬레이션 제. 특징 종양 판독 매개 변수 (연어)에 증식과 (바이올렛) 세포 사멸은 육각형로 표시됩니다. 화살표 활성화, 무딘 화살표 억제를 나타냅니다. 치료 대상이 어둡고 밝은 회색 사각형으로 표시됩니다, 피티 닙에 의해 억제는 노란색 (A)에 표시됩니다. 확산 (연어 곡선) 및 광고의 증가로 표시된 바와 같이 전자 기능 (컬러 곡선 (), NOT AND, OR) 부울 네트워크 연결을 보간에 의해 동적 시뮬레이션. EGFR 및 C-MET 공동 발현은 피티 니브 저항을 발생에 대한 임의의 시점 (8) (B) 후 세포 사멸 (바이올렛 곡선)의 ecrease. (노란색 곡선 아래, 같은 활성화, 프로토콜 참조) 잠재적 인 치료 태클 억제제로 PI3K 및 MEK 모두. (C) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53885/53885fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

결합 된 3 차원 조직은 엔지니어링<em&gt; 체외</em&gt; /<em&gt; 인 실리코</em특정 돌연변이 배경에서 약물의 효과를 예측&gt; 폐 종양 모델

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

a-combined-3d-tissue-engineered-vitroin-silico-lung-tumor-model-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

10.2K 조회수.  University Hospital Wuerzburg. We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity. 

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Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor cells with a natural matrix and continual flow of nutrients, as well as a model that shows the interaction of tumor cells with normal cellular components and a natural matrix. The acellular ex vivo lung model is created by isolating a rat heart-lung block and removing all the cells using the decellularization process. The right main bronchus is tied off and tumor cells are placed in the trachea by a syringe. The cells move and populate the left lung. The lung is then placed in a bioreactor where the pulmonary artery receives a continual flow of media in a closed circuit. The tumor grown on the left lung is the primary tumor. The tumor cells that are isolated in the circulating media are circulating tumor cells and the tumor cells in the right lung are metastatic lesions. The cellular ex vivo lung model is created by skipping the decellularization process. Each model can be used to answer different research questions.

Here, we present a protocol for an ex vivo lung cancer model that mimics the steps of tumor progression and helps to isolate a primary tumor, circulating tumor cells, and metastatic lesions.

Acellular과 세포 폐 종양 전이 연구 모델

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

연구

암 연구학

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

인간의 3 차원의 조직 공학<em&gt; 시험관</em&gt; 종양 테스트 시스템

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

생체공학

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions contribute to tissue architectural changes observed during tumorigenesis remains challenging due to the lack of appropriate models. In this protocol, we describe the generation of a 3D coculture model using a LUSC primary cell culture known as TUM622. TUM622 cells were established from a LUSC patient-derived xenograft (PDX) and have the unique property to form acinar-like structures when seeded in a basement membrane matrix. We demonstrate that TUM622 acini in 3D coculture recapitulate key features of tissue architecture during LUSC progression as well as the dynamic interactions between LUSC cells and components of the tumor microenvironment (TME), including the extracellular matrix (ECM) and cancer-associated fibroblasts (CAFs). We further adapt our principal 3D culturing protocol to demonstrate how this system could be utilized for various downstream analyses. Overall, this organoid model creates a biologically rich and adaptable platform that enables one to gain insight into the cell-intrinsic and extrinsic mechanisms that promote the disruption of epithelial architectures during carcinoma progression and will aid the search for new therapeutic targets and diagnostic markers.

An in vitro model system was developed to capture tissue architectural changes during lung squamous carcinoma (LUSC) progression in a 3-dimensional (3D) co-culture with cancer-associated fibroblasts (CAFs). This organoid system provides a unique platform to investigate the roles of diverse tumor cell-intrinsic and extrinsic changes that modulate the tumor phenotype.

폐 편평상피암 진행을 모델링하는 다차원 동문화 시스템

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex vivo drug screenings. However, current adenosine triphosphate (ATP)-based drug screening assays do not capture the complexity of a drug response (cytostatic or cytotoxic) and intratumor heterogeneity that has been shown to be retained in PDTOs due to a bulk readout. Live-cell imaging is a powerful tool to overcome this issue and visualize drug responses more in-depth. However, image analysis software is often not adapted to the three-dimensionality of PDTOs, requires fluorescent viability dyes, or is not compatible with a 384-well microplate format. This paper describes a semi-automated methodology to seed, treat, and image PDTOs in a high-throughput, 384-well format using conventional, widefield, live-cell imaging systems. In addition, we developed viability marker-free image analysis software to quantify growth rate-based drug response metrics that improve reproducibility and correct growth rate variations between different PDTO lines. Using the normalized drug response metric, which scores drug response based on the growth rate normalized to a positive and negative control condition, and a fluorescent cell death dye, cytotoxic and cytostatic drug responses can be easily distinguished, profoundly improving the classification of responders and non-responders. In addition, drug-response heterogeneity can by quantified from single-organoid drug response analysis to identify potential, resistant clones. Ultimately, this method aims to improve the prediction of clinical therapy response by capturing a multiparametric drug response signature, which includes kinetic growth arrest and cell death quantification.

This protocol describes a semi-automated method for medium- to high-throughput organoid drug screenings and microscope-agnostic, automated image analysis software to quantify and visualize multiparametric, single-organoid drug responses to capture intratumor heterogeneity.

벌크 및 단일 오가노이드 분석을 위한 광시야 라이브 셀 이미징을 사용한 다중 파라미터 종양 오가노이드 약물 스크리닝

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the evaluation of anticancer drugs. However, the conventional culture methods lack the ability to manipulate the tumor spheroids in a homogeneous manner at the three-dimensional level. To address this limitation, in this paper, we present a convenient and effective method of constructing average-sized tumor spheroids. Additionally, we describe a method of image-based analysis using artificial intelligence-based analysis software that can scan the whole plate and obtain data on three-dimensional spheroids. Several parameters were studied. By using a standard method of tumor spheroid construction and a high-throughput imaging and analysis system, the effectiveness and accuracy of drug tests performed on three-dimensional spheroids can be dramatically increased.

This article demonstrates a standardized method for constructing three-dimensional tumor spheroids. A strategy for spheroid observation and image-based deep-learning analysis using an automated imaging system is also described.

약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

미세유체역학(Microfluidics) 기반 혈관화된 인간 미세종양 모델 준비

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

저자 스포트라이트: Creating Human Vascularized Micro-Tumors as Models for Translational Cancer Research (중개 암 연구를 위한 모델로서의 인간 혈관 미세 종양 생성) 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

결합 된 3 차원 조직은 엔지니어링

요약

더 많은 비디오 탐색

Acellular과 세포 폐 종양 전이 연구 모델

인간의 3 차원의 조직 공학

폐 편평상피암 진행을 모델링하는 다차원 동문화 시스템

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

벌크 및 단일 오가노이드 분석을 위한 광시야 라이브 셀 이미징을 사용한 다중 파라미터 종양 오가노이드 약물 스크리닝

약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립

암 연구를 위한 생리학적 인간 혈관화 미세종양 모델 확립