저자는 친절에 좋아하는 원고를 교정에 대한 데이터 및 박사 B. Grötsch 제조 박사 J. 루터와 K. Ubieta 감사합니다. 이 작품은 독일 연구 협회 (BO3811 / 1-1 - 에​​미 뇌터)에 의해 지원되었다.

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저자는 공개 아무것도 없어.

지방 세포 인해 과도한 에너지 저장에 의한 지방 세포 증식 및 비대를 공개, 크기, 숫자 및 지역에 따라 표현형 특징을 통해 영양 (5). 지방산 조절 곤란 및 후속 대사 증후군 선도 이러한 이벤트는 또한, &quot;정상&quot;지방 확장이라 보존 대사, 증가 체지방량의 상태이다. 예를 들어, Kusminski 등. (21)는 대규모 지방 확대와 마우스는 그 지방의 확장이 필요 대사 증후군에 연결하고 지방 세포의 특성을 평가하기 위해 신중하게 판단 할 필요가되지 제안, 대사 건강을 유지 것으로 나타났다. 지방 조직 (AT)는 신체 대사 조절에 중추적 인 역할을한다. AT는 이상 지질 혈증, 동맥 경화증, 고 인슐린 혈증과 고혈당 3에 영향을 미칠 수있는 가장 큰 내분비 기관이다. 항상성 및 분자 m AT 평가를 조절 echanisms 대사 시스템 장애에 대한 이해를 허용 할 수 있습니다. 그러므로, 지방 세포 분화 조절 기전을 해명, 지방 세포의 크기와 지방 패드 질량은 비만 질환의 새로운 치료를 개발하는 데 도움이된다. 생체 내 및 시험 관내 방법에 사용하면, 지방 세포의 분화와 활성에 식품 및 유전자 발현에 미치는 영향의 역할을 결정할 수있다. 우리 프로토콜은 포도당 및 인슐린 대사 반응 22-24을 분석만큼 중요 의해 제안 지방 세포 분화, 증식 및 세포 자멸사의 밸런스를 결정하고, 상기 항상성을 결정한다. 발현 프로파일 차 지방 세포의 지방 생성, 지방 생성, 지방 분해, 지방산 흡수, 저산소증, 사멸 및 증식에 관여하는 유전자 분석 및 내장 AT는 지방 세포의 항상성과 가능한 장애에 대한 개관을 획득하기위한 높은 처리 방법이다.흥미 후보는 또한 웨스턴 블롯 또는 면역 조직 염색에 의한 단백질 수준에서 분석해야한다. 비대칭 시아닌 계 색소를 사용하여 실시간 PCR 시스템으로 최적의 결과를 얻기 위해 1 내지 10 ng의 범위의 cDNA의 농도는 50 내지 900 nm의 범위의 최적 프라이머 농도 비특이적 증폭을 최소화하기 위해 테스트되어야한다. 중요한 성분은 프라이머이다; 각 실행에 대해, 용융 곡선은 엄격 특이성을 확인하기 위해 프라이머 이량 체의 형성을 배제하도록 제어 될 필요가있다. 따라서, 대신의 cDNA의 H 2 O와 부정적인 컨트롤을 사용하는 것이 좋습니다. 또한, 상용 가능한 비대칭 시아닌 염료 (예 ROX 같이) 수동적 기준 염료를 함유하는 내부 기준 신호를 제공하도록 마스터 믹스로 제공된다. cDNA를 신호는 잘 - 투 - 잘 신호 변동을 해결하기 위해 ROX 신호를 데이터 분석 중에 정규화. 다른 점은 끈적 거리는을 설정하기 위해 고려되어야D qPCR의 시스템은 하우스 키핑 유전자의 선택입니다. 각 조건의 경우, 여러 하우스 키핑 유전자는, 사용 예를 들어, HPRT, β - 굴지, GAPDH, β-2-MG 또는 HSP90. 저산소 조건에 의해 안정화 HIF 단백질 마스터뿐만 아니라 지방 세포 생존을 결정 레귤레이터뿐만 아니라, 글루코스, 인슐린 내성 및 지질 대사 11,25,26 같은 대사 변화이다. 지방 패드에서 저산소 영역을 확인하기 위해, HIF-1α는 면역 조직 화학 염색에 의한 부분 AT에서 결정된다. HIF 단백질을 빠르게 정상 산소의 조건 하에서 5 내지 10 분 이내에 분해되기 때문에, 절차 및 조직 학적 분석을 위해 지방 패드의 단단히 고정 대기 시간을 방지하기 위해 제어되어야한다. 따라서,뿐만 아니라 HIF 염색 통해 저산소증을 보장하기 pimonidazole AT는 저산소 영역을 결정하는데 사용된다. 이미 뼈 (27)에 도시 된 바와 같이 Pimonidazole는 조직에 배포 할 수 있습니다효과적으로 더 특이 항체 (28)를 결합하여 조직 학적 섹션에서 검출 특히 저산소 세포 티올 - 함유 단백질에 결합함으로써 저산소 영역을 표시한다. 그러나, 다른 마커 및 방법은 저산소증 경로를 분석하는데 사용될 수있다. 예를 들면, 수산화 프롤린을 인식 프로 테아 HIF을 중재 폴리 - 유비퀴틴 유도 normoxia 아래 프롤린 잔기의 히드 록 실화를 유도 프 롤릴 수산화 효소 (PHD) 효소뿐만 아니라 폰 Hippel-Lindau의 (VHL) 단백질의 참여 저하는 통로 29, 30의 전체 개요를 분석 할 필요가있다. 또한, 유비쿼터스 HIFs의 검출은도 31, 32을 변경할 수있는 단백질 분해 안정성을 결정한다. 또한, TUNEL 염색에 의한 사료된다하여 증식과 세포 자멸사는 AT 조직 학적 섹션의 염색을 통해 생체 내에서 결정된다. 사료된다 및에 의해 확산의 정량화유동 세포 계측법 분석을 통해 TUNEL 또는 아 넥신 V 염색에 의해 poptosis도 33을 수행한다. 증식 물론 이러한 사료된다 양성 세포 측정에 의해 해결되지 않는 지방 세포의 세포주기의 분석과 같은 다른 기법에 의해 측정 될 수있다. FACS는 아폽토시스 세포 사멸 과정 대 괴사의 수준을 결정 넥신 V 및 TOP-PR-3 분석하여 또한 TUNEL 의한 세포 사멸 연구는 완성 될 수있다. 아폽토시스 AT 항상성에 중요한 세포 사멸의 과정을위한 기본적인 과정이다. 사실, 지방 세포의 세포 사멸의 조절 곤란 비만에 기여하는 과정에서 이전에 연루 및 34 지방 이상증되었습니다. 또한, 2011 년, Keuper 등의 알. 지방 세포의 세포 사멸에 지방 조직의 염증을 연결. 그들은 식세포 차례로 식세포를 유치 전구 지방 세포와 지방 세포에서 세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났다. 대 식세포의 모집은 염증, 어느 제어 방식을 가속포도당과 인슐린 내성 35 대사 증후군에 ibutes. 그러나, 지방 세포 사멸이 제대로 공부 현상에 의한 지방 세포의 세포 사멸 체중 감소로 이어질 수 있다는 가설에도 불구하고, 아직도있다. 본 프로토콜은 생체 내에서 증식, 세포 사멸 및 저산소증으로 다른 현상을 연구하기 위해 면역 조직 화학적 방법을 사용합니다. 따라서, 조직은 중요한 단계 4 % 포름 알데히드로 고정 하였다. 확장 된 조직 정착 시간은 상기 항체에 대한 비 액세스 될 에피토프, 변화하도록 이끈다. 반대로, 짧은 정착 시간은 시약 에피토프의 감도를 증가시킨다. 고정의 권장 최적의 시간은 24 시간입니다. 또한, 상기 부분의 두께는 그 에피토프에 결합하는 항체에 영향을 미친다; 최적의 두께는 μm의 2 내지 5이다. 5 μm의보다 두꺼운 부분은 증가 된 결합 부위에 거짓 긍정적 인 결과를 줄 것이다. 대조적으로, s의ections보다 얇은 2 μm의 적은 결합 부위를 포함하고 긍정적 인 부분은 잘 정의되지 않습니다. 또한, 중요한 요소는 에피토프에 결합하는 특정의 품질에 영향을주는 항체 자체, 배양 시간, 농도, 심지어 온도이다. 따라서, 항체 농도와 배양 시간을 확인하는 각 조건에 대한 필요가있다. 연구를 완료하려면, 우리는 다른 치료, 자극 또는 공동 문화에 의해 확장 될 수있는 시험 관내 지방 세포 분화 프로토콜을 제공합니다. 시험 관내 지방 세포 배양에 사용함으로써, 지방 세포 분화 및 기능에 결함을 판별 가능하다. 모든 기본 세포와 같이 ADSCs 및 지방 세포의 건강 행동과 외관이 매우 중요하다, 신뢰할 수있는 결과를 얻을 수있다. 입도, 세포질 vacuolations 및 / 또는 박리 차의 부적절한 매체, 미생물 오염이나 노화를 나타내는 악화의 징후이다세포. 다른 프로토콜 (36)에 의해 기술 된 바와 같이, 골수로부터 단리 된 중간 엽 줄기 세포를 사용하는 것도 가능하다 반면,이 프로토콜은 지방 패드 조직으로부터 격리 된 지방 세포를 사용한다. 최근이 지방 세포 분화의 초기 단계에서 발생하는 추가 차별 문제를 반영 할 수있는 기질 전구 세포를 포함, 이것은 현재의 프로토콜에서 누락 될 수 있습니다. 또한 ADSCs 빠르게 (일주일 이내에 10 배 이상) 확장 될 수 있으며, 일부 유로 후의 장기 배양 ADSCs은 여전히 중간 엽 37,38 능성을 유지한다. ADSCs을 사용하는 다른 이점은 ADSCs 간단하고 최소 침습 방법으로 지방 흡입에 의해 환자로부터 채취 할 수 있기 때문에 용이 한 인간으로 전환 할 수 있다는 것이다. AT는 내분비 방식으로 여러 다른 장기에 영향을 미친다 같이, 프로토콜 adipokines로 확장되어야한다. 이러한 렙틴, 아디포넥틴, 종양 괴사 인자 α (TNF)를 같은 Adipokines,지방 세포에 의해 분비 된 인슐린 저항성 ND는 지방 대사, 에너지 항상성 및 인슐린 감수성 (39)를 제어함으로써 대사성 질환에 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 따라서, 혈청 및 지방 세포의 secretome 분석이 수행되어야한다. 이러한 IL-6와 같은 AT 장애, adipokines 및 염증성 사이토 카인의 경우에, 예컨대 췌장, 간, 근육 기능 4로 장기의 조절 이상을 초래할 수있다. 전신 장기 부전을 배제하기 위하여, 동물 모델 또는 세포 배양 물은 자극 포도당 흡수를 그들의 응답을 테스트 할 수있다. 여기에서 우리는 AT 및 생체 내에서 지방 세포의 기본 상태를 분석하기위한 프로토콜을 제공하고 체외에서 지방 세포의 항상성 및 기능의 분자 메커니즘을 공개.

세계 보건기구 (WHO)에서 2014 보고서에 따르면 세계 성인 인구의 39 %가 과체중이며, 13 %가 비만 한 것이다. 가까운 미래에, 사람들이 과체중 노인 인구의 상당 부분을 포함 할 것이다. 비만과 노화의 중요한 특징은 이환율과 사망률이 관련 지방의 조절 곤란하다. Adipokines는 지방 조직 (AT)에 의해 분비되는 단백질, 비만 등 대사 증후군을 유발하고 당뇨병 (3)를 입력 할 수 있습니다. 대사 질환은 대부분 확장 4 AT의 결과 지방 세포의 지질 방울에 과도한 에너지 저장에 의해 발생합니다. 따라서,를 제어 할 기회를 찾기 위해 AT 원인과 확장의 분자 메커니즘을 결정 관심사이다. 위에 영양 두 가지 이벤트에 의해 조절된다 AT 확대로 이어진다 과도한 에너지 저장 지방 세포의 지질 소적으로, 공정또한 지방 세포 증식 5로 알려진 (지방 세포 크기 증가), 증가 된 지방 조직은 비대로 이어지는. 지방 조직은 지방 세포로 다 능성 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 분화 과정이다. 첫째, 중간 엽 줄기 세포는 확약 단계에서 전구 지방 세포로 발전. 둘째, 전구 지방 세포는 또한 성숙한 지방 세포 (6)의 기능적 특징을 취득 구별. 여러 전사 인자는 징크 핑거 단백질 423 (Zfp423) 초기 B 세포 인자 1 (Ebf1) 등의 지방 전구 세포 검지 마스터 레귤레이터로 확인되었다. Zfp423 초기 노력을 유도하는 반면, Ebf1은 지방 세포의 전구 세포 (6)의 생성이 필요합니다. 말단 분화 단단히 페 록시 좀 증식 제 - 활성화 수용체 γ (PPARγ)의 필수 전사 인자 칠해진다 전사 캐스케이드에 의해 제어된다. 또한 키 전사 요소 (C CCAAT / 증강 인자 결합 단백질이다/ EBP) 가족 (즉, C / EBPα, C / EBPβ 및 C / EBPδ), 크 룹펠 같은 요인 (KLFs), 캠프 응답 요소 바인딩 단백질 (CREB) 및 초기 성장 응답 20 (Krox20) 6. 최근에는 활성제 단백질 1 (AP-1) 패밀리는 지방 세포 분화 과정에 관여 8,9 것이 밝혀졌다. 는 AP-1 패밀리는에 Fos 이세 및 / 또는 활성화하는 전사 인자 (ATF) 부재로 이루어진 이량 체 단백질 복합체에 의해 형성된다. FOS 관련 항원 1 및 2 (FRA-1 및 프라-2) 지방 세포의 분화를 조절할 수있다. 훌라-1 훌라-2 제어 지방 세포 회전율 9 반면, / EBPα 8 C를 억제함으로써 지방 세포 분화를 저해. 훌라-2는 이에뿐만 아니라 지방 세포 분화시 PPARγ2 식을 억압하여 지방 세포의 수를 감소뿐만 아니라, 저산소증 유도 인자 (HIFs) 식의 직접적인 억제를 통해 지방 세포의 세포 사멸을 감소시킨다. HIF 제품군은 HETE입니다HIF-1α, HIF-2α와 HIF-1β로 구성 rodimeric 전사 인자 복합체. 이종는 산소에 민감한 HIF-α 단백질 (HIF-1α 또는 HIF-2α)와 산소를 구분하지 HIF-1β 서브 유닛 (10)으로 구성되어 있습니다. normoxia 동안, HIF-α 단백질은 폴리 ubiquitinylated하고 마지막으로 프로 테아 좀 (11)에 의해 분해된다. 확장시 AT에서 발생하는 저산소 조건에서 HIF-α 단백질은 더 이상 수산화 없습니다. 그들은 따라서 구조적으로 표현 HIF-1β와 안정 및 양식 이합체된다. HIF 응답 소자를 제어하는 유전자의 전사 활성은 혈관 형성, 대사 및 염증 (12)의 조절에 관여한다. 실제로, HIF-1α는 글루코스 내성을 유도하는 에너지 비용 및 지질의 사용 억제 주변뿐만 아니라, 렙틴에 의해 레벨과 HFD 유도 간 지방증 (13)을 증가시킴으로써 부전 AT 촉진한다. 또한, HIF-1α는 adipocy을 조절테 세포 사멸의 생체 내 및 생체 외 9인치 본 프로토콜은 성인 쥐의 지방 세포 항상성의 분자 특성을 해명하는 상태에서 공부에 대한 방법을 설명합니다. 그것은 세포 사멸, 증식 및 생체 내 및 생체 외 지방 세포의 분화가 저산소증에 의해 조절 될 수있는 방법을 보여줍니다. 이를 위해, 우리는 Fabp4-CreERT 마우스 (9)와 훌라-2 floxed 대립 유전자를 운반하는 쥐를 교차에 의해 생성 된 훌라-2의 지방 세포 특정 삭제와 마우스를 사용합니다. Fabp4-Cre 호텔 ERT 마우스를 사용하여 결실은 지방 세포 타목시펜 주입 (14)에 의한 비와 유도된다. 성인 모델의 경우 타목시펜의 내부 복강 주사 6 주 세의 나이에 시작하는 연속 5 일 동안 수행된다. 분석이 완료되기 전에 따라서, 마우스 6 주 동안 정상식이 또는 고지방식이 요법을 실시한다. 본 연구에 사용 된 마우스는 남성 같은 에스트로겐과 같은 여성 호르몬을 피하기 위해 C57BL6 배경 근거한신체 지방 분포 (15)를 규제하는 도시. 다른 유전 적 배경을 사용하여 인해 지질 관리 (16)의 변형과 관련된 차이로 대사 표현형을 변경할 수 있습니다. 이 프로토콜은 조직학을 사용하여 저산소증에서 AT를 분석하는 방법과 면역 조직 화학 및 프로파일 링 분석 유전자를 사용하여 생체 내에서 지방 세포의 세포 사멸, 증식 및 분화를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 저산소증에 노출에 의해 변경 주 지방 세포 분화 및 세포 사멸을 분석하는 방법을 보여주는 시험 관내 실험에 의해 완성된다.

<table><tbody><tr><td>RNAlater solution</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td>RNA stabilization solution</td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>4472908</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purified Mouse Anti-Human Ki-67</td><td>BD Biosciences</td><td>550609</td><td>Clone B56 (RUO)</td></tr><tr><td>Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO)</td><td>550609</td><td>Proliferation marker</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V</td><td>BioLegend</td><td>640906</td><td></td></tr><tr><td>Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb</td><td>Cell signalling</td><td>9664S</td><td>Clone 5A1E</td></tr><tr><td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb</td><td>9664</td><td>Apoptosis marker</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000 Reagent&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 Iodide</td><td>T3605</td><td>Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation&amp;frasl;Emission: 642&amp;frasl;661 nm</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&amp;rsquo;s hemalum</td><td>Merck</td><td>109249</td><td>hematoxylin</td></tr><tr><td>pegGOLD TriFast</td><td>Peqlab</td><td>30-2030</td><td>TRIzol, single-phase solution of guanidine isothiocyanate and phenol</td></tr><tr><td>Percellys Ceramic Kit 1.4&amp;nbsp;mm</td><td>91-PCS-CK14</td><td>tubes containing ceramic beads (1.4 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24</td><td>91-PCS24</td><td>homogenizer</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1 alpha Antibody</td><td>Pierce</td><td>PA1-16601</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13</td><td>700505</td><td>Hypoxia marker</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In Situ&lt;/em&gt; Cell Death Detection Kit, Fluorescein</td><td>Roche</td><td>11 684 795 001</td><td>TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma</td><td>318906</td><td></td></tr><tr><td>DNase I Solution (1&amp;nbsp;unit/&amp;micro;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>biotinylated anti mouse IgG (H+L)</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>biotinylated anti mouse IgG (H+L)</td><td>BA-1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC Kit</td><td>PK-4000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td><td>H-1200</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mechanism of regulation of adipocyte numbers in adult organisms through differentiation and apoptosis homeostasis

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of adipocytes, which in turn induces abnormal secretion of adipokines, triggering metabolic syndromes such as obesity, dyslipidemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, insulin resistance and type 2 diabetes. Therefore, investigating the molecular mechanisms behind adipocyte dysregulation could help to develop novel therapeutic strategies. Our protocol describes methods for evaluating the molecular mechanism affected by hypoxic conditions of the AT, which correlates with adipocyte apoptosis in adult mice. This protocol describes how to analyze AT in vivo through gene expression profiling as well as histological analysis of adipocyte differentiation, proliferation and apoptosis during hypoxia exposure, ascertained through staining of hypoxic cells or HIF-1&#945; protein. Furthermore, in vitro analysis of adipocyte differentiation and its responses to various stimuli completes the characterization of the molecular pathways behind possible adipocyte dysfunction leading to metabolic syndromes.

우리의 예를 사용하여 생체 내 및 생체 외 지방 세포의 항상성을 결정하는 방법을 보여 훌라을-2 FL / FL 야생형 한배 새끼에 비해 Fabp4-CreERT 마우스. 우리의 프로토콜은 증가 된 지방 세포의 세포 사멸에 의해 지시 된 바와 같이 저산소증에 의해 증가 HIF의 발현이 지방 세포의 기능 장애와 관련되는 방법을 정의합니다. 고지방 다이어트에 증가 된 지방 세포의 크기와 영역 (HFD) 처리 된 마우스 과잉 영양, 다른 요인들, 지질 방울에 과도한 에너지 저장에 의한 지방 세포의 비대, 발생합니다. 지방 세포의 크기와 영역은 비대의 지표이다. 정상에서 지방 패드의 섹션 (ND;도 6a)와 높은 지방 다이어트 (HFD도 6B) 육주 후 지방 세포의 크기와 지역의 마우스뿐만 아니라 정량화 명확하게 표시 지방 세포의 비대HFD 처리 된 마우스 (도 6c 및 d) 증가 지방 세포의 크기에 의해 표시된다 HFD의 S. 성인의 지방 조직 (AT)에서 증가 저산소증 프라 -2- FL / FL-Fabp4 CreERT 마우스 증가 HIF-1α의 레벨 및 지방 세포 자멸사에 이르게 AT에서 저산소증의 생체 상태를 확인하려면 훌라-2 FL / FL Fabp4-CreERT 마우스 12 주 세의 나이에 훌라-2 삭제 후 육주 분석 야생형 한배 새끼와 비교된다. Pimonidazole 복강 효과적인 저산소증 마커와 마우스에 투여; 그 독성 및 AT에 분배 할 수있다. 생체 내에서 AT에서 저산소 지방 세포는 면역 항체 염색 (도 7a)에 의해 정의된다. 또한, 쥐에서의 증가 된 AT 저산소 상태가 증가 HIF-1α 긍정적 ADIP 수반HIF-1α 발현 및 대상 유전자 (9)의 정량화에 의해 확인 된 면역 염색도 7b)로 나타낸 바와 같이 ocytes. 또한, 훌라-2에서 AT 섹션의 TUNEL 염색 FL / FL Fabp4-CreERT 마우스 및 제어 한배 새끼 (그림 7C) 지방 세포의 세포 사멸이 저산소증과 HIF-1α 식의 존재와 상관 관계가 증가 보여줍니다. 저산소증에 의한 지방 세포의 세포 사멸을 통해 차 지방 세포에서 HIF-1α 발현을 증가 다른 20 바와 같이 시험 관내 지방 세포 사멸을 분석하기 위해 피하 지방 패드에서 생성 된 지방 세포를 사용한다. 예상대로, 지방 세포에서 HIF-1α 발현은 저산소증 (그림 8a)의 24 시간 후에 증가한다. 상기 HIF-1α 활동 HIF 표적 RNA의 수준을 분석이러한 iNOS의 (유도 성 산화 질소 합성 효소)와 같은 유전자 qPCR에 의해 정량화된다.도 8b는 저산소 상태에서 HIF-1α의 발현 증가는 iNOS의 mRNA 발현 증가에 이르게 것을 보여줍니다. 우리가 이미 지방 세포에서 HIF-1α 발현을 증가 지방 세포의 세포 사멸과 관련이 증가 생체 내 (그림 8)에 도시 한 이후, 세포 사멸은 저산소 조건에서 넥신 V 염색으로 체외 문화에서 계량입니다. 생체 데이터 (도 7)과 일치하는, 증가 된 HIF-1α의 레벨은 저산소 조건에 의해 유도되는 증가 된 지방 세포가 아폽토시스 (도 8b)를 수반한다. 또한, 그 저산소에 의한 세포 사멸을 증명하는 HIF-의존; HIF-1α 또는 HIF-2α는 야생형 또는 훌라-2 결핍 생쥐에서 파생 된 지방 세포에 RNA 간섭에 의해 침묵된다. 넥신 같이 증가 된 지방 세포 사멸은 HIF-1α 또는 HIF-2α 입을 의해 복원<html> 저산소증 센서 HIF-α는 지방 세포 사멸을 조절하는 것을 증명도 8b에 V 염색. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig6.jpg" /> 그림 6 : 높은 지방 다이어트 (HFD) 쥐의 지방 세포의 크기와 면적 증가 정상적인 다이어트 (ND)가 공급 남성 야생형 마우스의 perigonadal 지방 패드에서 섹션 (A, B) H &amp; E 염색 (a) 또는 높은. 지방질 다이어트 (HFD) (b)에 육주합니다. 바는 500 μm의를 나타냅니다. (c, d) (b) 6- 주 ND (a) 또는 HFD가 공급 야생형 마우스의 perigonadal 지방 패드에서 지방 세포의 크기 (C) 및 영역 (D)의 정량화. N = 10 데이터는 SEM ±로 평균 값을 나타낸다. 통계 분석은 Student&#39;s의 t -test를 사용하여 수행 하였다. *** p &lt;0.0001.: //www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig7.jpg" /> 훌라-2 FL / FL Fabp4-CreERT 마우스 성인의 지방 세포에서 증가 HIF-1α 수준 및 세포 사멸 그림 7. 저산소증 (a)와 HIF-1α 남성 훌라-2 FL / FL Fabp4-creERT 마우스 남성 제어 한배 새끼 육주 후 타목시펜 주입의 AT (b)에서 염색. 배율 20 배는 40X를 삽입합니다. 검은 색 화살표는 저산소 영역과 HIF-1α 양성 세포를 나타냅니다. (c)에서 TUNEL 염색 훌라-2 FL / FL 타목시펜 주입 후 6 주에 Fabp4-CreERT 마우스 및 제어 한배 새끼. 배율 20 배는 40X를 삽입합니다. 검은 색 화살표는 TUNEL 양성 세포를 나타냅니다. 이 수치는 루터 등에서 수정되었습니다알. 9. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53822/53822fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/53822/53822fig8.jpg" /> 도 8. 저산소증에 의한 차 지방 세포에서 증가 HIF-1α 발현 및 지방 세포 자멸사 저산소 챔버에 넣고 차 지방 세포에서 HIF-1α와 HIFs 대상 iNOS의 mRNA 수준의 (a) 실시간 PCR 분석은 지정된 시점에서 분석 하였다. 분리 주 지방 세포에서 넥신 V FACS 염색에 의한 세포 사멸의 (b)에 정량 훌라-2 FL / 플라이 쉬 제어 또는 HIF-1α 또는 HIF-2α에 대한 쉬 플라스미드로 형질과 저산소증 아래에 배치 Fabp4-CreERT 마우스 또는 야생 형 제어 24 시간 동안 (1 % O 2). 이 수치는 루터 등의 알에서 수정되었습니다. <sup&gt; 9. 데이터는 SD 통계 분석은 학생의 T- 테스트를 사용하여 수행 하였다 ±로 평균 값을 나타낸다. * P &lt;0.05 ** P &lt;0.01 상당한으로 인정 하였다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53822/53822fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.

분화 및 세포 사멸 항상성을 통해 성인 유기체에있는 지방 세포의 숫자의 규제의 메커니즘

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

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Nanyang Technological University

Research

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Developmental Biology

14.9K 조회수.  Universitätsklinikum Erlangen. Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.

비디오: Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

천장 문화 성숙한 지방 세포의 탈분화를 통해 인간 된 지방 줄기 세포의 생성

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

연구

발생학

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the development of hypertension during obesity. The extent of hypertrophy and hyperplasia depends on depot location, sex, and the type of Adipocyte Progenitor Cell (APC) phenotypes present. Techniques used for APC and preadipocytes isolation in the last 10 years have drastically improved the accuracy at which individual cells can be identified based on specific cell surface markers. However, isolation of APC and adipocytes can be a challenge due to the fragility of the cell, especially if the intact cell must be retained for cell culture applications.
Magnetic-activated Cell Sorting (MCS) provides a method of isolating greater number of viable APC per weight unit of adipose tissue. APC harvested by MCS can be used for in vitro protocols to expand preadipocytes and differentiate them into adipocytes through use of growth factor cocktails allowing for analysis of the prolific and adipogenic potential retained by the cells. This experiment focused on the aortic and mesenteric PVAT depots, which play key roles in the development of cardiovascular disease during expansion. These protocols describe methods to isolate, expand, and differentiate a defined population of APC. This MCS protocol allows isolation to be used in any experiment where cell sorting is needed with minimal equipment or training. These techniques can aid further experiments to determine the functionality of specific cell populations based on the presence of cell surface markers.

Here we report a method for isolation of Adipocyte Progenitor Cell (APC) populations from Perivascular Adipose Tissue (PVAT) using Magnetic-activated Cell Sorting (MCS). This method allows for an increased isolation of APC per gram of adipose tissue when compared to Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS).

자기 활성화 세포 정렬에 의해 분리 된 혈관 주위 지방 조직으로부터의 지방 전구 세포 전구 세포의 확장 및 지방 생성 유도

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders

Recent advances in induced pluripotent stem cell (iPSC) technology have allowed the generation of different cell types, including adipocytes. However, the current differentiation methods have low efficiency and do not produce a homogenous population of adipocytes. Here, we circumvent this problem by using an all-trans retinoic-based method to produce mesenchymal stem cells (MSCs) in high yield. By regulating pathways governing cell proliferation, survival, and adhesion, our differentiation strategy allows the efficient generation of embryonic bodies (EBs) that differentiate into a pure population of multipotent MSCs. The high number of MSCs generated by this method provides an ideal source for generating adipocytes. However, sample heterogeneity resulting from adipocyte differentiation remains a challenge. Therefore, we used a Nile red-based method for purifying lipid-bearing mature adipocytes using FACS. This sorting strategy allowed us to establish a reliable way to model adipocyte-associated metabolic disorders using a pool of adipocytes with reduced sample heterogeneity and enhanced cell functionality.

The protocol allows the generation of a pure adipocyte population from induced pluripotent stem cells (iPSCs). Retinoic acid is used to differentiate iPSCs into mesenchymal stem cells (MSCs) which are used for producing adipocytes. Then, a sorting approach based on Nile red staining is used to obtain pure adipocytes.

지방 세포 관련 장애를 연구하기 위해 인간 iPSC를 순수한 지방 세포 집단으로 강력하게 분화

Recent advances in induced pluripotent stem cell (iPSC) technology have allowed the generation of different cell types, including adipocytes. However, the ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat. Development of UCP1-positive brown adipocytes in white adipose tissues (so called beige or brite cells) is highly induced by a variety of environmental cues such as chronic cold exposure or by PPAR&gamma; agonists, therefore, this cell type has potential as a therapeutic target for obesity treatment. Although most immortalized adipocyte lines cannot recapitulate the process of "browning" of white fat in culture, primary adipocytes isolated from stromal vascular fraction in subcutaneous white adipose tissue (WAT) provide a reliable cellular system to study the molecular control of beige/brite cell development. Here we describe a protocol for effective isolation of primary preadipocytes and for inducing differentiation to beige/brite cells in culture. The browning effect can be assessed by the expression of brown fat-selective markers such as UCP1.

Primary white preadipocytes isolated from white adipose tissues in mice can be differentiated into beige/brite cells. Presented here is a reliable cellular model system to study the molecular regulation of "browning" of white fat.

베이지 / Brite 셀에 Stromal 혈관 세포의 분리와 차별화

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

생물학

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute functionally to the expansion and remodeling of WAT in adulthood. A tremendous barrier to studying the implications of this cellular heterogeneity is the inability to readily isolate functionally distinct cell subpopulations from WAT SVF for in vitro and in vivo analyses. Single-cell sequencing technology has recently identified functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic PDGFR&#946;+ perivascular cell subpopulations in intra-abdominal WAT depots of adult mice. Fibro-inflammatory progenitors (termed, &#8220;FIPs&#8221;) are non-adipogenic collagen producing cells that can exert a pro-inflammatory phenotype. PDGFR&#946;+ adipocyte precursor cells (APCs) are highly adipogenic both in vitro and in vivo upon cell transplantation. Here, we describe multiple methods for the isolation of these stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal WAT depots. FIPs and APCs can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by taking advantage of biotinylated antibody-based immunomagnetic bead technology. Isolated cells can be used for molecular and functional analysis. Studying the functional properties of stromal cell subpopulation in isolation will expand our current knowledge of adipose tissue remodeling under physiological or pathological conditions on the cellular level.

This protocol describes the technical approach to isolate adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal white adipose tissue (WAT) depots by fluorescence-activated cell sorting or immunomagnetic bead separation.

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

면역학 및 감염병학

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments for T2D, more physiologically relevant in vitro adipocyte models are required. This study describes a new technique to isolate and culture mature human adipocytes. This method is entitled MAAC (membrane mature adipocyte aggregate culture), and compared to other adipocyte in vitro models, MAAC possesses an adipogenic gene signature that is the closest to freshly isolated mature adipocytes. Using MAAC, adipocytes can be cultured from lean and obese patients, different adipose depots, co-cultured with different cell types, and importantly, can be kept in culture for 2 weeks. Functional experiments can also be performed on MAAC including glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis. Moreover, MAAC responds robustly to diverse pharmacological agonism and can be used to study adipocyte phenotypic changes, including the transdifferentiation of white adipocytes into brown-like fat cells.

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Membrane mature adipocyte aggregate culture (MAAC) is a new method to culture mature human adipocytes. Here we detail how to isolate adipocytes from human adipose and how to set up MAAC.

인간 성숙한 지방세포의 고립과 문화는 막 성숙한 지방 세포 골재 배양 (MAAC)를 사용하여

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white preadipocyte cell lines. These cultured cell lines, however, have limitations. They do not fully capture the diverse functional spectrum of the heterogenous adipocyte populations that are now known to exist within white adipose depots. To provide a more physiologically relevant model to study the complexity of white adipose tissue, a protocol has been developed and optimized to enable simultaneous isolation of primary white and brown adipocyte progenitors from newborn mice, their rapid expansion in culture, and their differentiation in vitro into mature, fully functional adipocytes. The primary advantage of isolating primary cells from newborn, rather than adult mice, is that the adipose depots are actively developing and are, therefore, a rich source of proliferating preadipocytes. Primary preadipocytes isolated using this protocol differentiate rapidly upon reaching confluence and become fully mature in 4-5 days, a temporal window that accurately reflects the appearance of developed fat pads in newborn mice. Primary cultures prepared using this strategy can be expanded and studied with high reproducibility, making them suitable for genetic and phenotypic screens and enabling the study of the cell-autonomous adipocyte phenotypes of genetic mouse models. This protocol offers a simple, rapid, and inexpensive approach to study the complexity of adipose tissue in vitro.

This report describes a protocol for the simultaneous isolation of primary brown and white preadipocytes from newborn mice. Isolated cells can be grown in culture and induced to differentiate into fully mature white and brown adipocytes. The method enables genetic, molecular, and functional characterization of primary fat cells in culture.

신생아 마우스에서 기본 백색및 갈색 프레드포스세포의 격리 및 분화

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with multiple lipid droplets, a central nucleus, a high mitochondrial content, and the expression of uncoupling protein 1 (UCP1). BAT has been proposed as a potential therapeutic target for obesity and its associated metabolic disorders due to its ability to dissipate metabolic energy as heat. To investigate BAT function and regulation, brown adipocyte culturing is indispensable. The present protocol optimizes tissue processing and cell differentiation for culturing brown adipocytes from newborn mice. Additionally, procedures for the imaging of differentiated adipocytes with both confocal immunofluorescence and transmission electron microscopy are shown. In the brown adipocytes differentiated with the techniques described herein, the major defining features of classical BAT are preserved, including high UCP1 levels, increased mitochondrial mass, and very close physical contact between the lipid droplets and mitochondria, making this method a valuable tool for BAT studies.

Preadipocytes are isolated from the stromal vascular fraction of interscapular brown adipose tissue from newborn mice and differentiated into cells that accumulate lipid droplets, express molecular markers, and show the mitochondrial morphology of mature brown adipocytes. These cells are further analyzed by immunofluorescence and transmission electron microscopy.

Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with ...

Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance contributes to the development of type 2 diabetes (T2D) and other obesity-derived diseases of high prevalence worldwide. Therefore, understanding the mechanisms underlying insulin resistance is of great relevance. Several models have been used to study insulin resistance both in vivo and in vitro; primary adipocytes represent an attractive option to study the mechanisms of insulin resistance and identify molecules that counteract this condition and the molecular targets of insulin-sensitizing drugs. Here, we have established an insulin resistance model using primary adipocytes in culture treated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;).
Adipocyte precursor cells (APCs), isolated from collagenase-digested mouse subcutaneous adipose tissue by magnetic cell separation technology, are differentiated into primary adipocytes. Insulin resistance is then induced by treatment with TNF-&#945;, a proinflammatory cytokine that reduces the tyrosine phosphorylation/activation of members of the insulin signaling cascade. Decreased phosphorylation of insulin receptor (IR), insulin receptor substrate (IRS-1), and protein kinase B (AKT) are quantified by western blot. This method provides an excellent tool to study the mechanisms mediating insulin resistance in adipose tissue.

This protocol describes the isolation of mouse preadipocytes from subcutaneous fat, their differentiation into mature adipocytes, and the induction of insulin resistance. Insulin action is evaluated by the phosphorylation/activation of members of the insulin signaling pathway through western blot. This method allows direct determination of insulin resistance/sensitivity in primary adipocytes.

1차 배양에서 분화된 마우스 지방세포: 인슐린 저항성 모델

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

murine white 지방 조직의 반자동 분리

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

저자 스포트라이트: 조직 해리제를 사용하여 Murine White 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...