부인 스터 씨 Honrath 박사 지앙은 뛰어난 기술 지원을 부탁드립니다. 또한 닥터 VOLZ 및 디지털 PCR 장치에 대한 액세스를 제공하기위한 Dandri 박사의 연구 그룹은 알 것이다.

1. 혼합 문화 종양 세포와 비 암세포 모두 포함 준비 <ol><li> 확립 된 세포주 MPNST S462 (5)에서 종양 세포를 사용합니다. 비 - 종양 세포로 -6,7- 섬유 아세포를 사용하여 </li><li> 배양 모두 종양 세포를 10 % 소 태아 혈청 표준 DMEM 배지에서 섬유 아세포 (BSA), 3 mM의 글루타민, 0.1 mM의 2- 머 캅토 에탄올, 500 U가 / ㎖ 페니실린, 500 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신 및 1 mM의 피루브산 나트륨, 37 ℃에서 5 % CO 2 5-7. 부 합류, 0.05 % 트립신으로 세포를 수확하고 혈구를 사용하여 계산. </li><li> 0.2 ㎖의 배지에서 96- 웰 배양 플레이트의 각 웰에 함께 400 종양 세포 및 1600가 아닌 종양 세포를 섞는다. 오일의 치료 기간 동안 종양 세포의 빠른 성장을 고려하여, 종양 세포의 초기 비율은 25 %로 설정 하였다. 설정 4는 각각의 약물 농도에 대한 복제합니다. 37 ℃에서 세포를 인큐베이션하고, 5 % CO 2 O / N. </li></ol> 2. 드루g 치료 <ol><li> 시험 약물로서 닐 로티 닙을 사용합니다. DMSO 0, 2, 4 및 20 밀리미터 닐 로티 닙의 스톡 용액을 준비한다. 0, 10, 20 및 100 μM 6.7의 2 배 농축 된 약물 용액주고, 5 ㎖의 DMEM 배지에서 200 배 그들 각각의 희석. </li><li> 각 0.1 ml의 매체를 잘 제거하고 매체를 포함하는 약 0.1 ml에 추가 할 수 있습니다. 최종 농도가 0, 5, 10 및 50 μM이다. 5 일간 매체를 포함하는 약물의 세포를 배양 계속합니다. </li><li> 처리의 끝에서, 위상차 현미경을 사용하여 부착 된 세포를 검사하고 사진을 촬영. 멀리 매체를 기음 0.2 ml의 PBS로 한번 살아 접착제 세포를 씻는다. </li></ol> 3. 디지털 PCR을위한 DNA 준비 <ol><li> 유능한 8을 이용하여를 Lyse 셀. <ol><li> 각 웰에 50 ㎕의 알칼리 분해 용액 (25 mM의 NaOH를 0.2 mM의 EDTA)를 추가합니다. 호일로 우물을 밀봉합니다. 오븐에서 30 분간 가열 플레이트상에서 95 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. MICR에서 확인oscope 더 이상 손상 세포가 우물의 표면에 남아 있지 않은지 확인합니다. 경우에 세포를 완전히 용해시키기 가열 시간을 늘리거나 세제를 추가하지 않았다. -20 °에서 한 번에 동결은 세포를 파괴 강화합니다 C. </li><li> 물론 각 용액 (40 mM 트리스-HC, 산도 4.0) 중화 50 μl를 추가합니다. 10 ~ 30 분 동안 95 ° C에서 PCR의 자전거 타는 사람에 PCR 플레이트와 건조의 U 형 우물에 모든 해물을 전송합니다. 증류수 20 μL와 해물을 복원합니다. </li></ol></li><li> 드롭 투석 구를 사용하여 탈염 <ol><li> 평균 기공 크기는 0.025 μm의 가진 멤브레인 필터를 사용한다. </li><li> 12 웰 플레이트의 우물에 빛나는 쪽이 위로 증류수에 필터를 플로트. 5 분 동안 가습 필터. 필터 및 물과 공기 방울을 방지하기 위해주의. </li><li> 피펫 신중 필터의 4 각 영역에 진입 단계 3.1.4에서 각 샘플의 재구성 해물. 접시를 덮고 30 ~ 60 분 동안 투석. </li><li> 필터를 통해 틀지이나 방울을 방해하지 않고 필터에서 물을 멀리 빨아. </li><li> 새로운 PCR 플레이트의 우물에 해물-방울을 전송합니다. PCR의 사이 클러 10 분 30 95 ° C에서 가열에 의한 DNA-방울을 건조시킵니다. 10 μl의 물에 해물을 복원합니다. </li></ol></li></ol> 4. 디지털 PCR <ol><li> 이러한 DNA, 버퍼 및 RT의 분석 믹스로 해동 냉동 구성 요소 (예를 들어, VWR 미니 원심 분리기) 가능한 원심 분리기의 최대 힘에서 10 초 동안 스핀 다운 후 얼음에 보관하십시오. </li><li> DNA (표 1)을 제외한 모든 구성 요소를 포함하는 마스터 혼합물을 준비합니다. 죽은 볼륨을 고려하고 필요한 양보다 약 10 % 더 마스터 혼합물을 계산합니다. 참고 : 상업 키트에 사용 된 프라이머 및 프로브를 사용합니다. </li><li> 소용돌이 마스터 혼합물 (예를 들어, VWR 미니 원심 분리기) 가능한 원심 분리기의 최대 힘에서 10 초 동안 스핀 다운 각 15 μl를 분배96 PCR 플레이트의 웰. 마스터 혼합물을 함유하는 웰에 각 시료 (DNA를 포함) 모두 해물을 추가한다. 전송 RT에서 카트리지의 시료 측의 각 웰에 반응 혼합물 20 μL. </li><li> 카트리지의 유로 측의 각 웰에 방울 생성기 오일 70 μL 분주. 가스켓과 카트리지를 닫고 방울 생성기로 전체 설정을 배치합니다. 액적 생성을 시작합니다. </li><li> 96 웰 PCR 플레이트의 우물로 전송 40 μL 방울-솔루션입니다. 포일와 함께 접시를 밀봉하고 PCR의 자전거 타는 사람에 접시를 놓습니다. 105 ° C에서 뚜껑 온도를 설정하고 2 ° C / sec의 속도를 램프. 표 2의 설정을 사용하여 PCR을 수행하십시오. PCR을가, 방울 리더에 플레이트를 전송하고 읽기 시작 후. 또한, 최대 24 시간 동안 4 ° C에서 접시를 저장합니다. </li></ol> 5. 종양 세포의 비율을 계산 <ol><li> 디지털 PCR 데이터를로드 및 자동 분석가​​를 수행이다. </li><li> 직접 양극과 음극 방울의 일차원 및 2- 차원 분포를 조사하여 각각의 분석의 결과를 제어하고 잘 분리하고, 임계 라인 오른쪽 위치에 있다고 확인. 결과는 예를 들어, 기준을 만족하지 제외, 상기 분석에서 포지티브 및 네거티브 방울의 명확한 분리. 엑셀 시트에 결과 비 NF1 / RPP30를 복사합니다. </li><li> 2 × (1- NF1 / RPP30)으로 종양 세포의 비율을 계산합니다. </li></ol> 종양 세포의 비율 6. 용량 의존적 변화 <ol><li> 각각의 약물 농도를 들어, 4 회 반복의 평균과 표준 편차를 계산한다. 수단 및 약물 농도에 대한 표준 편차를 플롯. </li></ol>

<ol>
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The procedure is patent-protected (10 2013 221 452, Germany)

시험 관내 약물 특이성 평가 본 genetic- 셀 기반 도구의 핵심 단계는 하나 이상의 암 특이 유전자의 기능을 이용하여 종양 세포의 비율을 결정한다. 종래의 표현형 특징 7 대조적으로, 유전자 기능은 특정 안정하고 정량화하기 쉽다. 예를 들면, 종양 특이적인 변이 또는 카피 수 변이가 아닌 종양 세포에 독점적으로 종양 세포가 아니라 존재한다. 이러한 유전 적 특질을 확실하고 정확하게 본 연구에서 입증 된 바와 같이 디지털 PCR하여, 예를 들어, 정량 할 수있다. 디지털 PCR의 경우, DNA의 순도가 필수적인 것은 아니다. 그러나, 탈염 및 억제 분자를 제거하는 적절한 필터를 이용하여 드롭 투석에 의해 달성 될 수있는 필요하다. 모은 용해 및 드롭 투석, 간단하고 신속 특별한기구를 필요로하지 않으며, 따라서 임의의 표준 실험실에서 수행 될 수있다. 세포의 브리를하지 않으면또한 K, 추가 처리는, -20 ° C에서 세포를 동결 세제를 추가 및 / 또는 단백질 분해 효소를 사용하는 것으로 간주 될 수있다. 본 연구에서, NF1 유전자의 이형 삭제 정량화 대한 종양 특이 기능을 사용한다. 마찬가지로, 다른 유전자 나 좌위의 결실이 또한 사용될 수있다. 또한 돌연변이는 종양 세포를 정량화하기 위해 사용될 수있다. 이러한 경우에, 디지털 돌연변이 PCR 분석법 정상 대립 유전자는 광범위 그들 각각 특이성을 확인하기 위해 검증되어야한다. 종양 세포의 투여 량 - 의존 비율은 약물 - 특이성 또는 선택성에 대한 표시를 제공한다. 게다가, 그것은 또한 약물 (도 4)에 혼합 배양 총 세포의 반응에서 종양 세포의 추출 반응을 가능하게한다. 이 추출 전략없이 종양 모두 포함 차 배양을 사용의 기술적 문제에 대한 솔루션 (제공약물 테스트를위한 N-종양 세포). genetic- 때문에 응용 가능성을 가질 수있다 본 연구에서 입증 시험 관내 도구에서 셀 기반 (1)가 시험 관내에서 약물 특이성 또는 선택성을 평가하고 플랫폼을 제공 약물 발견 (2) 맞춤 암 치료에 어디를 차 문화에서 시험 약물을 가능하게하고 결과적으로 보조 화학 요법 사에서 약물 선택에 기여할 수있다. 특정 유전자 변경 또는 여러 유전 적 변화는 약물 치료 중이어서 할 수 있기 때문에 또한, 약물의 약리 메커니즘은이 도구를 사용하여 공부하실 수 있습니다. 개별화 차 배양을 사용에 어려움이 결핍 종양 세포의 정량 범용 유전 기능이다. 그러나, 전체 게놈 시퀀싱 오늘의 진행과 함께 자주 변경 유전자 영역이 공통 종양으로 알려져있다. 예를 들어, 머리와 목 사이종양, 71 %, 23 % 및 22 %는 TP53, FAT1 돌연변이 및 CDKN2A 유전자, 60 %, 34 % 및 26 %가 CDKN2A, STK11 및 PTEN 각각 10 유전자 영역의 결실을 가지고있다. 타겟 시퀀싱 및 / 또는 디지털 PCR을 이용하여 5 내지 10 등의 유전자 및 / 또는 영역을 스크리닝 따라서 가능성 유래 일차 배양에서 종양 세포의 정량에 이용 될 수있는 하나 이상의 유전 적 변형을 확인한다. 또 다른 제한은 차 문화를 설정하는 절제된 종양의 자주 부족한 양이다. 유리한 기능과 genetic-의 유망한 응용 잠재력과 셀 기반 체외 도구가, 그 한계를 염두에 보관해야하고 시험 관내 특성이 강조되어야한다에도 불구하고. 예를 들어, 종양 세포에 대한 약물의 차동 영향이나 독성 수도 인해 오히려 세포 유형의 차이 (슈반 세포 대 섬유 아세포)를하거나(다른 개인의) 다른 기원. 비 - 종양 세포에 비해 종양 세포에 대한 약물의 강력한 효과는 전자가 후자보다 더 빠르게 증가한다는 사실에 의해 설명 될 수있다. 가장 중요한 것은, 체외 동작 셀은 인체 세포보다 다르며 따라서, 시험 관내 평가의 결과들은 실제 임상 상황을 반영하지 않거나 부분적으로 수행. 따라서, 효능, 독성 및 배양 된 세포에 대해 얻어진 약물의 특이성은 오히려 바이오 마커 성격이지만 항생제 전임상 측정 효과의 신뢰성이 없습니다. 그럼에도 불구하고, 혼합 문화 및 / 또는 주 문화에 세포 라인에서 이동하는 생체 외 약물 효과와 특이도 / 선택도를 평가하는데 앞으로 단계입니다. 광범위한 노력으로, 시험관 조건에서 적어도 일부 의약품에 대한 환자의 실제 반응과 체외 데이터의 합리적인 상관 관계를 가능하게하는 찾을 수 있습니다.

Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios. 
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated. 
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">membrane filter of 25 mm diameter</td>
			<td style="width:71px;">Merk-Millipore</td>
			<td style="width:119px;">VSWP 02500</td>
			<td style="width:167px;">for drop-dialysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for NF1</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP1000177</td>
			<td>FAM-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for RPP30</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP2500350</td>
			<td>HEX-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QX200</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">186-4001</td>
			<td>the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Droplet oil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartriges&#160;</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gaskets</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartrige holder</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pierceble foil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>181-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing specificity of anticancer drugs in vitro

종양 및 비 종양 세포를 모두 함유하는 배양 물을 사용하여 시험 관내에서 항암제의 특이성을 평가하기위한 절차가 설명된다. 핵심 요소는 이중 디지털 프로브 PCR 분석 및 종양 세포의 비율의 후속 계산을 사용하여, 범용 서열과 관련하여 암 특이 적 유전자 변화를 정량한다. 상기 분석은 종양 설정된 광고의 세포를 함유하는 배양에서 수행되는 스파이크 된 비 - 종양 세포. 혼합 문화는 다양한 농도에서 시험 약물로 치료한다. 처리 후, DNA를 간단하고 저렴한 방법을 사용하여 96- 웰 플레이트의 웰에서 살아 접착 세포로부터 직접적으로 제조되며, 암 특이 적 유전자 변화와 기준 범용 시퀀스를 측정하기위한 이중 프로브 디지털 PCR 분석을 실시 . 본 데모에서, NF1 유전자의 이형 삭제가 암 특이 유전자 변형으로 사용되며기준 유전자와 같은 유전자 RPP30. 비 NF1 / RPP30를 사용하여, 종양 세포의 비율을 계산 하였다. 종양 세포의 비율의 용량 의존적 인 변화는 약물의 특이성에 대한 시험 관내 표시를 제공하기 때문에, 이러한 유전자 및 세포 - 기재 시험 관내 분석 가능성 신약 개발에 응용 가능성을 가질 것이다. 또한, 맞춤형 암 치료를 위해,이 genetic- 및 셀 기반 도구는 개별 종양의 차 문화를 사용하여 테스트 효능 및 후보 약물의 특이성에 의해 보조 화학 요법을 최적화에 기여할 수있다.

DNA의 품질이 결합 된 유능한가 / 드롭 투석을 만족 디지털 PCR (그림 1B)에 대한 충분한 사용하여 제조. 2000 아세포를 들어, 약 3000 ± 500 긍정적 방울 예상 4,000 복사본 (하나의 셀에 2 부)의 75 %에 해당 얻었다. 본 연구에서 종양 세포가 5 NF1 유전자의 이형 접합체 삭제 것으로 알려진 확립 라인 MPNST S462에서 있었다. 이것은 50 %의 유전자 투여 량의 감소는 분명히 듀얼 디지털 PCR 분석 (도 1b)에 의해 검출 하였다. 대조적으로,이 유전자의 두 카피가 섬유 아세포에서 측정 하였다. 종양 및 비 종양 세포 간의 이러한 차이는 유전 혼합 배양에서 종양 세포 (도 2)의 비율의 계산을 가능하게한다. RPP30에 NF1의 상대 유전자 투여 량을 측정하여, 혼합 배양에서 종양 세포의 비율이 결정될 수있다각각의 약물 농도 (그림 3). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" /> 원리 그림 1. 디지털 PCR. (A)입니다. (B) 듀얼 프로브 분석은 기준 (RPP30) 유전자와 관련하여 종양 세포 MPNST S462에서 대상 (NF1) 유전자의 감소 된 양을 알 수있다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" /> 도 2 종양 세포의 비율 계산. 종양 세포 및 비 - 종양 세포를 다양한 비율로 혼합하고 96 플레이트의 각 웰에 시딩 하였다. 첨부 O / N, 세포가 용해 된 후, 재치시간인가요 / 드롭 투석 탈염 해물 NF1 / RPP30 비율 준 디지털 PCR을 실시 하였다. 이 비율에 대한 자료는 각 웰에서 종양 세포의 비율을 계산 하였다. 평균과 각 4 설정 비율로 복제에서 종양 세포의 비율의 표준 편차를 계산 하였다. 종양 세포 (Y 축)의 계산 된 비율은 셋업 비율 (X 축)에 대해 도시 하였다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" /> 도 종양 세포의 비율 3 투여 량에 따른 변화. (A) 용량 의존적 표시 필수적인 세포의 감소. (B) 종양 세포의 비율 (평균 4 회 반복의 표준 편차)을 계산<html> NF1 비율 - 10 μM RPP30 0의 범위에서 감소 하였다. 가장 높은 용량 50 μM에서 몇 가지 중요한 세포로 인해 모든 세포에 독성 효과, 가능성이 남았다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" /> . 비 종양 세포에서의 종양 세포의 응답을 분리 한도 4 (A) 가능성 및 / 또는 전체 세포의 증식은 통상의 분석법을 사용하여 측정 될 수있다; 종양 세포의 비율은 본 연구에서 설명 된 절차를 사용하여 결정될 수있다. 두 개의 매개 변수를 사용하여 (B)은, 약물을 혼합 배양에서 총 세포의 반응은 종양 세포가 아닌 종양 세포 반응의 반응으로 나눌 수있다..COM / 파일 / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td><td style="width:171px;"> 1 반응 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> 2 × ddPCR 수퍼 믹스 </td><td style="width:171px;"> (12) </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> NF1에 대한 분석 믹스 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> RPP30에 대한 분석 믹스 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> HaeIII </td><td style="width:171px;"> 0.6 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> 소계 </td><td style="width:171px;"> (15) </td><td style="width:99px;"> 마스터 혼합물 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> DNA </td><td style="width:171px;"> 9 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> 합계 </td><td style="width:171px;"> (24) </td><td style="width:99px;"> 최종 PCR 혼합물 </td></tr></tbody></table> 표 1은 듀얼 ddPCR 반응 설정 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 단계 </td><td> 동작 </td><td> 온도 </td><td> 시각 </td><td> 사이클 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Polym활성화를 삭제 </td><td> 95 ° C </td><td> 10 분 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 이 </td><td> DNA 변성 </td><td> 94 ° C </td><td> 30 초 </td><td rowspan="2"> (40) </td></tr><tr><td> 삼 </td><td> 소둔 / exetension </td><td> 60 ° C </td><td> 1 분 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 중합 효소 비활성화 </td><td> 98 ° C </td><td> 10 분 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> (5) </td><td> 홀드 (선택 사항) </td><td> 4 ° C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 2 PCR 자전거 타는 설정

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Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

이 프로토콜의 목적은 종양 및 비 종양 세포를 모두 포함하는 혼합 된 배양 물을 사용하여 시험 관내에서 항암제의 특이성을 평가하는 것이다.

항암 약의 특이성 평가<em&gt; 체외</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

9.4K 조회수.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf.  이 프로토콜의 목적은 종양 및 비 종양 세포를 모두 포함하는 혼합 된 배양 물을 사용하여 시험 관내에서 항암제의 특이성을 평가하는 것이다. 

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In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of isolated tracheal preparations has proven to be a useful assay of airway smooth muscle (ASM) contractile response in genetically modified mice. These in vitro tracheal preparations are relatively simple, provide a robust response, and retain both functional cholinergic nerve endings and muscle responses, even after long incubations.
Tracheal tensometry also provides a functional assay to study a variety of second messenger signaling pathways that affect contraction of smooth muscle. Contraction in trachea is primarily mediated by parasympathetic, cholinergic nerves that release acetylcholine onto ASM (Figure 1). The major ASM acetylcholine receptors are muscarinic M2 and M3 which are Gi/o and Gq coupled receptors, respectively3,4,5. M3 receptors evoke contraction by coupling to Gq to activate phospholipase C, increase IP3 production and IP3-mediated calcium release from the sarcoplasmic reticulum3,6,7. M2/Gi/o signaling is believed to enhance contractions by inhibition of adenylate cyclase leading to a decrease in cAMP levels5,8,9,10. These pathways constitute the so called "pharmaco-contraction coupling" of airway smooth muscle11. In addition, cholinergic signaling through M2 receptors (and modulated by M3 signaling) involves pathways that depolarize the ASM which in turn activate L-type, voltage-dependent calcium channels (Figure 1) and calcium influx (so called "excitation-contraction coupling")4,7. More detailed reviews on signaling pathways controlling airway constriction can be found4,12. The above pathways appear to be conserved between mice and other species. However, mouse tracheas differ from other species in some signaling pathways. Most prominent is their lack of contractile response to histamine and adenosine13,14, both well-known ASM modulators in humans and other species5,15.
Here we present protocols for the isolation of murine tracheal rings and the in vitro measurement of their contractile output. Included are descriptions of the equipment configuration, trachea ring isolation and contractile measurements. Examples are given for evoking contractions indirectly using high potassium stimulation of nerves and directly by depolarization of ASM muscle to activate voltage-dependent calcium influx (1. high K+, Figure 1). In addition, methods are presented for stimulations of nerves alone using electric field stimulation (2. EFS, Figure 1), or for direct stimulation of ASM muscle using exogenous neurotransmitter applied to the bath (3. exogenous ACH, Figure 1). This flexibility and ease of preparation renders the isolated trachea ring model a robust and functional assay for a number of signaling cascades involved in airway smooth muscle contraction.

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgenic mice have been extremely useful in ascribing physiological function to genes. As such, research in general, and functional studies of airway, in particular, have undergone a remarkable shift toward murine models. Here we provide protocols for in vitro trachea constriction studies to evaluate smooth muscle function in murine airway.

마우스를 사용 Tracheal 수축의 체외 측정에서

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of ...

연구

의학

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

태아 알코올 노출의 Zebrafish 모델에서 Teratogenic 변경 사항 평가

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic Therapy is a novel approach for a more tumor selective treatment.
Photodynamic Therapy (PDT) that makes use of a nontoxic photosensitizer (PS), which, upon activation with light of a specific wavelength in the presence of oxygen, generates oxygen radicals that elicit a cytotoxic response1. Despite its approval almost twenty years ago by the FDA, PDT is nowadays only used to treat a limited number of cancer types (skin, bladder) and nononcological diseases (psoriasis, actinic keratosis)2.
The major advantage of the use of PDT is the ability to perform a local treatment, which prevents systemic side effects. Moreover, it allows the treatment of tumors at delicate sites (e.g. around nerves or blood vessels). Here, an intraoperative application of PDT is considered in osteosarcoma (OS), a tumor of the bone, to target primary tumor satellites left behind in tumor surrounding tissue after surgical tumor resection. The treatment aims at decreasing the number of recurrences and at reducing the risk for (postoperative) metastasis.
In the present study, we present in vitro PDT procedures to establish the optimal PDT settings for effective treatment of widely used OS cell lines that are used to reproduce the human disease in well established intratibial OS mouse models. The uptake of the PS mTHPC was examined with a spectrophotometer and phototoxicity was provoked with laser light excitation of mTHPC at 652 nm to induce cell death assessed with a WST-1 assay and by the counting of surviving cells. The established techniques enable us to define the optimal PDT settings for future studies in animal models. They are an easy and quick tool for the evaluation of the efficacy of PDT in vitro before an application in vivo.

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

The protocol reported here allows the evaluation of the efficacy of photodynamic therapy (PDT) in cell lines and the optimization of the PDT settings before applying the therapy in animal models.

골육종 세포의 광 역학 치료의 세포 독성 효능<em&gt; 체외</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

와 전염성 해면상 뇌증 종 장벽 평가<em&gt; 체외</em&gt; 프리온 단백질 변환 분석

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. Several drugs are administered into the anterior chamber or vitreous, and the intraocular injection has been effective in curing various intraocular diseases. Rabbit eyes have been widely used for ophthalmic research, as the animal is easy to handle and economical compared to other mammals, and the size of a rabbit eye is similar to that of a human eye. Using a 30 G needle, drugs can be injected into the intracameral and intravitreal spaces of rabbit eyes. The eyeballs are then frozen until analysis, and can be divided into the aqueous humor, vitreous, and retina/choroid. The vitreous and retina/choroid samples can be homogenized and solubilized before analysis. Then, immunoassays can be performed to measure the concentrations of intraocular drugs in each compartment. Appropriate pharmacokinetic models can be used to calculate several parameters, such as the half-life and maximum concentration of the drug. Rabbit eyes can be a good model for pharmacokinetic studies of intraocular drugs.

Rabbits are widely used to study the pharmacokinetics of intraocular drugs. We describe a method for conducting pharmacokinetic studies of intraocular drugs using rabbit eyes.

안구 약의 약동학 연구에서 토끼 눈의 사용

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

의 최적화 분석<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 간 지방증

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로<em&gt; 체외에서</em&gt; 청력 연구의 스크리닝 도구

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to moderate level of increase in high-density lipoprotein (HDL) cholesterol in plasma. However, a possible role of these drugs in altering morphology and distribution of cholesterol particles is poorly understood. Here, we describe the in vitro evaluation of lipid-lowering drug effects in modulating morphological features of cholesterol particles using the plaque array method in combination with imaging flow cytometry. Image analyses of the cholesterol particles indicated that lovastatin, simvastatin, ezetimibe, and atorvastatin induce the formation of both globular and linear strand-shaped particles, whereas niacin, fibrates, fluvastatin, and rosuvastatin induce the formation of only globular-shaped particles. Next, purified very low-density lipoprotein (VLDL) and LDL particles incubated with these drugs showed changes in the morphology and image texture of cholesterol particles subpopulations. Furthermore, screening of 50 serum samples revealed the presence of a higher level of linear shaped HDL cholesterol particles in subjects with dyslipidemia (mean of 18.3%) compared to the age-matched normal (mean of 11.1%) samples. We also observed considerable variations in lipid-lowering drug effects on reducing linear shaped LDL and HDL cholesterol particles formation in serum samples. These findings indicate that lipid-lowering drugs, in addition to their cell-mediated hypolipidemic effects, may directly modulate morphology of cholesterol particles by a non-enzymatic mechanism of action. The outcomes of these results have potential to inform diagnosis of atherosclerosis and predict optimal lipid-lowering therapy.

The objective of this study was to evaluate in vitro lipid-lowering drug effects in modulating the morphology of cholesterol particles. Comparison of lipid-lowering drugs revealed variations in their effect in modulating the morphological features of cholesterol particles.

콜레스테롤 입자의 형태를 변조에 지질 저하 약물의 차동 효과

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard therapy, a considerable number of CLI patients are not suited for either surgical or endovascular revascularization. Angiogenic therapies are emerging as an option for these patients but are currently still under investigation. Before application in humans, those therapies must be tested in animal models and its mechanisms must be clearly understood. An animal model of hindlimb ischemia (HLI) has been developed by the ligation and excision of the distal external iliac and femoral arteries and veins in mice. A comprehensive panel of tests was assembled to assess the effects of ischemia and putative angiogenic therapies at functional, histologic and molecular levels. Laser Doppler was used for the flow measurement and functional assessment of perfusion. Tissue response was evaluated by the analysis of capillary density after staining with the anti-CD31 antibody on histological sections of gastrocnemius muscle and by measurement of collateral vessel density after diaphonization. Expression of angiogenic genes was quantified by RT-PCR targeting selected angiogenic factors exclusively in endothelial cells (ECs) after laser capture microdissection from mice gastrocnemius muscles. These methods were sensitive in identifying differences between ischemic and non-ischemic limbs and between treated and non-treated limbs. This protocol provides a reproducible model of CLI and a framework for testing angiogenic therapies.

Here, a critical hindlimb ischemia experimental model is presented followed by a battery of functional, histologic and molecular tests&#160;to assess the effectiveness of angiogenic therapies.&#8203;

힌들보 리 허 혈의 뮤린 모델에서 치료 혈관 신생 평가

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...