Name: using tomoauto: a protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography
Uploaded: 2016-01-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography at JoVE.com

우리는 의견 박사 윌리엄 Margolin 감사합니다. 우리는 박사에서 SerialEM의 지원에 감사합니다. 데이비드 Mastronarde과 첸 쑤. DM, BH와 JL은 웰치 재단 알레르기 및 전염병 국립 연구소, 일반 의료 과학 국립 연구소 (NIGMS)에서 보조금 R01GM110243과 R01GM107629, 그랜트 AU-1714에서 그랜트 R01AI087946에 의해 지원되었다. 직접 전자 검출기는 건강 상 S10OD016279의 국립 연구소에 의해 투자되었다.

1. Minicell 준비 <ol><li> S.을 만들려면 flexneri minicells는 구조적으로 스펙 티노 마이신 내성 플라스미드 5 μL electrocompetent 스트렙토 마이신 내성 혈청 형 5A (M90T-SM) 전기에 의해 세포로 낮은 복사본에서 대장균 세포 분열 유전자 ftsQ, ftsA 및 ftsZ을 표현 플라스미드 pBS58, 1 μl를 변환 1mm 큐벳에 5 밀리 2.5 kV의에. </li><li> 1.5 ml의 극저온 마이크로 튜브 15 % 글리세롤에서 -80 ° C에서 보관 minicell 샘플. 사용하기 위해, 4 ml의 세포를 피펫 팁을 사용하여 unthawed 마이크로 튜브에서 세포의 약 5 μl를 긁어 일시 중지 준비가되면 스펙 티노 마이신과 트립신 간장 국물 / ㎖ 농도 100 μg의 추가. 37 ° C에서 O / N 성장. </li><li> 피펫 다시 100 μg의 / ml의 농도에 추가 스펙 티노 마이신 1.2 (200)에 ㎖의 트립신 간장 국물의 문화 2 ㎖. 늦은 로그 상에 37 ℃에서 성장한다. </li><li> minicells, 원심 분리 농축5 분 1,000 XG에 1.3에서 문화 200 ㎖. 조심스럽게 10 분 동안 20,000 XG에 새로운 원심 분리 튜브에서 원심 분리로 상청액 분획을 붓는다. 조심스럽게 부어과 상청액 분획을 폐기하고, 부드럽게 피펫 팁을 이용하여 잔여 액체로 펠릿을 혼합하여 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 펠릿의 혼합물을 약 100 μl를 옮긴다. </li></ol> 2. EM 그리드 준비 <ol><li> 유리 슬라이드에 R2 / 2 구멍 투성이의 탄소 필름 200 메쉬 구리 그리드 탄소 측면을 놓습니다. 주 : R2 / 2의 200 메시 그리드는 여전히 표본을지지하고 카메라의 분야에서 탄소막의 에지를 배치하는 동안 하나의 그리드 사각형은 취득하기 위해서 설정 될 수 틸트 계의 수를 최대화하도록 선택된다 원하는 배율로. 미세한 메쉬 그리드 및 R1.2 같은 작은 구멍 투성이 탄소막 / 1.3 400 메쉬 높은 배율에서 영상화 시료에 사용될 수있다; 같은 R3.5으로 더 큰 구멍 투성이의 탄소 필름 / 1 200 메쉬 사용 할 수 있습니다샘플 D는 낮은 배율에서 영상화 또는 현미경은 R1과 같은 큰 간격 탄소 에지 구멍 투성이 탄소막 없어야한다면 / 4 200 메쉬 관심 영역으로 스테이지를 정렬로부터 지역을 보호 돕기 위해 사용될 수있다 과다 노출 루틴을 집중하고 추적한다. </li><li> 글로우 방전 장치의 플랫폼에서 슬라이드를 놓습니다. 주 : 우리는 양극과 플랫폼이 진공 데시 케이 터로 가공되었고, 고주파 발생기에 의해 구동되는 내부 소자를 사용한다. 진공을 생성 한 후, 글로우 방전 그리드 1 분간 프로브에 양극과 전원에 고주파 발생기 프로브를 부착. 필요한 시간은 그리드 분 몇 초에 이르기까지 다양 글로우 방전합니다. 글로우 방전 시간을 가변하는 시료 농도없이 유리체 얼음 건조 나타나는 격자의 문제를 진단하는데 사용될 수있다. </li><li> 집게 세트와 그리드를 제거하고 집게가 탄성 B와 닫힌 된 자물쇠과. </li><li> 1.4에서 제조 된 minicells와 microcentrifuge 관에 10 나노 콜로이드 금 용액 100 μl를 추가하고 부드럽게 손가락으로 튜브를 쓸어 넘겨 섞는다. 2.2 제조 그리드 혼합물의 새로운 피펫 장소 4 μL와. 주 : 콜로이드 금 크기와 치료의 다양한 가능 금의 크기는, 획득 된 확대 크기로 처리 될 현미경의 화소 사이즈 주어진보다 5 화소 인 것을주의해야한다 모호한 기능에 너무 크게되지 않는 반면 관심. </li><li> 플 런지 동결 장치를 준비; 액체 질소와 외부 냉동 컨테이너를 작성 후 액체 에탄과 내부 챔버를 입력합니다. 플런저로드에 그리드와 집게를 부착하고 상승 된 위치로 플런저로드를 잠급니다. 주 : 20 Iancu 등을 상업적 런지 냉동 장치의 사용을 설명하기위한 프로토콜.. </li><li> 신중 t하는 ​​여과지를 터치함으로써 그리드를 가릴그는 즉시 그리드를 동결, 플런저로드를 해제, 그리드 및 필터 종이 분리하여 정지 필터 종이에 심지 사이의 메 니스 커스 (meniscus)까지의 샘플 놓습니다. 조심스럽게 플런저로드에서 집게를 제거하고 그리드 홀더에 그리드를 배치합니다. </li><li> 액체 질소로 적재 영역과 흡수 펌프 용기를 충전함으로써 크라이 EM 전송 스테이션을 준비한다. 적재 영역은 그리드 홀더 적재 영역에서 현미경 시편 카트리지가 액체 질소 온도 장소되면. </li><li> 조심스럽게 이전 Polara 현미경 이상 모델에 C 스타일의 클립 링에 작은 나사 잠금 고리 중 하나 인 잠금 링을 제거; 집게를 사용하여 카트리지에 EM 그리드를 배치하고 부드럽게 그리드를 고정하는 카트리지에 다시 잠금 고리를 다시 연결합니다. </li><li> 현미경에서 여러 시편 홀더를 제거하고 전송 스테이션에 연결합니다. 카트리지 집게를 사용하여 표본 홀더에 카트리지를 배치적재 영역에서 홀더를 후퇴하고 현미경으로 다시 여러 시험편 홀더를 전송 거라고. 참고 :. 첸 등 21 2.1-2.9을 자세히 설명하는 시각적 프로토콜을 참조하십시오. </li></ol> 3. 높은 처리량 자동 기울기 시리즈 컬렉션 <ol><li> 낮은 배율지도의 컬렉션 <ol><li> SerialEM (10)의 &#39;네비게이터&#39;메뉴에서 &#39;열기&#39;를 클릭하여 새 탐색기 창을 엽니 다 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM) </li><li> 허용 이미징 조건을 포함 그리드 사각형 찾기 (즉, 얇은 얼음, 아니 오염, 관심의 대상이) 낮은 배율에서 형광 스크린을 사용하여 (~ 2,300X minicell 표본에 대한). 참고 : [선택 :.이 단계는 전체 그리드를 montaging에 의해 SerialEM으로 자동화 할 수 있습니다, 그러나 그것은 단순히 수동으로 몇 지역을 선택 빠를 수 있습니다] </li><li> 다음 조정 50 °에 시편 홀더를 기울여 eucentric 높이로 단계를 조정XY 스테이지의 번역까지 Z-높이 기울어 기울지보기간에 최소이다. </li><li> 그리드 광장의 중심으로 이동하고 현재 단계의 위치를​​ 저장하기 위해 탐색기 창에서 &#39;추가 단계 순위&#39;버튼을 클릭합니다. </li><li> 모두 허용 그리드 사각형 무대 위치가 저장 될 때까지 위의 단계 3.1.1-4를 계속합니다. </li><li> &#39;파일&#39;메뉴에서 &#39;새 몽타주&#39;를 클릭하여 새 몽타주 MRC 파일을 엽니 다. 열어 몽타주 설정 대화 상자에서 전체 그리드 광장 (표준 200 메쉬 그리드에 대한 예를 들어, 10 × 10)을 취득한다 X와 Y의 조각의 수를 선택합니다. &#39;대신 이미지 쉬프트의 스테이지를 이동&#39;및 라디오 버튼 &#39;조각 정렬하는 데 사용되는 상관 관계 건너 뛰기&#39;를 8 등 높은 비닝 (binning)을 사용하여 선택합니다. </li><li> 네비게이터 창에서 첫 번째 단계 위치를 클릭하고는 &#39;획득&#39;확인란을 선택하여 얻을 수 설정. 탐색기 창에서 각 단계의 위치에 대해이 작업을 반복합니다. </li><li> 네비게이터는 &#39;네비게이터&#39;메뉴에서 &#39;포인트에서 획득&#39;를 클릭하여 대화 상자를 획득 엽니 다. &#39;획득 맵 이미지&#39;와 &#39;거친 eucentricity&#39;확인란을 선택하고 다른 모든 확인란이 체크되어 있는지 확인하십시오. 각 단계의 위치에서 몽타주를 수집하기 위해 &#39;진행&#39;을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 틸트 - 시리즈 수집 <ol><li> 네비게이터 창에서 획득 한지도 중 하나를 선택하고 &#39;로드 맵&#39;버튼을 클릭합니다. </li><li> 네비게이터 창에서 틸트 - 시리즈를 취득하는지도에있는 버튼 &#39;점 추가&#39;를 선택 점을 클릭합니다. 그런 다음 버튼 &#39;포인트 추가 중지&#39;를 클릭합니다. 수집 된 각 맵에 대해 반복합니다. </li><li> 카메라 메뉴에서 &#39;매개 변수&#39;를 선택하고 초점, 시험 및 기록 모드에 대한 매개 변수를 정의합니다. [선택 :. 데이터가 기록 모드에 대한 매개 변수를 지정할 수 있습니다 투여 량 - 분획] </li><li> 탐색기 창에서 지점을 선택하고 &#39;틸트 - 시리즈를 확인9; 상자를 선택합니다. 매개 변수를 선택 열리는 틸트 - 시리즈 설정 대화 창에서 틸트 시리즈 수집을 위해 원하는. 탐색기 창에서 선택된 지점의 나머지 부분에 대한 반복하지만,지도를 선택하지 마십시오. </li><li> 탐색기 메뉴에서 다시 &#39;지점에서 취득&#39;을 선택합니다. 네비게이터 대화 선택 &#39;항목을 다시 정렬&#39;, 자동 초점 &#39;과&#39;거친 eucentricity 취득 &#39;예비 작업 등을하고&#39;틸트 시리즈를 취득 &#39;기본​​ 작업으로, 선택&#39;할 때 모든 열을 닫습니다 &#39;끝에 닫기 열 밸브 점으로 수집되었다. 틸트 - 시리즈를 진행하면 각 맵의 각 지점에서 수집됩니다. </li></ol></li></ol> 4. 높은 처리량 자동 기울기 시리즈 처리 및 재건 Tomoauto 사용 <ol><li> 용량 - 분획 데이터 빔에 의한 모션의 보정 [선택 사항] 참고 : Tomoauto는 MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.ht를 사용㎖) 용량 분획 현미경 사진에서 빔 유도 동작을 제거합니다. NOTIONCORR (16)이 시스템에 설치되어 있어야합니다. <ol><li> 명령을 실행 터미널에서 원래의 기울기 시리즈, 현재 작업 디렉토리에 SerialEM (10)의 출력 로그 및 개별 용량 분별 이미지 모두와 함께 : dose_fractioned_to_stack &lt;filename.st&gt; &lt;filename.st&gt; 처리 할 수있는 틸트 시리즈의 이름입니다. </li></ol></li><li> 틸트 - 시리즈의 정렬 및 재건 참고 : 기본적으로는 틸트 Tomoauto 계 자동화 기점 모델 생성, 정렬, 콘트라스트 전송 기능 (CTF), CTF 정정 (23)의 판정 처리 (http://bio3d.colorado.edu/imod/) IMOD (13)을 사용하고 재건. 또한 사용자는 자동 기점 모델 생성, CTF에 대한 (IMOD에 포함) RAPTOR (24)를 사용하는 tomoauto의 옵션이 있습니다FIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) CTF을 결정하고, tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) 재건 또는 소프트웨어 패키지의 조합에 의한에 구성. 각각의 패키지로 제공이 구성뿐만 아니라, 매개 변수는 로컬 구성 파일은 또한 특정 시료에 사용 세부 파라미터 수집하기 위해 생성 될 수 있지만 가장 일반적으로 실험실에서 사용 된 값에 맞게 편집 할 수있는 전역 구성 파일에서 처리 설정 또는 개별 틸트 시리즈. 사용하고자하는 모든 패키지는 시스템에 설치되어 있어야합니다. <ol><li> 현재 작업 디렉토리의 기울기 시리즈로, 터미널에서 명령을 실행 tomoauto --CTF --mode = 정렬 &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; &lt;filename.st&gt; 처리 할 수있는 틸트 시리즈 및 &lt;fid_diam&gt;는 diame입니다나노 미터의 기준 마커의 터. 이 명령은 정렬과 자동 기울기 시리즈의 CTF을 추정됩니다. 이 명령 --CTF 옵션을 제거하여 CTF 처리를 건너 뛸 수있다. </li><li> 배향 처리에있어서 임의의 에러를 시각적으로 두드러진 경사 배향 계를 조사하고 명령을 실행함으로써 추정 CTF 검사 : 3dmod &lt;파일 이름&gt; .ali submfg &lt;파일 이름&gt; _ctfplotter.com 각각, 여기서 &lt;파일 이름&gt; 접미사없이 기울기 시리즈의 이름입니다. 또한 얼라인먼트 품질 통계치 정량적 인 배향에 의해 생성 평균 예측 오차를 표시 tomoauto 명령의 출력을 확인. </li><li> 허용 정렬 주어진 명령을 실행하여 처리를 진행합니다 : tomoau에 --CTF --mode = 재구성 &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; 4.2.1에서와 같은 사용자와 대체. 이 명령은, CTF를 해결 기울기 시리즈에서 기준 마커를 지우고 재건을 계산합니다. 다시 CTF 처리는 4.2.1에서와 같이 건너 뛸 수 있습니다. </li><li> [선택] 육안 검사 단계를 건너 뛰고 완전히 처리 및 복원 명령을 실행 자동화하는 tomoauto --CTF &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; </li><li> [선택] 로컬 구성 파일을 생성하는 방법에 대한 tomoauto 문서를 참조하십시오, 특정 로컬 구성을 사용하여 다음 명령을 실행합니다 tomoauto [옵션] -L &lt;local_config&gt; &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; 여기서 &lt;local_config&gt;는 지역의 conf의 이름입니다프린터의 구성 파일. </li></ol></li></ol> 5. 하위 단층 평균화 참고 : 15은 (http://www.electrontomography.org/) 서브 단층 평균화 실험을 처리하기 위해, 그러나 프로토콜 설명 I3 패키지를 사용하는 대부분의 사용 가능한 서브 - 단층 평균화 소프트웨어 packages16to 프로세스 서브 단층 평균화 실험에 일반적으로 적용 그러나 대부분의 프로토콜은 사용 가능한 서브 단층 평균화 된 소프트웨어 패키지에 일반적으로 적용되는 16 ~ 18 기재. <ol><li> 현재 작업 디렉토리에 복원 된 단층 촬영으로 명령을 실행하여 입자 따기위한 단층 촬영을 엽니 다 tomopick &lt;파일 이름&gt; .rec 여기서 &lt;파일 이름&gt; 4.2.2과 같다. injectisome을 선택하고 tomogra의 조각을 통해 서민 위쪽 및 아래쪽 화살표 키를 사용하여 먼저 기초 신체 후 바늘 끝을 클릭 마우스 왼쪽 버튼을 사용하여 열리는 창에서엠. 이러한 방식으로 모든 볼 injectisomes을 선택합니다. 이 구조의 장축을 정의뿐만 아니라 세 개의 오일러의 두 구조의 배향을 나타내는 각도 추정 텍스트 파일의 좌표를 저장한다. </li><li> 계산적 추출 명령을 실행하여 정의 장축의 중앙에 중심을 단층 400 3 복셀 큐브 : 클립 크기 조정 -cx &lt;X&gt; -cy &lt;Y&gt; -cz &lt;Z&gt; -ix 400 -iy 400 -iz 400 &lt;파일 이름&gt; .rec &lt;파일 이름&gt; _001.mrc 여기서 &lt;X&gt;, &lt;Y&gt;, &lt;Z&gt; 구조의 중간 좌표는과 &lt;파일 이름&gt; 4.2.2과 같다. 추출 된 입방체의 크기는 사용 된 구조와 배율에 따라 다양해야하고, 충분히이 샘플 (400) 3 인 관심 복셀 구조를 묶 할만큼 충분히 커야한다. </li><li> 다운 샘플 (BIN) 명령을 실행함으로써, 초기 배향을위한 연산 시간을 줄이기 위해 4 배수로 서브 단층 : binvol -b 4 &lt;파일 이름&gt; _001.mrc &lt;파일 이름&gt; _001.bin4.mrc 여기서 &lt;파일 이름&gt; 5.2과 같다. </li><li> 결정된 오일러 서브 단층 촬영 각도에 적용하고 명령을 실행하여 초기 템플릿을 생성하기 위해 세계 평균을 계산한다. I3totsum.sh </li><li> 정렬하고 세포질 영역의 이진 분류 마스크를 사용하여 다운 샘플링 하위 단층 촬영을 분류합니다. 단층의 특성 누락 쐐기 아티팩트를 최소화하기 위해 푸리에 공간에서 서브 단층 평균을 수행합니다. 4 데이터를 비닝를 들어, SAMPFACT = &quot;4 4 4&quot;를 이용하시기 바랍니다. i3mramsacls.sh </li><li> 5.5 단계를 반복하여 서브 두 단층 촬영 (SAMPFACT = 배만큼 다운 샘플링# 34 2 2 2 &quot;)과 다시 한번 원래 데이터 (SAMPFACT =&quot;1 1 1 &quot;). i3mramsacls.sh </li></ol>

<ol>
	<li>Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+III+secretion+injectisome.">The type III secretion injectisome.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).</li><li>Galan, J. E., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+into+eukaryotic+cells+by+type+III+secretion+machines.">Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines.</a> Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).</li><li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system.">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li><li>Schraidt, O., Marlovits, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+model+of+Salmonella's+needle+complex+at+subnanometer+resolution.">Three-dimensional model of Salmonella's needle complex at subnanometer resolution.</a> Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).</li><li>Hodgkinson, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+the+Shigella+T3SS+transmembrane+regions+reveals+12-fold+symmetry+and+novel+features+throughout.">Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).</li><li>Kudryashev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+structural+analysis+of+the+Yersinia+enterocolitica+injectisome.">In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome.</a> eLife. 2, e00792 (2013).</li><li>Kawamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+and+distinct+structural+features+of+Salmonella+injectisome+and+flagellar+basal+body.">Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body.</a> Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).</li><li>Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ-the+potential+of+subtomogram+averaging.">Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+protein+structure+at+8.5&#197;+resolution+using+cryo-electron+tomography+and+sub-tomogram+averaging.">Determination of protein structure at 8.5&#197; resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging.</a> J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+tomography:+an+integrated+software+suite+for+real-time+electron+microscopic+tomographic+data+collection,+alignment+and+reconstruction.">UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction.</a> J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated,+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon.">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Winkler, H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+marker-free+alignment+with+simultaneous+geometry+determination+and+reconstruction+of+tilt-series+in+electron+tomography.">Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).</li><li>Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+subvolume+alignment+and+classification+applied+to+myosin+V+and+SIV+envelope+spikes.">Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes.</a> J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).</li><li>Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+Architecture+of+Axonemes+Revealed+by+Cryoelectron+Tomography.">The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography.</a> Science. 313 (5789), 944-948 (2006).</li><li>Casta&#241;o-D&#237;ez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamo:+a+flexible,+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments.">Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).</li><li>Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., F&#246;rster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PyTom:+a+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis.">PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).</li><li>Hu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+type+III+secretion+sorting+platform+of+Shigella+flexneri.">Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).</li><li>Iancu, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography+sample+preparation+using+the+Vitrobot.">Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Cryoelectrontomography+of+Bacterial+Cells.">Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells.</a> J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTF+determination+and+correction+for+low+dose+tomographic+tilt+series.">CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series.</a> J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).</li><li>Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markov+random+field+based+automatic+image+alignment+for+electron+tomography.">Markov random field based automatic image alignment for electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).</li><li>Rouhou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTFFIND4:+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs.">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> bioRxiv. , (2015).</li><li>Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomo3D+2.0+&#8211;+Exploitation+of+Advanced+Vector+eXtensions+(AVX)+for+3D+reconstruction.">Tomo3D 2.0 &#8211; Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction.</a> J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).</li><li>Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-Electron+Tomography+Reveals+the+Sequential+Assembly+of+Bacterial+Flagella+in+Borrelia+burgdorferi.">Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).</li><li>Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacteriophage+T7+Virion+Undergoes+Extensive+Structural+Remodeling+during+infection.">The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection.</a> Science. 339 (6119), 576-579 (2013).</li><li>Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=W:+Molecular+architecture+of+chemoreceptor+arrays+revealed+by+cryoelectron+tomography+of+Escherichia+coli+minicells.">W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).</li><li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+Ultrastable+gold+substrates+for+electron+cryomicroscopy.">Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy.</a> Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 기술 된 고 처리량 방법이 1,917 크라이 틸트 계를 처리하고 그대로 S. 4,500 이상의 서브 단층 촬영을 생성 할 수있었습니다 flexneri 19 injectisome. 수집 된 데이터는 복잡한 정렬 세포질을 포함하여 현장 injectisome에서의 세부 특성화되었다. 방법은 또한 injectisome의 정렬 플랫폼의 구성을 명료하게 도왔다 추정의 단백질 성분의 특정 결실, 여러 돌연변이 세포를 시각화하기 위해 이용 하였다. 우리의 방법은 injectisome의 구조 - 기능 관계를 조사하기 위해 새로운 길을 제공했다. 그 결과, 새로운 스테이지 T3SS 매개 분비 기전을 기본 메커니즘 상기 절개에 대해 설정 하였다. 여기에 제시된 프로토콜은 그대로 S의 높은 처리량 극저온 동부 설명 flexneri,하지만 크라이 ET 적합한 어떤 프로젝트에 적용 가능하다. 이 방법은 구조물의 사용되었습니다보렐리 아 burgdorferi에 (27)의 편모 모터의 RAL 특성, E.의 감염 E.에서 박테리오파지 T7 (28)에 의해 대장균 minicells 및 화학 수용체 배열 대장균 (29). 대량의 데이터 세트의 수집을 용이하게함으로써 다수의 변이체뿐만 아니라 이미지와 같은 기계 조립체 (27)와 파지 감염 (28)의 진행 과정의 동적 추론을 허용하는 조건 중 다수 선별 할 수있다. 여러 소프트웨어 패키지를 수집하고 처리 실행을 완벽하게 제어 할 수 있도록함으로써, 사용자는 최적의 결과에 대한 패키지의 다른 조합을 사용자 정의 할 수 있습니다. 등. 21 첸 이전 틸트 계 IMOD 13 장 처리 및 RAPTOR 24 Leginon 12 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터를 수집하는 자동화 기술과 유사한 프로토콜을 발표했다. 현재의 프로토콜은 공동 다른 방법을 자세히 설명이 방법을 보완llecting 및 처리 데이터는 또한 기술 및 절차는 용량 분별 데이터, 자동화 CTF 추정 및 보정, 및 내보다 강력한 자동 정렬 루틴, 고급 서브 단층 평균화 통해 고해상도에 증가 된 초점으로 구동 얼마나 많은 나타내면서 IMOD (13). 이전의 프로토콜 데이터 수집 강조한 영상 내용이수록되어 있지만,이 방법은, 수집 된 데이터를 처리의 상세에 초점을 맞춘다. 주요 병목 프로젝트와 행동을 느리게 지루한 사용 설명서 개입의 양을 제한하면서 높은 처리량 방법은 현미경과 컴퓨터 자원의 사용을 최대화 대규모 데이터 수집 할 수 있습니다. 랩퍼 라이브러리 tomoauto은 간단하고 집중적으로 각 소프트웨어 패키지에 사용 된 모든 파라미터의 전체 구성을 허용하고있다. 적절한 구성이 결정되면, 그것은 전체 D로 설정을 적용 후 용이ataset. 작은 서브 세트를 수동으로 처리 할 필요가있는 동안 틸트 계의 대부분은, 허용 가능한 결과 (도 4a)으로 처리 될 수있다. 이 경사 시리즈는 일반적으로 과도한 이미지 이동, 빈약 한 반면, 또는 실패 자동화 기점 추적 루틴을 야기 충분한 기준 마커의 부족 (그림 4B)에 의해 퍼진 적은 이상적인 인수 있습니다. 최상의 단층 촬영을 얻으려면, 광범위한주의 이미지 처리에 샘플 준비, 이미지 수집, 매주 중요한 단계에서주의해야합니다. 자동화 된 서브 단층 템플릿 매칭에 의해 추출 및 tomoauto 같은 기존의 워크 플로우 파이프 라인에 같은 디나모 현대 하위 단층 평균 소프트웨어 패키지의 통합과 같은 높은 처리량 크라이 동부의 추가 개발이 현재 연구되고있다. 차세대 직접 검출 장치 카메라의 최근의 출현은 틸트 시리즈 SNR을 증가 MOR 수 있도록 주요 개선했다때문에 검출기의 높은 효율로 전자 일관된 CTF 결정. 새로운 전체 금 격자 형태의 사용은 수작업 30 덜 필요로 자동 기울기 계 처리 및 재건 성공률을 향상 틸트 계 컬렉션 결함을 감소시킬 수있다. 마지막으로 컴퓨터 클러스터 및 그래픽 처리 장치 (GPU)의 현재 유비쿼터스 사용하여 사용자에게 제공, 병렬화 큰 데이터 세트 처리, 곧 희망 시간 일부터 실행 시간을 단축 할 수있을 것이다 이러한 시스템을 이용할 수 배관의 개발을 빠르게 여전히 실험 설계 및 의미있는 데이터 분석 사이에서 더 적은 가동 중지 시간은 여전히​​ 데이터 세트의 크기를 증가 및 높은 해상도를 달성한다.

유형 III 분비 시스템 (T3SS)는 많은 그람 음성 병원균에 필수적인 독성 결정이다. 또한 바늘 ​​착체라고도 injectisome은 진핵 숙주 세포를 1, 2로 박테리아에서 이펙터 단백질의 직접적인 전좌 필요한 중앙 T3SS 기계이다. injectisome가 외 바늘 기저 체 및 세포질 착체를 포함라고도 정렬 복잡한 3 등. 이전의 연구는 중요한 기초 체 단백질 (4, 5)의 원자 구조와 함께, 살모넬라 및 시겔로부터 정제 injectisomes의 3 차원 구조를 해명했다. 살모넬라, 시겔 라 (Shigella), 및 예 르시 니아에서 injectisomes의 동일계 구조 최근-ET 크라이 (6)에 의해 드러난 7. 그러나, 이펙터 선택 및 니들 어셈블리에 필수적인 세포질 단지는, 그 구조에 가시화되지 않았습니다. 곳을 알아내는 - 동부 MOS입니다(원위치) 네이티브 휴대 맥락 나노 해상도 기계 분자 이미징에 적합한 기술을 t. 그럼에도 불구하고, 극저온 동부에 의해 달성 해상도는 시편의 두께에 의해 제한된다. 단점을 극복하기 위해, 우리는 유 전적으로 크라이 동부 충분히 얇은 minicells을 생산하기 위해 수정 된 악성 시겔 flexneri 변형에 그대로 injectisomes 군데. 극저온 ET의 또 다른 한계는 매우 신속하게 샘플 고해상도 정보를 파괴 전자빔에 의한 조사에 시료의 감도이다. 적합한 투여 량은 전체 기울기 계 사이에 분산 될 수 있도록 그 결과, 매우 낮은 투여 량은 개개의 틸트 - 이미지에 사용된다. 이것은 매우 어려운 단층 소음의 다량에서 피사체의 구조적 특징을 구별 할 수있게하고 cryo-에 의해 달성 될 수있는 해상도를 제한 최종 재구성 된 신호 대 잡음비 (SNR)를 낮춘다 동부. Conventi이러한 푸리에 리얼 공간 필터로서뿐만 아니라, 다운 샘플링 ONAL 화상 처리는 콘트라스트를 높이기 위해 사용하지만, 고해상도 많은 정보를 필터링을 희생 할 수있다. 최근에는, 서브 - 단층 평균화 가능 크게 SNR을 증가시키고 서브 - 나노 미터 수준 (8, 9)에 어떤 경우에는 이후에 최종 해상도로했다. 착물의보다 상세한 분석이 가능해진다 계산적 함유 서브 단층 촬영 수천 추출하여 정렬하고 하위 단층 촬영을 평균 원래 단층 촬영 및 관심 분야는 높은 SNR 및 높은 해상도와 현장 복잡한 구조에서 결정합니다. 이러한 방법은 거대 분자 어셈블리와 네이티브 휴대 문맥에서의 동적 배좌에 더욱 통찰력을 제공하는 유전자 접근법과 통합 될 수있다. 일반적으로 수십 또는 서브 - 단층 촬영 천 수백 고 판정하기 위해 평균화 될 필요현장에서 -resolution 구조. 틸트 시리즈의 충분한 수의 인수는 서브 단층 촬영이 많은 빠르게 병목 현상이 생산하는 데 필요한. 그 결과 틸트 시리즈는 종종 재건하기 전에 정렬로 기울기 시리즈를 가지고 해결해야 빔에 의한 변화, 무대 반발뿐만 아니라, 확대, 회전 및 기울이기 결함에 의해 영향을 받는다. 틸트 시리즈는 일반적으로 또 다른 병목 현상을 일으키는 원인이 전통적으로 수동 기울기 시리즈의 검사를 통해 선택 추적 금 기준 마커,에 의해 정렬됩니다. 많은 소프트웨어 패키지 (11), (12), 틸트 계 정렬 및 재구성 (13) (14)와 서브 - 단층은 평균 15-18 컴퓨터 제어 전자 현미경 (10)을 통해 자동 기울기 계 획득을 위해 개발되어왔다. 이러한 패키지는 극저온 ET의 흐름에서 개별 작업을 처리, 그것은 SYSTEMA에 프로세스에 높은 레벨의 추상화를 구축하는 것이 바람직하게학적으로 하나의 파이프 라인으로 전체 체계를 간소화. 따라서 집중적으로 각 성분의 전체 구성을 유지하면서 간단한 사용자 조작을 허용 하나 반 자동화 기기에이 패키지의 번호를 정리하기위한 &quot;tomoauto&quot;소프트웨어 래퍼 라이브러리를 개발했다. 도서관은 온라인 원격 소스 코드 저장소 (http://github.com/DustinMorado/tomoauto)에 의해 오픈 소스, 잘 문서화 지속적으로 개발 및 사용을위한 자유롭게 사용할 수, 맞춤형 개발 또는 추가 통합이다. 이 높은 처리량 크라이 동부 파이프 라인 (S)에 그대로 injectisomes을 시각화하기 위해 이용되고있다 flexneri minicells. 1,917 단층 촬영의 총 서브 단층 (19)을 평균함으로써 결정 세포질 정렬 플랫폼을 포함한 컴퓨터 본래의 동일계 구조 고해상도을 드러내는,이 방법을 사용하여 생성 하였다. 함께 야생 타입 및 m-의 분자 모델링utant 기계는, 우리의 높은 처리량 파이프 라인은 네이티브 휴대 컨텍스트 손상 injectisome의 구조와 기능을 이해하기위한 새로운 수단을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Tyrptic Soy Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0692</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Apparatus</td><td>Bio-rad</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>1 mm Cuvette</td><td>BTX</td><td>45-0124</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Cryogenic Tube</td><td>Thermoscientific</td><td>5000-1020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tube</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z336769</td><td></td></tr><tr><td>Holey Carbon Grids</td><td>Quantifoil&lt;br/&gt; (Electron Microscopy Sciences)</td><td>Q2100CR2</td><td>R2/2 200 Cu</td></tr><tr><td>Glow Discharge Device</td><td>In-House</td><td></td><td>Commercial Alternative Available</td></tr><tr><td>Vacuum Desiccator</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z119016&amp;nbsp;</td><td>Used in In-House Glow Discharge Device</td></tr><tr><td>High-Frequency Generator</td><td>Electro-Technic Products</td><td>BD-10A</td><td>Used in In-House Glow Discharge Device.&amp;nbsp; CAUTION: This device generates high voltages.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont&lt;br/&gt; (Electron Microscopy Sciences)</td><td>72705-D</td><td>Style 5 Anti-magnetic</td></tr><tr><td>Colliodal Gold</td><td>Aurion</td><td></td><td>BSA 10nm</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman</td><td></td><td>#2</td></tr><tr><td>Ethane&amp;nbsp;</td><td>Matheson Tri-Gas</td><td>UN1035</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen</td><td>Matheson Tri-Gas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>Plunger Device</td><td>In-House</td><td></td><td>Commercial Alternative Available</td></tr><tr><td>Cryogenic Grid Storage Box</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71166-30</td><td></td></tr><tr><td>Transmission Electron Microscope</td><td>FEI</td><td></td><td>Tecnai Polara F30&lt;br/&gt; (300 KeV)</td></tr><tr><td>Direct Detection Device Camera</td><td>Gatan</td><td></td><td>K2 Summit</td></tr><tr><td>Tomogram Acquisiton Software</td><td>SerialEM</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography</td></tr><tr><td>Beam-induced Motion Correction Software</td><td>MOTIONCORR</td><td></td><td>http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires &gt;2GB Nvidia GPU</td></tr><tr><td>Tilt-Series Alignment Software</td><td>IMOD</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo</td></tr><tr><td>Automatic Fiducial Marker Modelling Software</td><td>IMOD</td><td></td><td>Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0&lt;br/&gt; (Usable in tomoauto)</td></tr><tr><td>CTF Determination Software</td><td>IMOD</td><td></td><td>Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf&lt;br/&gt; (Usable in tomoauto)</td></tr><tr><td>Tilt-Series Reconstruction Software</td><td>tomo3d</td><td></td><td>https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo</td></tr><tr><td>Tilt-Series Automated Processing Software</td><td>tomoauto</td><td></td><td>https://github.com/DustinMorado/tomoauto</td></tr><tr><td>Particle Picking Software</td><td>i3</td><td></td><td>http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD</td></tr><tr><td>Subvolume Averaging Software</td><td>i3</td><td></td><td>Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org</td></tr></tbody></table>

using tomoauto: a protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

minicells S의 샘플 flexneri 수집 및 그림 2에 설명 된 파이프 라인을 다음 tomoauto 사용하여 회로도 그림 1에서 보여로 처리했다. 틸트 시리즈는 낮은 배율 몽타주 맵에 사용자가 지정한 지점에서 높은 처리량 틸트 계 취득 가능 SerialEM (10) (도 3)를 사용하여 수집 하였다. 현미경은 빔 유도 모션 22 (도 4)을 감소시키기 위해 직접 검출 장치의 카메라에 용량 분별 모드를 사용하여 수집 하였다. Tomoauto MOTIONCORR 22는 각 처리 용량 분획 현미경 사진의 컬렉션을 복용하는 움직임 보정을 조정 및 틸트 - 시리즈로 결과를 상기 (동영상 1) 처리 될 어셈블. tomoauto의 가​​장 일반적인 응용 프로그램은 사설입니다초기 기울기 시리즈의 C 정렬. Tomoauto는 조악 틸트 계 정렬 및 최종 정렬을 생성하기 위해 사용되어 차례로 시료 중의 콜로이드 성 금 입자를 추적 기점 초기 모델을 생성하는 IMOD (13)에 필요한 명령의 순차적 인 실행을 구성한다. 이 기점 모델의 정확도는 재구성 된 단층 화상의 품질에 필수적이기 때문에, 사용자는 육안으로 직접 처리해야 틸트 계열을 식별하기 위해 이후에 재구성을 진행하기 이전에 자동으로 계산 기점 모델을 검사 할 수있다.도 5 도표 두 기울기 시리즈가 조악 정렬 및 tomoauto에 의해 생성 된. 결정된 기준점 모델 5A, C는 기울어지지 않은 이미지를 표시하고 기준점 모델 모두에서 기준 마커를 중심으로 모델 포인트 올 피규어 것은. 5B 피규어, 대응을 기울임 보여 D 도 5b에 모델도에서 50하면서 일련 </strong&gt; 아직 제대로 금 입자를 추적, 그림 5D의 여러 모델 포인트 (빨간색)은 대응하는 금 마커에서 탈선과 모델은 미세 조정에 적합하지 않습니다했다. 이러한 에러는 모델 지점의 중심과 금 마커의 가능성 중심 간의 평균 예측 오차로서 정량적으로 측정 할 수 있고, tomoauto은 측정 오류 검사를 신속하게 사용자 정의 임계 값을 초과하면 사용자에게 경고하도록 구성 될 수있다. 불충분하게 자동 정렬 틸트 시리즈 수동 정렬 될 수있다. 우리는 tomoauto이 성공적으로 약 80 %의 우리의 수집 틸트 시리즈 (영화 2)의 -90 %를 정렬 것을 찾을 수 있습니다. 틸트 시리즈가 성공적으로 정렬 한 후,이를 최종 단층로 재구성되어야한다. 사용자가 사용하는 IMOD (13) 또는 최종 재구성을 생성하기 위해 26 tomo3d Tomoauto 수 있도록 설계되었다. 우리는 현재 T를 사용omo3d 크게 재구성 시간을 줄이기 위해 현대 컴퓨터의 멀티 코어 처리 장치 (CPU의)의 여러 기능을 활용할 수있다. 도 6 및 영화 3과 같이 최종 단층은 분할하여 셀룰러 주석, 또는 샘플 내의 분자 기계의 높은 해상도 정보를 획득하기 위해 평균화 서브 단층 사용될 수 묘화 샘플의 3 차원 볼륨이다. 서브 단층 평균화 증가 SNR 모두 개별 단층 촬영 소음의 높은 수준을 평균과 관련하여 임의의 방향의 잘 분산 세트 내의 다수의 서브 - 단층 촬영을 이용함으로써 누락 된 쐐기에 의해 생성 된 아티팩트를 감소 쐐기 누락하는 것은 유물을 제한하고 최종 해상도를 향상시킬 수 있습니다. 본래의 S. 2.7nm 서브 단층 평균 이 기술을 공동으로 할 수있는 큰 개선을 보여줍니다 EMDB (EMD-2667)에 증착 된 flexneri T3SS는 그림 7에 표시됩니다도 6b에 단일 단층에 표시 injectisome에 mpared. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53608/53608fig1.jpg" /> 그림 1. 높은 처리량 냉동 전자 단층 촬영의 도식 개요. 액체 현탁액을 빠르게 EM 그리드 및 틸트 시리즈의 세트에 동결은 자동화 된 컴퓨터 제어 전자 현미경으로 수집됩니다. 그 결과 현미경은 단층을 생성하는 tomoauto를 사용하여 자동으로 처리됩니다. 여기서 마지막 단계 인 세그먼트 S. 후 등. 2015 15에서이 프로토콜에 의해 생성 된 단층 촬영에서 flexneri minicell. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53608/53608fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53608/53608fig2.jpg" /> 그림 tomoauto 과정 2. 순서도. tomoauto 워크 플로우의 분석 데이터가 모든 방법을 최종 하위 단층 평균 용량 분별 현미경의 컬렉션에서 처리하는 방법을 보여줍니다. 하위 프로세스 상징 세부 구성 적절한 소프트웨어를 실행하여 입력을 처리 할 좌표를 tomoauto 작업. 문서 및 다중 심볼 문서가 실제로 사용자에 의해 처리 결과를 표시하는 동안 데이터 심볼은 일반적으로 사용자에 의해 사용되지 않는 출력을 보여준다. 마지막으로 사용자 개입 워크 플로에서 발생하는 기호는 표시가 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53608/53608fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53608/53608fig3.jpg" /> SerialEM 네비게이터 그림 3. 배치 틸트 시리즈 수집. 무대 위치로 저장됩니다 몽타주지도의 위치 (도시 selecti화면의 좌측에 도시 된 네비게이터 창 목록과 현재로드 맵)에 대한 인수는 맵에 추가 적십자사 수치 레이블 선택된 지점과 함께 버퍼 윈도우에 표시된다. 획득 포인트는 탐색기 창에서 레이블로 나열되고. &quot;틸트 시리즈&quot;체크 상자를 사용하여 취득하도록 설정할 수 있습니다 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53608/53608fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53608/53608fig4.jpg" /> 그림 용량 분획 데이터에 모션 보정 4. 효과. (A)이 기울어지지하고 나안 현미경 사진을 도시하고 (MOTIONCORR 처리) 움직임 보정 된 화상 (B)에 도시되고, 콘트라스트 보정 후의 약간 개선된다. 개선 푸리에 TRANSF 보면 더 명백하게 알 수있는현미경의 ORM (C) 전 (D)의 움직임 보정 후의. 이미지는 EH 같은 정보를 표시하지 않지만 콘트라스트 감소와 C와 D에 표시 톤 반지 60도, 기울어 진 현미경으로 더 이상 높은 경사에서 볼 수 있습니다. 스케일 바 250 나노 미터. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53608/53608fig4.large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53608/53608fig5.jpg" /> 그림 tomoauto 자동 기울기 시리즈 정렬 5. 좋고 나쁜 결과. (A) 기울지 대략 정렬 현미경 자동 tomoauto을 사용하여 제조 기점 모델. (B) 50도 경사의 기점 결정된 모델. 모델이 여전히 잘 맞는 적절한 기준 마커를 중심으로한다. (C, D) </&gt; 강한 박스 영역에서 확대 된 각각의 모델 (A, B)를 보여줍니다. 이 틸트 시리즈 1.06 화소 평균 잔차와 정렬 하였다. (E) 다른 틸트 시리즈 및 50도 경사의 (F) 시리즈에서 기울어지지 않은 현미경 사진과 기점 모델. 여기에서 우리는 그 모델 (빨간색으로 표시) 여러 기준 마커의 트랙을 잃은보고이 나쁜 자동화 된 추적의 대표입니다. (G, H) 박스 영역에 확대 각각 (E, F)의 모델을 보여줍니다. 이 경사 시리즈는 3.51 픽셀의 평균 잔여 오류로 정렬 시리즈의 수동 정렬에 의해 처리 할 수 있었다. (A) 스케일 바 500 nm의 (C) 스케일 바 50 nm의. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53608/53608fig5large.jpg" target="_blank">의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.</a> <img alt="그림 6" src=&quot;/files/ftp_upload/53608/53608fig6.jpg&quot;/&gt; 그림 6. 단층 촬영은 tomoauto에 의해 자동으로 생성. (A) 이것은도 4a에 표시된 기울기 계의 재구성의 중심에서 일곱 조각 투영 표시. 스케일 바는 250nm. (B)는 (A)에서 박스형 영역의 확대보기를 디스플레이 그대로 injectisome. 스케일 바 100 나노 미터. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53608/53608fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53608/53608fig7.jpg" /> 그대로 S의 그림 7. 하위 단층 평균 flexneri 유형 III 분비 시스템. (A) 본래의 S. 2.7 nm의 서브 단층의 평균 중앙 조각 EMDB (EMD-2667)에서 flexneri T3SS. (B) 전체 투사 따라볼륨의 X 축. (C)의 IMOD (130)의 형상에서 본 임계 부피있는 isosurface 렌더링. 스케일 바는 5nm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53608/53608fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="영화 1" src="/files/ftp_upload/53608/53608Movie1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53608/Movie-1.mp4" target="_blank">영화 1 : 애니메이션이 정렬되지 않은 틸트 일련의 (오른쪽 다운로드를 클릭).</a> 이 애니메이션으로 처음 SerialEM에 의해 수집 된 기울기 시리즈를 통해 실행됩니다. 번역 상 변화는 쉽게 눈에 띄지 결함이 재구성 될 수 기울기 시리즈 전에 수정해야와 함께 개별 기준점 이미지 이미지 마커, 이러한 변화의 엉뚱한 패스에 의해 식별된다. <img alt="영화 2" src=&quot;/files/ftp_upload/53608/53608Movie2.jpg&quot;/&gt; <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53608/Movie-2.mp4" target="_blank">영화 2 :. 정렬 틸트 시리즈의 애니메이션 (오른쪽 다운로드를 클릭)</a> 이 애니메이션은 tomoauto에 의해 자동 정렬 후 영화 1에 표시된 같은 현미경 사진을 통해 실행됩니다. 기준 마커의 불규칙한 경로 해주기 틸트 일련 부드러운 궤적을 따르고, 경사 축은 뷰어에 대해 수직으로 정렬된다. <img alt="영화 3" src="/files/ftp_upload/53608/53608Movie3.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53608/Movie-3.mp4" target="_blank">영화 3 :. 애니메이션 복원 틸트 일련의 (오른쪽 다운로드를 클릭)</a> 이 애니메이션 영화 2 (B)에 표시되는 틸트 시리즈의 그림 6 생성 된 후 자동 재건에 표시된 단층 촬영을 통해 실행Y tomoauto.

Watch this Scientific Journal Video about Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography at JoVE.com

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

우리는 분자 기계 구조의 동일계에서 높은 해상도를 결정하기 위해 높은 처리량 극저온 전자 단층을 활용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 일반적인 병목 현상을 회피, 대용량의 데이터가 처리 될 수있게하고, 사용자가 중요한 생물학적 질문에 집중할 수 있도록 자원 중단 시간을 감소시킨다.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

using-tomoauto-protocol-for-high-throughput-automated-cryo-electron

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.9K 조회수.  University of Texas Health Science Center at Houston.  우리는 분자 기계 구조의 동일계에서 높은 해상도를 결정하기 위해 높은 처리량 극저온 전자 단층을 활용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 일반적인 병목 현상을 회피, 대용량의 데이터가 처리 될 수있게하고, 사용자가 중요한 생물학적 질문에 집중할 수 있도록 자원 중단 시간을 감소시킨다. 

비디오: Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) <a href="http://www.usaid.gov">(www.usaid.gov)</a>. The virus infects and destroys CD4+ T-cells thereby crippling the immune system, and causing an acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) 2. Infection begins when the HIV Envelope glycoprotein "spike" makes contact with the CD4 receptor on the surface of the CD4+ T-cell. This interaction induces a conformational change in the spike, which promotes interaction with a second cell surface co-receptor 5,9. The significance of these protein interactions in the HIV infection pathway makes them of profound importance in fundamental HIV research, and in the pursuit of an HIV vaccine.
The need to better understand the molecular-scale interactions of HIV cell contact and neutralization motivated the development of a technique to determine the structures of the HIV spike interacting with cell surface receptor proteins and molecules that block infection. Using cryo-electron tomography and 3D image processing, we recently demonstrated the ability to determine such structures on the surface of native virus, at &tilde;20 &Aring; resolution 9,14. This approach is not limited to resolving HIV Envelope structures, and can be extended to other viral membrane proteins and proteins reconstituted on a liposome. In this protocol, we describe how to obtain structures of HIV envelope glycoproteins starting from purified HIV virions and proceeding stepwise through preparing vitrified samples, collecting, cryo-electron microscopy data, reconstituting and processing 3D data volumes, averaging and classifying 3D protein subvolumes, and interpreting results to produce a protein model. The computational aspects of our approach were adapted into modules that can be accessed and executed remotely using the Biowulf GNU/Linux parallel processing cluster at the NIH <a href="http://biowulf.nih.gov">(http://biowulf.nih.gov)</a>. This remote access, combined with low-cost computer hardware and high-speed network access, has made possible the involvement of researchers and students working from school or home.

The protocol describes a high-throughput approach to determining structures of membrane proteins using cryo-electron tomography and 3D image processing. It covers the details of specimen preparation, data collection, data processing and interpretation, and concludes with the production of a representative target for the approach, the HIV-1 Envelope glycoprotein. These computational procedures are designed in a way that enables researchers and students to work remotely and contribute to data processing and structural analysis.

Cryo - 전자 Tomography 및 자동 하위 tomogram 평균을 사용하여 HIV의 봉투 Glycoproteins의 분자 구조 결정

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

연구

면역학 및 감염병학

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

생체공학

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

세균성 세포의 전자 Cryotomography

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

생물학

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ever-increasing share of published structural data. Recent advances in TEM technology and automation have boosted both the speed of data collection and quality of acquired images while simultaneously decreasing the required level of expertise for obtaining cryo-EM maps at sub-3 &#197; resolutions. While most of such high-resolution structures have been obtained using state-of-the-art 300 kV cryo-TEM systems, high-resolution structures can be also obtained with 200 kV cryo-TEM systems, especially when equipped with an energy filter. Additionally, automation of microscope alignments and data collection with real-time image quality assessment reduces system complexity and assures optimal microscope settings, resulting in increased yield of high-quality images and overall throughput of data collection. This protocol demonstrates the implementation of recent technological advances and automation features on a 200 kV cryo-transmission electron microscope and shows how to collect data for the reconstruction of 3D maps that are sufficient for de novo atomic model building. We focus on best practices, critical variables, and common issues that must be considered to enable the routine collection of such high-resolution cryo-EM datasets. Particularly the following essential topics are reviewed in detail: i) automation of microscope alignments, ii) selection of suitable areas for data acquisition, iii) optimal optical parameters for high-quality, high-throughput data collection, iv) energy filter tuning for zero-loss imaging, and v) data management and quality assessment. Application of the best practices and improvement of achievable resolution using an energy filter will be demonstrated on the example of apo-ferritin that was reconstructed to 1.6 &#197;, and Thermoplasma acidophilum 20S proteasome reconstructed to 2.1-&#197; resolution using a 200 kV TEM equipped with an energy filter and a direct electron detector.

High-resolution cryo-EM maps of macromolecules can be also achieved by using 200 kV TEM microscopes. This protocol shows the best practices for setting accurate optics alignments, data acquisition schemes, and selection of imaging areas that are all essential for the successful collection of high-resolution datasets using a 200 kV TEM.

200KV 투과 전자 현미경을 사용한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

생화학

User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for the high-resolution structure determination of biological macromolecules. Despite the remarkable advances in cryo-EM, there is still scope for improvement in various aspects of the single-particle analysis workflow. Single-particle analysis demands a suitable software package for high-throughput automatic data acquisition. Several automatic data acquisition software packages were developed for automatic imaging for single-particle cryo-EM in the last eight years. This paper presents an application of a fully automated image acquisition pipeline for vitrified biomolecules under low-dose conditions. 
It demonstrates a software package, which can collect cryo-EM data fully, automatically, and precisely. Additionally, various microscopic parameters are easily controlled by this software package. This protocol demonstrates the potential of this software package in automated imaging of the severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike protein with a 200 keV cryo-electron microscope equipped with a direct electron detector (DED). Around 3,000 cryo-EM movie images were acquired in a single session (48 h) of data collection, yielding an atomic-resolution structure of the spike protein of SARS-CoV-2. Furthermore, this structural study indicates that the spike protein adopts two major conformations, 1-RBD (receptor-binding domain) up open and all RBD down closed conformations.

Single-particle cryo-electron microscopy demands a suitable software package and user-friendly pipeline for high-throughput automatic data acquisition. Here, we present the application of a fully automated image acquisition software package, Latitude-S, and a practical pipeline for data collection of vitrified biomolecules under low-dose conditions.

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 사용자 친화적이고 높은 처리량 및 완전 자동화된 데이터 수집 소프트웨어

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

극저온 전자 단층 촬영 데이터 수집 최적화를 위한 전략

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, replication, segregation, etc.) remain poorly understood, partially due to the lack of experimental approaches to high-resolution visualization of specific chromatin loci in structurally preserved nuclei. Here we present a protocol for the visualization of replicative domains in monolayer cell culture in situ,&#160;by combining EdU labeling of newly synthesized DNA with subsequent label detection with Ag-amplification of Nanogold particles and ChromEM staining of chromatin. This protocol allows for the high-contrast, high-efficiency pre-embedding labeling, compatible with traditional glutaraldehyde fixation that provides the best structural preservation of chromatin for room-temperature sample processing. Another advantage of pre-embedding labeling is the possibility to pre-select cells of interest for sectioning. This is especially important for the analysis of heterogeneous cell populations, as well as compatibility with electron tomography approaches to high-resolution 3D analysis of chromatin organization at sites of replication, and the analysis of post-replicative chromatin rearrangement and sister chromatid segregation in the interphase.

This protocol presents a technique for high-resolution mapping of replication sites in structurally preserved chromatin in situ that employs a combination of pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold labeling and ChromEMT.

전자 단층 촬영에 의한 초구조적으로 보존 된 크로마틴의 복제 도메인 이미징

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved automated acquisition strategies, preparative techniques that expand the possibilities of what the electron microscope can image at high-resolution using cryo-ET and new subtomogram averaging software. Additionally, data acquisition has become increasingly streamlined, making it more accessible to many users. The SARS-CoV-2 pandemic has further accelerated remote cryo-electron microscopy (cryo-EM) data collection, especially for single-particle cryo-EM, in many facilities globally, providing uninterrupted user access to state-of-the-art instruments during the pandemic. With the recent advances in Tomo5 (software for 3D electron tomography), remote cryo-ET data collection has become robust and easy to handle from anywhere in the world. This article aims to provide a detailed walk-through, starting from the data collection setup in the tomography software for the process of a (remote) cryo-ET data collection session with detailed troubleshooting. The (remote) data collection protocol is further complemented with the workflow for structure determination at near-atomic resolution by subtomogram averaging with emClarity, using apoferritin as an example.

The present protocol describes high-resolution cryo-electron tomography remote data acquisition using Tomo5 and subsequent data processing and subtomogram averaging using emClarity. Apoferritin is used as an example to illustrate detailed step-by-step processes to achieve a cryo-ET structure at 2.86 &#197; resolution.

초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집 및 서브 단층 촬영 평균화

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...