The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute's prime contract with the US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract No. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. and J.W. performed this work as employees of Battelle Memorial Institute. Subcontractors to Battelle Memorial Institute who performed this work are: S.M. as an employee of MRI Global; M.G.L. as an employee of Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; and J.H.K. as an employee of Tunnell Government Services, Inc.

1. 실험 항목 <ol><li> 이전 BSL-4 실험실에 진입 실험 (예를 들면, 세포, 미디어, 소모품)을위한 BSL-2 실험실에서 모든 물품을 수집합니다. </li><li> (참고 7에서 자세히 설명)을 BSL-4 항목의 절차를 완료합니다. </li></ol> BSL-4 실험실에서 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛 2. 준비 <ol><li> 일단 BSL -4- 기관 내부 완료된 일상 점검의 내부 (도 1)을 보장한다. 체크리스트는 이전에 작성하여 바이러스가 사용될 표시되어 있지 않은 경우 체크리스트를 작성합니다. 체크리스트가 이미 완료된 경우에 이름을 추가하고있는 바이러스 목록에 사용될 것이다. </li><li> (5 % 이중 차 암모늄 살균제 용액으로 예를 들면 N- 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드, N- 알킬 디메틸 에틸 벤질 암모늄 (새시 포함) BSC의 전체 내부를 분무하여 클래스 II BSC 청소에이전트에 대한 클로라이드 또는 다른 살균제의 적절한 사용)와 종이 타월 10, 11로 닦아된다. 점착성 소독액을 제거 캐비닛 및 새시 안에 70 % 에탄올 용액을 분무. </li><li> 앉아있는 경우, 캐비닛의 뒷면에 도달 할 수 있도록 편안한 높이로 클래스 II BSC의 앞에 의자를 설정하고 실험실 전문가의 얼굴이 전면 개방 위 (그림 2) 11 자리 잡고있다. </li><li> 바이오 안전성 캐비닛 용 폐기물 용기를 준비합니다. 폐기물 용기의 이중 급 암모늄 소독제 용액의 최종 농도가 더 5 % 미만인지 확인합니다. 그에 따라 계획 및 10 % 용액이되는 폐기물은 살균제를 희석 것이다 추가됩니다 할 수 있습니다. 또한,시 및 분석 완료 후 사전 제거 및 장갑을 낀 손에 모든 항목을 스프레이 클래스 II BSC 내부 5 % 이중 급 암모늄 소독제 용액 스프레이 병을 배치합니다. </li> &lt;리&gt;는 공기 흐름 (11)의 클래스 II BSC 및 중단으로 반복 재료 소개를 피하기 위해 멀리 돌아 가능한 캐비닛의 클래스 II BSC에서 전체 실험에 필요한 적절한 재료를 놓습니다. </li></ol> 3. 예 : 상패 분석 <ol><li> 바이러스를 함유하는 샘플을 검색하고 손으로 저장 위치에서 바이러스를 제어하고 37 ℃의 배양기에서 물질을 해동. </li><li> 계획된 바이러스 희석액에 따라 사용되는 6- 웰 플레이트의 웰 라벨. 뚜껑과 몸체가 분리 된 경우 성공적인 매칭을 보장하기 위해 접시의 뚜껑과 본체를 표시합니다. </li><li> 클래스 II BSC에 단계 3.1-3.2에서 자료를 가져와. 다른 쪽 ( &quot;더러운 측&quot;)에 ( &quot;깨끗한 측&quot;)와 낭비를하지 않았거나 한쪽 바이러스와 접촉하지 않습니다 모든 항목을 놓습니다. 가능하면, 에어로졸 발생 활동 한 동안 떨어져 &quot;더러운 항목&quot;에서 &quot;깨끗한 항목&quot;적어도 30cm를 유지1. </li><li> 내부 중심이 자기 (11)을 보호하기 위해 가장 효과적인 위치가되도록 설계 한, 가능한 클래스 II BSC의 내부 중앙에 가깝게 작동한다. </li><li> 바이러스 샘플 및 제어 바이러스의 50 μl를 제거하고 2 % 소 태아 혈청에 둘 베코의 변형 이글의 매체의 450 μL에 배치합니다. 지금까지 필요 (그림 3A)와 같은에서 연속 희석을 진행합니다. </li><li> 샘플에 기포 발생을 최소화하기 위해 노력하는 동안 희석 동안 천천히 그리고 조심스럽게 피펫 팁으로 바이러스 샘플을 적어도 5 번 섞는다. 또한 다음 희석에 각각 첨가 한 후 피펫 팁을 변경합니다. </li><li> 최종 희석 시료 5 시간 혼합 한 후, 같은 부피의 희석을 위해 폐기물 컨테이너로 바이러스 시료 50 μL를 버린다. </li><li> 팁 폐기 할 때는 expell 전에 팁의 내부와 외부의 오염을 제거하기 위해 쓰레기 통에서 소독액 각 팁을 씻어폐기물 통에 팁을 보내고. </li><li> 희석액이 이루어진 후에, 6- 웰 플레이트의 각 웰에 500 ㎕의 미디어두고 따로 희석 웰을 설정하고 세포 배양 플레이트의 웰로부터 매체의 흡입을 시작. </li><li> 수동, 볼륨 조절을 사용하여 피펫의 상단에 쓰레기 통에서 피펫 팁, 흡인 소독제 용액으로 완료되면, 푸시 버튼 피펫을 피펫 내부의 적절한 오염 제거를 위해. 실험이 끝날 때까지 폐기물로 버킷 팁을 떠난다. </li><li> 미디어 판에서 제거 된 후, 각 샘플에 대한 팁 각을 변경, 중복 미리 라벨링 플레이트에 적절한 우물에 올바른 시료 100 μl를 추가합니다. </li><li> 플라크 분석 접종이 완료되면, 소독 용액으로 장갑을 낀 손을 스프레이 손으로 인큐베이터에 다시 접시를 배치하기 전에 모든 판의 외부를 닦아 소독 용액에 적신 종이 타월을 사용합니다. 레모든 판을 다시 인큐베이터로 될 때까지이 과정을 이탄. </li><li> 1 시간 동안 세포에 걸쳐 매 15 분 샘플의 적절한 분산을 보장하기 위해 8 자형 모션 플레이트 락. </li><li> 락 플레이트 종료 후 플라크 분석의 중첩을 위해 사용되는 배 이글의 최소 필수 배지 혼합물을 1.6 %의 트라가 칸트, 아가보다 조작하기 쉽다 반고체 오버레이와 함께 클래스 II BSC로 플레이트를 반환한다. </li><li> 우물의 표면에 걸쳐 오버레이의 평등 한 분배를위한 8 자형 동작으로 다시 한 번 6 웰 플레이트와 바위에 각 웰에 오버레이 혼합물 2 ㎖를 추가합니다. 잘 사용하는 모든이 오버레이 혼합물로 중첩 될 때까지이 과정을 반복합니다. </li><li> 혈청 학적 피펫의 팁 오버레이 절차를 수행 할 때 교차 오염을 방지하기 위해 우물에 액체를 만지지 않도록하십시오. </li></ol> 4. 폐기물 처리 및 청소 악기 및 바이오 안전성 내각 &lt;올&gt; <li> 완전히 적어도 10 분의 접촉 시간 동안 폐기물 양동이 5 % 소독액 모든 폐기물 잠수함. 피펫 팁, 혈청 학적 피펫, 전술 한 바와 같이 다른 폐기물을 소독. 또한, 상기 용액을 10 분의 접촉 시간 동안 폐기물 통에 접촉을 유지하도록 5 % 살균제 용액 폐기물 버킷 (안과 밖) 스프레이. </li><li> 폐기물에 대한 경과 접촉 시간을 기다리는 동안, 5 % 소독액에 종이 타월을 담가 같은 Micropipette과 같은 악기를 닦아하고, BSC에서 제거. 클래스 II BSC에서 장갑을 낀 손을 가져 전에 5 % 소독액과 장갑을 낀 손을 스프레이. <ol><li> BSC에에서 가능한 Micropipette을 제거한 후, 기기에 스티커 발생을 방지하기 위해 70 % 에탄올 용액으로 별도의 종이 타월로 닦아냅니다. 효율적으로 5 % 살균제로 닦여 수없는 악기를 스프레이하고 10 분 동안 BSC의 용액과 접촉 둡니다. </li></ol></li><li> 충분한 접촉 시간 후, BSC에서 모든 항목을 제거합니다. 싱크에 폐기물을 포함하는 폐기물 통을 포함하여 항목을 가져 가라. 살균제 잔류 물을 제거하기 위해 재사용 할 수있는 항목을 씻어. 자신의 저장 위치에있는 모든 항목을 돌려줍니다. </li><li> 클래스 II BSC의 작업 표면, 캐비닛 측면을 청소하고 다시 유리의 내부, 5 % 소독액과 띠 (1)는 70 %의 에탄올 용액 하였다. </li><li> 당기 및 고압 증기 멸균에 대해 별도의 피펫 트레이에 폐기물 양동이와 장소 표면 소독 혈청 피펫에서 혈청 피펫 드레인 (혈청 학적 피펫이 날카로운 위험을 제시 할 수 있고 쓰레기 봉투를 찢어 수 있습니다. 전에 하드 양면 용기에 이러한 피펫을 배치 고압 증기 멸균). </li><li> 싱크대의 하부에 배치 된 스트레이너에 폐기물 통의 내용을 붓는다. </li><li> straine의 내용을 싱크대에 빨간색 생물 학적 가방 늘어서 생물 학적 폐기물 용기를 가져오고 덤프빨간색 생물 학적 가방에 r에. 스트레이너의 내부에 충실 할 수 마이크로 피펫 팁을 제거하는 여과기에 도달하지 마십시오. 모든 팁이 제거 될 때까지 폐기물 용기의 내부를 따라 스트레이너를 쳐, 또는 여과기에서 팁을 제거하는 핀셋을 사용합니다. </li><li> 싱크대 옆에있는 랙에 건조 폐기물 양동이와 장소를 씻어. </li></ol> 5. 고압 증기 멸균 폐기물 <ol><li> 카트에 오토 클레이브 트레이에서 생물 학적 폐기물 용기 및 장소에서 생물 학적 가방을 제거합니다. </li><li> 트레이에 고정 가방을 유지하기 위해 오토 클레이브 트레이의 측면을 연결, 열린 생물 학적 가방을두고 가방의 외부를 통해 오토 클레이브 테이프의 조각을 놓습니다. </li><li> 혈청 학적 피펫 팁 트레이에 오토 클레이브 테이프의 두 조각을 놓고 자신의 이니셜과 날짜로 레이블을 붙입니다. 오토 클레이브 트레이 카트에 혈청 학적 피펫 트레이를 배치합니다. </li><li> 오토 클레이브를 엽니 다. 제공되는 오토 클레이브로드 / 언로드 캘리포니아를 연결오토 클레이브에 RT 카트에 휴식을 신축 오토 클레이브 플랫폼을 가지고. </li><li> 오토 클레이브에서 금속 막대를 제거하고 상부를 엽니 다. 오토 클레이브 멸균 사이클이 성공적으로 완료되었는지 확인하기 위해 금속 막대에 Geobacillus 스테아로써 모필 러스의 포자를 포함하는 생물학적 지표의 병을 놓습니다. </li><li> 오토 클레이브 트레이의 폐기물 가방의 중심에 금속 막대를 배치하지만, 금속 막대는 여전히 쉽게 접근 할 수 있는지 확인합니다. </li><li> 신축 오토 클레이브 플랫폼으로 폐기물 및 혈청 학적 피펫 트레이 가득 오토 클레이브 트레이를 놓고 다시 오토 클레이브에 밀어 넣습니다. </li><li> 오토 클레이브에서 오토 클레이브 로딩 / 언 로딩 카트를 분리하고 오토 클레이브 문을 닫습니다. </li><li> 오토 클레이브를 시작합니다. </li><li> 사이클이 시작될 때까지 오토 클레이브를 두지 마십시오. 오토 클레이브의 작동 화면이 실행되는 남은 시간을 표시합니다. </li><li> 오토 클레이브의 실행이 완료된 후, 생물학적 IND 삭제icator하고 지정된 인큐베이터에서 가열하여 성장을 평가한다. 성장은 생물학적 지표에 감지되면, 오토 클레이브에서 쓰레기를 재 실행하고, 새롭게 지표를 평가합니다. 성장이 검출되지 않은 경우, 시설에서 쓰레기를 제거한다. </li></ol> 6. 예 : 고정 및 상패 분석 ​​실험의 염색 <ol><li> 통과 (사용 바이러스에 의존한다) 일의 적절한 수의 후 실험실로 다시 돌아가 다시 한번 섹션 1과 2에서 단계를 수행합니다. </li><li> 조심스럽게 단계 3.1.2 완료 인큐베이터에서 플라크 분석 플레이트를 제거하고 손으로 클래스 II BSC에 배치합니다. </li><li> 미디어 및 오버레이 재료 모두를 피펫 및 소독액 용기에 분배 10 % 중성 완충 포르말린 0.8 % 크리스탈 바이올렛 (12, 13)의 혼합물로 대체합니다. 혼합물 플레이트 바이러스를 불 활성화 30 분 동안 플레이트에 남아하자. </li><li> 불 활성화 한 후, 신중하게 중립을 제거별도의 폐기물 용기에 포르말린 / 크리스탈 바이올렛 혼합물 및 장소는 처분 이전에 중화한다. </li><li> 살균제와 장갑을 낀 손 스프레이 전술 한 바와 같이 클래스 II BSC에서 그들을 전달하기 전에 판의 외부를 닦으십시오. </li><li> 여분의 얼룩을 제거하고 건조 카트에 판을 배치 판을 씻어 싱크를 진행합니다. </li><li> 플레이트가 완전히 건조되면 플라크를 계산하기 위해 빛의 상자를 사용합니다. 모든 수를 기록하고 표준 식 (그림 3B)에서 바이러스 역가를 계산합니다. </li></ol> 7. BSL-4 실험실에서 샘플을 제거 <ol><li> BSL -2- 실험실 조건에서 조작 될 모든 샘플을 비활성화한다. 따라 10 % 중성 완충 포르말린 (NBF) 또는 트리 졸 LS (페놀, 구아니딘 이소 티오 시아 네이트, 티오시 안산 암모늄, 아세트산 나트륨, 글리세린) 1,14를 사용 IRF-프레드릭의 내부 바이오 사무실 승인 두 가지 방법 중 하나. 전송 사이전 BSL-4 실험실에서 제거를위한 포장에 BSC의 외부 새로운 깨끗한 튜브 또는 판에 mples. </li><li> 백의 내부와 BSL -4- 실험실 밖으로 전송받은 샘플 튜브의 외부를 살균하기에 충분한 5 % 살균제 또는 정착액 용액을 함유하는 열 밀봉 주머니에서 튜브 또는 플레이트의 열 밀봉 비활성화 샘플. 동일한 절차에 따라 다른 주머니에이 파우치를 놓습니다. </li><li> 제 파우치 밀봉 가열 밀봉 주머니의 외측 소독 적어도 10 분 동안 5 % 소독액 함유 덩크 탱크에 열 밀봉 주머니를 배치했다. </li><li> 불 활성화 방법을 사용, 룸 샘플이 전송되는 위치에, 에이전트가 사용되는 튜브의 수 및 튜브의 크기, 볼륨을 서술하여 실험실 내부의 덩크 탱크 일지를 작성합니다. </li><li> 덩크 탱크에서 파우치를 검색하고 BSL-2 실험실에 샘플을 채취하기 위해 BSL-4 실험실 외부에 동료와 함께 좌표. </li></ol>

<ol>
	<li>Shurtleff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+regulations,+safety+considerations+and+physical+limitations+on+research+progress+at+maximum+biocontainment.">The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment.</a> Viruses. 4, 3932-3951 (2012).</li><li>de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NIAID+Integrated+Research+Facility+at+Fort+Detrick.">The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick.</a> Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).</li><li>Keith, L., Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+imaging+in+BSL-3+and+BSL-4+envrionments:+imaging+pathophysiology+of+highly+pathogenic+infectious+diseases.">Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases.</a> Pharmaco-imaging in drug and biologics development. , (2014).</li><li>Janosko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+Precautions+and+Operating+Procedures+in+an+(A)BSL-4+Laboratory:+1.+Laboratory+Suite+Entry+and+Exit+Procedures.">Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> J Vis Exp. , e52065 (2014).</li><li>Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+for+murine+norovirus.">Plaque assay for murine norovirus.</a> J Vis Exp. , e4297 (2012).</li><li>Alfson, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+to+plaque-forming+unit+ratio+of+Ebola+virus+influences+disease+course+and+survival+in+cynomolgus+macaques.">Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques.</a> J Virol. , (2015).</li><li>Shurtleff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+filovirus+plaque+assay+for+use+in+preclinical+studies.">Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies.</a> Viruses. 4, 3511-3530 (2012).</li><li>Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+inactivation+by+nucleic+acid+extraction+reagents.">Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents.</a> J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

BSL-4 실험실에서 작업은 상당한 시간과 세부 사항에 대한 추가적인주의가 필요합니다. 이 환경에서 작업의 모든 유형이 아니라 철저한 훈련, 그리고 양심적 인 개인이 필요합니다. 분석 실험실 근로자가 훈련을해야하는 몇 가지 주요 개념을 포함로 표준 바이러스 성 플라크 분석은 BSL-4 실험실에서 높은 결과 병원균 작업을위한 일반적인 절차의 정확한 모델을 제공합니다. 첫 번째 주요 개념은 높은 결과 병원균에 대한 기본 봉쇄로 기능 클래스 II BSC,의 적절한 사용 및 안전 관행에의 응용 프로그램입니다. 클래스 II BSC의 기능은 크게 개인에 대한 노출 위험을 제한하는 방법을 지시하는 방법을 이해. 클래스 II의 작업 영역에 걸쳐 오염 된 지역에 깨끗한 지역에서 작업 흐름 ( &quot;깨끗한 측&quot;) ( &quot;더러운 측&quot;)는 BSC는 교차 오염 (11)을 방지하는 데 도움이됩니다. 깨끗하고 오염 물질 및 Suppl에이거 깨끗한 항목을 통해 오염 항목의 이동을 제한하기 위해 분리되어야한다. 두 번째 주요 개념은 물리적 및 생물학적 폐기물 관리입니다. 폐기물의 두 가지 유형의 배치에 적절한 단계는 실험실 전문가가 안전 유지와 환경이 오염되지 않도록에 필수적이다. 실험 기간 동안 단계는 비활성화 및 샘플 BSL-4 실험실에서 가져 전에 병원균을 파괴하도록 설계되었습니다. 이러한 중요한 단계의 예는 다음과 같습니다 각 팁에 살균제를 피펫 팅 소독제, 고압 증기 멸균 쓰레기와 함께 잠재적으로 오염 물질의 적어도 10 분의 접촉 시간을 허용하고, 오토 클레이브 사이클 동안 불임의 유효성을 검사. 이 단계는 높은 결과 병원균의 파괴를 보장하기 위해 중복 될 수 있도록 설계되었습니다.

A correction was made to the authors section in: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices
One of the authors names was corrected from:
Nicole Joselyn
to:
Nicole Josleyn

A correction was made to the authors section in: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

Erratum: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

높은 결과 병원균을 처리하는 실험실 요원의 안전 (더 감염 prophylaxes이나 치료 방법이없는) 가장 중요하기 때문에, 미국 보건 복지부는 생명 의학에서 병원균과 함께 작업의 안전한 행위에 대한 설비 건설을위한 가이드 라인 및 우수 사례를 설립했다 바이오 안전성 관점 1 임상 실험실. 법률 및 규제를 통해, 관행 및 절차의 대부분은 이러한 병원체와 작업에 따라야 필수 요건이되었다. 미국, 쉽게 사람에서 사람 전송되는 병원균에서 높은 경우 - 사망률 결과 및 / 또는 주요 공중 보건에 미치는 영향과 생물 테러의 가능성을 가지고, 알레르기 및 감염성의 건강 / 국립 연구소의 국립 연구소로 분류됩니다 질병 (NIH / NIAID) 우선 순위 병원균과 또는 질병 통제 및 예방 (CDC) 바이오 테러의 범주에 대한 센터 에이전트 2. 또한, H이 병원균은 잠재적 생화학 테러 요원 대량 사상자 또는 경제, 중요 인프라, 또는 공신력 3에 파괴적인 영향 가능성이있는 경우 IGH-결과 병원균은 1 단계 선택 에이전트로 분류됩니다. BSL-4의 실험실과 연구소에 대한 액세스를 포함 BSL-4 작업은, 더 높은 BSL-2 / 3 작업보다 제어된다. 예를 들어, 인해 상당한 정장 트레이닝 요구 광범위한 멘토 요구 사항 및 추가적인 의료 바이오 필수로 BSL-2 또는 BSL -3- 실험실 비교 BSL -4- 실험실에 액세스 실질적으로 더 어렵다. 또한, BSL-2 또는 BSL -3- 설비 4-6 대 BSL -4- 시설의 물리적 보안 장벽은 일반적으로 존재한다. BSL-4 출입 절차에 우리의 첫 번째 문서에 설명 된 바와 같이, 실험실 직원은 BSL-4 실험실 (7)에 입학 자격 광범위한 교육 및 심리 검사를 받아야. WBSL-4 실험실 ithin, 감염과 실수의 위험은 피할 수 또는 설립 절차에 따라 완화. 연구는 최소한의 멀티 태스킹 또는 산만, 신중하고 신중하게 진행해야합니다. 긍정적 인 압력 정장 절곡하는 것은 어렵고, 얼굴 방패는 현미경과 같은 절차를 제한 할 수 있습니다. 부피가 큰 장갑 등의 소품을 취급 또는 튜브 라벨 등의 미세 운동 작업의 성능을 방해. BSL-4 실험실에서 소요되는 시간을 최소화하기 위해, 실험실 전문가는 작업 (들)의 완성을위한 BSL-4 실험실에 이러한 물질을 BSL-2 실험실에서 앞서 수행 할 수있는 단계를 식별하고 수송하는 작업 절차를 검토해야합니다. BSL-2 실험실에서 추가 처리를 위해 물질을 제거 할 때, 재료는 고정 및 밀폐 된 차 컨테이너에서 BSL-4 실험실에서 제거됩니다. 제거해야 할 샘플의 예로는 효소 결합 immunosorbe 분석한다 고정판 또는 감염 물질의 튜브NT 분석법 (ELISA), 면역 형광 분석법 (IFA) 또는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR). BSL-2 실험실에서에 비해 BSL-4의 실험실에 필요한 개인 보호 장비에 의해 부과 된 더 큰 물리적 한계뿐만 아니라, 세포 배양 접시와 폐기물 처리에 높은 결과 병원균의 불 활성화에 대한 절차는 적은 병원성 바이러스에 필요한 것보다 엄격한 BSL-2 실험실에서 공부했다. 최소한, 이들 방법은 CDC 요건을 충족해야한다. 예를 들어, 오염 된 세포 배양 플레이트 및 다른 재료는 중성 완충 포르말린과 같은 화학적 시약으로 불 활성화 될 수있다. 처리 된 세포 배양 플레이트 또는 튜브는 액체 살균제를 가득 덩크 탱크로 실험실에서 포르말린을 함유하는 열 밀봉 주머니에 넣고, 제거되어야한다. 폐기물 버킷 살균제 솔루션 가득 소독제 일시적으로 실험 기간 동안 및 소독에 대해 생성 된 폐기물을 수신에 사용되는 스프레이장갑을 nfecting 각각 바이오 안전성 캐비닛 표면 및 악기 청소. 나열된 농도 차 암모늄 살균제 솔루션은 모든 미국 BSL-4 실험실 (바 J, 개인 통신, 2015)의 황금 표준으로 간주됩니다. 폐기물 통에서 고체 폐기물은 오염 가능성을 제거하기 위해 멸균한다. 하기 위해 시각적 작업 흐름 및 일반적인 BSL -4- 절차 한계를 보여, 우리는 일반적으로 사용되는 바이러스 절차의 예로서, 표준 바이러스의 플라크 분석을 사용 하였다. 바이러스 분석 절차는 일반적으로 설명되지만,이 프로토콜에서 실험 인원의 안전을 보장하기 위해 사용되는 바이오 절차를 강조한다. 플라크 분석 기법 8,9에 대한 자세한 배경에 대한 이전의 고전 상패 분석 시각화를 참조하십시오. 여기에 제시된 절차는 CDC (1)에 의해 설명 된 BMBL 사양을 따릅니다. 그러나, 제시된 프로토콜은IRF-프레드릭 특정. 각 BSL-4 시설은 BSL-4 실험실에서 실험의 실행에 영향을 미칠 다른 표준 운영 절차 (SOP를) 및 운영 방법이 있습니다. 폐기물 관리 및 상패 분석의 실행을위한 대체 절차는이 연구소의 관리 및 운영에 따라 다를 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, BSL-4 정장 실험실 및 BSL-4 환경 내에서 클래스 II 캐비닛 작업을 수행하기위한 절차의 설정에 대한 일반적인 이해는 고위험 병원체의 연구를 고민 할 때 과학자들은 제약 및 안전에 미치는 영향을 이해하는 데 도움이됩니다. BSL-4 실험실에서 직장을 둘러싼 어려움의 외부 협력자의 증가 인식이 조정 된 기대와 연구 지역 사회에 의료 대책 개발에 더 쉽게 발생할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="797">
	<colgroup>
		<col span="2" />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Micro-Chem Plus</td>
			<td style="width:239px;">National Chemical Laboratories</td>
			<td style="width:129px;">255</td>
			<td style="width:192px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-ml 96-Deep Well Plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>278743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10-ml Serological Pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25-ml Serological Pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Crystal Violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-050-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tragacanth</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-702-2000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20-&#956;l Pipette Tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-402-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-&#956;l Pipette Tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-402-561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1000-&#956;l Pipette Tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-402-581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-604Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2X EMEM</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>115-073-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipettor</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1000-&#956;l Pipette&#160;</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>&#160;L-1000XLS+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-&#956;l Pipette&#160;</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>&#160;L-200XLS+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-Well, Multichannel 200-&#956;l Pipettor</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L12-200XLS+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-Well, Multichannel 1000-&#956;l Pipettor</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>LA8-1200XLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Attest</td>
			<td>Express Medical Supplies&#160;</td>
			<td>MMM12192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autoclave</td>
			<td>Getinge</td>
			<td>GEB 2404 AMB-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autoclave Bag</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-828E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2000-ml Beaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-591-10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autoclave Tray</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-359-20B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette Tray</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-361-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37&#176;C Incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>WU-39321-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biohazard Can</td>
			<td>Rubbermaid Commercial</td>
			<td>FG614500 RED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autoclave Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autoclave Rod</td>
			<td>Made by IRF Facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light Box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S11552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat Sealer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9793612&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat Seal Pouches</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-812-25H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biohazard Bag</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-828E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

safety precautions and operating procedures in an (a)bsl-4 laboratory: 2. general practices

바이오 안전성 레벨 4 (BSL-4) 봉쇄 실험실에서 작업 시간과 세부 사항에 큰 관심을 필요로한다. 비 고 결과 병원균과 BSL-2 실험실에서 수행하는 것과 동일한 작업은 BSL-4 환경에서 상당히 오래 걸릴 수 있습니다. 이 증가 된 시간 요구 사항으로 인해 실험실 획득 감염, 잠재적 오염의 작업 환경과 높은 결과 병원균이 가능합니다 릴리즈에서 지역 사회에서 연구원을 보호하기위한 것이다 요인의 군중이다. 실험실 내부, 운동은 필수 전신 안전 정장에 ​​부착 된 공기 호스로 인해 제한됩니다. 또한, 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛 (BSC들)에서 제거 된 모든 항목의 소독이 필요합니다. 실험실 전문가는 BSL-4 실험실의 관행에서 훈련을해야하고 그들이 수행하는 능력에서 높은 능력을 보여 주어야한다. 이 기사의 초점은 적절한 절차 및 실험실 (B)을 보장하는 기술을 간략하게 설명하는 것입니다예제 절차와 표준 바이러스 플라크 분석법을 이용하여 iosafety 실험의 정확성. 실험을 수행하는 것은 시각적으로 강조 할 때 특히 적절한 기술은 BSL-4 환경에서 안전하게 작업 할 수 있습니다. 이러한 기술은 다음과 같습니다 실험, 적절한 작업을 완료 클래스 II BSC의 청소, 폐기물 관리 및 BSL-4 실험실 내부에서 발생하는 폐기물의 안전한 폐기 및 BSL- 내부에서 불 활성화 된 샘플의 제거를위한 클래스 II BSC를 설정 BSL-2 실험실 4 실험실.

BSL-4 실험실 내에서 적절한 절차에 따라이 분석의 안전하고 효과적인 완성을 보장하기위한 중요합니다. 완성 된 매일의 내부 체크리스트 (그림 1)을 참조하여, 실험실 직원은 장비가 완전히 작동 확인합니다. BSC에 중앙의 적절한 몸체 위치가 실험 최적의 공기 유동 상태 (도 2)에서 수행되는 것을 보장한다. 바이러스 샘플을 직렬로 플레이트 당 30-300 플라크 (도 3A) 및 바이러스 역가 (도 3b)을 결정하기 위해이 판을 얻기 위해 희석한다. 다수의 인자 숙주 세포주에 대한 친 화성 바이러스 접종 기법 바이러스 성장, 적절한 희석 범위 및 오버레이의 선택 조건을 포함 8 플라크의 형성에 영향을 미칠. 절차 동안 BSC에서 발생하는 폐기물을 제대로하기 전에 고온 가압 멸균에 의해 이전에 BSC 다시에서 제거에 소독BSL-4 환경을 떠나지. 이러한 절차에 따라, 더 실험실 획득 감염은 IRF-프레드릭에서 BSL-4 연구 기간 동안 기록되지 않았다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53600/53600fig1.jpg" /> 그림 1 :. 샘플 매일 내부 시스템 점검이 체크리스트의 일일 완료 실험실 직원 전에 일을 시작으로 실험실 (가장 중요한 BSC) 내에서 장비를 점검 것을 보장합니다. 기지국 제어기가 보정 범위를 벗어난 것으로 확인되면,이 BSC는 사용되지 않아야하고, 유지 보수가 통지되어야한다. 모든 BSC들 제대로 조정 및 작동.해야 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53600/53600fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53600/53600fig2.jpg" /> 그림<html> 2 :. 노란색 소독액 및 사용 피펫을 포함하는 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛에 실험실 전문 피펫 샘플의 뒤로 및 사이드 뷰 (A) 폐기물 통은 웰 플레이트 (B)의 오른쪽에, 그리고 소독 스프레이 병이다 폐기물 통 (A)의 오른쪽. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53600/53600fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53600/53600fig3.jpg" /> 그림 3 : 샘플의 바이러스 역가의 계산 바이러스 역가가 ㎖의 당 플라크 형성 단위 (PFU)로 표현된다.. 바이러스 역가를 계산하기 위해, 희석 팩터 (d) 희석 된 바이러스의 양이 웰 (V)에 추가 시간의 곱에 의해 명확하게 정의 된 플라크 (PFU) 및 분할의 개수를 카운트.D / 53600 / 53600fig3large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Watch this Scientific Journal Video about Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 2. General Practices at JoVE.com

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 2. General Practices

Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.

(A)의 안전주의 사항 및 운영 절차 BSL-4 실험실 2. 일반 사례

Work in a biosafety level 4 (BSL-4) containment laboratory requires time and great attention to detail. The same work that is done in a BSL-2 laboratory ...

safety-precautions-operating-procedures-an-bsl-4-laboratory-2-general

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

17.8K 조회수.  National Institutes of Health (NIH). Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.

비디오: Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 2. General Practices

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

연구

면역학 및 감염병학

Comprehensive &amp; Cost Effective Laboratory Monitoring of HIV/AIDS: an African Role Model

We present the video about assisting anti-retroviral therapy (ART) by an apt laboratory service - representing a South-African role model for economical large scale diagnostic testing. In the low-income countries inexpensive ART has transformed the prospects for the survival of HIV seropositive patients but there are doubts whether there is a need for the laboratory monitoring of ART and at what costs - in situations when the overall quality of pathology services can still be very low. The appropriate answer is to establish economically sound services with better coordination and stricter internal quality assessment than seen in western countries. This video, photographed at location in the National Health Laboratory Services (NHLS-SA) at the Witwatersrand University, Johannesburg, South Africa, provides such a coordinated scheme expanding the original 2-color CD4-CD45 PanLeucoGating strategy (PLG). Thus the six modules of the video presentation reveal the simplicity of a 4-color flow cytometric assay to combine haematological, immunological and virology-related tests in a single tube. These video modules are: (i) the set-up of instruments; (ii) sample preparations; (iii) testing absolute counts and monitoring quality for each sample by bead-count-rate; (iv) the heamatological CD45 test for white cell counts and differentials; (v) the CD4 counts, and (vi) the activation of CD8+ T cells measured by CD38 display, a viral load related parameter. The potential cost-savings are remarkable. This arrangement is a prime example for the feasibility of performing &gt; 800-1000 tests per day with a stricter quality control than that applied in western laboratories, and also with a transfer of technology to other laboratories within a NHLS-SA network. Expert advisors, laboratory managers and policy makers who carry the duty of making decisions about introducing modern medical technology are frequently not in a position to see the latest technical details as carried out in the large regional laboratories with huge burdens of workload. Hence this video shows details of these new developments.

Comprehensive & Cost Effective Laboratory Monitoring of HIV/AIDS: an African Role Model

Anti-retroviral therapy to treat HIV/AIDS is monitored in South Africa on a large scale. Flow cytometry is combined for haematology (CD45), immunology (CD4) and viral-load linked CD38 assay. Recorded at NHLS-SA laboratories, Johannesburg, these modern methods are cost-efficient with heightened local internal quality control, serving as role-models for resource-limited diagnostics.

HIV / AIDS의 종합 및 비용 효과적인 실험실 감시 : 아프리카 역할 모델

We present the video about assisting anti-retroviral therapy (ART) by an apt laboratory service - representing a South-African role model for economical ...

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. Infective eggs are given by oral gavage, hatch in the distal small intestine, invade the intestinal epithelial cells (IECs) 
that line the crypts of the cecum and proximal colon and upon maturation the worms release eggs into the environment1. This model is a powerful tool to 
examine factors that control CD4+ T helper (Th) cell activation as well as changes in the intestinal epithelium. The immune response that occurs in 
resistant inbred strains, such as C57BL/6 and BALB/c, is characterized by Th2 polarized cytokines (IL-4, IL-5 and IL-13) and expulsion of worms while Th1-associated 
cytokines (IL-12, IL-18, IFN-&gamma;) promote chronic infections in genetically susceptible AKR/J mice2-6. Th2 cytokines promote physiological changes in 
the intestinal microenvironment including rapid turnover of IECs, goblet cell differentiation, recruitment and changes in epithelial permeability and smooth muscle 
contraction, all of which have been implicated in worm expulsion7-15. Here we detail a protocol for propagating Trichuris muris eggs which can 
be used in subsequent experiments. We also provide a sample experimental harvest with suggestions for post-infection analysis. Overall, this protocol will provide 
researchers with the basic tools to perform a Trichuris muris mouse infection model which can be used to address questions pertaining to Th proclivity in 
the gastrointestinal tract as well as immune effector functions of IECs.

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris infection is an intestinal model of Th2 immunity where resistant mice generate a protective Th2 response and susceptible mice generate a pathological Th1 response.

Trichuris muris 감염 : 굿에서 2 형 내성 및 염증의 모델

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

총 단백질 추출 및 2-D 겔 전기 영동 방법에 대한<em&gt; Burkholderia의</em&gt; 종

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor treatment options exist. The hallmarks of these laboratories are: custom-designed airtight doors, dedicated supply and exhaust airflow systems, a negative-pressure environment, and mandatory use of positive-pressure (&#8220;space&#8221;) suits. The risk for laboratory specialists working with highly pathogenic agents is minimized through rigorous training and adherence to stringent safety protocols and standard operating procedures. Researchers perform the majority of their work in BSL-2 laboratories and switch to BSL-4 suit laboratories when work with a high-consequence pathogen is required. Collaborators and scientists considering BSL-4 projects should be aware of the challenges associated with BSL-4 research both in terms of experimental technical limitations in BSL-4 laboratory space and the increased duration of such experiments. Tasks such as entering and exiting the BSL-4 suit laboratories are considerably more complex and time-consuming compared to BSL-2 and BSL-3 laboratories. The focus of this particular article is to address basic biosafety concerns and describe the entrance and exit procedures for the BSL-4 laboratory at the NIH/NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Such procedures include checking external systems that support the BSL-4 laboratory, and inspecting and donning positive-pressure suits, entering the laboratory, moving through air pressure-resistant doors, and connecting to air-supply hoses. We will also discuss moving within and exiting the BSL-4 suit laboratories, including using the chemical shower and removing and storing positive-pressure suits.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Although researchers are generally knowledgeable about procedures and safety precautions required for biosafety level 1 or 2 (BSL-1/2) experiments, they may not be familiar with experimental procedures in BSL-4 suit laboratories. This article provides a detailed visual demonstration of BSL-4 suit laboratory systems check, laboratory entry, movement, and exit procedures.

(A)의 안전주의 사항 및 운영 절차 BSL-4 실험실 : 1. 바이오 안전성 레벨 4 정장 연구소 스위트 출입국 절차

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

<em&gt; 체외</em&gt; HIV 공동 감염의 맥락에서 말라리아에 면역 반응을 측정하기위한 모델

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 4. Medical Imaging Procedures

Medical imaging using animal models for human diseases has been utilized for decades; however, until recently, medical imaging of diseases induced by high-consequence pathogens has not been possible. In 2014, the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Integrated Research Facility at Fort Detrick opened an Animal Biosafety Level 4 (ABSL-4) facility to assess the clinical course and pathology of infectious diseases in experimentally infected animals. Multiple imaging modalities including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging, positron emission tomography, and single photon emission computed tomography are available to researchers for these evaluations. The focus of this article is to describe the workflow for safely obtaining a CT image of a live guinea pig in an ABSL-4 facility. These procedures include animal handling, anesthesia, and preparing and monitoring the animal until recovery from sedation. We will also discuss preparing the imaging equipment, performing quality checks, communication methods from "hot side" (containing pathogens) to "cold side," and moving the animal from the holding room to the imaging suite.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 4. Medical Imaging Procedures

Here, we present an overview of the preparation and animal handling procedures required to safely perform medical imaging in an animal biosafety level 4 laboratory. Computed tomography of a mock-infected guinea pig illustrates these procedures that may be used to evaluate the disease caused by a high consequence pathogen.

(A)의 안전주의 사항 및 운영 절차 BSL-4 실험실 4. 의료 영상 절차

Medical imaging using animal models for human diseases has been utilized for decades; however, until recently, medical imaging of diseases induced by ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 3. Aerobiology

Aerosol or inhalational studies of high-consequence pathogens have recently been increasing in number due to the perceived threat of intentional aerosol releases or unexpected natural aerosol transmission. Specific laboratories designed to perform these experiments require tremendous engineering controls to provide a safe and secure working environment and constant systems maintenance to sustain functionality. Class III biosafety cabinets, also referred to as gloveboxes, are gas-tight enclosures with non-opening windows. These cabinets are maintained under negative pressure by double high-efficiency-particulate-air (HEPA)-filtered exhaust systems and are the ideal primary containment for housing aerosolization equipment. A well planned workflow between staff members within high containment from, for instance, an animal biosafety level-4 (ABSL-4) suit laboratory to the ABSL-4 cabinet laboratory is a crucial component for successful experimentation. For smooth study execution, establishing a communication network, moving equipment and subjects, and setting up and placing equipment, requires staff members to meticulously plan procedures prior to study initiation. Here, we provide an overview and a visual representation of how aerobiology research is conducted at the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases Integrated Research Facility at Fort Detrick, Maryland, USA, within an ABSL-4 environment.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 3. Aerobiology

As high-consequence pathogens can potentially infect subjects through airborne particles, aerobiology has been increasingly applied in pathogenesis research and medical countermeasure development. We present a detailed visual demonstration of aerobiology procedures during an aerosol challenge in nonhuman primates in an animal biosafety level 4 maximum containment environment.

(A)의 안전주의 사항 및 운영 절차 BSL-4 실험실 3. 공중 생물학

Aerosol or inhalational studies of high-consequence pathogens have recently been increasing in number due to the perceived threat of intentional aerosol ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축<em&gt; 녹농균</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...