Name: a human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs
Uploaded: 2017-07-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
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Lee Niswander 박사와 Rada Massarwa 박사에게 기술 전문 지식과 여기에 설명 된 슬라이스 문화 공 촛점 이미징 프로토콜에 대한 공헌에 감사드립니다. 뇌 종양 조직 슬라이싱 및 배양 변수 최적화에 관한 전문 지식을 제공 한 Kalen Dionne 박사에게 감사드립니다.

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인간의 암 조직에서 유래 한 organotypic slice culture는 전임상 번역 실험을위한 매력적이고 활용도가 낮은 플랫폼을 제공합니다. 토종 미세 환경에서 이동, 증식 및 세포 사멸과 관련하여 종양 세포의 인구 수준 행동을 이해하는 것은 부족합니다. 비판적으로, 세포 행동의 수준에서 역동적이고 시간 - 해결 방식으로 치료에 종양 반응을 연구 치료 저항의 새로운 메커니즘에 빛을 발산 수 있습니다. 인간의 종양 슬라이스 배양은 인간의 질병 과정과 현재의 생체 내 및 생체 내 모델링 기술 간의 연결 고리를 제공합니다 19 . 최근 EGFR 증폭 16 시그널링에 관련된 세포 이동 동작 최초로 측정 간 종양 변화를보고, GBM 이동을 연구하는 방법으로서, 여기에 기재된 기술을 검증. 이 연구는 또한 슬라이스 배양 모델을 사용하여 파티를 테스트했습니다GBM 16에 대한 잠재적 인 항 침입 치료제로서의 EGFR 억제제 gefitinib의 고유 특이 적 효과. 조직 절단, 레트로 바이러스 감염, 이미징 및 이미지 분석 패러다임의 일반적인 함정 중 일부는 위에 논의되었습니다. 그러나 레트로 바이러스 감염 프로토콜은 더 많은주의를 기울여야합니다. 환자 대 환자의 변화를 고려할 때, 각 슬라이스 내에서 바이러스로 표지 된 종양 세포의 밀도를 적정하는 것은 어려울 수 있습니다. 불충분 한 세포 수가 바이러스 구조물에 의해 분류된다면 레트로 바이러스 상등액의 5-10 μL 분량을 표지 된 종양 세포가 원하는 농도가 될 때까지 매일 각 표면의 표면에 추가하십시오. 기본 슬라이스 배양에서, 복제 세포의 퍼센트는 일반적으로 형질 전환 된 세포주에서보다 낮으며, 따라서 임의 시점에서 레트로 바이러스 결합에 허용되는 세포의 서브 세트를 제한한다. 또는 너무 많은 셀에 라벨이 지정되어 있으면세포 이동 경로의 경계를 촉구하고, 뉴론 배지로 바이러스 상층 액을 희석하여보다 낮은 유효 역가를 달성한다. 종양 관련 미세 아교 세포는 레트로 바이러스를 발현하는 형광 단백질을 모든 표지화 된 세포의 약 1 %의 빈도로 통합시켰다. 우리는 post-imaging 데이터 분석을 위해 microglia binding lectin을 사용하여 별도의 분석을 위해 시각적으로 이들 세포를 분리 할 수있었습니다 ( 그림 5 ). 영양 전달, 세포 - 세포 상호 작용 및 세포 외 기질을 포함한 종양의 미세 환경은 모두 GBM 20 의 병인에 중요한 역할을합니다. 직접적인 인간 GBM 슬라이스 배양은 작은 동물 모델 또는 전파 된 세포 배양 내에서의 passaging의 필요성을 없애 주며 동시에 인간의 종양 미세 환경을보다 자세히 보여줍니다. 또한, 슬라이스 배양은 세포 - 세포 및 세포 -ECM 상호 작용을 유지하면서 샘플을 가로 질러 영양분에 대한 통일 된 접근을 제공합니다. var를 줄임으로써종양 내에서 발생하는 것으로 알려진 영양소에 대한 세포 내 접종에서, 우리는 종양 수준에서 종양 세포 행동 ( 즉, 이동) 사이의 본질적인 차이에 대해 배양 된 관찰 된 차이점을 밝힐 것을 제안한다. 그러나 인간의 종양에서 생성 된 슬라이스 문화를 통해 수집 된 데이터를 해석하는 것은 고유의 종간 및 종양 이형성으로 인해 복잡합니다. 비판적으로, 인간 종양 슬라이스 배양의 생체 내 유지 관리 중에 발생할 수있는 유전 적 및 후 발생 적 교대를 특성화하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. Phase I / II 임상 시험과 병행하여 인간 종양 슬라이스 배양을 사용하는 것은 슬라이스 매개 변수와 환자 임상 결과를 연관시키는 유망한 전략입니다. 슬라이스 배양이 종양 치료를 개인화하기 위해 사용될 수 있기 전에 이러한 잠재적 예측 / 예후 인자의 검증이 필요합니다. 다른 사람들의 연구뿐만 아니라 우리의 연구는 바이오 마커 검증의 타당성을 입증한다 &lt;GBM 9 , 16의 슬라이스 배양에서 치료제의 신속한 생체 외 시험을 수행 할 수 있습니다. 폐 22 , 결장 22 , 머리와 목 23 , 유방 24 및 전립선 암 25 조직을 사용하는 유사한 인간 슬라이스 배양 기술은이 접근법이 인간 암에서 일반화 될 수 있음을 제시합니다.

glioblastoma (GBM)에 대한 실험실 연구는 종양 세포의 이동과 침입과 같은 인간 질병의 필수 병리학 적 특징을 충실히 재구성하는 모델의 부족으로 인해 방해 받고 있습니다. 2 차원 및 3 차원 체외 침윤 분석 및 3D 설치류 슬라이스 배양 모델의 비교 연구는이 두 상황에서 기계적으로 다른 세포 이동 프로그램을 발견하여 2D 시스템에서 인간 질병 1 , 2 , 3으로 의 결과의 번역 가능성을 잠재적으로 제한합니다. 여기에 설명 organotypic 종양 슬라이스 문화 및 이미지 패러다임은 수술 절제에서 얻은 전직 인간의 종양 조직의 조각 내에서 종양 세포 마이 그 레이션의 연구 수 있습니다. 따라서, 시간 경과 공 촛점 현미경과 함께 외과 절제 종양 조직의 슬라이스 문화는 기본에서 종양 세포 이동을 연구하는 플랫폼을 제공합니다조직 용해 또는 배양 passaging없이 microenvironment. 인간 종양 이종 이식, 레트로 바이러스 유발 종양 및 세포 오버레이에서 생성 된 GBM의 설치류 뇌 절편 배양 모델을 사용하여 종양 침습 1 , 2 , 3 , 4 , 5 를 연구하는 광범위한 문헌이있다. 최근에 여러 그룹이 인간 GBM 조직 6 , 7 , 8 , 9 , 10 에서 직접 organotypic 슬라이스 문화의 세대를 설명했다. 그러나, 기술 및 배양 배지를 슬라이싱하는 것과 관련하여 공개 된 프로토콜 간에는 현저한 차이가있다. 더 나아가, organotypic 슬라이스 문화의 사용은 세포 signali의 변화를 포함 정적 실험 종점에 초점을 맞추고있다신장, 증식 및 사망을 초래할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 시간 경과 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경을 통해 동적 종양 세포 행동의 시간 분해 관찰을 통합하여 이전의 슬라이스 문화 패러다임을 확대합니다. 인간 GBM에서의 inter 11 및 intratumoral 12 , 13 유전 변이의 최근 발견은 종양 세포 거동과이 이질성을 연결시키는 중요성과 치료에 대한 종양 반응에 미치는 영향을 강조한다. 여기에 우리는 거의 실시간으로 종양 세포 이동을 시각화하기 위해 인간 암 조직에서 직접 슬라이스 문화의 사용에 대한 간소하고 재현 가능한 프로토콜을보고합니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM High Glucose&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium, minus phenol red</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>12349-015</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), serum free</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin Suspension</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638-20ML</td><td>10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture</td></tr><tr><td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>16520-050</td><td>Melts at 65.5 &amp;#176;C, Remains fluid at 37 &amp;#176;C, and sets rapidly below 25 &amp;#176;C.</td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4 from &lt;em&gt;Griffonia simplicifolia&lt;/em&gt;, Alexa Fluor 647 Conjugate</td><td>Thermo Fisher (Molecular Probes)</td><td>I32450</td><td>Used in media to label Microglia/Macrophages</td></tr><tr><td>pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector</td><td>Clonetech</td><td>632520</td><td></td></tr><tr><td>Retro-X Concentrator&amp;nbsp;</td><td>Clonetech</td><td>31455</td><td>Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants</td></tr><tr><td>pVSG-G Vector</td><td>Clonetech</td><td>631530</td><td>part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System</td></tr><tr><td>GP2-293 Viral packaging cells</td><td>Clonetech</td><td>631530</td><td>part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate Glue (Super Glue)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z105899</td><td>Medium-viscosity</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way Embedding Mold (Square - S22)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18646A-1</td><td>Molds for tumor sample embedding</td></tr><tr><td>Stainless Steel Micro Spatulas</td><td>Fisher Scientific</td><td>S50823</td><td>Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade</td></tr><tr><td>Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>Single Edge Razor Blade (American Safety Razors)</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-989-001</td><td>Blade edge is 0.009&quot; thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome.</td></tr><tr><td>Leica VT1000 S Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophilic PTFE cell culture insert&amp;nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>35 mm Glass Bottom Dishes&amp;nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C Sleeve</td><td>20 mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 mm</td></tr><tr><td>LSM 510 Confocal Micoscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45)</td></tr><tr><td>PECON Stagetop Incubator</td><td>PeCON Germany</td><td>(Discontinued)</td><td>Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes.</td></tr></tbody></table>

a human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs

Glioblastoma (GBM)는 수술, 화학 요법 및 방사선 요법에도 불구하고 극도로 열악한 임상 예후를 계속 수행합니다. 주변 뇌 실질로 진행성 종양 침입은 지속적인 치료 도전을 나타냅니다. GBM에 대한 안티 - 마이 그 레이션 요법을 개발하기 위해서는 통제 된 실험을 위해 생리적으로 관련된 배경을 제공하는 모델 시스템이 필수적입니다. 여기, 우리는 수술 절제술 동안 얻은 인간의 GBM 조직에서 조각 문화를 생성하기위한 프로토콜을 제시한다. 이러한 배양 물은 동물 이종 이식 물 또는 단일 세포 배양 물을 통과하지 않고 생체 외 실험을 허용한다. 또한, 종양 세포의 이동성 및 치료제에 대한 관련 반응을 정량적으로 연구하기 위해 세포 추적과 함께 시간 경과 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하는 방법을 설명합니다. 절편은 수술 조직 획득 90 분 이내에 재현 가능하게 생성됩니다. Retrovirally 중재 형광 세포 라beling, 공 촛점 이미징 및 종양 세포 이동 분석은 문화의 2 주 이내에 완료됩니다. 우리는 인간 GBM에서 증가 된 철새 행동과 관련된 유전 적 요인을 밝히기 위해 이러한 조각 문화를 성공적으로 사용했습니다. 또한, 우리는 안티 - 마이 그 레이션 요법에 대한 응답으로 환자 - 특정 변형을 감지하는 모델의 능력을 검증했다. 앞으로 인간 GBM 슬라이스 문화는 개인화 된 신경 종양 치료법을 발전시키기 위해 치료제에 대한 종양 감수성을 빠른 생체 내 평가를위한 매력적인 플랫폼입니다.

<html> 우리 그룹은 초기 GBM 절제술을받은 50 명 이상의 환자로부터 슬라이스 문화를 성공적으로 생성했습니다. 이 슬라이스 생성, 배양, 레트로 바이러스 라벨링, 이미징 및 마이그레이션 분석 프로토콜은 재현 가능한 워크 플로우로 간소화되었습니다 ( 그림 1 ). 비판적으로,이 organotypic GBM 조각 문화 ( 그림 2 ) 최대 15 일 pathologic의 각인 및 microglia의 유지 관리를 포함한 문화를 통해 원래 종양 조직과 일치를 보여줍니다. 또한, 우리는 미세 환경 변화에 대한 종양 반응의 기능적 분석을 수행하기 위해이 시스템을 활용 해 왔습니다. 생리적 무결성 측정으로, 우리는, GBM 슬라이스 배양 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 생체 내 (17)에 넘치게 GBM 미세 환경 내에서 일어나는 프로세스의 생성을 측정함으로써 저산소증 (1 % O 2)에 응답하는 방법을 검토&quot;&gt; 우리는 저산소 상태에서 슬라이스 배양 물을 배치함으로써 급속한 생리적 반응을 일으키고 배지로 VEGF가 방출되도록 유도한다는 것을 입증했다 ( 그림 3 ). 종양 세포 이동의 정성 및 양적 측면을 평가하기 위해 우리는 시간 경과 영상을 이용하여 자세한 이동지도를 생성했습니다. 이지도는 종양 소규모 영역 (1mm 2 )의 범위 내에서 추적 된 모든 GBM 세포를 구분하여 종양 개체의 동적 인 이동 행동을 정적으로 시각화합니다. 이동 속도와 방향성 (세포 이동 / 총 이동 거리)의 정량적 측정을 각 세포에 대해 계산하여 종양 부위, 종양 샘플 및 치료 반응에 따른 이동 매개 변수의 변화를 조사했습니다 ( 그림 4 ). 세포 라벨링 및 이미징 프로토콜 des여기에 기술 된 것은 또한 원주 종양 미세 환경을 통한 이동 중에 세포 형태학의 변화를 평가하기에 충분한 공간적 및 시간적 해상도를 제공한다. 우리는 형태 학적으로 뚜렷한 운동성 종양 세포와 소구류의 존재가 슬라이스 배양 내에서 혼합되어 있음을 관찰했다 ( 그림 5A ). 종양 세포의 움직임은 정체 된 세포에서 필로 포디아 (filopodia)를 반복적으로 돌출 시키거나 후퇴시키는 &quot;탐색 및 파열 (burst and burst)&quot;과정에 의해 특징 지어졌고, 짧은 시간에 효율적인 운동이 이루어졌다. 약 10 분마다 이미징 슬라이스 영역은 또한 세포 분열을 겪고있는 종양 세포의 시간 경과 이미지를 기록하기위한 적절한 시간 해상도를 제공했습니다. 이 분열하는 세포는 이동에서 일시 정지하고 유사 분열을 완료하고 딸 세포는 3 시간 내에 모두 마이그레이션을 재개했습니다 ( 그림 5D ). 대조적으로, 미세 아교 세포는 인접한 종양 세포보다 낮은 방향성으로 더 높고보다 일정한 속도로 이동하며,상대적으로 비효율적 인 이주를 보여줍니다 ( 그림 5C, 5E-G ). 이러한 관찰은 치료에 대한 환자 또는 세포 특이 적 반응의 기본이되는 생물학에 대한 통찰력을 얻는 데 중요 할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 종양 세포 (16)의 증강 철새 잠재력을 가진 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 유전자 증폭의 상관 관계를 포함하여 인구 수준에서 세포 이동의 매개 변수 입증 환자에 대한 환자 변동성이 프로토콜을 사용했다. 또한, 종양 조각의 시간 경과 현미경 이전과 반 침습적 약물, 피티 닙 치료 후, EGFR 증폭 종양 조각 (16)에 특이 마이그레이션에 상당한 감소를 보여 주었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53557/53557fig1.jpg" /> 그림 1 : </strong&gt; 인간 GBM Organotypic Slice Culture 감염, 영상 및 세포 이동 분석 워크 플로우. 종양 조직은 수술 중 항행 장비 를 통해 특정 지역에 국한됩니다. 1 주일 후 슬라이스, ZsGreen 표현 레트로 바이러스는 mitotically 활성 종양 세포를 레이블 슬라이스 문화에 추가됩니다. 감염 3 일 후, 공 촛점 이미징을위한 조각이 준비되었습니다. 3D 이미징 데이터는 세포 이동 경로 추적, 종양 세포 이동 맵 생성 및 종양 세포 이동 매개 변수 계산을 위해 2D 이미지로 후 처리됩니다. 이 숫자의 일부는 원래 Parker et al , 2013 16에 게시되었으며 Oxford University Press의 허가를 받아 복제되었습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53557/53557fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 2. 인간 GBM Organotypic 슬라이스는 전 생체 내 문화를 통해 조직 학적 특징을 유지 합니다. ( A ) T1 조영 향상된 MRI 시퀀스는 조직 획득 (화살표)의 지역을 지역화하고 문서화하는 데 사용되었습니다. ( B ) A.에서 강조 표시된 지역에서 얻은 조직에서 생성 된 슬라이스 문화에서 문화의 8 일째 초기 기증자 조직 (OR) 및 조각의 H &amp; E 얼룩 ( C ) GBM의 Microenvironmental pathologic 및 세포 기능, 생체 내 유지됩니다 슬라이스 문화 전반에 걸쳐. (상단, 하단) 확대 사진에서 microglia / macrophage 마커 인 CD68에 대한 면역 조직 화학 검사는 배양 15 일 후 슬라이스에서 소교 세포의 지속성을 나타냅니다. 슬라이스 배양 4 일째의 H &amp; E 염색은 pseudopallisading necrosis, patho(iii)과 (iv) 배율 모두에서 GBM의 로직 특성. 스케일 바 = 200 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53557/53557fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53557/53557fig3.jpg" /> 도표 3 : 인간 GBM 조각 문화는 저산소증에 반응하여 VEGF를 분비합니다. ( A ) 실험은 동일한 종양 영역에서 생성 된 3 개의 유사한 크기의 종양 조각을 포함하는 개별 문화 삽입물을 활용했습니다. 절편은 12 시간 동안 정상 산소 상태로 유지되었으며, 12 시간 간격으로 2 시간의 저산소 상태가 유지되었으며, 각 간격 전에 새로운 매질이 추가되었다. ( B ) 2 개의 대표적인 종양으로부터 생성 된 슬라이스 배양 물로부터 ELISA (평균 ± 표준 편차)에 의해 측정 된 배지로의 VEGF 분비는 유의하게 증가 하였다정상 산소보다 저산소증이었다 (p &lt;0.05). ( C ) 4 가지 종양의 슬라이스 배양 물을 풀 분석 한 결과, 정상 산소와 비교하여 12 시간 간격으로 저산소증을 일으킨 후에 VEGF 분비가 증가하는 것으로 나타났다 (p &lt;0.05). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53557/53557fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53557/53557fig4.jpg" /> 그림 4 : 종양 세포 경로 트랙 데이터는 세포 속도와 방향성의 정량적 결정을 허용합니다. 낮은 방향성과 그 비효율적 지그재그 경로에 관여하는 반면,이 개략도 (16)에 표시된 바와 같이 (1)의 방향성과 (A) 종양 세포는 직선 벡터 따라 최적의 효율성을 나타낸다. 옥스포드 대학의 허가를 받아 증쇄.프레스. ( B ) 전형적인 경로 추적 데이터 ( &quot;저&quot;해상도 ~ 55 분 셀 추적 간격)의 분석은 속도와 방향성의 세포 다양성을 입증합니다. ( C ) 각 셀 트랙에 대한 방향성과 이동 속도는 세포 집단 전체의 이동 거동을 시각화하기 위해 플롯됩니다 (각 점은 개별 셀을 나타냄). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53557/53557fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53557/53557fig5.jpg" /> 그림 5 : GBM Slice Cultures 내의 Microglia는 종양 세포에 비해 높은 이동 속도와 낮은 방향성으로 특징 지어집니다. ( A ) ZSGreen 레트로 바이러스 및 Isolectin - I 태그의 microglia를 선택적으로 표현 종양 세포 복제<html> B 4 -647 접합체는 대표적인 슬라이스 배양 물로부터 대표적인 종양 미세 영역에 혼합되어 존재한다. ( BC ) 동일한 종양 미세 영역에서 개별적으로 추적 된 GBM ( B )와 미세 신경 세포 ( C )의 경로는 불일치하는 이동 거동을 보여줍니다. 스케일 바 = 200 μm. ( D ) 활발하게 이동하는 종양 세포가 멈추고, 그 과정을 후퇴하며 (화살촉), 세포 분열을 겪고, 두 딸 세포가 반대 방향 (화살표)으로 이동한다. 스케일 바 = 50 μm. ( E 와 F ) Microglia는 같은 지역의 종양 세포와 비교했을 때 증가 된 이동 속도 (p &lt;0.0001)와 감소 된 방향성 (p &lt;0.0001)을 나타냅니다. (G) 속도와 방향성에 기초한 종양과 소교 세포의 분포는 두 세포 집단의 독특한 철새 표현형을 보여준다.et = &quot;_ blank&quot;&gt; 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

glioblastoma (GBM)의 현재 ex vivo 모델은 생리 학적으로 인간 종양 침습 연구에 최적화되어 있지 않습니다. 여기, 우리는 신선한 인간 GBM 조직에서 organotypic 슬라이스 문화의 생성 및 유지를위한 프로토콜을 제시한다. 시간 경과 현미경 및 정량 세포 이동 분석 기술에 대한 설명이 제공됩니다.

종양 세포 이동 연구를위한 인간 Glioblastoma Organotypic Slice 문화 모델 및 항 침윤성 약물의 환자 특이 적 효과

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

12.8K 조회수.  Stanford University Hospital, Stanford University School of Medicine.  glioblastoma (GBM)의 현재 ex vivo 모델은 생리 학적으로 인간 종양 침습 연구에 최적화되어 있지 않습니다. 여기, 우리는 신선한 인간 GBM 조직에서 organotypic 슬라이스 문화의 생성 및 유지를위한 프로토콜을 제시한다. 시간 경과 현미경 및 정량 세포 이동 분석 기술에 대한 설명이 제공됩니다. 

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Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better understand the molecular mechanisms underlying glioma cell migration, an ability to study the interaction between hGCs and axons within the tumor microenvironment is essential. In order to model this cellular interaction, we developed a mixed culture system consisting of hGCs and dorsal root ganglia (DRG) axon-oligodendrocyte co-cultures. DRG cultures were selected because they can be isolated efficiently and can form the long, extensive projections which are ideal for migration studies of this nature. Purified rat oligodendrocytes were then added on purified rat DRG axons and induced to myelinate. After confirming the formation of compact myelin, hGCs were finally added to the co-culture and their interactions with DRG axons and oligodendrocytes was monitored in real-time using time-lapse microscopy. Under these conditions, hGCs form tumor-like aggregate structures that express GFAP and Ki67, migrate along both myelinated and non-myelinated axonal tracks and interact with these axons through the formation of pseudopodia. Our ex vivo co-culture system can be used to identify novel cellular and molecular mechanisms of hGC migration and could potentially be used for in vitro drug efficacy testing.

Here we present an ex-vivo mixed monolayer culture system for the study of human glioma cell (hGC) migration in real-time. This model provides the ability to observe interactions between hGCs and both myelinated and non-myelinated axons within a compartmentalized chamber.

등쪽 뿌리 신경절 축삭-올리고젠드로시트 공동 배양에 대한 인간 신경교종 세포 이동의 실시간 모니터링

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

연구

암 연구학

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were developed. These models may be particularly important in the field of neuro-oncology. Indeed, brain tumors have the tendency to invade the healthy brain environment. We describe herein an ideal 3D glioblastoma spheroid-based assay that we developed to study tumor invasion. We provide all technical details and analytical tools to successfully perform this assay.

Here, we describe an easy-to-use invasion assay for glioblastoma. This assay is suitable for glioblastoma stem-like cells. A Fiji macro for easy quantification of invasion, migration, and proliferation is also described.

교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu constitutes the tumor microenvironment (TME) and can modulate response to therapy in vivo or drug response ex vivo. Conventional cancer drug discovery screens are carried out on cells cultured in a monolayer, a system critically lacking the influence of TME. Thus, experimental systems that integrate sensitive and high-throughput assays with physiological TME will strengthen the preclinical drug discovery process. Here, we introduce ex vivo tumor tissue slice culture as a platform for medium-high-throughput drug screening. Organotypic tissue slice culture constitutes precisely-cut, thin tumor sections that are maintained with the support of a porous membrane in a liquid-air interface. In this protocol, we describe the preparation and maintenance of tissue slices prepared from mouse tumors and tumors from patient-derived xenograft (PDX) models. To assess changes in tissue viability in response to drug treatment, we leveraged a biocompatible luminescence-based viability assay that enables real-time, rapid, and sensitive measurement of viable cells in the tissue. Using this platform, we evaluated dose-dependent responses of tissue slices to the multi-kinase inhibitor, staurosporine, and cytotoxic agent, doxorubicin. Further, we demonstrate the application of tissue slices for ex vivo pharmacology by screening 17 clinical and preclinical drugs on tissue slices prepared from a single PDX tumor. Our physiologically-relevant, highly-sensitive, and robust ex vivo screening platform will greatly strengthen preclinical oncology drug discovery and treatment decision making.&#160;

We introduce a protocol for measuring real-time drug response in organotypic tumor tissue slices. The experimental strategy outlined here provides a platform to carry out medium-high throughput drug screens on tissue slices derived from clinical or mouse tumors in ex vivo conditions.

오르가노티픽 종양 조직 슬라이스에서 실시간 약물 반응 측정

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical outcomes. Preclinical mouse models of breast cancer brain metastatic (BCBM) growth are useful but are expensive, and it is difficult to track live cells and tumor cell invasion within the brain parenchyma. Presented here is a protocol for ex vivo brain slice cultures from xenografted mice containing intracranially injected breast cancer brain-seeking clonal sublines. MDA-MB-231BR luciferase tagged cells were injected intracranially into the brains of Nu/Nu female mice, and following tumor formation, the brains were isolated, sliced, and cultured ex vivo. The tumor slices were imaged to identify tumor cells expressing luciferase and monitor their proliferation and invasion in the brain parenchyma for up to 10 days. Further, the protocol describes the use of time-lapse microscopy to image the growth and invasive behavior of the tumor cells following treatment with ionizing radiation or chemotherapy. The response of tumor cells to treatments can be visualized by live-imaging microscopy, measuring bioluminescence intensity, and performing histology on the brain slice containing BCBM cells. Thus, this ex vivo slice model may be a useful platform for rapid testing of novel therapeutic agents alone or in combination with radiation to identify drugs personalized to target an individual patient&#39;s breast cancer brain metastatic growth within the brain microenvironment.

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

We introduce a protocol for measuring real-time drug and radiation response of breast cancer brain metastatic cells in an organotypic brain slice model. The methods provide a quantitative assay to investigate the therapeutic effects of various treatments on brain metastases from breast cancer in an ex vivo manner within the brain microenvironment interface.

유방암 뇌 전이성 종양 성장을 연구하고 표적으로 삼는 Ex Vivo 뇌 슬라이스 모델

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

뇌의 Organotypic 슬라이스와 암 세포의 3 차원 회전 타원체와 공 배양 시스템

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

의학

<meta charset="utf8"></head><body>LEGO: 지질 조절 장애 및 약물 표적을 밝히는 인간 GBM 오가노이드 모델

Laboratory-Engineered Glioblastoma Organoid Culture and Drug Screening

Glioblastoma (GBM) is described as a group of highly malignant primary brain tumors and stands as one of the most lethal malignancies. The genetic and cellular characteristics of GBM have been a focal point of ongoing research, revealing that it is a group of heterogeneous diseases with variations in RNA expression, DNA methylation, or cellular composition. Despite the wealth of molecular data available, the lack of transferable pre-clinic models has limited the application of this information to disease classification rather than treatment stratification. Transferring the patients' genetic information into clinical benefits and bridging the gap between detailed descriptions of GBM, genotype-phenotype associations, and treatment advancements remain significant challenges. In this context, we present an advanced human GBM organoid model, the Laboratory Engineered Glioblastoma Organoid (LEGO), and illustrate its use in studying the genotype-phenotype dependencies and screening potential drugs for GBM. Utilizing this model, we have identified lipid metabolism dysregulation as a critical milestone in GBM progression and discovered that the microsomal triglyceride transfer protein inhibitor Lomitapide shows promise as a potential treatment for GBM.

<meta charset="utf8"></head><body>실험실에서 엔지니어링한 교모세포종 오가노이드 배양 및 약물 스크리닝

Here, we outline a comprehensive protocol for generating and utilizing laboratory-engineered glioblastoma organoids (LEGO) to investigate genotype-phenotype dependencies and screen potential drugs for glioblastoma treatment.

실험실에서 엔지니어링한 교모세포종 오가노이드 배양 및 약물 스크리닝

Glioblastoma (GBM) is described as a group of highly malignant primary brain tumors and stands as one of the most lethal malignancies. The genetic and ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

약물 치료를 종양 미세 환경을 공부하고 대상에 대한 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 문화 시스템

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

종양 세포 이동 연구를위한 인간 Glioblastoma Organotypic Slice 문화 모델 및 항 침윤성 약물의 환자 특이 적 효과

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오르가노티픽 종양 조직 슬라이스에서 실시간 약물 반응 측정

유방암 뇌 전이성 종양 성장을 연구하고 표적으로 삼는 Ex Vivo 뇌 슬라이스 모델

뇌의 Organotypic 슬라이스와 암 세포의 3 차원 회전 타원체와 공 배양 시스템

실험실에서 엔지니어링한 교모세포종 오가노이드 배양 및 약물 스크리닝

실험실에서 엔지니어링한 교모세포종 오가노이드 배양 및 약물 스크리닝

실험실에서 엔지니어링한 교모세포종 오가노이드 배양 및 약물 스크리닝

약물 치료를 종양 미세 환경을 공부하고 대상에 대한 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 문화 시스템

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로