We thank Dr. Jordi Ochando from the Flow Cytometry Shared Resources at the Mount Sinai Medical Center for their assistance in flow cytometry analysis. We thank Dr. Rumana Huq from the Microscopy Shared Resource Facility at the Mount Sinai Medical Center for their imaging assistance. The authors thank the TJ Martell Foundation for its support in this project.

이 프로토콜은 기관 연구 윤리 보드에서 승인을 우리의 기관에서 수행과 인간의 복지에 대한 모든, 기관, 국가, 국제 지침을 준수하고 있습니다. 고급 전립선 암 환자에서 말초 혈액 1. 컬렉션 참고 : 전이성 전립선 암 환자를 선택합니다. 기록 된 환자의 동의를 얻어 격리 연령 이전 화학 요법과 호르몬 치료를 포함하여 환자의 임상 적 특징을 기록한다. 전이성 질환을 가진 환자는 잠재적으로 말초 혈액에서 CTCS의 가장 높은 농도를해야합니다. <ol><li> 동의 후 적절한 임상 시험 심사위원회가 프로토콜을 승인하에 혈액 샘플을 수집합니다. 라텍스 장갑 및 절차 전반에 걸쳐 실험실 코트를 착용 할 것. </li><li> 바늘 홀더에 25 G 나비 바늘과 튜브를 연결합니다. 의 영역을 청소하기 위해 알코올 면봉을 사용하여이두와 팔뚝 사이의 전주 정맥 후 환자의 상완에 지혈대를 적용합니다. </li><li> 전주 정맥에 나비 바늘을 삽입하고 수집을 시작하기 위해 바늘 홀더에 혈액 수집 튜브를 밀어 넣습니다. 혈액 응고를 방지하기 위해 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 함유 수집 튜브에 혈액의 약 10 ㎖를 수집한다. </li><li> 환자에서 나비 바늘을 제거하고 1 분 동안 정맥 천자의 사이트를 통해 멸균 거즈 패드에 압력을 적용합니다. 멸균 붕대로 커버 사이트. </li></ol> 단핵 세포의 분리 (2) 주 : 1 단계에서 수집 된 혈액 단핵 CTCS 이외에 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) (예 : 림프구 및 단핵구)를 포함 할 것이다. <ol><li> : 1 비율 피펫 전체 5 ㎖의 혈청 학적 피펫 50ml의 폴리스티렌 원뿔 튜브에 혈액과는 1 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS)를 추가합니다. 조심스럽게 피펫 혼합물 균질화한다. </li><li> 빈 50 ml의 폴리스티렌 원뿔 관에 저속 밀도 구배 원심 분리하여 혈액 성분을 분리하기 위해 상업적으로 준비된 솔루션 (피콜 - 페이크)의 15 ML을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 별개 상부층을 형성하는 단계에서 2.2 폴리스티렌 튜브에, 단계 2.1에서, 전혈 및 HBSS 혼합물을 피펫. 솔루션의 혼합을 최소화하기 위해 낮은 설정으로 설정 피펫이 효율적인 분리를 보장합니다. </li><li> RT에서 30 분 동안 400 XG (25 °의 C)에서 원심 분리한다. 가장 낮은 설정으로 감속 분리 후 솔루션의 혼합을 방지합니다. 가속도가 어떤 속도로 설정 될 수있다. </li><li> 원심 분리 후, 튜브의 하단에 상단과 분리 솔루션에 플라즈마 사이의 PBMC를하고 CTCS 끼워 층의 얇은 흰색 - 회색 스트라이프를 식별합니다. </li><li> 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 50 ㎖ 폴리스티렌 튜브에 단계 2.5에서 흰색 - 회색 스트라이프에서 세포를 수집합니다. </li><li> PBMC를하고 CTCS와 C 50 ml의 폴리스티렌 원뿔 관에 HBSS 추가10 분 RT는 씻어 400 XG에 다시 entrifuge. </li><li> 씻어 실온에서 3 분 동안 400 XG에 다시 HBSS 원심 분리기 50 ml의 액체에 resuspend 펠렛을 가만히 따르다. </li><li> 상층 액을 버리고, 적혈구 용해 버퍼의 5 ㎖로 나머지 펠렛을 재현 탁하고 실온에서 5 분 솔루션을 품어. </li><li> RT에서 3 분 동안 400 XG에서 원심 분리하여 적혈구 용해 완충액을 제거한다. </li><li> 상층 액을 제거하고 종래 항체 염색 차단 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 보충 된 1 ml의 PBS 1X에 펠렛을 재현 탁. </li></ol> 정렬 형광 활성 세포에 대한 CD45-FITC 항체 3. 염색 단핵 세포 (FACS) <ol><li> 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 (단계 2.11)에서 실행 가능한 (트리 판 블루 음성) 세포의 수를 정량화. (10 % FBS와 PBS 1X)에 1 × 106 세포 / ㎖ 현탁액을 준비하고 1 시간 동안 얼음에 놓습니다. </li><li> 정량 배포두 튜브에 이전 단계에서 세포 현탁액. 제어 및 CD45 염색 등의 레이블 튜브. </li><li> 250 : 제어 튜브에서, (1)의 희석 IgG1κ-FITC (2.5 μg의 / ㎖)을 추가한다. CD45 염색 튜브에서, (1)의 희석 CD45 FITC (2.5 μg의 / ㎖) 차 항체 컨쥬 게이트를 추가한다 (250)와 30 분 동안 얼음에 세포 현탁액을 배양한다. CD45 항원 라벨링은 조혈 세포를 배제하기 위해 사용된다. </li><li> 4 ℃에서 3 분 동안 400 XG에서 세포를 원심 분리기, 상층 액을 버린다. </li><li> 멸균 1 X PBS로 각 펠렛을 일시 중단에 의해 두 번 세포를 씻으은 4 ℃에서 3 분 동안 400 XG에서 원심 분리 한 다음 10 % FBS와 보충. </li><li> 10 μg / ml의 농도 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)을 함유하는 PBS의 1 배의 1 ml의 용액 중에 세포를 재현 탁. </li><li> 12mm X 75mm의 폴리스티렌 튜브에 35 μm의 여과기 캡을 통해 최종 솔루션을 필터링합니다. </li></ol> 전립선 CTCS 4. 분리하여FACS 참고 : 라이브 CD45 부정적인 CTCS를 수집하는 사이토 흐름을 활용합니다. <ol><li> 레이블 튜브에서 세포를 사용하여 설정 보상 컨트롤 &quot;제어.&quot; </li><li> 파편과 적절한 앞​​으로 산란과 측면 산란 매개 변수를 사용하여 세포의 클러스터를 제외 게이트를 만듭니다. </li><li> 표지 된 튜브에서 세포 현탁액을 이용하여 FITC 게이트 확립 &quot;CD45-FITC를.&quot; </li><li> 태평양 블루 채널을 사용하여 게이트 가능한 (DAPI 음성) 세포. </li><li> 10 % FBS가 보충 된 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 1640 2 ㎖를 함유하는 멸균 15 ml의 폴리스티렌 튜브에 원추형 CD45 네가티브 인구를 수집한다. </li><li> 10 % FBS가 보충 된 RPMI 500 μL - 3 분 동안 원심 분리기 (400)에서 정렬 XG 전립선 종양 세포 현탁액을, 다음 200에서 펠렛을 재현 탁. </li></ol> 이종 이식 성장의 마우스 및 모니터링에 CTCS 5. 주입 노트 :기관 동물 관리위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 준수하여 모든 동물 절차를 실시한다. 이 프로토콜은 모든 관련 규제 및 제도 기관, 규정 및 지침에 따라 준수에 우리의 동물 관리위원회의 승인을 특정 동물을 사용 의정서에 따라 우리 기관에서 진행되고있다. <ol><li> 얼음에 1 비율 및 장소 : 1에서 세포 외 기질로 분류 전립선 종양 세포 현탁액을 섞는다. </li><li> 산소 / 분 1 L의 5 % (v / v)로 흡입 이소 플루 란을 공급 챔버 내에 피하 주입하기 전에 마우스를 마취. 마우스 각막과 발가락 반사의 손실을 확인하여 적절한 마취를 확인합니다. </li><li> 25 G 바늘과 1 ML의 주사기를 사용하여, 8~10주 세 남자 면역 결핍 마우스의 양쪽 상단 측면에 전립선 종양 세포와 세포 외 기질 세포 현탁액의 피하 250 μl를 주입. 주입 부피는 I 인 250 μL없이 CTC 농도 주입mportant 값. 마우스에 최대 SQ 정부는 더 이상 1 ml를하지 않습니다. &#160;</li><li> 피하 결절 밀도의 성장을위한 마우스 주사 부위의 주간 촉진을 수행함으로써 일주일에 두 번 마우스의 무게를 측정하여 마우스를 모니터링합니다. </li><li> 종양의 크기가 분자 분석 및 직렬 통로 충분한 종양 조직을 위해 0.5 cm 및 최대 직경 미만 1cm 때 경추 탈구 수확 피하 인간 전립선 암을 이종 이식 한 다음 이산화탄소 질식에 의해 쥐 안락사. 더 종양에​​도 불구하고 고통 또는 15 %의 체중 감소의 징후와 쥐를 안락사는 만져서입니다. </li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature. 17, 1514-1520 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

이 원고 CTCS에서 전립선 암 PDX 모델 생성 방법을 설명한다. PDX의 생성을위한 CTCS의 사용 기존의 방법에 비해 여러 가지 잠재적 모델 중요한 이점을 갖는다. 첫째, 말초 혈액에서 CTCS의 접근 컬렉션 다른 질병 단계에서 동일 환자에서 실험 모델의 생성을 가능하게한다. 둘째, 채혈은 종양 세포의 수집을위한 수술을 필요로 기존 방법에 비해 종양 세포를 분리하기 위해 안전하고 저렴한 방법을 나타낸다. CTC 농축 여러 방법이 많은 인해 자금과 자원의 한계로 모든 실험실에 액세스 할 수 없습니다 그러나 기술되었다. 우리는 외과, 많은 실험실, 편리 저렴하고 접근 방법의 사용에 활용할 수있는 우리의 실험실에서 분석을 개발하기 위해 노력했다. 이러한 방법의 잠재적 인 제한은높은 종양 환자에게 부담이 프로토콜의 사용을 제한 할 수 희귀 세포의 검출 감도가 불충분. 상피 세포의 물리적 또는 생물학적 특성을 사용하는 기술은 여러 가지 추가 이상이 제한을 완화하고,이 희귀 세포 집단 (4)의 검출 및 분리를 증가시키기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜에 설명 된 CTC 농축하는 방법은 음의 선택을 사용한다; CD45 + 백혈구 폐기 및 CD45된다 - CTCS이 유지됩니다. 요소 세포 현탁액에서 유동 세포 계측법에 의해 정렬 할 때 (예를 들어, 비 생존 세포를.) - 그것은 CD45 오염 가능성 제거하는 것이 중요합니다. 특히, 적혈구 용해 완충 용액의 사용 및 DAPI 염색으로 생존 할 셀 생략 중요한 고려 사항이다. 이러한 조치는 비 CTC 요소가 CD45 오염시키지 않도록 보장 할 수 있지만 - 인구, 우리의 이전 연구 제안이 원하는 세포 Population 충분히 이러한 방법 (11)이 풍부합니다. 그것은 CTC 인구의 순도는 전립선 암 세포 (3)에 고유 한 표면 마커를 셀에 항체를 사용하여, 양성 선별을 통해 개선 될 수 있다는 것이 가능하다. 또한, 시료에 존재하는 상피 세포의 CTC 얼룩이 및 개수는 EpCAM 또는 다른 적절한 얼룩을 사용하여 테스트 할 수있다. 전체 수율을 감소시키면서 그러나 말초 혈액 샘플의 추가 처리는 궁극적으로 순도를 증가시킬 수있다. 이 프로토콜에서 우리는 쉽게 주입 및 개발 종양의 모니터링을 허용 고립 CTCS의 피하 주사를 시행 하였다. 그러나, 피하 모델은 종양 생착 및 종양 세포 개체군의 손실을 손상시킬 수 불충분 한 영양 공급을 갖는다. 이러한 SUCC 향상 전립선 미세 촉진 마우스 전립선 (직교), 및 캡슐 subrenal 주입, 주입과 같은 대체 부위essful 생착 종양 이질성 보존은 조사자 선호도 1,2에 기초하여 수행 될 수있다. 최적으로, NOD / SCID / IL2λ 수용체 널 (NSG) 마우스 모델은 그러나 면역 쥐 (누드 NOD / SCID 또는, SCID / 베이지)의 다른 변형이 또한 성공적으로 사용되어, 이종 이식 생착 (12)의 속도를 증가시키기 위해 사용되어야 고형 종양의 발생에 PDX 모델 (1)를 산출했다. 생성 PDX 모델은 연속적 계대 될 수 있으며, 원래의 종양 특성 안정성이 확립 유전 9-11,13 방법을 사용하여 모니터. 가능한 전립선 암 CTCS의 높은 숫자의 회복은 질병의 단계에 따라 달라집니다. CTCS 높은 전이성 부담 환자의 혈액에서 분리 될 때 PDX 모델의 성공적인 세대는 가장 보장된다. 우리는 성공적으로 100 내지 10,000의 범위 CTCS로 혈액 샘플에서 PDX 모델을 생성 하였다. 우리의 경험에서, 잘 훈련 된 노동에 필요한atory 요원은 혈액 샘플에서 전립선 CTCS의 성공적인 차단을 보장하기 위해 자주 프로토콜을 수행한다. 우리 기관 담당자가 초기 종양 세포주에서 세포 아군 정상적인 건강한 사람의 혈액 샘플을 사용하여이 프로토콜 훈련 것을 추천한다. 부재 또는 차 전립선 암에서의 낮은 숫자 CTCS 전이성 전립선 암이 방법의 사용을 제한 할 수있다. CTC의 생성을위한 방법은 이후에 분자 전립선 암의 특성, 약물 스크리닝, 모니터링 된 치료 반응, 바이오 마커 개발 및 맞춤 암 치료의 다른 진보를 포함하여 많은 연구 프로그램에서 이용 될 수있다이 프로토콜에서 설명 PDX 모델을 산출했다.

A correction was made to <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/53182">Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells</a>. There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from:
Veronica Rodriquez-Bravo
to:
Veronica Rodriguez-Bravo

A correction was made to Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells.

Erratum: Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

환자 유래의 이종 이식은 암 연구에 사용되는 점점 더 인기를 실험 모델입니다. 이들은 생체 생물학적 경로, 전임상 약효 평가, 및 개인화 된 암 치료를위한 1,2- 아바타의 생성 특성에 사용될 수있다. 이전에, 다른 연구 그룹은 주입 또는 면역 저하 된 마우스 (1)에 단일 종양 세포 현탁액 또는 전체 종양 이식편을 주입함으로써 어느 PDX 모델을 개발 하였다. 이 PDX 모델은 신선한 고형 종양의 수술 수집, 악성 복수 또는 비용이 많이 드는 둘과 인성 사망률의 증가 위험에 환자를 노출하는 수술을받은 환자에서 흉막 삼출이 필요합니다. 암 연구 분야에서 최근의 발전은 상당한 종양 세포 순환의 검출, 분리 및 특성화되었다. 이들 종양 세포가 일차 종양 덩어리에서 탈출하고 순환을 입력그들은 전이 및 재발에 중요한 역할을하는 경우, 암의 가장 흔한 원인은 관련 사망률 3. 여러 고형암 유형에서 CTCS의 평가 및 특성 진단, 예후, 잔류 병 (3)를 모니터링하기위한 임상 정보를 제공하고 있습니다. 어느 물성, 바이오 마커의 발현 또는 CTCS의 기능적 특성에 의존하는 현재 사용되는 방법의 다양한 효율적 CTCS 4 분리하는데 사용될 수있다. 기존 거시적 CTC 분리 방법은 표면 분자에 대해 밀도 구배 원심 분리, 필터 기공 물리적 여과 및 분리를 포함한다. 가장 널리 사용되는 CTC 분리 방법론 CTCS 항체 기반의 캡처에 기초한다. 두 세포 표면 마커의 양성 및 음성 선택은 말초 혈액으로부터 CTCS를 분리하는데 이용 될 수있다. 말초 순환에 CTCS에 대한 긍정적 인 선택은 일반적으로 상피 마커 (예를 들어,는 EpCAM)를 사용하는CTCS하지만 조혈하지 세포에서 발현 다시. 이 방법의 단점은 전이 가능성이있는 CTCS 자주 상피 - 투 - 중간 엽 3 상피 표면 마커를 downregulates 전이 (EMT),받은 것입니다. 전이성 잠재력 CTCS를 분리하기 위해, 조혈 표면 마커 CD45을 채용 음성 선별 방법은, 백혈구의 정상 세포 집단 5 ​​사용될 수 고갈. 전립선 암은 가장 일반적으로 암 진단 및 남성 6의 암 관련 사망의 주된 원인이다. 종양 진행 및 공격성의 메커니즘은 완전히 이해되지 않으며, 따라서 생성 및 전립선 암의 분자 이질성 요점을 되풀이 실험 모델의 특성은 중요한 관심사이다. 전립선 암 PDX 모델왔다 immunocom에 인간 전립선 암 세포의 생착에 의해 이전에 생성 된약속 마우스 7,8. 그러나, 이러한 모델의 생성은 주로 병의 무통 성질에 기인 마우스에 면역이 전립선 암의 생착 낮은 속도에 의해 방해되어왔다. 최근 CTCS 유방암 9, 폐암 및 전립선 암 10 11 PDX 모델을 생성하는 데 사용되어왔다. 이러한 개념 증명 연구는 수술 시료 채취의 필요성 PDX 모델 독립적 발생의 가능성을 소개했다. 이 문서에서 우리는 구체적으로이 소설의 실험 모델의 생성하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning Cell Gro</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polystyrene conical tube</td><td>Crystalgen</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>Red blood cell lysing buffer</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>d3571</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer One Use Needle Holder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable Latex Tourniquet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Latex or non-latex gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>alcohol swabs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 x 2 cotton gauze pads</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesive bandage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 G needle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation of prostate cancer patient derived xenograft models from circulating tumor cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

이 프로토콜은 절연 CD45 네가티브 전립선 암에서 CTCS PDX 모델의 생성을 초래할 것이다. 우리의 프로토콜에서 사용되는 음성 선별 방법에 따라 그 DAPI 염색을 이용하여 사균을 배제 할 필요가있다. 유동 세포 계측법에 의해 검출 CD45 음성 세포의 비율은 가변적이며 환자 (도 1a)의 종양 부담에 따라 달라진다. 흰색 화살표 (도 1b)로 표시된 바와 같이 (세포 핵을 식별) CD45 및 DAPI를 사용하여 정렬되지 않은 세포의 면역 형광 염색, CD45 음성 세포를 보여준다. 도 1C에서, 피하 결절 밀도 마우스의 양쪽 측면에 알 수있다. 각 결절 밀도는 이종 이식의 성장을 나타내며,이 마우스의 등 근육에서 돌출과 질감에서 확고한 같이 건강한 조직에서 별개로 감상 할 수 있습니다. 주입 및 이종 이식 개발 사이의 시간 간격은 patie의 CTC 부담에 따라 크게 달라질 수 있습니다NT 샘플, 이식 된 세포의 수와 CTCS의 생물학적 공격성. CTCS로부터 생성 전립선 PDX는 헤 마톡 실린과 에오신 염색 된 것과 같이 인간 전립선 종양 요점을 되풀이하고, 같은 안드로겐 수용체 (AR) 및 전립선 특이 적 막 항원 (PSMA) (도 1D)와 같은 전립선 특이 세포 마커에 대한 면역 조직 화학에 의해. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53182/53182fig1.jpg" /> 인간의 전립선 암 CTCS에서 전립선 암 PDX 모델의 1 세대를 그림. (A) 전립선 암 환자의 말초 혈액에서 CD45 염색 특정 세포 집단을 도시 한 플롯 유동 세포 계측법. . 긍정적 인 DAPI 얼룩 세포가 죽은 만 가능한 세포가 분리되어 보장하기 위해 게이팅에 의해 제외 된 분류되지 않은 인구 (B) CD45의 면역 염색은 CD45의 존재 확인 -. 세포 (흰색 화살표) (C) </strong&gt;는 생체 내 종양 수확 후 대표 PDX 종양을 보여줍니다 기존의 헤 마톡 실린 및 에오신 및 특정 전립선 마커를 사용하여 CTC PDX 모델 (D) 분석.; 안드로겐 수용체 (AR) 및 전립선 특이 막 항원 (PSMA). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53182/53182fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

전립선 암 환자의 발생은 종양 세포를 순환에서 이종 이식 모델을 파생

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

14.0K 조회수.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

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Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor pieces are injected subcutaneously into athymic nude mice (immunocompromised, T cell deficient) to create a bank of tumors and subsequently are passaged into different generations of mice in order to maintain these tumors from patients. Importantly, cellular heterogeneity of the original tumor is closely emulated in this model, which provides a more clinically relevant model for evaluation of drug efficacy studies (single agent and combination), biomarker analysis, resistant pathways and cancer stem cell biology. Some limitations of the PDTX model include the replacement of the human stroma with mouse stroma after the first generation in mice, inability to investigate treatment effects on metastasis due to the subcutaneous injections of the tumors, and the lack of evaluation of immunotherapies due to the use of immunocompromised mice. However, even with these limitations, the PDTX model provides a powerful preclinical platform in the drug discovery process.

Utilizing patient-derived tumors in a subcutaneous preclinical model is an excellent way to study the efficacy of novel therapies, predictive biomarker discovery, and drug resistant pathways. This model, in the drug development process, is essential in determining the fate of many novel anti-cancer therapies prior to clinical investigation.

전임상 환자 유래 종양 소설 안티 - 암 치료의 조사를위한 이종 이식 모델의 개발 및 유지 보수

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

연구

암 연구학

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients' tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.

We describe a method for stable labeling of patient-derived xenografts (PDXs) with lentiviral particles expressing green-fluorescent protein and luciferase reporters. This method allows for tracking the growth of PDXs at the primary site, as well as detecting spontaneous and experimental metastases using in vivo imaging systems.

종양의 성장과 전이 연구 추적 가능한 기자와 유방암 환자 유래의 이종 이식의 라벨링

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a common mechanism of disease progression and a prognostic-determinant feature of malignant tumors. In prostate cancer (PC), resistance to MTAs such as the taxane Docetaxel dictates treatment failure as well as progression towards lethal stages of disease that are defined by a poor prognosis and high mortality rates. Though studied for decades, the array of mechanisms contributing to acquired resistance are not completely understood, and thus pose a significant limitation to the development of new therapeutic strategies that could benefit patients in these advanced stages of disease. In this protocol, we describe the generation of Docetaxel-resistant prostate cancer cell lines that mimic lethal features of late-stage prostate cancer, and therefore can be used to study the mechanisms by which acquired chemoresistance arises. Despite potential limitations intrinsic to a cell based model, such as the loss of resistance properties over time, the Docetaxel-resistant cell lines produced by this method have been successfully used in recent studies and offer&#160;the opportunity to advance our molecular understanding of acquired chemoresistance in lethal prostate cancer.

Resistance to cancer therapies contributes to disease progression and death. Determining the mechanistic underpinnings of resistance is crucial for improving therapeutic response. This manuscript details the protocol to generate taxane-resistant cell models of prostate cancer (PC) to help dissecting the pathways involved in progression to Docetaxel resistance in PC patients.

반대로 mitotic 에이전트 Docetaxel에 전립선 암 세포 모델의 생성

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and transgenic genetically engineered mouse models. Unlike subcutaneous tumors, orthotopic tumors contain more clinically accurate vasculature, tumor microenvironment, and responses to multiple therapies. In contrast to genetically engineered mouse models, orthotopic models can be performed with lower cost and in less time, involve the use of highly complex and heterogeneous mouse or human cancer cell lines, rather that single genetic alterations, and these cell lines can be genetically modified, such as to express imaging agents. Here, we present a protocol to surgically injecting a luciferase- and mCherry-expressing murine prostate cancer cell line into the anterior prostate lobe of mice. These mice developed orthotopic tumors that were non-invasively monitored in vivo and further analyzed for tumor volume, weight, mouse survival, and immune infiltration. Further, orthotopic tumor-bearing mice were surgically castrated, leading to immediate tumor regression and subsequent recurrence, representing castration-resistant prostate cancer. Although technical skill is required to carry out this procedure, this syngeneic orthotopic model of both androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer is of great use to all investigators in the field.

The goal of this protocol is to demonstrate the intra-prostatic injection of prostate cancer cells, with subsequent castration. Orthotopic pre-clinical models of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer are critical to study the disease in the context of a clinically relevant tumor microenvironment and an immunocompetent host.

발광 및 형광 Orthotopic Syngeneic Murine 모델 Androgen 종속 및 거세 내성 전립선 암

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and colorectal cancer (CRC). More than 50% of patients with muscle-invasive UCC, despite curative therapy for clinically-localized disease, will develop metastases and die within 5 years, and metastatic CRC is a leading cause of cancer-related deaths in the US. Xenograft models that consistently mimic UCC and CRC metastasis seen in patients are needed. This study aims to generate patient-derived orthotopic xenograft (PDOX) models of UCC and CRC for primary tumor growth and spontaneous metastases under the influence of LN stromal cells mimicking the progression of human metastatic diseases for drug screening. Fresh UCC and CRC tumors were obtained from consented patients undergoing resection for HG-UCC and colorectal adenocarcinoma, respectively. Co-inoculated with LN stromal cell (LNSC) analog HK cells, luciferase-tagged UCC cells were intra-vesically (IB) instilled into female non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice, and CRC cells were intra-rectally (IR) injected into male NOD/SCID mice. Tumor growth and metastasis were monitored weekly using bioluminescence imaging (BLI). Upon sacrifice, primary tumors and mouse organs were harvested, weighed, and formalin-fixed for Hematoxylin and Eosin and immunohistochemistry staining. In our unique PDOX models, xenograft tumors resemble patient pre-implantation tumors. In the presence of HK cells, both models have high tumor implantation rates measured by BLI and tumor weights, 83.3% for UCC and 96.9% for CRC, and high distant organ metastasis rates (33.3% detected liver or lung metastasis for UCC and 53.1% for CRC). In addition, both models have zero mortality from the procedure. We have established unique, reproducible PDOX models for human HG-UCC and CRC, which allow for tumor formation, growth, and metastasis studies. With these models, testing of novel therapeutic drugs can be performed efficiently and in a clinically-mimetic manner.

This protocol describes the generation of patient-derived orthotopic xenograft models by intra-vesically instilling high-grade urothelial cell carcinoma cells or intra-rectally injecting colorectal cancer cells into non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice for primary tumor growth and spontaneous metastases under the influence of lymph node stromal cells, which mimics the progression of human metastatic diseases.

인간 비뇨기과 세포 암 및 대장암 종양 성장 및 자발적 전이를 위한 환자 유래 직교 이종이식 모델

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. Although there are many established gastric cancer cell lines and many conventional transgenic mouse models for preclinical research, the disadvantages of these in vitro and in vivo models limit their applications. Because the characteristics of these models have changed in culture, they no longer model tumor heterogeneity, and their responses have not been able to predict responses in humans. Thus, alternative models that better represent tumor heterogeneity are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models preserve the histologic appearance of cancer cells, retain intratumoral heterogeneity, and better reflect the relevant human components of the tumor microenvironment. However, it usually takes 4-8 months to develop a PDX model, which is longer than the expected survival of many gastric patients. For this reason, establishing primary cancer cell lines may be an effective complementary method for drug response studies. The current protocol describes methods to establish PDX models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. These methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

The current protocol describes methods to establish patient-derived xenograft (PDX) models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. The methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) are a rigorous method for studying mammalian development and disease. Our laboratory has developed several GEMMs of prostate cancer (PCa) that lack expression of one or multiple tumor suppressor genes using the site-specific Cre-loxP recombinase system and a prostate-specific promoter. In this article, we describe our method for necropsy of these PCa GEMMs, primarily focusing on dissection of mouse prostate tumors. New methods developed over the last decade have facilitated the culture of epithelial-derived cells to model organ systems in vitro in three dimensions. We also detail a 3D cell culture method to generate tumor organoids from mouse PCa GEMMs. Pre-clinical cancer research has been dominated by 2D cell culture and cell line-derived or patient-derived xenograft models. These methods lack tumor microenvironment, a limitation of using these techniques in pre-clinical studies. GEMMs are more physiologically-relevant for understanding tumorigenesis and cancer progression. Tumor organoid culture is an in vitro model system that recapitulates tumor architecture and cell lineage characteristics. In addition, 3D cell culture methods allow for growth of normal cells for comparison to tumor cell cultures, rarely possible using 2D cell culture techniques. In combination, use of GEMMs and 3D cell culture in pre-clinical studies has the potential to improve our understanding of cancer biology.&#160;

We show a method for necropsy and dissection of mouse prostate cancer models, focusing on prostate tumor dissection. A step-by-step protocol for generation of mouse prostate tumor organoids is also presented.

전립선암의 유전자 조작 마우스 모델에서 종양 오르가노이드의 생성

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

유전학

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred to as patient-derived organoids (PDO), are an invaluable resource for studying the mechanism of tumorigenesis and metastasis of prostate cancer. Their main advantage is that they maintain the distinctive genomic and functional heterogeneity of the original tissue compared to conventional cell lines that do not. Furthermore, 3D cultures of PDO can be used to predict the effects of drug treatment on individual patients and are a step towards personalized medicine. Despite these advantages, few groups routinely use this method in part because of the extensive optimization of PDO culture conditions that may be required for different patient samples. We previously demonstrated that our prostate cancer bone metastasis PDX model, PCSD1, recapitulated the resistance of the donor patient&rsquo;s bone metastasis to anti-androgen therapy. We used PCSD1 3D organoids to characterize further the mechanisms of anti-androgen resistance. Following an overview of currently published studies of PDX and PDO models, we describe a step-by-step protocol for 3D culture of PDO using domed or floating basement membrane (e.g., Matrigel) spheres in optimized culture conditions. In vivo stitch imaging and cell processing for histology are also described. This protocol can be further optimized for other applications including western blot, co-culture, etc. and can be used to explore characteristics of 3D cultured PDO pertaining to drug resistance, tumorigenesis, metastasis and therapeutics.

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Three-dimensional cultures of patient BMPC specimens and xenografts of bone metastatic prostate cancer maintain the functional heterogeneity of their original tumors resulting in cysts, spheroids and complex, tumor-like organoids. This manuscript provides an optimization strategy and protocol for 3D culture of heterogeneous patient derived samples and their analysis using IFC.

환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3D) 오르가노이드의 설립 및 분석

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Generation of an Orthotopic Xenograft of Pancreatic Cancer Cells by Ultrasound-Guided Injection

Pancreatic cancer (PCa) represents one of the deadliest cancer types worldwide. The reasons for PCa malignancy mainly rely on its intrinsic malignant behavior and high resistance to therapeutic treatments. Indeed, despite many efforts, both standard chemotherapy and innovative target therapies have substantially failed when moved from preclinical evaluation to the clinical setting. In this scenario, the development of preclinical mouse models better mimicking in vivo characteristics of PCa is urgently needed to test newly developed drugs. The present protocol describes a method to generate a mouse model of PCa, represented by an orthotopic xenograft obtained by ultrasound-guided injection of human pancreatic tumor cells. Using such a reliable and minimally invasive protocol, we also provide evidence of in vivo engraftment and development of tumor masses, which can be monitored by ultrasound (US) imaging. A noteworthy aspect of the PCa model described here is the slow development of the tumor masses over time, which allows precise identification of the starting point for pharmacological treatments and better monitoring of the effects of therapeutic interventions. Moreover, the technique described here is an example of implementation of the 3Rs principles since it minimizes pain and suffering and directly improves the welfare of animals in research.

We present a protocol to generate a minimally invasive orthotopic pancreatic cancer model by ultrasound-guided injection of human pancreatic cancer cells and the subsequent monitoring of tumor growth in vivo by ultrasound imaging.

초음파 유도 주사에 의한 췌장암 세포의 동종 이종이의 생성

Pancreatic cancer (PCa) represents one of the deadliest cancer types worldwide. The reasons for PCa malignancy mainly rely on its intrinsic malignant ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

인간 종양 이종 이식에서 마우스 세포의 고갈은 크게 대상 세포의 다운 스트림 분석을 향상

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...