이 작품은 의학의 웨이크 포레스트 대학과 공동 연구 계약에 따라 RJ 레이놀즈 담배 회사 (RJRT)에 의해 자금을 지원한다. GL 프라 사드는 RJRT의 풀 타임 직원입니다.

참고 : 동의서 본 연구를 수행 할 수는 좋은 임상 사례 당, IRB 승인에 따라 지역 임상 연구 단위에서 얻었다. 피 처리는 다른 PBMC를 세포 배양 실험의 분리 미생물 살균 용품 및 시약을 사용하여, 멸균 조건 하에서 수행된다. 1. WS-CM 준비 <ol><li> 이전 12 설명 된대로 WS-CM을 생성합니다. <ol><li> 35-60-2, 용액에 퍼프 볼륨 초에 퍼프 간격, 퍼프 기간 로즈웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 다음과 같은 금연 요법을 사용하여 페놀 레드없이 1640 매체를 통해 네 3R4F 참조 담배에서 연기를 전달하여 WS-CM을 준비 각각 초에. 각각의 혼합물은 20 ml의 샘플을 생성합니다. </li></ol></li><li> 날짜, 완료 시간, 담배 이름과 번호와 레이블 튜브 (들). -80 °에서 500 ㎕를 분주 즉시 흡연이 완료된 후에 C 보관하십시오. </li><li> 냉동 WS의 분취 량을 분석앞서 설명한 바와 같이 12-㎝ 니코틴, 담배 특이 니트로사민, 다환 방향족 탄화수소의 농도를 결정한다. </li></ol> PBMC를 2. 분리 <ol><li> (담배 제품이 아닌 소비자 있습니다) 건강한 기증자로부터 신선한 혈액을 수집 웨이크 포레스트 침례 건강 IRB (15)는 별도의 승인에 따라 아래와 같이 신선한 혈액에서 PBMC를을 분리합니다. <ol><li> 혈액 가방의 도착 이전에, 500ml의 병, 가위, 분리 버퍼, 그리고 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS) (RT) 바이오 안전성 레벨 2 (BSL-2) 세포 배양 후드에서 준비를해야합니다. 격리 버퍼 빛으로부터 보호되어야한다. </li><li> 거꾸로 혈액 가방을 잡고 그냥이 튜브의 최소 3cm를 떠나 고정 된 경우 아래의 튜브를 잘라. </li><li> 500㎖의 병 뚜껑을 제거하고 병 구멍 위의 튜브를 개최합니다. 혈액 가방을 들고 피가 t에 가방에서 자유롭게 흐를 수 있도록하는 데 반전가방이 비어있을 때까지 그는 병입니다. 피가 거품을 만들지 않도록 똑바로 아래로 대 병의 내부 벽에 흐르게. </li><li> 혈액에 격리 버퍼의 5 비율 : 1의 병에 격리 버퍼를 따르십시오. 엔드 오버 엔드, 10 배, 단단히 병을 씌우고 조심스럽게 반전. 실온에서 1 시간 동안, 조명 오프 배양 세포 배양 후드에서 병을 둡니다. </li><li> 라이트, 밀짚 색의 층은 혈액 위에 구축됩니다. 50 ML 원뿔 튜브에 25 ml의 혈청 학적 피펫을 사용하여이 레이어를 제거합니다. 혈액을 기증 피사체에 따라, 300 ml의 - 수집 된 금액은 50 다를 수 있습니다. </li><li> RT에서 10 분 동안 200 XG에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 어두운 혈액 색의 펠렛을 떠나, 반투명 뜨는을 대기음. 펠렛이 느슨하지만 점성이 될 것입니다. </li><li> 피펫 15ml의 원뿔형 튜브에 차단 완충액 3 ㎖. </li><li> 재현 탁 펠렛까지의 수집 담황색 액체의 모든 50 ㎖에 대한 DPBS 20 ㎖를 추가2.1.5 TEP. 소용돌이는 철저하게 혼합, 여러 관에서 재현 탁 액체를 통합합니다. 이 액체는 혈액 세포를 일시 중지 포함되어 있습니다. </li><li> 전달 피펫, 단계 2.1.8에서 분리 완충액 3ml를 상 전사 현탁 혈구 5 mL를 가진. 두 개의 레이어를 만들 천천히 조심스럽게 세포 현탁액을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브를 기울입니다. 최소한의 가속 및 브레이크없이 실온에서 40 분 동안 400 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브로 된 PBMC를 포함하는 결과 흐린 중간 계층 (버피 코트)를 제거하기 위해 전송 피펫을 사용합니다. 그 아래에 다른 명확한 그리기 계층 마십시오. 각 50 ML 원뿔 관에 25 개 미만 mL로 전송합니다. </li><li> 세포를 씻어 (50 ML 원뿔 튜브의 전체 잔량을 채우기 위해 또는 그 이상)의 차가운 버퍼의 25 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 400 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 유동 완충액 10 ml로 펠렛을 재현 탁. 이 PBMC를 포함되어 있습니다. 세포를 세어 메신저를 사용당하지 나 장소를 동결 얼음에. </li></ol></li></ol> 3. 냉동과 PBMC를 녹고 <ol><li> 원심 분리기 400 x g에서 10 분 동안 단계 2.1.13에서 수집 한 PBMC는. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 이소 프로필 알코올 냉동 컨테이너를 입력합니다. 주의 : 이소 프로필 알코올은 가연성 및 급성 독성. </li><li> 20 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 함유하는 RPMI 1640 배지 (39 °의 C)와 펠렛을 재현 탁. 이 동결 RPMI 1640 배지이다. 약 5 × 107 세포 / ㎖를 갖는 현탁액을 초래할 것이다 매체 동결 양 펠렛을 재현 탁. 동결 가능한 세포의 수는 달라진다. </li><li> 2 ML의 cryotubes에 세포 현탁액 1 ml의 분량을 분배하고 냉동 컨테이너 cryotubes를 배치합니다. O / N를 저장하고 cryotubes를 제​​거하고에 저장 전송 -80 ° C에서 냉동실에 cryotubes와 냉동 컨테이너를 배치-190 ° C -150 ° C 사이의 극저온 냉동기. </li><li> 극저온 저장 부로부터 cryotube을 제거하고 37 ℃ 수조에서 교반과 함께 급속 해동. </li><li> 즉시 10 % FBS, 1 % 펜 / 연쇄상 구균과 1 % L- 글루타민을 함유하는 10 ml의 RPMI 1640 완전 배지 (4 ° C)와 15 ML 원뿔 튜브에 cryotube에서 해동 한 PBMC를 전송합니다. 해동 cryotube의 내용은 최대 세포 생존 (15)을 얻기 위해 가능한 한 빨리 전송 될 것이다. </li><li> 10 분 동안 400 XG에서 PBMC를 원심 분리기. </li><li> 5 ㎖의 RPMI 1640 배지로 완전한 펠렛을 재현 탁하고 세포를 카운트. </li><li> 이러한 트리 판 블루 배제 방법으로 확립 된 방법으로 세포 생존 능력을 측정합니다. 95 % - 일반적으로이 방법으로 세포 생존율은 약 90이다. PBMC를 이제 실험에 사용 준비가 된 것입니다. </li></ol> 4. 세포 사멸 결정 참고 : 여기에 나열된 희석이 스​​투의 목적을 위해입니다DY. 희석 따라 변경 될 수 있습니다. <ol><li> 100 ㎕의 총 부피로 RPMI 완전 배지를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 WS-CM 또는 니코틴 희석 / 웰, 이하 나타낸 바와 같이. </li><li> 다음 농도에 WS-CM 희석 : 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, (WS-CM에서 니코틴 함량을 기준으로) 등차 니코틴 단위의 2.5, 3, 4, 및 5 ㎍ / ㎖의 12. </li><li> 다음 농도로 RPMI 배지에서 니코틴 희석 : 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 및 3000 ㎍ / mL로. 주의 : 니코틴은 급성 독성 및 환경 위험합니다. </li><li> 웰 1 × 106 세포의 농도로 / 각 웰에 RPMI 완전 배지에 현탁 한 PBMC 100 ㎕를 추가한다. 셀 플러스 WS-CM 또는 니코틴의 총 부피는 200 μL / 잘 될 것입니다. </li><li> 이 연구의 목적으로, 전술 한 바와 같이 두 세트의 플레이트를 준비한다. 판을 덮고 24 시간, 37 ℃에서 3 시간, 5 % CO 2에 대한 하나의 판에 대해 하나의 판을 배양한다. 필요에 따라 시점을 조정합니다. </li&gt; <li> 얼음 차가운 버퍼 200 μL와 세포를 재 부유 마지막 3 분 동안 300 XG에서 원심 분리 상층 액을 흡입, 커버 플레이트와 함께 접시의 바닥을로 소용돌이 실온에서 세포를 씻고 세척 단계를 한 번 더 반복한다. </li><li> / 잘 100 μL의 총 부피에 대한 각 웰에 7 aminoactinomycin의 D (7AAD)의 5 μL 다음 버퍼를 실행하는 95 μl를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 인큐베이션 플레이트. </li><li> 클러스터 튜브에 버퍼를 실행 100 μl를 추가합니다. 클러스터 튜브 플레이트의 각 웰로부터 세포 현탁액의 전체 볼륨을 전송하고 유동 세포 계측기에 샘플을 획득. </li><li> 분석 소프트웨어를 이용하여 유세포 7AAD 양성 세포의 비율을 결정한다. </li></ol> 5. EC 50 결정 <ol><li> WS-CM과 니코틴의 EC (50) 값은 한 PBMC의 7AAD 양성 염색에 의해 결정됩니다. </li><li> EC (50) 값은 진한로 정의된다entration되는 세포의 50 %는 24 시간 분석에서 더 이상 없었다 가능한 한 값은 등차 니코틴 단위 / ㎖ μg의로서 표현된다. </li><li> 이 연구의 목적으로, EC (50)의 값은 각각, WS-CM 및 니코틴 1.56 ㎍ / ml 내지 1650 ㎍ / ㎖의 것으로 결정되었다. </li></ol> 6. 분비 된 사이토 카인 참고 : 여기에 나열된 희석이 연구의 목적이다. 희석액은 그에 따라 조정될 수있다. <ol><li> / 웰의 농도에서 100 ㎕의 총 부피를 RPMI 완전 배지를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 WS-CM을 희​​석시키고, 0.3, 1.56, 등차 니코틴 유닛 (3), 5 ㎍ / ml의. </li><li> 다음 니코틴 농도를 희석 : 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 및 3000 ㎍ / ㎖의. 주의 : 니코틴은 급성 독성 및 환경 위험합니다. </li><li> 웰 1 × 106 세포의 농도로 / 각 웰에 RPMI 완전 배지에 현탁 한 PBMC 100 ㎕를 추가한다.셀 플러스 WS-CM 또는 니코틴의 총 부피는 200 μL / 잘 될 것입니다. </li><li> 판을 덮고 37 ° C에서 3 시간, 5 % CO 2 동안 품어. </li><li> 3 분 300 XG에 원심 분리 상층 액을 흡입, 커버 플레이트와 함께 접시의 바닥을로 소용돌이 마지막으로 얼음 차가운 200 μL 버퍼를 실행하고 세척 단계를 한 번 더 반복과 세포를 일시 중단하여 실온에서 세포를 씻으십시오. </li><li> RPMI 전체 매체의 200 μl를 추가하고, 세척 단계를 한 번 더 반복한다. </li><li> 각 웰에 10 ㎍ / ml의 LPS 매체의 200 μl를 추가합니다. </li><li> 커버 플레이트 및 4 시간, 24 시간, 48 시간, 또는 37 ° C에서 72 시간 5 % CO 2 동안 품어. 필요에 따라 배양 시간을 조정합니다. </li><li> 3 분 동안 300 × g에서 접시를 원심 분리기. </li><li> 7 단계와 8 단계의 분석을 수행하기 위해 -80 ° C에서 냉동실에 잘 각각의 저장소에서 상층 액 175 μl를 가져 가라. </li></ol> 7. 세포 측정 비드 어레이 분석 &lt;OL&gt; <li> CBA 분석에서 6.10 및 사용 단계에서 제조 세포 상층 액을 해동. 제조업체의 지침에 따라 세포 측정 비드 어레이 (CBA) 분석을 수행합니다. </li></ol> 8. IL-8 ELISA <ol><li> IL-8 ELISA 단계 6.10 및 사용으로부터 세포 상층 액을 녹여. 제조업체의 지침에 따라 ELISA 분석을 수행합니다. </li></ol> 9. 세포 내 염색 및 유동 세포 계측법 참고 : 여기에 나열된 희석이 연구의 목적이다. 희석액은 그에 따라 조정될 수있다. <ol><li> / 웰의 농도에서 100 ㎕의 총 부피를 RPMI 완전 배지를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 WS-CM을 희​​석시키고, 0.3, 1.56, 등차 니코틴 유닛 (3), 5 ㎍ / ml의. </li><li> 동일한 플레이트에서 다음 니코틴 농도를 희석 : 2, 10, 50, 100, 500, 2000 및 4000 ㎍ / mL로. 주의 : 니코틴은 급성 독성 및 환경 해저드입니다DOUS. </li><li> / 잘 1 × 10 6 세포의 농도로 RPMI 완전 배지에 현탁 PBMC를 100 μl를 추가합니다. 셀 플러스 WS-CM 또는 니코틴의 총 부피는 200 μL / 잘 될 것입니다. </li><li> 판을 덮고 37 ° C에서 3 시간, 5 % CO 2 동안 품어. </li><li> 얼음 차가운 버퍼 200 μL와 세포를 재 부유 마지막 3 분 동안 300 × g에서 원심 분리 한 상층 액을 흡입, 커버 플레이트와 함께 접시의 바닥을로 소용돌이 실온에서 세포를 세척하고, 세척 단계를 한 번 더 반복한다. </li><li> 판에 RPMI 완료 매체의 200 μl를 추가하고, 세척 단계를 한 번 더 반복한다. </li><li> RPMI 전체 매체를 사용하여 2 μL / ㎖ GolgiPlug의 작업 농도가 10 ㎍ / ml의 LPS를 준비하고 각 웰에 200 μl를 추가합니다. </li><li> 37 ° C에서 6 시간, 5 % CO 2 판을 품어. </li><li> 단계 9.8의 끝에서, 버퍼 (39 °의 C)를 실행하고 (300)에서 회전하여 세포를 씻어4 ℃에서 3 분 XG. </li><li> 각 웰에 Cytofix 100 μl를 추가하고 4 ℃에서 20 분 동안 품어. </li><li> 4 ℃에서 3 분 동안 300 XG에서 1 배 Permwash (4 ° C에서)와 단계 9.9에 설명 된대로 세포를 제거하는 과정을 3 회 반복한다. </li><li> 에 다음 항체의 하나의 각 5 μL 각 아니라 다음에 45 μL 1X Cytoperm의 추가 각 웰 : TNF-α-알렉사 형석 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. 30 분 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> 1 배 Permwash (4 ° C에서)과 4 ℃에서 3 분 동안 300 XG에서 버퍼 (4 ° C)를 실행 한 시간 단계 9.9에 설명 된대로 세포 두 번 씻으십시오. </li><li> 2 % 파라 포름 알데히드 (39 °의 C) 200 μL로 세포를 재현 탁. 12 × 75mm 튜브에 세포를 전송하고, 사이토 흐름에 샘플을 분석 할 수 있습니다. 주의 : 파라 포름 알데히드는 급성 독성 및 건강 위험, 부식성. </li></ol> (10) K562 죽이는 분석 참고 : K562 세포는 성장한다RPMI 완료 매체와 37 ° C, 5 % CO 2의 문화에서 그들은 분석하기 전에 80 %의 합류에 도달 할 때까지. <ol><li> 유리 병에 DMSO의 18 μl를 추가하여 숙신 에스테르 (CFSE) 원액 카복시 5 mM의를 준비합니다. </li><li> / 웰로 각각의 웰에 대해 원하는 등차 니코틴 단위 또는 니코틴 농도를 달성하기 위해 100 ㎕의 총 부피로 RPMI 완전 배지를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 WS-CM 또는 니코틴 희석. 주의 : 니코틴은 급성 독성 및 환경 위험합니다. </li><li> / 웰 1.5 × 10 6 세포의 농도로 RPMI 완료 매체에 PBMC를 100 μl를 추가합니다. WS-CM 또는 니코틴 세포의 총 부피는 200 μL / 잘 될 것입니다. </li><li> 판을 덮고 37 ° C에서 3 시간, 5 % CO 2 동안 품어. </li><li> 실온에서 8 분 동안 400 XG에 10 DPBS ㎖의 원심 분리기를 추가하여 K562 세포를 씻으십시오. </li><li> DPBS 10 mL로 재현 탁하고 세포를 K562 세포를 카운트. </li><li> CFSE 가공용 준비1 ML의 DPBS에 CFSE 주식 솔루션 1 μl를 추가하여 NG 솔루션입니다. </li><li> 2 × 107 세포 - 함유 한 K562 세포 현탁액 1 ㎖에 CFSE 작동 액 1ml를 추가한다. 소용돌이와 실온에서 2 분 동안 정확하게 품어. </li><li> 즉시 FBS 200 μl를 추가합니다. 소용돌이와 실온에서 2 분 동안 정확하게 품어. </li><li> RPMI 전체 매체의 10 ML을 추가하고 실온에서 8 분 동안 400 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> RPMI 상청액을 제거하고 펠렛을 끊고 RPMI 완전 배지 10 mL로 세포를 재현 탁하고 CFSE로 표지 된 K562 세포를 카운트. </li><li> 실온에서 3 분 동안 300 XG에 접시를 원심 분리하여 PBMC를 씻으십시오. 액체를 경사 분리하여 상층 액을 기음. 덮개를 장착하고 접시의 바닥을 소용돌이. RPMI 전체 매체의 200 μl를 추가하고 세척 단계를 한 번 더 반복한다. </li><li> (1.5 × 106 PBMC를 K562s 100,000) PBMC 플레이트와 상기 각 I 샘플 웰에 1:15 비로 CFSE 표지 된 K562 세포를 추가37 ° C에서 5 시간 5 % CO 2 ncubate. </li><li> 실온에서 3 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포 믹스를 씻으십시오. 액체를 제거하여 상층 액을 기음. 덮개를 놓고 판의 바닥을 소용돌이. </li><li> 유동 완충액 200 μl를 첨가하고, 10.14 단계를 한 번 더에 기재된 세정 공정을 반복한다. </li><li> / 잘 100 μL의 총 부피에 대한 각 웰에 7AAD의 5 μL 다음 실행 버퍼의 95 μl를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 인큐베이션 플레이트. </li><li> 각 웰에 유동 완충액 100 ㎕를 첨가하고, 클러스터 튜브 플레이트의 각 웰로부터 세포 현탁액의 전체 볼륨을 전송하고 유동 세포 측정기에 샘플을 획득. </li><li> 분석 소프트웨어를 이용하여 유세포 7AAD 양성 및 CFSE 양성 세포의 비율을 결정한다. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+leukocyte+subsets+from+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+clinical+research.">Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research.</a> Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).</li><li>Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dead+cell+discrimination+with+7-amino-actinomycin+D+in+combination+with+dual+color+immunofluorescence+in+single+laser+flow+cytometry.">Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry.</a> Cytometry. 13, 204-208 (1992).</li><li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells:+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay.">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).</li><li>Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-induced+death+by+apoptosis+in+human+lymphokine-activated+natural+killer+cells.">Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells.</a> Blood. 87, 2411-2418 (1996).</li></ol>

The authors declare that there are no conflicts of interest.

우리와 다른 사람은 이전에 TPP를 함께 한 PBMC의 치료는 표현과 사이토 카인 및 대상 셀 (14)을 죽이는 기능 측정의 분비 등 여러 반응을 억제하는 것이 증명하고있다. 이전의 연구에서 설명하는 실험 방법은 더 이상 배양 기간을 필요로 크기 14에서 겸손했다. 기본이 매력적인 생체 모델의 응용 가능성을 감안할 및 응용 연구, 우리는 이러한 여러 단계의 생물학적 분석에서 분석 매개 변수의 최적화 할 수 있는지를 조사 하였다. 여기서는 TPP 처리 생체 PBMC 모델을 사용 TLR 매개 면역 반응을 측정하는 방법을 단순화 제시한다. 가능한 한 PBMC의 분리 이러한 생체 분석을위한 핵심 요구 사항이다. 잠재적 기증자의 개별 변동과 생리 학적 상태를 감안할 때, 그것은 반응하는 한 PBMC를 얻을 이상적입니다. 본 연구의 목적을 위해, 우리는 격리이전에 출판 된 방법 (15)를 사용하여 일반적으로 건강한 성인 피험자에서 D PBMC를. 또한, 기증자 간의 변동성을 최소화하기 위해 본 연구에서, 우리는 알레르기, 감염있는 사람을 제외, 또는 누가 어떤 처방전을 복용하거나 아스피린 같은 카운터 약물 이상했다. 이 최적의 생존 및 후속 실험에서 세포의 기능을 보장하므로 또한 갓 채취 혈액으로부터 단리 한 PBMC는 바람직하다. 67-72 시간 동안 TLR 효능과 자극을 활용 한 이전 방법은 세포 내 사이토 카인 분비 사이토 카인 (14)을 측정합니다. (아무 WS-CM 또는 니코틴 제어 조건에서) TLR 자극 된 세포에서 사이토 카인 분비의 시간 코스는 최대한의 분비가 24 시간에서 발생하는 것이 좋습니다. 더욱이, 우리는 TLR Golgiplug 작용제와 함께 인큐베이션 합하고 세포 내 사이토 카인의 측정도 6 (H)의 총 인큐베이션 시간을 감소시켰다. 이것은 측정하는 별도의 분석을 요구하지만사이토킨 양성 세포는, 데이터가 이전의 방법 (14)와 비교하여 더 강하다. 이전의 결과와 일치, WS-CM 강하게 분비 및 세포 내 사이토 카인의 유도를 억제 하였다. 따라서, 이들 변형은 실질적으로 분석 시간을 감소하도록 인도 및 문헌에 기술 된 것과 매우 유사한 결과를 수득 하였다. 우리는 사이토 카인 수준을 평가하는 유동 세포 계측법 및 ELISA 방법을 이용했지만, 예컨대 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (RT-qPCR에)와 같은 다른 기술들은 보완 기술로서 이용 될 수있다. 역사적으로, 방사성 동위 원소 표지 방법 (예를 들어, 51 CR-자료 분석)를 활용 이펙터 된 PBMC에 의한 세포 사멸을 대상으로. 이 보고서에 기재 한 방법은 방사능의 사용을 제거하고, 그 존재를 유동 세포 계측법에 의해 모니터링 될 수있는 형광 염료와로드 셀을 사용한다. 상술 한 방법의 또 다른 장점은 본원에 비교적 신속하고 adapte 수 있다는 것이다높은 처리량 분석에 D. 타겟 및 이펙터 세포의 배양 기간은 5 시간이기 때문에,이 분석은 8 시간에 완료 될 수있다. 이것은 그들이 며칠의 기간에 걸쳐 한 PBMC 및 활성화 / 자극 아형의 단리를 필요로 더 복잡한 다른 게시 된 방법과 대조에, 또는 NK 세포 및 K562 세포 접합체의 분석은 세포 독성 (17, 18)를 모니터링한다. 현재의 방법의 또 다른 장점은 더 큰 유연성을 수득 이펙터 세포로 직접 동결 보존 한 PBMC를 사용한다는 것이다. 요약하면, 우리는 쉽게 상이한 화합물을 테스트하기 위해 적용될 수있는 가연성 TPP 처리 한 PBMC에서 TLR - 매개 면역 반응의 효과를 확인할 수있는 몇 가지 분석법을 설명했다. 동결 보존 성분의 사용은 세포 계측법, CBA의 분석법, ELISA를 견고하고, 일관된 결과가 다른 실험실에 걸쳐 신속하게 얻을 수 있었다 흐름 확립 된 기술과 함께 상당한 유연성을 허용하고,oratories.

심혈관 질환 (CVD), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 암 1,2- 포함한 만성 흡연의 건강에 미치는 악영향에 기술 점의 실질적인 몸체. 만성 흡연은 염증과 면역 억제를 일으키는 것으로 알려져 있으며, 이러한 변화는 흡연자 3 미생물 감염과 암의 위험 증가에 기여할 것으로보고되고있다. 생체 외 및 생체 기술이 유용의 병태 생리 학적 효과의 분자 기초를 해명에 담배 연기 4-9 (표 1)과 각종 담배 제품 (10, 11)의 새로운 규정을 안내하기위한 중요한 도구로 인식된다. 예를 들어, 우리는 전체 연기 된 배지 (WS-CM) 및 총 입자상 물질 (TPM) 등의 가연성 담배 제품 준비 (TPP를)이 훨씬 더 독성과 손상에 있음을 증명하고있다불연성 TPP를 또는 니코틴 (12, 13)보다 DNA. 게시 된 작업과 일치, 그것은 최근에 가연성 TPP를 또는 니코틴 (12, 13)이보고되었다. 게시 된 작업과 일치, 우리는 최근 가연성 TPP를 표시 한 면역 억제의 원인이 보도했다. 이것은 수용체 (TLR) -ligands 같은 톨의 억제에 의해 입증 된, 생체 모델 (14)에 한 PBMC에 의해 살해 (K562) 사이토 카인 분비를 자극, 세포를 대상으로. 흡연 - 유도 된 질병 과정에서 염증의 중요성을 감안하면, 담배 연기의 면역 조절 성 효과를 평가하기위한 분석 조건의 추가적인 최적화는 본 조사된다. 생체 외 분석은 일반적으로 세포 내 사이토 카인을 측정뿐만 아니라 분석 죽이고 14 K562 세포 내에서 세포 독성 T 세포 및 NK 세포 용해 기능을 분비. 분석은 WS-CM 및 니코틴과 PBMC의 후속 자극과 사전 배양을 포함TLR와 S 3 일에 걸쳐 주작 동근; 최종 판독은 효소 면역 분석법 (ELISA를)를 사용하여 및 / 또는 유동 세포 계측법으로 수행된다. 우리는 TLR-4 수용체에 결합하고,이 한 PBMC 세포 내 사이토 카인 및 사이토 카인 분비의 자극의 결과로 생산 세균 지질 다당류 (LPS)를 이용했다. 단리 한 PBMC, 세포 사멸 분석, 및 IL-8을 정량 TPP를 우리 또한 본 방법의 면역 조절 효과를 평가하기위한 각종 분석 단계의 최적화 외에. 이러한 방법은 다른 연구 문제를 해결하기 위해 적용 및 추가 규제 맥락에서 담배 제품을 평가하기 위해 정제 할 수있다. 표 1. 체외의 보고서를 간행하고 생체 방법은 담배 제품의 준비 varilus 병태 생리 학적 효과를 연구하는 데 사용 CS, 담배 연기 매체.; CSC, 담배 연기 응축; CSE, 담배 연기 추출물; ELISA, 면역 분석을 효소는 링크; GADPH, 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소; qPCR을 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응; RT, 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응; TS, 담배 연기. <table><tbody><tr><td> 저자 (연구 년) </td><td> Laan의 등 알. (2004) </td><td> 무디 등 알. (2004) </td><td> Oltmanns 등 알. (2005) </td><td> Vayssier (1998) </td><td> Witherden 등 알. (2004) </td><td> Birrell 등 알. (2008) </td></tr><tr><td> 세포는 사용 </td><td> 인간 기관지 내피 세포 (BEAS-2B), 인간 호중구 </td><td> 인간의 폐포 상피 세포 (A549) </td><td> 인간기도 평활근 세포 (HASMC) </td><td> premonocytic 인간 U937 세포, 인간 단핵 </td><td> 폐포 유형 II 상피 세포 (ATII) </td><td> 인간 단핵구세포주 (THP-1), 인간 폐 식세포 </td></tr><tr><td> TPP 사용 </td><td> CSE </td><td> CSC </td><td> CSE </td><td> TS </td><td> CSE </td><td> CS </td></tr><tr><td> 방법 사용 </td><td> ELISA, qPCR에, 마이그레이션, 전기차 이동 </td><td> Immunohisto - 화학, 전기, Arrayscan 키트, RT-PCR, ELISA </td><td> ELISA, RT-PCR, qPCR에, 전기 영동 </td><td> 젤 이동성 변화 </td><td> 광학 현미경, 전자 현미경, 전기, ELISA </td><td> qPCR에, ELISA, E-toxate 키트 (시그마), P65 플레이트 분석 (TransAM), 전기 영동, 다양한 면역 키트 </td></tr><tr><td> 측정 </td><td> IL-8, GM-CF, AP-1, NF-κB, 마이그레이션 </td><td> 히스톤 아세틸 트랜스퍼, 히스톤 아세틸 라제, NF-κB, IL-8, PI κB-α, GADPH </td><td> HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, 에오 </td><td> 열 충격 / 스트레스 단백질 (HSP / 인 Hsp70), HF 전사 인자, NF-κB,TNF-α </td><td> 계면 활성제 단백질 (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ </td><td> IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK 인산화 cJUN : DNA 결합, 글루타티온, P65 : DNA 결합 </td></tr><tr><td> 최종 결과 </td><td> CSE는 AP-1 활성의 억제를 통해 사이토 카인 생성을 하향 조절한다. </td><td> H 2 O 2와 CSC는 차별적으로, 히스톤 탈 아세틸 화 효소의 활성을 감소, 히스톤 단백질의 아세틸 화를 강화 염증성 사이토 카인의 방출을 조절한다. </td><td> 담배 연기는 담배 연기에 의해 TNF-α, 20 % CSE 이하 IL-8 릴리스, 에오 탁신의 억제 및 RANTES에 의해 강화 HASMC에서 IL-8의 출시를 일으킬 수 있습니다. </td><td> TS는 인 Hsp70 과발현 및 활동과 TNF-α 자료를 결합 NFkB의 억제와 관련이 HF 전사 인자를 활성화. </td><td> 감소 ATII 세포 유래 케모카인 수준의 타협 alveoLAR 수리, 담배 연기에 의한 폐포 손상과 폐기종에 기여. </td><td> 데이터는 왜 흡연자가 증가 호흡기 감염에 대한 기계적인 설명을 제공합니다. 선천성 반응 억제는 IL-8의 증가를 수반한다. </td></tr></tbody></table>

<table><tbody><tr><td>12 x 75 mm tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>2 ml microtubes</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>3R4F reference cigarettes</td><td>Univ. of Kentucky, College of Agriculture</td><td>3R4F</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>500 ml bottle</td><td>Corning</td><td>430282</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>96-well flat bottom plate</td><td>Termo Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>96-well round bottom plates</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture hood</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Series A2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>58110R</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Molecular Probes Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Cluster tubes</td><td>Corning</td><td>4401</td><td>Harmful if swallowed, carcinogen</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm (Permwash)</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>DMSO (dimethyl sulfoxide )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>FCAP Array</td><td>BD Biosciences</td><td>652099</td><td>Software analyzes CBA data</td></tr><tr><td>Filter unit</td><td>Nalgene</td><td>156-4020</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td>8 colors, at Ex 405 and Em 785.</td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Calibur</td><td>4 colors at Ex 495 and Em 785.</td></tr><tr><td>Flow cytometry analysis software</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Freezing container</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>Contains DMSO, irritant</td></tr><tr><td>GogliPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>Carcinogen, irritant, corrosive</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Human Inflammatory Cytokine Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&amp;gamma; V-500 Antibody</td><td>BD Horizon</td><td>561980</td><td>skin sensitizer</td></tr><tr><td>IL-8 ELISA Kit</td><td>R and D Systems</td><td>DY208</td><td></td></tr><tr><td>Isolation buffer</td><td>Isolymph, CTL Scientific Corp.</td><td>1114868</td><td>Flammable liquid, irritant</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>MIP1-&amp;alpha; PE Antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>554730</td><td>Acute toxicity, oral</td></tr><tr><td>Monensin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5273</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Nicotine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td>Acute toxicity, environmental hazard</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>&amp;ldquo;M&amp;rdquo;</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Flammable, skin irritation</td></tr><tr><td>Pen/strep</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Running buffer</td><td>MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Th1/Th2 CBA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>551809</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha; Alexa Fluor 488 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>502915</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr></tbody></table>

methods to evaluate cytotoxicity and immunosuppression of combustible tobacco product preparations

다른 병리 생리 학적 변화 중, 담배 연기 만성 노출은 미생물 감염 및 종양 발생률 흡연자의 감수성 증가로 연결되었다 염증 및 면역 억제를 야기한다. 생체 내 인간 말초 혈 단핵 세포에서 수용체 - 매개 면역 반응의 억제 (한 PBMC) 연기 성분으로 처리하는 메커니즘을 연구 및 담배 제품에 대한 노출 가능성이있는 장기 효과를 평가하는 매력적인 방법이다. 여기서 우리는 박테리아 리포 폴리 사카 라이드, 수신자 같은 수용체 4 리간드에 의해 자극 된 PBMC를 사용하여 생체 분석을 수행하는 방법을 최적화. 전체 연기 된 배지 (WS-CM)의 효과는, 가연성 담배 제품 준비 (TPP), 니코틴은 생체 분석에 PBMC를하여 사이토 카인 분비와 표적 세포 사멸에 조사 하였다. 우리는 그 표시 분비 사이토킨 IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, IL-8, 사이토 카인의 세포 내 IFN-47 ;, TNF-α 및 MIP-1α는 WS-CM-노출 PBMC를 억제했다. K562의 표적 세포 살해 분석으로 산출 된 PBMC의 효과기 세포 용해 기능은 또한 WS-CM에 노출 감소; 니코틴은 이러한 분석에 최소한의 효과적이었다. 요약하면, 우리는 생체 내 분석의 TPP를 효과를 평가하기 위해 개선 된 분석법의 세트를 제공하고,이 방법은 용이하게 다른 관심있는 제품을 테스트하도록 구성 될 수있다.

결과는 평균 (네 기증자 샘플)의 평균 ± 표준 오차로 표시 하였다. 치료 및 치료를받지 않은 샘플 사이의 학생의 t- 테스트는 해당 컨트롤이 모든 치료 용 Excel 소프트웨어뿐만 아니라 t-test를 비교를 사용하여 수행 하였다. 통계적 유의성에 의해 표시되었습니다 * P &lt;0.05; **, P &lt;0.005; ***, P &lt;0.0005. WS-CM 및 니코틴에 대한 노출의 효과를 측정하기 위해, PBMC를 3 시간 또는 24 시간 동안 다른 WS-CM 및 니코틴의 농도로 처리 하였다. 세포 사멸은 이중 가닥 핵산에 인터 칼 7AAD의 같은 견고하고 안정적인 7AAD 염색법에 의해 측정하고, 죽거나 사균 (16)의 세포막을 관통 할 수있다. 세포 사멸의 용량 의존적 증가 등차 니코틴 단위 (도 1A)의 4 ㎍ / ml의 검출 가까운 80 % 세포 사멸과 함께 24 시간에서 WS-CM 관찰되었다. 세포 죽음의 비교 정도였다만 3,000 ㎍ / ㎖의 니코틴 (그림 1B)에 주목했다. 우리는 WS-CM 및 사이토 카인 유도 및 표적 세포를 죽일 수있는 능력에 대한 영향을 평가하기 니코틴 3 시간 동안 PBMC를 노출하기 때문에, WS-CM 3 시간 처리 다음 상당한 독성을 유발 여부를 확인하는 것이 필요했다. PBMC를 상당한 독성을 경험하지 않았다 WS-CM의 동등 니코틴 단위의 5 ㎍ / ㎖로 처리 (&lt;5 %; 그림 1A). 3 시간 동안 니코틴 치료 만 2,000 ㎍ / ㎖ (그림 1B)에서 측정 (8 %) 세포 사멸을 일으키는 원인이되었다. 따라서, 지시 된 투여 량 및 치료 기간에 WS-CM 또는 니코틴에 노출 실험 조건 하에서 현저한 세포 독성을 유발하지 않았다. 면역 조절 효과를 측정하기 위해, PBMC를 서로 다른 시간 기간들에 대한 LPS로 자극하고, 분비 된 사이토 카인은 CBA 분석으로 측정 하였다. LPS 자극 시간을 최적화하기 위해, 우리는 4 시간, 2 LPS로 자극 된 PBMC를 노출4 시간, 48 시간, 72 시간, 및 사이토 카인 분비를 측정 하였다. 예를 들어, 24 시간 동안 LPS 자극은 사이토 카인 IL-6 및 IL-8 (도 2)의 최대 분비를 수득하고, 연장 된 시간주기는 사이토킨에 더욱 증가 (IL-6) 또는 감소 (IL-8)을 초래하지 않았다 분비. 유사한 결과가 이러한 IL-10, IL-1β 및 TNF-α와 같은 다른 시토 킨 분비 얻었다 (데이타 미기재). 파일럿 시간 코스 실험은 LPS에 의한 TLR-4 자극에 대한 반응에서 사이토 카인의 최대 생산량은 24 시간에 의해 발생하는 것을 제안하고, 따라서, 분비되는 사이토 카인은 이후의 모든 실험에서 24 시간에 측정 하였다. LPS와 TLR-4 수용체의 자극에 의해 다음 WS-CM 및 니코틴과 치료, 분비되는 사이토 카인 (그림 3)의 용량 의존적으로 감소 귀착되었다. WS-CM과 치료는 IFN-γ의 깊은 감소 (그림 3A), TNF (그림 3B), IL-10 (그림 3C &lt;결과낮은 동등 니코틴 단위 (1.56 ㎍ / ㎖)에서&gt; / 강해)와 IL-6 (그림 3D). 사이토 카인의 억제 또한 니코틴 분명했다. 그러나, 니코틴과 사이토 카인의 억제는 상당히 높은 투여 량에서 발생하고, 억제도가 개별 사이토 카인 변화. IL-6가 실험 높은 농도 (4 ㎎ / ㎖) (Figurie 3D)에서 억제되고, 반면 예를 들어, IFN-γ는 50 μg의 대폭 / ㎖에서 니코틴 억제 것으로 나타났다. 다음에는 ELISA 분석을 사용하여 동일한 샘플에서 IL-8 농도를 측정 하였다. IL-8 분비를 효과적으로 WS-CM-PBMC를 노출 억제 하였다; 니코틴의 억제 효과는 2 ㎎ / ㎖ (그림 4)에서 상당한 동안. 세포 내 사이토 카인의 수준은 LPS로 자극에 WS-CM- 및 니코틴 처리 한 세포에서 정량화 하였다. 이전에 우리는 3 일 동안 PBMC를 자극하고 측정하기 위해 배양의 마지막 6 시간 동안 Golgiplug 추가세포 내 사이토 카인 (14). 우리는 이제 크게 6 시간의 총 LPS 및 골지체 플러그 자극을 조합함으로써 인큐베이션 기간을 감소시키고 세포 내 사이토 카인 양성 세포를 (도 5)를 측정 하였다. (5 IFN-γ 양성 세포의 투여 량 - 의존성 퍼센트 감소를 도시한다 도 5a), TNF-α 양성 nicotine- 및 WS-CM- 모두에서 세포 (도 5b)은 MIP-1α 양성 세포에서 농도 의존적 % 감소 (도 5C) 반면-CM WS에서 관찰되었고, PBMC를 노출 -exposed PBMC를. 이 분석에서는 하부 등차 니코틴 단위 (1.56 ㎍ / ㎖)에 WS-CM에 노출 된 후 세포 내 사이토킨 양성 세포의 수의 감소를 관찰 하였다. 두 사이토 카인 분비 및 세포 내 사이토킨 분석법 IFN-γ 수준 또는 IFN-γ 양성 세포의면에서 유사한 결과를 보였다. 기능 측정, WS-CM- 및 nicotine-의 능력으로대상 K562 세포를 죽이는 치료 PBMC를 결정 하였다. 그림 6a는 제어에 의한 (CFSE 표지 K562) 세포 사멸이, WS-CM에 노출 된 대상의 7AAD 양성 염색을 대표하는 유세포 원시 데이터를 묘사하고, 니코틴 처리 한 PBMC. 상자에 숫자는 %의 7AAD 양성 CFSE 표지 K562 세포를 나타냅니다. 1.56 ㎍ / ㎖의 노출은 WS-CM 크게 제어 및 낮은 투여 량과 비교 한 PBMC에서 이펙터 세포의 살상 능력을 감소시켰다. 낮은 투여 량 및 높은 니코틴 처리는 세포 사멸을 방해하지 않았다.도 6B는 여러 번의 실험에 공여자 죽이고 퍼센트 K562 세포의 투여 량 - 의존적 감소를 나타낸다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52351/52351fig1highres.jpg" /> WS-CM (㎍ / ml) 및 니코틴 (㎍ / ㎖)의 등차 니코틴 단위의 증가하는 농도에 노출 된 후 PBMCs를 그림 1. 세포 사멸. </str옹&gt; PBMC를 3 시간 및 24 시간 (A) 및 3 시간 및 24 시간 (B)에 대한 니코틴에 대한 WS-CM 처리 하였다. 세포사 7AAD 염색에 의해 측정 하였다. 각 점은 대표적인 실험에서 4 기증자의 평균 ± SD 오차 막대를 나타냅니다. 통계적 유의성은으로 표시됩니다 * P &lt;0.05; ** P &lt;0.005, *** P &lt;0.0005. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52351/52351fig2highres.jpg" /> 상이한 시점에서 LPS로 자극 된 PBMC에 의한 IL-6 및 IL-8의 분비도 2. PBMC를하여 4 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간 동안 LPS로 자극 하였다. 세포 배양 상청액에서 IL-6와 IL-8의 사이토 카인의 수준은 인간 염증성 사이토킨 키트 (키트 CBA)를 이용하고 유동 세포 계측법 측정 하였다. 이러한 데이터는 세 개의 다른 기증자로부터 한 PBMC를 사용하여 두 개의 독립적 실험 중 하나로부터 평균 ± SD 오차 막대를 나타낸다. 통계시gnificance가로 표시됩니다 : * P &lt;0.05; ** P &lt;0.005. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52351/52351fig3highres.jpg" /> LPS 자극 다음 WS-CM (㎍ / ml) 및 니코틴 (㎍ / ㎖)의 등차 니코틴 단위 증가하는 농도로 처리 한 PBMC에 의한 사이토 카인의 분비도 3. 감소. PBMC를는 WS-CM 및 니코틴의 다양한 농도에 노출시켰다 3 시간 동안 24 시간 동안 LPS로 자극. IFN-γ (A)의 수준은, 세포 배양 상청액의 TNF (B), IL-10 (C) 및 IL-6 (D) 사이토킨 TH1 /은 Th2 CBA의 분석을 이용하여 유세포 분석기를 측정 하였다. 이 데이터는 네 가지 다른 기증자로부터 한 PBMC를 사용하여 3 개의 독립적 인 실험 중 하나에서 평균 ± SD 오차 막대를 나타냅니다. 통계적 유의성은으로 표시됩니다 * P &lt;0.05; ** P &lt;0.005; *** P &lt;0.0005. 높은 사기<html> WS-CM의 centrations는 *** P &lt;0.0005와 통계 학적으로 유의 한 차이를 보였다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52351/52351fig4highres.jpg" /> LPS 자극 다음 WS-CM (㎍ / ml) 및 니코틴 (㎍ / ㎖)의 등차 니코틴 단위 증가하는 농도로 처리 한 PBMC에 의한 IL-8 분비의도 4 감쇠. 한 PBMC는 WS-CM 및 니코틴 노출시켰다 24 시간 동안 LPS로 자극하고, IL-8 ELISA로 측정 하였다 분비. 이러한 데이터는 네 가지 다른 기증자로부터 한 PBMC를 사용하여 세 개의 독립적 실험 중 하나로부터 평균 ± SD 오차 막대를 나타낸다. 통계적 유의성은으로 표시됩니다 * P &lt;0.05; ** P &lt;0.005; *** P &lt;0.0005. WS-CM의 높은 농도는 *** P &lt;0.0005와 통계 학적으로 유의 한 차이를 보였다. .JPG &quot;/&gt; WS-CM (㎍ / ml) 및 니코틴 (㎍ / ㎖)의 등차 니코틴 단위 증가하는 농도로 처리 한 PBMC 세포 내 사이토 카인 양성 세포도 5 감소. 한 PBMC는 WS-CM 및 니코틴의 농도 변화에 노출 된 3 시간과 6 시간 동안 LPS와 Golgiplug 자극. WS-CM 및 니코틴 차량 제어는 RPMI 완전 배지이었다. 세포 내 IFN-γ 양성 (A), TNF-α 양성 (B), MIP-1α 및 양성 (C) 세포를 유세포 분석기로 정량 하였다. 이러한 데이터는 네 가지 다른 기증자로부터 한 PBMC를 사용하여 네 개의 독립적 실험 중 하나로부터 평균 ± SD 오차 막대를 나타낸다. 통계적 유의성은으로 표시됩니다 * P &lt;0.05; ** P &lt;0.005; *** P &lt;0.0005. WS-CM의 높은 농도는 *** P &lt;0.0005와 통계 학적으로 유의 한 차이를 보였다. <img alt="그림 6"SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52351 / 52351fig6highres.jpg&quot;/&gt; PBMC를 표적을도 6 저감 WS-CM (㎍ / ml) 및 니코틴 (㎍ / ㎖)의 등차 니코틴 단위의 증가하는 농도에 노출되는 능력을 죽이고. PBMC를 3 적응증 WS-CM 농도의 니코틴으로 처리하여 hr이고, CFSE 표지 된 K562 세포는 표적 세포로서 첨가하고 추가 5 시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포 7AAD로 염색하고 세포 계측법 죽이는 능력을 측정하는 데 사용 된 흐름. 그림 6A 게이트 된 상자에 표시된 %의 살인과 결과 세포 계측법을 대표하는 흐름을 보여줍니다. 화살표가 노출 1.56 ㎍ / ml의 %의 살인을 감소 나타냅니다 WS-CM. 그림 6b는 네 가지 다른 기증자로부터 한 PBMC를 사용하여 네 개의 독립적 인 실험에서 대표 평균 ± SD 오차 막대를 보여줍니다. 통계적 유의성은으로 표시됩니다 ** P &lt;0.005; *** P &lt;0.0005. WS-CM의 높은 농도도 유의 하였다 재치시간 *** P &lt;0.0005.

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Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.

방법은 가연성 담배 제품 준비의 세포 독성 및 면역 억제를 평가하기

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

methods-to-evaluate-cytotoxicity-immunosuppression-combustible

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K 조회수.  Wake Forest University Health Sciences. Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure. 

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Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface  

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated respiratory epithelium. A protocol is described for isolating and exposing these cells to mainstream cigarette smoke (CS), in order to study epithelial cell responses to CS exposure. The protocol consists of three parts: the isolation of airway epithelial cells from mouse trachea, the culturing of these cells at air-liquid interface (ALI) as fully differentiated epithelial cells, and the delivery of calibrated mainstream CS to these cells in culture. The ALI culture system allows the culture of respiratory epithelia under conditions that more closely resemble their physiological setting than ordinary liquid culture systems. The study of molecular and lung cellular responses to CS exposure is a critical component of understanding the impact of environmental air pollution on human health. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the etiology of chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and other tobacco-related diseases, which represent major global health problems.

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface as a model of differentiated respiratory epithelium. A protocol is described for isolating, culturing and exposing these cells to mainstream cigarette smoke, in order to study molecular responses to this environmental toxin.

에어 리퀴드 인터페이스에서 마우스 호흡기 상피 세포 및 실험 담배 연기에 노출의 분리

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

연구

의학

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.

The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.

전체 담배 연기에의 Organotypic 3D 기관지와 코 조직 문화 모델의 반복 노출의 영향 평가

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

생체공학

Generation of Electronic Cigarette Aerosol by a Third-Generation Machine-Vaping Device: Application to Toxicological Studies

Electronic-cigarette (e-cig) devices use heat to produce an inhalable aerosol from a liquid (e-liquid) composed mainly of humectants, nicotine, and flavoring chemicals. The aerosol produced includes fine and ultrafine particles, and potentially nicotine and aldehydes, which can be harmful to human health. E-cig users inhale these aerosols and, with the third-generation of e-cig devices, control design features (resistance and voltage) in addition to the choice of e-liquids, and the puffing profile. These are key factors that can significantly impact the toxicity of the inhaled aerosols. E-cig research, however, is challenging and complex mostly due to the absence of standardized assessments and to the numerous varieties of e-cig models and brands, as well as e-liquid flavors and solvents that are available on the market. These considerations highlight the urgent need to harmonize e-cig research protocols, starting with e-cig aerosol generation and characterization techniques. The current study focuses on this challenge by describing a detailed step-by-step e-cig aerosol generation technique with specific experimental parameters that are thought to be realistic and representative of real-life exposure scenarios. The methodology is divided into four sections: preparation, exposure, post-exposure analysis, plus cleaning and maintenance of the device. Representative results from using two types of e-liquid and various voltages are presented in terms of mass concentration, particle size distribution, chemical composition and cotinine levels in mice. These data demonstrate the versatility of the e-cig exposure system used, aside from its value for toxicological studies, as it allows for a broad range of computer-controlled exposure scenarios, including automated representative vaping topography profiles.

Electronic cigarette (e-cig) users are increasing worldwide. Little, however, is known about the health effects induced by inhaled e-cig aerosols. This article describes an e-cig aerosol generation technique suitable for animal exposures and subsequent toxicological studies. Such protocols are required to establish experimentally reproducible and standardized e-cig exposure systems.

3 세대 기계 Vaping 장치에서 전자 담배에 어로 졸의 생성: 독물학 연구 응용 프로그램

Electronic-cigarette (e-cig) devices use heat to produce an inhalable aerosol from a liquid (e-liquid) composed mainly of humectants, nicotine, and ...

화학

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among adults. High quality, reproducible research on the consequences of electronic cigarette use is essential for understanding emerging public health concerns and crafting evidence based regulatory policy. While a growing number of papers discuss electronic cigarettes, there is little consistency in methods across groups and very little consensus on results. Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This protocol details instructions for the assembly and operation of said device, and demonstrates the use of the generated extract in two sample applications: an in vitro cell viability assay and gas-chromatography mass-spectrometry. This method provides a tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This method provides a useful tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

전통적인 담배 연기와 전자 담배 연 무질에서 액체 추출의 세대에 대 한 장치를 운영 하는 마이크로컨트롤러

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

세포 독성의 평가 인간의 정밀 컷 폐 분할 영역에서 물질의 Immunomodulatory 효과

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

면역학 및 감염병학

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. The potential adverse health effects of electronic cigarette vapor (E-vapor) exposure are poorly defined. While several animal models of E-vapor exposure have been developed, few models expose rodents to clinically relevant quantities of nicotine and make direct comparisons to cigarette smoke within the same exposure system. Here, we present a method for constructing and operating an E-vapor chamber and cigarette smoke chamber. The chambers are constructed by outfitting anesthesia chambers with a computer controlled pumping system that delivers consistent amounts of E-vapor or cigarette smoke to rodents. Nicotine exposure is measured indirectly by quantifying pre and post-exposure serum cotinine levels. This exposure system can be modified to accommodate various types of E-cigarettes&#160;and tobacco cigarettes, and can be used to compare the effects of E-vapor&#160;and cigarette smoke in vivo.

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

This protocol describes a method for exposing rodents to electronic cigarette vapor (E-vapor) and cigarette smoke. Exposure chambers are constructed by modifying anesthesia chambers with an automated pumping system that delivers E-vapor or cigarette smoke to rodents. This system can easily be modified to accommodate many experimental endpoints.

전자 담배와 담배 연기의 효과 비교<em&gt; In Vivo</em&gt; 노출 시스템

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. ...

Accessing the Cytotoxicity and Cell Response to Biomaterials

Biomaterials contact directly or indirectly with the human tissues, making it important to evaluate its cytotoxicity. This evaluation can be performed by several methods, but a high discrepancy exists between the approaches used, compromising the reproducibility and the comparison among the obtained results. In this paper, we propose a protocol to evaluate biomaterials cytotoxicity using soluble extracts, which we use for dental biomaterials. The extracts preparation is detailed, from pellets production to its extraction in a culture medium. The biomaterials cytotoxicity evaluation is based on metabolic activity using the MTT assay, cell viability using the Sulphorhodamine B (SBR) assay, cell death profile by flow cytometry, and cell morphology using May-Gr&#252;nwald Giemsa. Additional to cytotoxicity evaluation, a protocol to evaluate cell function is described based on the expression of specific markers assessed by immunocytochemistry and PCR. This protocol provides a comprehensive guide for biomaterials cytotoxicity and cellular effects evaluation, using the extracts methodology, in a reproducible and robust manner.

This methodology aims to evaluate biomaterial cytotoxicity through the preparation of soluble extracts, using viability assays and phenotypic analysis, including flow cytometry, RT-PCR, immunocytochemistry, and other cellular and molecular biology techniques.

생체 재료에 대한 세포 독성 및 세포 반응에 접근

Biomaterials contact directly or indirectly with the human tissues, making it important to evaluate its cytotoxicity. This evaluation can be performed by ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it is challenging to assess the contributions of individual constituents to its overall toxicity. Toxicological profiles of individual constituents as well as mixtures can be however established in vitro, by applying high through-put screening tools, which enable the profiling of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHCs) of tobacco smoke, as defined by the U.S. Food and Drug Administration (FDA).2
For an initial assessment, an impedance-based instrument was used for a real-time, label-free assessment of the compound&#39;s toxicity. The instrument readout relies on cell adhesion, viability and morphology that all together provide an overview of the cell status. A dimensionless parameter, named cell index, is used for quantification. A set of different staining protocols was developed for a fluorescence imaging-based investigation and a HCS platform was used to gain more in-depth information on the kind of cytotoxicity elicited by each HPHC.
Of the 15 constituents tested, only five were selected for HCS-based analysis as they registered a computable LD50 (&#60; 20 mM). These included 1-aminonaphtalene, Arsenic (V), Chromium (VI), Crotonaldehyde and Phenol. Based on their effect in the HCS, 1-aminonaphtalene and Phenol could be identified to induce mitochondrial dysfunction, and, together with Chromium (VI) as genotoxic based on the increased histone H2AX phosphorylation. Crotonaldehyde was identified as an oxidative stress inducer and Arsenic as a stress kinase pathway activator.
This study demonstrates that a combination of impedance-based and HCS technologies provides a robust tool for in vitro assessment of CS constituents.

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.

유해 및 잠재적으로 유해한 구성 성분의 독성 효과를 평가하기 위해 높은 콘텐츠 심사 분석 (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

생물학

Analyzing the Effect of Tobacco Product Preparations on Cytokine Production via Intracellular Staining and Flow Cytometry

Source: Arimilli, S. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/52351">Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015)
This video demonstrates the effect of tobacco product preparations, TPPs, on cytokine production from human peripheral blood mononuclear cells using flow cytometry. Treatment of the cells with TPP downregulates the production of pro-inflammatory cytokines, which is estimated after lipopolysaccharide stimulation, followed by immunostaining and flow cytometry analysis.

세포 내 염색 및 유세포 분석을 통한 사이토카인 생산에 대한 담배 제품 제제의 효과 분석

Source: Arimilli, S. et al., Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations.&#160;J. Vis. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immune Response

Immune Modulation

An Assay to Measure Chemically-Induced Cytotoxicity in Human Precision-Cut Lung Slices

Source: Neuhaus, V. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/57042">Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018)
This video illustrates a technique for evaluating cytotoxicity in human precision-cut lung slices through the WST-1 assay. Human precision-cut lung slices are subjected to incremental concentrations of a cytotoxic chemical to quantify their cytotoxicity. A decrease in color intensity serves as confirmation of the chemical&#39;s detrimental impact on lung cells.

인간의 정밀 절단 폐 절편에서 화학적으로 유도된 세포 독성을 측정하기 위한 분석

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. General Preparation of Human ...